DE60304571T2

DE60304571T2 - Benzodioxolderivate als modulatoren der proteolyseaktivität in pflanzen

Info

Publication number: DE60304571T2
Application number: DE60304571T
Authority: DE
Inventors: George Denys Glynne Jones; Valerio Borzatta
Original assignee: Endura SpA
Current assignee: Endura SpA
Priority date: 2002-02-14
Filing date: 2003-02-13
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2023-02-14
Also published as: EP1511382A1; ITMI20020287A0; BR0307603A; EP1511382B1; ES2263986T3; WO2003067985A1; CN1633238A; US20050085390A1; ATE322821T1; ZA200407110B; CN100512644C; US8017557B2; DE60304571D1; ITMI20020287A1; AU2003210260B2; AU2003210260A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Benzodioxolderivaten zur Modifizierung der Enzymaktivität in Pflanzen.
Stand der Technik
Piperonylbutoxid ist ein seit einiger Zeit als Synergist von Insektiziden, wie beispielsweise Insektiziden vom Typ Pyrethin, Pyrethroid und Carbamat, bekanntes Benzodioxolpolyoxyethylen.
Dessen relativ geringe Toxizität gegenüber Menschen und Tieren und dessen nennenswerte Effekte auf ein großes Spektrum von Insektiziden hat die schnelle Verbreitung von dessen Verwendung in der Landwirtschaft ermöglicht.
Der Mechanismus an dem Herzstück dieses synergistischen Effektes wurde bisher noch nicht geklärt, selbst wenn von Zeit zu Zeit direkte oder indirekte Regulationseffekte auf manche bei der Inaktivierung der oder in dem Katabolismus der Insektizidmoleküle, mit denen es einen Synergismus bildet, involvierte spezifische Enzyme vorgeschlagen wurden, wie beispielsweise auf in Insekt-Homogenisaten vorliegende nicht spezifische Esterasen (Piperonyl Butoxide "The insecticide Synergist", 1998, Academic Press, S. 215), vor kürzerer Zeit auf mikrosomale Oxidasen (Alzogaray R.A., Arch. Insect Biochem. Physiol., 2001, 46: 119-126) oder auf Cytochrom P450-Monooxygenasen (Kotze et al., Int. J. Parasitol, 1997, 27: 33-44). Bisher wurde allerdings ein Effekt von PBO auf Enzyme pflanzlichen Ursprungs nicht beschrieben, geschweige denn ein Effekt insbesondere auf die proteolytische oder Peptidase-Klasse von Enzymen.
Die Bedeutung der Proteasen und deren physiologischen Inhibitoren als Schlüsselenzyme bei der Regulierung zellulärer Prozesse sowohl in Tieren als auch in Pflanzen ist bekannt und weithin anerkannt.
In Pflanzen beispielsweise ist die Balance zwischen proteolytischen Enzymen und natürlichen Inhibitoren das Herzstück der genauen zeitlichen Regulationen des Keimungsverfahrens von ruhenden Samen.
Es ist ebenfalls bekannt, dass über den Verlauf der Evolution die Herstellung von natürlichen Inhibitoren proteolytischer Enzyme in Pflanzen unter anderem als ein Schutzmechanismus gegenüber Parasiten gewählt wurde. Die Nützlichkeit der auf dieser Art von Ansatz basierenden Interventionen wird beispielsweise von Harsulkar A.M. et al. in Plant Physiol. 1999, 121: 497-506 bestätigt. Ein auf der Verwendung von transgen exprimierten Proteaseinhibitoren basierender Ansatz wird in der EP 0 502 730 und in der EP 0 339 009 beschrieben: erstens ist die Expression von Inhibitor ausreichend, um einen Schutzeffekt gegenüber Nematoden zu verursachen, zweitens verstärkt die transgene Expression eines natürlichen Proteaseinhibitors den insektiziden Effekt des Produktes des ersten, das Bt-Toxin (Bacillus thuringiensis Toxin) kodierenden Gens. Derselbe Ansatz wird von S. Macintosh et al. in J. Agric. Food Chem. 1990, 38: 1145-1152 beschrieben.
Es ist daher offensichtlich, dass die Verfügbarkeit eines mit regulierender Aktivität der Wirksamkeit von proteolytischen Enzymen pflanzlichen Ursprungs ausgestatteten Produkts für ein breites Spektrum von Anwendungen von großem industriellem Interesse ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Benzodioxolderivaten der Formel I, von denen Piperonylbutoxid (PBO) bevorzugt ist, als Modulatoren der Aktivität oder des Gehaltes von proteolytischen Enzymen in Pflanzen. Zur Hydrolyse von Peptidbindungen befähigte proteolytische Enzyme sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carboxypeptidasen, Aminopeptidasen, Dipeptidasen und Endopeptidasen.
Die Behandlung mit Benzodioxolderivaten wird an Pflanzen durchgeführt, welche vorzugsweise für ein Protein mit insektizider Funktion, das vorzugsweise der Kategorie von Bacillus thuringiensis Toxinen (Bt-Toxin), welche zu der Cry Gruppe gehören, angehört, transgen sind. Vorzugsweise sind solche transgenen Pflanzen Wolle, Mais, Tomate, Kartoffel und Soja und besonders bevorzugt Wolle.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von Zusammensetzungen enthaltend die Benzodioxolderivate als die aktiven Bestandteile in Kombination mit geeigneten Emulgatoren und optional mit Photoschutzverbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Benzotriazolen, Benzophenonen und sterisch gehinderten Aminen als Modulatoren der Aktivität oder des Gehaltes von proteolytischen Enzymen in Pflanzen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Regulieren der proteolytischen Aktivität in Pflanzen, vorzugsweise in transgenen Pflanzen und besonders bevorzugt in Wolle, Mais, Soja, Tomate, Kartoffel, umfassend im Wesentlichen die Behandlung solcher Pflanzen mit Benzodioxolderivaten und mit den solche Verbindungen enthaltenden Zusammensetzungen in einer Weise, dass die Endkonzentration von enthaltenem PBO zwischen 50 und 500 Gramm/Hektar beträgt und die Behandlung am Ende des Vegetationszyklus durchgeführt wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1. Graphische Wiedergabe der Inhibition ansteigender Konzentrationen von PBO auf die Aktivität des Enzyms Papain durch Dixon-Darstellung.
Aus der bei zwei verschiedenen, eingesetzten Substratkonzentrationen (CBZ: L-Lysin-p-nitrophenylester), nämlich bei 1,5 × 10^–4 M (voller Kreis -⦁-) bzw. 6 × 10^–5 M (leerer Kreis -O-), erhaltenen Dixon-Darstellung ist es möglich, die Inhibitionskonstante (K_i) von PBO auf das Enzym Papain, welche 2,6 × 10^–3 M beträgt, zu berechnen. Des Weiteren ist es möglich, aus diesem Diagramm den IC₅₀ von 2 × 10^–3 M zu errechnen.
Abszisse: PBO Konzentration (M); Ordinate 1/V (Δ Abs/Min.). Reverse Mizellenuntersuchung ISO-AOT 50 mM (AOT: Doppelaerosol (2-Ethylhexylnatriumsulfosuccinat in Isooctan (ISO)); W_o (H₂O/AOT) = 23
2. Graphische Widergabe der Inhibition von ansteigenden Konzentrationen an PBO auf die Aktivität des Enzyms Ficin durch Dixon-Darstellung.
Aus der bei zwei verschiedenen, eingesetzten Substratkonzentrationen (CBZ: L-Lysin-p-nitrophenylester), nämlich bei 1,5 × 10^–4 M (voller Kreis -⦁-) bzw. 6 × 10^–5 M (leerer Kreis -O-), erhaltenen Dixon-Darstellung ist es möglich, die Inhibitionskonstante (K_i) von PBO auf das Enzym Ficin, welche 0,45 × 10^–3 M beträgt, zu berechnen. Aus diesem Diagramm ist es ebenfalls möglich, den IC₅₀ von 0,8 × 10^–3 M zu bestimmen.
Abszisse: PBO Konzentration (M); Ordinate 1/V (Δ Abs/Min.). Reverse Mizellenuntersuchung ISO-AOT 50 mM (AOT: Doppelaerosol (2-Ethylhexylnatriumsulfosuccinat in Isooctan (ISO)); W_o (H₂O/AOT) = 25
3. Graphische Widergabe der Inhibition von ansteigenden Konzentrationen an PBO auf die Aktivität des Enzyms Bromelain durch Dixon-Darstellung.
Aus der bei zwei verschiedenen, eingesetzten Substratkonzentrationen (CBZ: L-Lysin-p-nitrophenylester), nämlich bei 1,5 × 10^–4 M (voller Kreis -⦁-) bzw. 6 × 10^–5 M (leerer Kreis -O-), erhaltenen Dixon-Darstellung ist es möglich, die Inhibitionskonstante (K_i) von PBO auf das Enzym Bromelain, welche 0,1 × 10^–3 M beträgt, zu berechnen. Aus diesem Diagramm ist es ebenfalls möglich, den IC₅₀ von 0,4 × 10^–3 M zu bestimmen.
Abszisse: PBO Konzentration (M); Ordinate 1/V (Δ Abs/Min.). Reverse Mizellenuntersuchung ISO-AOT 50 mM (AOT: Doppelaerosol (2-Ethylhexylnatriumsulfosuccinat in Isooctan (ISO)); Wo (H₂O/AOT) = 28
4. Carboxypeptidaseaktivität in Wollkeimen nach 4 Tagen Keimung.
Das Ausmaß der proteolytischen Aktivität in Wollkeimen wurde 30', 60', 90' und 120' nach der Suspension von Acetonpulver in wässrigem Puffer bei pH 6,5 durch Bestimmen der Absorption bei 280 nm in einer Quarzküvette nach der Proteinpräzipitation mit TCA und nach der Entfernung durch Zentrifugation gemessen.
Jede Analysenreihe wurde zweifach durchgeführt. Der Vergleich zwischen den Werten der Carboxypeptidaseaktivität von behandelten und unbehandelten Proben wurde unter Verwendung des Durchschnittswerts jeder Analysenreihe gemacht.

Behandelte Proben: dunkelgrau
Unbehandelte Proben: hellgrau

5. Endopeptidaseaktivität in Wollkeimen nach 4 Tagen Keimung.
Das Ausmaß der hydrolytischen Aktivität in Wollkeimen wurde 15', 30', 60', 90' und 120' nach der Solubilisierung von Acetonpulver in einem wässrigem Puffer bei pH 7,7 durch Bestimmen der Absorption bei 280 nm in einer Quarzküvette nach der Proteinpräzipitation mit TCA und der Entfernung durch Zentrifugation gemessen. Jede Analysenreihe wurde zweifach durchgeführt. Der Vergleich zwischen den Werten der Carboxypeptidaseaktivität in behandelten (dunkelgrau) und unbehandelten (hellgrau) Proben wurde unter Verwendung des Durchschnittswertes für jede Analysenreihe gemacht. Abszisse: Zeit (Min.); Ordinate: Absorption bei 280 nm.
6. Bt-Gehalt in PBO behandelten gegenüber PBO unbehandelten Wollpflanzen.
Eine immunoenzymatische Untersuchung wurde durchgeführt, um die Bt-Menge in unterschiedlichen Stufen der Pflanzenentwicklung zu bestimmen.

a) gemessene Bt-Toxinwerte; Ordinate: Bt ausgerückt als ppm; Abszisse: Tage der Pflanzenkultur und, wenn unterschiedlich, des Pflanzengewebes. Schwarze (linke) Säule: unbehandelte Wolle; graue (rechte) Säule: PBO behandelte Wolle. Die Standardabweichung ist ebenfalls angegeben.
b) %-Unterschiede in der Bt-Menge über die Zeit in PBO behandelten gegenüber unbehandelten Pflanzen. Ordinate: % Bt-Gehalt (ppm) in PBO behandelten minus unbehandelten Pflanzen; Abszisse: Tage der Pflanzenkultur und, sofern unterschiedlich, des Pflanzengewebes (Kotyledone oder Blätter).

7. Vergleich zwischen der Endopeptidaseaktivität von mit PBO behandelten und unbehandelten Wollpflanzen bei unterschiedlichen Wachstumsstadien durch Radialdiffusionsuntersuchung.
Der Radius einer aus Pflanzenextrakten hergestellten klaren Zone wurde mit einer durch eine serielle Verdünnung von Trypsin erhaltenen Standardkurve verglichen. Eine Standardlösung von Trypsin wurde eingesetzt, um eine Standardkurve für jede Probenplatte aufzuzeichnen; folglich wurde die Endopeptidaseaktivität als Einheiten Trypsin der Äquivalente ausgedrückt. Für jeden Extrakt wurde durch das Biuret-Verfahren die Menge an löslichen Proteinen in mg bestimmt und die enzymatische Aktivität wurde dann als spezifische Aktivität, das heißt Einheiten/mg löslicher Proteine, ausgedrückt. Abszisse: Zeit (Tagen); Ordinate: Trypsin Einheiten/mg an löslichem Protein.
8. Vergleich zwischen der Peptidaseaktivität (U/mg an löslichem Protein) von PBO behandelten und unbehandelten Wollpflanzen durch photometrische Untersuchung mit DL-BAPA als Substrat.
Die photometrische Untersuchung bei 410 nm wurde der DL-BAPA-Hydrolyse folgend ausgeführt. Eine Peptidaseeinheit (U) wurde als die Menge an Enzym definiert, welche eine Einheit Absorptionsveränderung bei 410 nm/Minute bei einem pH von 8,2 und bei 30°C erzeugt. Für jeden Extrakt wurde durch das Biuret-Verfahren die Menge an löslichen Proteinen in mg bestimmt und die enzymatische Aktivität wurde dann als spezifische Aktivität, d. h. Einheiten/mg lösliche Proteine, ausgedrückt.
Jede Analyse wurde zweifach oder dreifach durchgeführt, und die Standardabweichung für jeden Punkt ist ebenfalls angegeben. Abszisse: Zeit (Tage); Ordinate: Trypsin Einheiten/mg lösliches Protein.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Benzodioxolderivaten gemäß der nachfolgenden allgemeinen Formel I:
worin R₁, R₂ und R₃ entweder gleich oder verschieden und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, C₂-C₈-Alkyl; CH₂OR₄, worin R₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, -(CH₂CH₂O_n)-R₅, wobei n eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 ist und R₅ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, C₁-C₈-Alkyl, Aryl nicht substituiert oder substituiert mit: C₁-C₄-Alkyl, Halogen, Cyanogruppe (CN), -SO₃H-Gruppe, Carboxyalkylgruppe-COOR₆ (worin R₆ Wasserstoff oder C₁-C₈-Alkyl ist), einer -N(R₇)-R₈-Gruppe, worin R₇ und R₈ gleich oder verschieden sind: Wasserstoff oder C₁-C₄-Alkyl oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an welches diese gebunden sind, ein Piperidinyl, ein Pyrrolidin, ein Morpholin-Gruppe bilden; R₅ ist zusätzlich ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: C₇-C₉-Aralkyl, nicht substituiert oder an dem aromatischen Ring substituiert durch Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: C₁-C₄-Alkyl, Halogen, eine Cyanogruppe, eine -SO₃H-Gruppe, eine Carboxyalkylgruppe -COOR₉, worin R₉ dieselbe Bedeutung wie R₆ hat, und, wobei, wenn R₁, R₂ und R₃ dieselben sind, diese nicht Wasserstoff sein können, wobei die Verwendung auf der überraschenden Entdeckung basiert, dass die zuvor definierten Verbindungen mit der Eigenschaft ausgestattet sind, die Aktivität oder den Gehalt von proteolytischen Pflanzenenzymen zu modulieren.
Vorzugsweise sind die Substituenten R₁, R₂ und R₃ in den zuvor genannten Verbindungen gleich oder verschieden und ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, C₂-C₄-Alkyl, CH₂OR₄, worin R₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, -(CH₂CH₂O)_n-R₅, wobei n eine ganze Zahl zwischen 1 und 2 ist und R₅ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl, Benzyl, Aryl nicht substituiert oder substituiert durch: C₁-C₃-Alkyl, und, wobei, wenn R₁, R₂ und R₃ dieselben sind, diese nicht Wasserstoff sein können.
In solchen Verbindungen der Formel I sind die Substituenten R₁, R₂ und R₃ besonders bevorzugt gleich oder verschieden und ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, Propyl, CH₂OR₄, wobei R₄-(CH₂CH₂O)₂-R₅ ist und R₅ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: C₂-C₄-Alkyl, Phenyl, Toluyl, und, wobei, wenn R₁, R₂ und R₃ dieselben sind, diese niemals Wasserstoff sein können. Ganz besonders bevorzugt entsprechen solche Verbindungen Piperonylbutoxid (PBO) oder 5-[[2-(2-Butoxyethoxy)ethoxy]methyl]-6-propyl-1,3-benzodioxol gemäß der Formel (II):
Aus Gründen der Einfachheit wird nachfolgend nur auf die Verbindung Piperonylbutoxid Bezug genommen, welche unter der Abkürzung PBO oder der Bezeichnung "Benzodioxolderivate" bekannt ist, wobei beabsichtigt ist, dass sich die vorliegende Erfindung mit dieser Abkürzung und mit dieser Bezeichnung auf alle, die bevorzugten Substituenten enthaltenden Verbindungen der allgemeinen Formel I bezieht.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe Proteasen, Proteinasen oder Peptidasen in einer äquivalenten Weise eingesetzt und sind dazu gedacht, sich auf peptidische Hydrolasen zu beziehen, welche aus Gründen der Einfachheit über den Verlauf der vorliegenden Beschreibung als proteolytische Enzyme oder als Proteasen bezeichnet werden, d. h. auf Enzyme mit hydrolytischer Aktivität gegenüber Peptid- oder Amidbindungen unabhängig von deren Position, daher entweder, wenn diese intern in der Polypeptidkette vorliegen, oder, wenn diese an den N- oder C-terminalen Enden vorliegen. Gemäß dieser Definition sind daher sowohl Enzyme vom Typ der Endopeptidasen als auch Exopeptidasen, wie beispielsweise die Aminopeptidasen oder die Carboxypeptidasen, welche die Peptidbindungen unter Freisetzung einzelner Aminosäuren sequenziell von den N- oder C-terminalen Enden hydrolysieren, innerhalb der Definition proteolytischer Enzyme.
Die proteolytischen Enzyme, auf welche PBO dessen regulatorische Aktivität ausübt, sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carboxypeptidasen, Aminopeptidasen, Dipeptidasen und Endopeptidasen, wobei die Endopeptidasen wiederum vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Serinproteasen, Cysteinproteasen, Kathepsinen und Metallo-Endopeptidasen und die Cysteinproteasen wiederum bevorzugt ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Bromelain, Calpain, Ficin, Papain und Chymopapain.
Die Regulation der proteolytischen Aktivität in Pflanzen, beispielsweise durch die Aktivierung von spezifischen Inhibitoren, hat im Vergleich zu den Proteasen von Insekten und von pathogenen Mikroorganismen eine vornehmlich defensive Rolle. In dem Fall der durch mechanische durch biologische Mittel verursachten Verletzungen werden Protea seinhibitoren, welche zu der Verteidigungsstrategie der Pflanze beitragen, de novo synthetisiert.
Das modulatorische Potenzial der Inhibitoren auf die endogenen Proteasen könnte in Samen bescheiden sein und dazu tendieren, bei der Keimung zu verschwinden; eine wichtige Rolle wurde den Inhibitoren während der Samenreifung zugeordnet, um den Proteinabbau während der Akkumulationsphase zu vermeiden. Daher umfasst die vorliegende Erfindung gemäß einer weiteren Zielsetzung als eine weitere Ausführungsform die PBO proteolytische Modulationsaktivität auf Samen; gemäß einer weiteren Ausführungsform ist PBO ebenfalls dazu nützlich, die Aktivierung der Pflanzenverteidigung in dem Falle von Wunden oder von Verletzungen zu verursachen, was die Regulation des allgemeinen Gewebewachstums erlaubt.
Ein weiterer Vorteil der neuen Aktivität auf die hier beschriebene proteolytische Pflanzenzellaktivität ist die Regulation der Produktion, der Reifung oder des Abbaus oder in anderen Worten des Umsatzes an endogenen Proteinverbindungen, beispielsweise solchen mit natürlichen Insektiziden oder fungiziden Funktionen oder mit Gewebereparaturfunktionen. Dieser Mechanismus kann beim Verstärken der natürlichen Antwort der Pflanzenzelle gegenüblicher möglichen parasitären Angriffen oder gegenüber von extern abgeleiteten Belastungen helfen.
Ein Beispiel von mit fungizider Aktivität ausgestatteten Substanzen ist von Leah et al. in J. Biol. Chem., 1991, 266: 1564-1573 beschrieben worden und wird hier nicht vollständig aufgelistet: Ribosomen inaktivierende Proteine (RIP), welche eine Spezifität für einander lediglich entfernt entsprechender Ribosomen, wie beispielsweise Pilze, aber nicht für Pflanzenribosomen aufweisen, oder die Chitinasen und die (1-3)-β- Glucanasen, welche in die Synthese der Zellwände von Pilzen eingreift. Andere von Pflanzen in der Form von inaktiven Proteinvorläufern hergestellte Substanzen, welche Defensivfunktionen gegenüber Bakterien und Pilzen in deren reifen Form aufweisen, sind Thionine, welche beispielsweise von Bohlmann H. in Critical Reviews in Plant Sciences, 1994, 13: 1-16 beschrieben worden sind.
Die Behandlung mit PBO gemäß der hier beschriebenen neuen Verwendung wird an allen Pflanzentypen wie dem Fachmann bekannt durchgeführt, wobei sich auf die der Luft ausgesetzten Teile der Pflanze und insbesondere auf die Blätter konzentriert wird. Die Behandlung kann ebenfalls an Samen durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Behandlung vorzugsweise an transgenen Pflanzen ausgeführt, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wolle, Mais, Kartoffel, Tomate und Soja. Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von Benzodioxolderivaten als Modulatoren der proteolytischen Aktivität in bezüglich der Einführung eines ein Protein kodierenden Transgens transgenen Pflanzen.
Die nach der Behandlung mit PBO erhaltene Abweichung der proteolytischen Pflanzenaktivität hat abhängig von dem betrachteten System einen unterschiedlichen Effekt, weil sie die Erhöhung oder sogar die Verringerung der Verfügbarkeit eines Proteins oder eines Proteins in dessen aktiven Konformation ermöglichen kann. Es ist bekannt, dass ein stationärer Zustandspegel das Ergebnis der Geschwindigkeit des Proteinabbaus und der -produktion ist. Allerdings ist die Proteolyse ebenfalls als Mechanismus für die Proteinaktivierung bekannt. Als Ergebnis erlaubt die neue Verwendung eine Steigerung in der natürlichen oder induzierten Verteidigung der Pflanze gegenüber parasitärer Infektion oder gegenüber äußeren Angriffen. Dementsprechend ist eine weitere und bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Regulation von transgen exprimierten Proteinmengen durch die Modulation der proteolytischen Aktivität innerhalb einer Pflanzenzelle. Insbesondere bevorzugt sind bezüglich eines der Bacillus thuringiensis Toxine transgene Pflanzen.
Insbesondere in dem Fall von für das Bacillus thuringiensis Bt-Toxingen transgenen Pflanzen ist die Möglichkeit der Steuerung des Mechanismus der Proteolyse extrem wichtig, um sowohl die Aktivität des transgenen Toxins zu steuern, oder, um dessen Herstellung zu regulieren.
Es sollte allerdings beachtet werden, dass diese bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nicht auf einen einzigen Herstellungs- oder Aktivierungsmechanismus auf das transgene Protein beschränkt ist, sondern sich auf alle Mechanismen erstreckt, welche von PBO durch einen direkten oder indirekten Effekt (wie beispielsweise durch Proteaseinhibitoren) auf proteolytische Enzyme aktiviert werden. Eine Erhöhung in den Mengen der proteolytischen Enzyme kann durch direkte oder indirekte Untersuchungen überwacht werden. Unter den indirekten Untersuchungen kann die Aktivität der Proteasen auf verschiedene endogene oder exogene Substrate gemäß den auf dem technischen Gebiet gut bekannten Verfahren gemessen werden.
In dem Falle transgener Pflanzen kodiert das Transgen eines der Cry-Proteine von Bacillus thuringiensis und besonders bevorzugt ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cry I, Cry II, Cry III, Cry IV und insbesondere Cry IA (a), (b) oder (c). Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Pflanze Wolle und das Transgen kodiert für das Cry I Toxin von Bacillus thuringiensis.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben des Weiteren beobachtet, dass in für Bt Cry I Protein transgener Wolle die Menge an transgenem Toxin nach der PBO Behandlung höher ist als in unbehandelten transgenen Pflanzen und diese Erkenntnis korreliert mit einer Abnahme der proteolytischen Aktivität in während einer Zeitspanne von wenigstens 100 Tagen mit PBO behandelten Pflanzen gegenüber unbehandelten.
Folglich ist die Verwendung von Benzodioxolderivaten gemäß der Formel I als proteolytische Modulatoren insbesondere vorteilhaft in transgenen Pflanzen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wolle, Mais, Tomate, Kartoffel und Soja, und zwar bevorzugt, wenn diese für Bt-Toxin und besonders bevorzugt für Cry I Toxin transgen sind, zum Inhibieren der proteolytischen Mechanismen, welche direkt oder indirekt die Expression von transgenem Bt-Toxin in der Pflanzenzelle modifizieren (d.h. inaktivieren oder reduzieren). Ganz besonders bevorzugt ist die PBO Behandlung von für eines der Bacillus thuringiensis Toxine transgene Wolle.
Die Mengen an Bt-Toxin in Pflanzen werden wie auf diesem technischen Gebiet bekannt gemessen, beispielsweise mit mit für das Bt-Toxin spezifischen Antikörpern ausgeführten immunoenzymatischen Untersuchungen. Alternativ dazu können kleinere Mengen von Bt-Toxin als die geeigneten Grenzen auf dem Feld oder in dem Laboratorium durch direktes Messen des Fehlens der Mortalität der parasitären Insekten gemessen werden.
Gemäß einer zusätzlichen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Regulieren der proteolytischen Aktivi tät in Pflanzen bereit, vorzugsweise zur wenigstens teilweisen Inhibierung der proteolytischen Aktivität einer Pflanze, umfassend im Wesentlichen die Behandlung der Pflanze mit PBO oder dessen Derivaten oder mit Zusammensetzungen enthaltend PBO als aktiven Bestandteil in einer Weise, dass die Konzentration des aktiven Bestandteils zwischen 50 und 800 Gramm/Hektar, besonders bevorzugt zwischen 100 und 400 Gramm/Hektar und ganz besonders bevorzugt zwischen 200 und 350 Gramm/Hektar beträgt. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise bis zu dreimal pro Vegetationszyklus wiederholt und wird besonders bevorzugt an dem Ende des Vegetationszyklus ausgeführt.
Dieser bevorzugte Aspekt ist von besonderer Relevanz, wenn die Pflanze transgen ist, und insbesondere, wenn solch eine Pflanze, vorzugsweise Wolle, Mais, Tomate, Kartoffel und Soja, für das Cry-Toxin von Bacillus thuringiensis transgen ist. Tatsächlich wird die modulatorische Aktivität von PBO während verschiedenen Phasen des Pflanzenwachstumszyklus wenige Stunden nach der Behandlung bis wenige Tage nach der Behandlung beobachtet.
Die Modulation der Proteaseaktivität durch PBO in Pflanzen ist vorzugsweise eine negative Modulation durch eine direkte Inhibition des Enzyms durch das PBO oder durch einen indirekten Effekt, wie beispielsweise durch die Aktivierung von Proteaseinhibitoren oder durch die de novo Synthese spezifischer Proteaseinhibitoren.
Die Behandlung mit PBO wird unter Verwendung von Zusammensetzungen mit geeigneten Hilfsstoffen oder Emulgatoren in geeigneter Weise durchgeführt. Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung gemäß einem weiteren Aspekt auf die Verwendung von Zusammensetzungen enthaltend die Benzodioxolderivate gemäß der Formel I oder die be vorzugten Ausführungsformen hiervon, wie beispielsweise PBO, als aktiven Bestandteil in Kombination mit geeigneten Emulgatoren oder Hilfsstoffen und optional mit Photoschutzverbindungen als Modulatoren der Aktivität oder der Menge von proteolytischen Enzymen in Pflanzen. Die Emulgatoren sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Calciumsalzen von Alkylarylsulfonsäuren, Polyglykolestern von Fettsäuren, Alkylarylpolyglykolethern, Polyglykolethern von Fettalkoholen, Ethylenoxid-Propylenoxid-Kondensationsprodukten, Alkylpolyethern, Sorbitanfettsäureestern, Polyoxyethylensorbitanfettsäureestern und Polyoxyethlensorbitanestern. Besonders bevorzugt sind die Emulgatoren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkylarylpolyglykolethern und Calciumsalzen von Alkylarylsulfonsäure. Die Emulgatoren liegen in einer Minimalkonzentration von 2 Gew.-% vor.
Die Konzentration von PBO in den Zusammensetzungen mit Emulgatoren oder Hilfsstoffen beträgt zwischen 1 und 98 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 20 und 95 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt zwischen 50 und 90 Gew.-%.
In der vorliegenden Patentanmeldung wird die Mischung aus aktiven Bestandteilen in Kombination mit den geeigneten Hilfsstoffen oder Emulgatoren "Konzentrat" genannt. Dem Konzentrat wird optional ein Schutzmittel gegen Photooxidation (Photoschutzmittel) zugefügt, das ausgewählt ist aus der Klasse von Verbindungen bestehend aus Benzotriazolen, Benzophenonen und sterisch gehinderten Aminen in Konzentrationen zwischen 0,1 Gew.-% und 10 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 0,5 Gew.-% und 8 Gew.-% und besonders bevorzugt zwischen 1 Gew.-% und 5 Gew.-% des Konzentrats.
Unter den Benzotriazolen sind die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2-(2'-Hydroxy-5-t-octylphenyl)benzotriazol und 2-(2'-Hydroxy-3',5'-di-t-butylphenyl)-5-chlorbenzotriazol.
Unter den Benzophenonen sind die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon, 2-Hydroxy-4-octyloxybenzophenon und 2'-Dihydroxy-4,4'-dimethoxybenzophenon.
Unter den sterisch gehinderten Aminen sind die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Di(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperinidyl)sebacat; Di(1,2,2,6,6-pentamethyl-4-piperidinyl)sebacat; alpha-[[6-[[4,6-Bis(dibutylamino)-1,3,5-triazin-2-yl] (2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)amino]hexyl] (2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)amino]-omega-[4,6-bis(dibutylamino)-1,3,5-triazin-2-yl]-poly[[6-[butyl(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)amino]-1,3,5-triazin-2,4-diyl][2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)imino]-1,6-hexandiyl[2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)imino]; Polymer von Dimethylsuccinat mit 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinethanol; Polymer von N,N'-Di-(2,2,6,6-Tetramethyl-4-piperinidyl)-1,6-hexandiamin mit 2,4,6-Trichlor-1,3,5-triazin und 1,1,3,3-Tetramethylbutylamin; Polymethylpropyl-3-oxy(4((2,2,6,6-tetramethyl)piperidinysiloxan; 1,3,5-Triazin-2,4,6-triamin; N,N'''[1,2-Ethandiyl-di[[[4,6-bis[butyl(1,2,2,6,6-pentamethyl-4-piperidinyl)amino]-1,3,5-triazin-2-yl]imino]-3,1-propandiyl]]-di[N',N''-dibutyl-N',N''-bis(1,2,2,6,6-pentamethyl-4-piperidinyl)] oder der nachfolgenden Mischung: Mischung aus dem Polymer von Dimethylsuccinat mit 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinethanol und dem Polymer von N,N'-Di(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)-1,6-hexandiamin mit 2,4,6-Trichlor-1,3,5-triazin und 1,1,3,3-Tetramethylbutylamin.
Besonders bevorzugt sind Benzophenone und ganz besonders bevorzugt 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon sowie 2-Hydroxy-4-octyloxybenzophenon sowie unter den sterisch gehinderten Aminen sind Di(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)sebacat und Di(1,2,2,6,6-pentamethyl-4-piperidinyl)sebacat bevorzugte Verbindungen.
Das das Photoschutzmittel optional enthaltende Konzentrat ist emulgierbar und wird daher mit Wasser vermischt, um geeignete Lösungen zu erhalten, um durch Feldsprühen zerstäubt zu werden, so das die Konzentration an PBO zwischen 50 und 800 Gramm/Hektar, vorzugsweise zwischen 100 und 400 Gramm/Hektar und ganz besonders bevorzugt zwischen 200 und 350 Gramm/Hektar beträgt. Jeder Behandlungszyklus auf dem Feld kann aus einer bis zu drei Behandlungen pro Vegetationszyklen zusammengesetzt sein.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die nachfolgend experimentellen Beispiele, welche lediglich exemplarisch und nicht beschränkend sind, näher beschrieben.
EXPERIMENTELLER TEIL
Beispiel 1. In vitro Inhibition von Cystein-Endopeptidasen durch Piperonylbutoxid
Die Untersuchungen wurden, wie von Walde et al. in Eur. J. Biochem., 1988, 173: 401-409 beschrieben und bereits in der Literatur in kinetischen Studien der Inhibition von Trypsin mit natürlichen und synthetischen Inhibitoren berichtet, durch die Untersuchung von in organischem Lösemittel dispergierten reversen Mizellen durchgeführt. Solch eine Untersuchung wurde auf die nachfolgenden aufgereinigten Pflanzen enzyme angepasst: Papain, Ficin und Bromelain (Sigma Katalog Nr.: P4762, F4125, B5144) in der Gegenwart von Substrat CBZ (L-Lysin-p-nitrophenylester, Sigma Katalog Nr. C3637), und mit Wo (molares Verhältnis von Wasser/Tensid oder H₂O/AOT) = 23, 25, 28 entsprechend ausgeführt.

Die Enzymuntersuchung an reverser Mizelle wurde bereits in der Literatur für das Enzym Trypsin beschrieben und auf verschiedene Enzyme angepasst. Diese Werte wurden durch heftiges Vermischen von 1 ml 50 mM AOT-ISO mit geeigneten Volumina Protease und verschiedenen Pufferlösungen, nämlich MES (2-[N-Morpholino]ethan-sulfonsäure) für das Enzym Papain, HEPES (N-[2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]) für das Enzym Ficin und Acetat für das Enzym Bromelain, in einer Quartz-Spektrophotometriezelle erhalten. Sobald die Lösung vollständig transparent und augenscheinlich homogen war, wurde diese thermostatisch auf 30°C eingestellt. Zu dieser Lösung wurde ein geeignetes Volumen des Substrats CBZ (aufgelöst in Acetonitril/H₂O, 80:20 (v/v) bei einer Konzentration von 15 mM) zugefügt und die Lösung nachfolgend weiter vermischt (die Lösung kehrte zu transparent zurück), wonach die Änderung in der Absorption (Δ Abs) bei 340 nm mit einen Cary 219 Spektrophotometer gemessen wurde. Die Untersuchungsbedingungen waren zusammenfassend wie folgt: Papain:

AOT-ISO:	50 mM (Natrium-bis-2-ethylhexylsulfosuccinat-Isooctan)
– Wo:	23
– Puffer:	50 mM MES, pH 6,2 enthaltend 2,5 mM Cystein,

– Temperatur:	30°C
– Substrat:	1,5 × 10^–4 M und 6 × 10^–5 M CBZ (L-Lysin-p-nitrophenylester, Sigma)
– Papain:	2 mg/ml
– PBO (sofern anwesend):	zwischen 4,87 × 10^–4 M und 5,9 × 10^–3 M

Ficin

AOT-ISO:	50 mM (Natrium-bis-2-ethylhexylsulfosuccinat-Isooctan)
– Wo:	25
– Puffer:	50 mM HEPES, pH 7,1 enthaltend 2,5 mM L-Cystein,
– Temperatur:	30°C
– Substrat:	1,5 × 10^–4 M und 6 × 10^–5 M CBZ (L-Lysin-p-nitrophenylester, Sigma)
– Ficin:	1,7 mg/ml
– PBO (sofern anwesend):	zwischen 4,87 × 10^–4 M und 5,9 × 10^–3 M

Bromelain:

AOT-ISO:	50 mM (Natrium-bis-2-ethylhexylsulfosuccinat-Isooctan)
– Wo:	28
– Puffer:	10 mM Acetat, pH 4,6 enthaltend 1 mM L-Cystein,
– Temperatur:	30°C
– Substrat:	1,5 × 10^–4 M und 6 × 10^–5 M CBZ (L-Lysin-p-nitrophenylester, Sigma)
– Bromelain:	2 mg/ml
– PBO (sofern anwesend):	zwischen 4,87 × 10^–4 M und 5,9 × 10^–3 M.

Die erhaltenen experimentellen Daten sind in den 1, 2 und 3 graphisch in der Form von Dixon-Diagrammen (beispielsweise beschrieben in: "Quantitative Problems in Biochemistry", E. A. Dawes, 5. Ausgabe, 1972, Baltimore, The Williams and Wilkins Company) dargestellt. Solch eine graphische Wiedergabe erlaubt die Berechnung der K_i-Werte (Inhibitionskonstante) erhalten für PBO auf Papain: 2,6 × 10^–3 M, auf Ficin: 4,5 × 10^–4 M und auf Bromelain: 1 × 10^–4 M, und zeigt daher an, dass der inhibitorische Effekt von PBO auf Bromelain höher ist. Die an nicht gesättigten Substratkonzentrationen erhaltenen Testergebnisse zeigen an, dass unter diesen Bedingungen PBO alle untersuchten Proteasen inhibiert. Insbesondere ist es möglich, aus den in den 1 bis 3 wiedergegebenen Dixon-Darstellungen den IC₅₀ von PBO zu evaluieren, welcher auf das Papainsystem gleich 2 × 10^–3 M ist, auf das Enzym Ficin gleich 0,8 × 10^–3 M ist und auf das Enzym Bromelain gleich 0,4 × 10^–3 M ist.
Beispiel 2. Inhibition von Bromelain durch PBO.
Die Untersuchung wurde wie von Heinrikson & Kezdy, 1976 in Methods in Enzymol. 45, S. 740 beschrieben durchgeführt. Die Bedingungen waren wie hier kurz zusammengefasst: 50 μg Bromelain wurden mit unterschiedlichen Mengen Na CBZ-L-Lysin-p-nitrophenylestersubstrat in 3 ml 10 mM Acetatpuffer mit pH 4,6 enthaltend KCl (0,1 M) und L-Cystein (1 mM) vermischt. Die Veränderungen in den anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeiten wurden in zwei verschiedenen Experimenten durch die Änderungen der Absorption bei 340 nm/Min. in der Gegenwart von einer 1 %-Lösung von PBO in H₂O gemessen.
Die Ergebnisse sind wie in der Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1. Der Effekt von 1 % PBO auf die Aktivität von Bromelain.
Die Daten zeigen, dass 1 % PBO eine inhibitorischen Effekt auf Bromelain aufweist, welcher für Substratkonzentrationen von 20 bis 24 μM sowie von 48 bis 50 μM zwischen 64 und 80 % variabel ist.
Das Experiment wurde unter Einsatz ansteigender Konzentrationen an PBO und einer festen Substratkonzentration (240 μM) wiederholt. Die Daten sind in der Tabelle 2 wiedergegeben. Tabelle 2. Effekt ansteigender Mengen von PBO auf die Aktivität des Enzyms Bromelain
Aus den Daten in der Tabelle 2 kann beobachtet werden, dass PBO bei Konzentrationswerten von höher als 0,5 % eine inhibitorische Aktivität auf das proteolytische Enzym Bromelain aufweist.
Dieser Effekt ist konzentrationsabhängig. Das Ausmaß der Inhibition ist im Einklang mit dem in den vorherigen Beispielen erhaltenen Daten.
Beispiel 3. Effekt von PBO auf Carboxypeptidase und Endopeptidase in Wollkeimlingen.
Mit dem Ziel, den Effekt von PBO auf das endogene enzymatische Pflanzensystem zu evaluieren, wurden in vitro Untersuchungen unter Einsatz von, aus behandelten (PBO) und unbehandelten eingefrorenen trockenen Samenkeimen erhaltenen, Acetonpulvern ohne die Zugabe von jeglichem spezifischen exogenen Substrates durchgeführt. Die Grundidee war, die physiologische, enzymatische Proteinhydrolyseaktivität "einzufrieren" und das Verfahren gemäß dem von Hile et al. 1972 und von Funkhouser et al. 1980 beschriebenen Verfahren einfach durch Solubilisieren des proteolytischen enzymatischen Systems in geeigneten Puffern, welche 0,1 M Phosphat mit pH 6,5 und 0,1 M Tris-HCl mit pH 7,7 waren, zum Evaluieren sowohl der Carboxypeptidase- als auch der Endopeptidase-Aktivitäten wiederherzustellen.
Materialien und Methoden
Wollsamen (cv. Carmela) wurden von "Semillas Baffle" in Barcelona (E) erhalten.
Keimungsbedingungen
Die Samen wurden zuvor in Leitungswasser abgespült und dann unter Belüftung in destilliertem Wasser über Nacht getränkt (Funkhouser, E.A. et al., Z. Pflanzenphysiol., 1980, 100, 319-324).
Nach diesem Verfahren wurden die Samen in sedimentierten und sterilen Sand eingepflanzt und dann mit destilliertem Wasser (unbehandelte Samen) und mit demselben Volumen einer Mikrosuspension von gesättigtem PBO (1 % w/v) (behandelte Samen) gewaschen. Die die Samen enthaltenden Kunststoffbehälter wurden, wie von Hile, J. N. und Dure, L.S. in J. Biol. Chem., 1972, 247: 5034-5040 beschrieben, mit einem Kunststofffilm bedeckt und für 4 Tage bei 30°C im Dunklen in einer Keimungsvorrichtung platziert.
Gefriertrocknen
Die Wollkeime wurden nach 4 Tagen gesammelt und in flüssigem Stickstoff eingefroren und gefriergetrocknet (Hile et al. 1972). Nach diesem Verfahren wurde das Material in einem Stampfer zermahlen und von faserförmigem Material befreit und sedimentiert, um ein feines, homogenes Mehl von ungefähr 0,5 Mesh zu erhalten.
Herstellung von Acetonpulvern
Die Mehle wurden unter Einsatz von n-Hexan (1:10 w/v) bei Raumtemperatur entfettet und dann mit Aceton bei –20°C behandelt, um Pigmente und Polyphenolverbindungen, in diesem Fall hauptsächlich Gossypol, zu entfernen. Die erhaltenen Pulver wurden bei Raumtemperatur in einem trockenen Behälter gelagert.
Carboxypeptidaseuntersuchung
Das Acetonpulver (30 mg) wurde in Puffer (4 ml) suspendiert und bei 37°C für 30, 60, 90, 120 Minuten inkubiert. Die Proteolyse wurde durch Zugabe von 1 ml 12 % Trichloressigsäure beendet. In diesem Fall wurde als Puffer 0,1 M Phosphat mit pH 6,5 eingesetzt (Hile et al. 1972). Die Kontrolle war eine Suspension derselben, in derselben Weise hergestellten Probe, aber in diesem Fall wurde diese sofort durch Zugabe von 1 ml Trichloressigsäure inaktiviert. Die Versuche mit behandelten und unbehandelten Proben wurden zur gleichen Zeit durchgeführt.
Photometrische Analyse
Die Proteine wurden mit Trichloressigsäure präzipitiert und dann durch Filtration zunächst mit Whatman-Papier Nr. 4 und dann durch Mikrofiltration (Orange Scientific Braine l'Alleud, Belgien (∅ 0,2 μm)) entfernt. Schließlich wurden die hydrolysierten Proteinproben als klare Lösungen durch Bestimmen der Absorption bei 280 nm in einer Quartzküvette analysiert.
Jede Analysenreihe wurde zweimal durchgeführt. Der Vergleich zwischen den Werten der Carboxypeptidaseaktivität der behandelten und der unbehandelten Proben wurde unter Verwendung des Durchschnittswerts jeder Analysenreihe durchgeführt.
Aus den in der 4 gezeigten Daten kann gefolgert werden, dass die auf die Carboxypeptidase bezogene proteolytische Aktivität in den behandelten Proben geringer als in den unbehandelten Proben ist.
In der Tabelle 3 ist der Prozentsatz dieser Unterschiede ebenfalls wiedergegeben. Tabelle 3 – Carboxypeptidaseaktivität von behandelten und unbehandelten Wollkeimen nach dem 4. Tag der Keimung
Endopeptidaseuntersuchung
Das Acetonpulver (30 mg) wurde in Puffer (4 ml) suspendiert und bei 37°C für 15, 30, 60, 90, 120 Minuten inkubiert. Die Proteolyse wurde durch Zugabe von 1 ml 12 % Trichloressigsäure beendet. In diesem Fall war der eingesetzte Puffer 0,1 M Phosphat mit pH 7,7 (Funkhouser et al., 1980). Die Kontrolle war eine Suspension der selben, in derselben Weise hergestellten Probe, wurde aber sofort durch Zugabe von 1 ml Trichloressigsäure deaktiviert. Die Versuche mit den behandelten und den unbehandelten Proben wurden zu derselben Zeit ausgeführt.
Photometrische Analyse
Die Proteine wurden mit Trichloressigsäure präzipitiert und dann durch Filtration zunächst mit Whatman-Papier Nr. 4 und dann durch Mikrofiltration (Orange Scientific Braine d'Alleud, Belgien (∅ 0,2 μm)) entfernt. Schließlich wurden die hydrolysierten Proteinproben als klare Lösungen durch Bestimmen der Absorption bei 280 nm in einer Quartzküvette analysiert.
Jede Analysenreihe wurde dreifach durchgeführt. Der Vergleich zwischen den Werten der Endopeptidaseaktivität der behandelten und unbehandelten Proben wurde unter Verwendung der Durchschnittswerte für jede Analysenreihe durchgeführt. Wie aus der 5 gesehen werden kann ist auch die Endopeptidaseaktivität in PBO behandelten Wollkeimen geringer als die in unbehandelten Proben. In der Tabelle 4 sind die Prozentzahlen dieser Unterschiede ebenfalls wiedergegeben.
Beispiel 4. Effekt von PBO auf den Bt-Toxingehalt in transgenen Wollpflanzenproben.
Mit dem Ziel, die Korrelation zwischen den Bt-Toxingehalten und dem Effekt der PBO Behandlung bei Wollpflanzen aufzufinden, wurde die Bt-Toxinkonzentration in mit PBO behandelten oder unbehandelten (die Kontrolle) Bt transgenen Wollpflanzenproben (cv. SicalaV2i) gemessen.
Die Untersuchung wurde an in unterschiedlichen Pflanzenentwicklungsstadien gesammelten Proben durchgeführt, welche waren: 4, 35, 60, 80 Tage nach dem Säen.
Materialien und Methoden.
Um die Bt-Toxinkonzentration in PBO behandelten oder unbehandelten Wollproben zu bestimmen, wurde eine spezifische ELISA Untersuchung durchgeführt. Das ELISA Cry1Ab/Cry1Ac Plate Kit wurde von Envirologix (Portland, Maine – USA) erhalten. Die Untersuchung wurde gemäß dem Envirologix-Protokoll mit den nachfolgenden Änderungen durchgeführt:

1. Das aus Blatt- oder Kotyledon-Geweben erhaltene, gefriergetrocknete Wollpulver wurde anstelle von frischem und vollständigem Blattgewebe eingesetzt.
2. Die Bt-Toxinextraktion aus dem gefriergetrockneten Wollpulver wurde mit einem Proben/Puffer-Verhältnis von 1:25 (w/v) durchgeführt.
3. Die Extraktion wurde durchgeführt, indem die Probe für wenigstens 4 Stunden bei Raumtemperatur in dem Puffer belassen wurde, anstelle von dem Einsatz des Envirologix wegwerfbaren Gewebeextraktionsgerätes. Der Extrakt wurde dann durch Zentrifugation bei 5.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur geklärt.

Die 6a zeigt die Bt-Konzentrationen in PBO behandelten oder unbehandelten Wollpflanzenproben bei den zuvor genannten Pflanzenentwicklungsstadien. In der 6 und in der Tabelle 5 ist ebenfalls gezeigt, dass in den PBO behandelten Proben nach 35, 60, 85 Tagen nach dem Einpflanzen ein signifikant geringerer Bt-Gehalt vorliegt, wohingegen nach 4 Tagen kein Unterschied gefunden wurde. Die 6b zeigt den Unterschied zwischen PBO behandelten und unbehandelten Wollpflanzenproben in Prozentzahlen.
In der Tabelle 5 sind die mit der beschriebenen Untersuchung erhaltenen Ergebnisse zusammengefasst. Tabelle 5. Bt-Gehalt und Unterschiede zwischen PBO behandelten und unbehandelten Proben in transgener Wolle

Δ: Unterschied in den Werten behandelt minus Kontrolle (cv V2i unbehandelt)

Beispiel 5: Effekt der PBO Behandlung auf die Protease (Endoprotease)-Aktivität in Wollpflanzen bei unterschiedlichen Wachstumsstadien.
Mit dem Ziel, die Wirkung von PBO auf die proteolytische Aktivität in Wollpflanzen zu evaluieren, wurde die enzymatische Aktivität auf Proben von mit PBO behandelten und unbehandelten (als Kontrolle) Wollblättern getestet. Die Proben wurden in unterschiedlichen Entwicklungsstadien der Pflanzen gesammelt, welche waren: 4, 35, 60 und 85 Tage nach dem Säen.
Diese Proben wurden durch Bestimmen des Bt-Gehaltes (wie in dem Beispiel 4 beschrieben) analysiert. Zu diesem Zweck wurde die enzymatische Aktivität auf rohe, gefriergetrocknete Blätterextrakte mit zwei unterschiedlichen Untersuchungen getestet: der radialen Diffusionsuntersuchung (RDA, Radial Diffusion Assay), bei der ein Protein, wie beispielsweise Rindergelatine, als Substrat eingesetzt wurde, um die Endopeptidaseaktivität zu testen, sowie eine in dem nächsten Beispiel beschriebene photometrische Untersuchung, bei der DL-BAPA als Substrat eingesetzt wurde, um eine allgemeine Peptidaseaktivität zu bestimmen.
Materialien und Methoden
Pflanzenkultur
Wollsamen von cv. Sicala V2i wurden zuvor in destilliertem Wasser gespült und dann in einer gleichen Anzahl geeigneter, sedimen tierten und sterilen Sand enthaltender Plastikbehälter platziert. Die Samen wurden mit gleichen Volumina destilliertem Wasser gewässert und die Kulturbehälter wurden dann mit einem Kunststofffilm bedeckt, um ein Verdampfen während der Keimung zu verhindern, welche für 4 Tage bei 30°C im Dunklen ausgeführt wurde. Die zu analysierenden Samen wurden nach 4 Tagen der Keimung mit destilliertem Wasser oder mit einem gleichen Volumen einer mit PBO (2 % w/v) gesättigten Mikrosuspension gewässert. Nach 4 Tagen wurden diese Keime zum Testen gesammelt, wohingegen die anderen Keime in geeignete Gefäße umgesetzt und in einem Gewächshaus während des Tages bei 24°C und während der Nacht bei 20°C inkubiert wurden.
Behandlungen
Zu festen Zeiten von 4, 35, 60, 85 Tagen nach dem Aussäen wurden 10 bezüglich deren Höhe ziemlich homogene Pflanzen mit einer kommerziellen PBO Formulierung (Endura) mit 2 % (w/v) behandelt. Die Behandlungen wurden durch Verdampfen der verdünnten Formulierung auf den Pflanzen verteilt, wobei dabei darauf geachtet wurde, dass beide Blätterseiten behandelt wurden.
Gefriertrocknen
Zwei Tage nach jeder Behandlung wurden eine Probe der behandelten Pflanzen und die entsprechenden Kontrollen gesammelt und alle Blätter wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und gefriergetrocknet. Nach diesem Verfahren wurde das Material in einem Stampfer zerpulvert und dann bei Raumtemperatur in einem trockenen Behälter gelagert.
Extraktpräparation
Eine Pulverteilmenge der behandelten und Kontrollproben, welche jede Stufe des Pflanzenwachstums wiedergibt, wurden jeweils in zwei Stufen extrahiert. Die Pulverprobe wurde mit 0,1 M Tris-HCl, pH 7,7 (1:20 w/v) Puffer unter Einsatz eines Ultrarrax-Vermischers bei 24.000 × UpM für 2 Minuten in einem Eisbad, um Überhitzung zu vermeiden, extrahiert. Der Extrakt wurde dann durch Zentrifugation bei 5000 × g bei 10°C für 20 Minuten geklärt. Der klare Überstand wurde gesammelt und mit Whatman-Papier Nr. 4 filtriert. Das Sediment wurde mit demselben Verfahren weiter extrahiert, mit der Ausnahme, dass in diesem Fall das Extraktionsverhältnis 1:10 (w/v) betrug. Schließlich wurden die Überstände der zwei Extraktionsverfahren vereinigt und dann 4- bis 5-fünfmal durch Zentrifugation bei 3000 × g für 2 Stunden bei 15°C unter Einsatz geeigneter Konzentratoren (Amicon Inc. Beverly, MA – USA) ausgestattet mit einer Membran mit einem 10 kD Ausschluss konzentriert.
Proteinkonzentration
Für jeden Extrakt wurde die Menge an löslichen Proteinen durch das Buiret-Verfahren bestimmt und die enzymatische Aktivität wurde dann als spezifische Aktivität, d.h. Einheiten/mg löslicher Proteine, ausgedrückt.
Die RDA wurde wie von Santarius, K. und Ryan, C. in Anal. Biochem., 1977, 77: 1-9 beschrieben in, in Agargel dispergierte Rindergelatine als Substrat enthaltenden Petri-Schalen durchgeführt. Jede Schale enthielt 5 Vertiefungen, von denen 4 mit geeigneten Teilmengen an konzentrierten Wollextrakten gefüllt waren, wohingegen eine mit Rinder-β-Trypsin als Standardlösung (0,2 U/ml) gefüllt war. Die Schalen wurden mit einem Kunststofffilm bedeckt und abgedichtet, um eine Verdampfung zu verhindern, und dann für 16 Stunden bei 37°C inkubiert.
Die enzymatische Aktivität in dem Protein-Agar-Gel führte aufgrund der Proteolyse der Rindergelatine gegenüber einem opaken Hintergrund zu einer radialen, klaren Diffusionszone um jede kreisrunde Vertiefung herum.
Die Trypsin Äquivalente wurden durch Messen der Radien der durch die Pflanzenextrakte produzierten klaren Zonen berechnet und mit einer durch eine serielle Verdünnung von Trypsin erhaltenen Standardkurve verglichen. Jede Schale enthielt eine Trypsin-Standardlösung, welche eingesetzt wurde, um für jede Platte eine Standardkurve aufzunehmen; folglich wurde die Endopeptidaseaktivität als Einheiten der Trypsinäquivalente ausgedrückt.
Jede Analyse wurde vierfach durchgeführt. Die 7 zeigt die Werte der mit RDA an behandelten und unbehandelten Wollproben erhaltenen Endopeptidaseaktivität. Dieses Experiment legt dar, dass die kommerzielle PBO-Formulierung (Endura), insbesondere bei 35, 60, 85 Tagen nach dem Aussäen, die Endopeptidaseaktivität in Wollblättern vom Sicala V2i-Genotyp inhibierte. In der Tabelle 6 sind die Unterschiede zwischen behandelten und unbehandelten Wollproben in Prozentzahlen gezeigt. Tabelle 6. Endopeptidaseaktivität von PBO behandelten und unbehandelten Proben durch die RDA Untersuchung.

U = Trypsin-Aquivalente

Die photometrische Untersuchung wurde wie von Erlanger, B.F. et al. in Arch. Biochem., 1961, 95: 271-278 beschrieben, durchgeführt. In der Untersuchung wurde die Variation der Absorption aufgrund der DL-BAPA Hydrolyse bei 410 nm gemessen. Die Untersuchung wurde durch Vermischen von 20 μl rohem Wollextrakt mit 980 μl DL-BAPA in 0,1 M Tris-HCl Puffer mit pH 8,2 direkt in einer Küvette durchgeführt. Eine Peptideseeinheit wurde definiert als die Menge an Enzym, welche eine Einheit einer Absorptionsvariation (410 nm) pro Minute bei pH von 8,2 und 30°C erzeugte.
Jede Analysenreihe wurde zweifach oder dreifach durchgeführt. Die 8 gibt die Werte der als U/mg an löslichem Protein berechneten Peptidaseaktivität in PBO behandelten und unbehandelten Wollproben wieder. In dieser Figur ist ein Maximum der Peptidaseaktivität rund 60 Tage nach der Entwicklung gezeigt. Zu dieser Zeit zeigt die Behandlung mit einer kommerziellen PBO Formulierung (Endura) eine signifikante maximale Inhibition der proteolytischen Aktivität von Sicala V2i Wolle. Durch diese Untersuchung werden Unterschiede in der proteolyti schen Aktivität in PBO behandelten gegenüber unbehandelten Wollpflanzen über den gesamten Pflanzenwachstumszyklus beobachtet. Eine signifikante statistische Inhibition wird während des größten Teils des Pflanzenwachstumszyklus beobachtet. Schließlich sind in der Tabelle 7 die spezifischen Aktivitäten der Peptidase von behandelten und unbehandelten Sicala V2i Wollproben gezeigt.
In dieser Tabelle werden die Aktivitätsunterschiede zwischen den behandelten und unbehandelten Proben ebenfalls in Prozentzahlen wiedergegeben.
Tabelle 7. Peptidaseaktivität (U/mg an löslichem Protein) von PBO behandelten und unbehandelten Proben bei der photometrischen Untersuchung mit DL-BAPA als Substrat.

Claims

Verwendung eines Benzodioxolderivats gemäß Formel I
worin R₁, R₂ sowie R₃ entweder gleich oder verschieden und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff; C₂-C₈-Alkyl; CH₂OR₄ mit R₄ ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, -(CH₂CH₂O)_n-R₅, worin n eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 und R₅ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, C₁-C₈-Alkyl, Aryl entweder unsubstituiert oder substituiert mit C₁-C₄-Alkyl, mit Halogen, mit einer Cyano (CN)-Gruppe, mit einer -SO₃H-Gruppe, mit einer -COOR₆-Carboxyalkylgruppe, worin R₆ Wasserstoff oder C₁-C₈-Alkyl ist, mit einer -N(R₇)-R₈-Gruppe, worin R₇ sowie R₈ gleich oder verschieden Wasserstoff oder C₁-C₄-Alkyl oder zusammen mit einem Stickstoffatom, an welchem diese gebunden sind, eine Piperidinyl-, Pyrrolidinyl-, Morpholinylgruppe wiedergeben können; R₅ zusätzlich ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C₇-C₉-Aralkyl entweder unsubstituiert oder substituiert mit einem aromatischen Ring durch Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: C₁-C₄-Alkyl, Halogen, durch eine Cyanogruppe, durch eine -SO₃H-Gruppe, durch eine -COOR₉-Carboxyalkylgruppe, worin R₉ dieselbe Bedeutung wie R₆ aufweist und worin, wenn R₁, R₂ sowie R₃ alle dieselben sind, diese nicht Wasserstoff sein können, zur Modulation der Aktivität oder des Gehaltes an proteolytischen Enzymen in Pflanzen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei R₁, R₂ sowie R₃ entweder gleich oder verschieden und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, C₂-C₄-Alkyl, CH₂OR₄, worin R₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, -(CH₂CH₂O)_n-R₅, worin n eine ganze Zahl zwischen 1 und 2 und R₅ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl, Benzyl, Aryl unsubstituiert oder substituiert mit C₁-C₃-Alkyl.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei R₁, R₂ entweder gleich oder verschieden und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, Propyl, CH₂OR₄, worin R₄ -(CH₂CH₂O)₂-R₅ ist sowie R₅ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: C₂-C₄-Alkyl, Phenyl, Tolyl.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Verbindung die folgende Formel II aufweist:
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Enzyme ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Carboxypeptidasen, Aminopeptidasen, Dipeptidasen, Endopeptidasen.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Endopeptidasen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Serin-Proteasen, Cystein-Proteasen, Kathepsinen, Metallo-Endopeptidasen.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Cystein-Proteasen sind: Bromelain, Calpain, Ficin, Papain, Chymopapain.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Pflanzen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Soja, Mais und Wolle.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Pflanzen transgen sind.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Transgen für ein Cry-Protein von Bacillus thuringiensis kodiert.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Cry-Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Cry I, Cry II, Cry III, Cry IV.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Protein ein CryIA-Protein des Subtyps (a), (b) oder (c) ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Modulation eine negative Modulation ist.
Verwendung eines Benzodioxolderivates nach einem der Ansprüche 1 bis 13 in Kombination mit geeigneten Emulgatoren sowie optional Photoschutz-Verbindungen als Modulatoren der Aktivität oder des Gehaltes an proteolytischen Enzymen in Pflanzen.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Emulgatoren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Calciumsalzen von Alkylarylsulfonsäuren, Polyglykolestern von Fettsäuren, Alkylarylpolyglykolethern, Polyglykolethern von Fettalkoholen, Kondensationsprodukten von Ethylenoxid-Propylenoxid, Alkylpolyethern, Estern von Sorbitanfettsäure, Estern von Polyoxyethylensorbitanfettsäure, Sorbitanestern von Polyoxyethylen.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Emulgatoren ausgewählt sind aus: Alkylarylpolyglykolethern sowie Calciumsalzen von Alkylarylsulfonsäuren.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Photoschutz-Verbindungen ausgewählt sind aus der Klasse der Verbindungen bestehend aus: Benzotriazolen, Benzophenonen sowie sterisch gehinderten Aminen.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Benzophenone ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon sowie 2-Hydroxy-4-octyloxybenzophenon, und die sterisch gehinderten Amine ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperinidyl)sebacat sowie Di(1,2,2,6,6-pentamethyl-4-piperidinyl)sebacat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 umfassend die Behandlung der Pflanzen mit den Benzodioxolderivaten der Formel II: bei einer Konzentration umfassend 50 bis 800 g/Hektar.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Konzentration 100 bis 400 g/Hektar, besonders bevorzugt 200 bis 350 g/Hektar beträgt.
Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung bis zu dreimal pro Vegetationszyklus wiederholt wird.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei wenigstens eine Behandlung am Ende des Vegetationszyklus ausgeführt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei die Behandlung durch Zerstäuben ausgeführt wird.
Verfahren durch Anspruch 23, wobei die Behandlung auf den luftexponierten Flächen der Pflanze ausgeführt wird.