DE60226126T2

DE60226126T2 - Verwendung von gamma-gt inhibitoren zur behandlung von chronischen degenerativerkrankungen

Info

Publication number: DE60226126T2
Application number: DE60226126T
Authority: DE
Inventors: Hans Weiher; Helmut Sies; Günter Wagner
Original assignee: GTX Pharmaceuticals GmbH
Current assignee: GTX Pharmaceuticals GmbH
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2002-02-20
Publication date: 2009-05-07
Anticipated expiration: 2022-02-21
Also published as: EP1361885B1; DE60226126D1; EP1361885A1; ATE392213T1; WO2002066047A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von γ-GT-Inhibitoren zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von degenerativen Erkrankungen. Sie bezieht sich speziell auf die Behandlung von chronischen Nieren- oder Innenohr-Zuständen oder -Schädigungen, die durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) hervorgerufen werden.
Degenerative Erkrankungen werden als Erkrankungen betrachtet, die mit chronischen Funktionsstörungen und/oder chronischen physiologischen Schäden im menschlichen oder tierischen Körper verbunden sind. Außer degenerativen Erkrankungen unter anderem des zentralen Nervensystems können chronische Funktionsstörungen der Niere oder der Leber zu einer Degeneration der entsprechenden Gewebe führen. So stellen zum Beispiel, Nierenkrankheiten oder degenerative Erkrankungen des Innenohrs häufige pathologische Zustände dar, für die kaum eine Behandlung verfügbar ist.
Insbesondere Glomerulosklerose und andere Nierenkrankheiten stellen eine häufige Komplikation vieler chronischer Zustände dar, wozu Diabetes gehört (Ha und Kim, Diabetes Res. Clin. Pract. 45: 147–151 (1999)). Man nimmt an, dass dabei ein Überschuss an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) eine entscheidende Rolle spielt (Haugen und Nath, Blood Purif. 17: 58–65 (1999)). Man hat Tiermodelle entwickelt, um die daran beteiligten Pathomechanismen zu untersuchen. In einem genetischen Maus-Modell für otorenale Krankheit (Meyer zum Gottesberge, European Archive Otorhinolaryngology 253: 470–474 (1996); Weiher, Cell 62: 425–434 (1990)) ist es gezeigt worden, dass eine Interventionstherapie mit Radikalfängern wirksam ist (Binder, Am. J. Pathol. 154: 1067–1075 (1999)). Allerdings wäre eine Therapie mit Antioxidantien am Menschen ziemlich schwierig mit der gewünschten Spezifität durchzuführen, wenn man zum Beispiel die jeweils zu beseitigende Sauerstoffspezies ebenso wie den Wirkort berücksichtigt. Daher wäre es vorteilhaft, die Enzymaktivität, die die jeweilige ROS erzeugt, die für die Gewebeschäden verantwortlich ist, spezifisch zu inhibieren.
Sofern im Stand der Technik eine Rolle für ROS bei der Glomerulosklerose vorgeschlagen worden ist, war nichts über die genaue Quelle der schädigenden Einheiten in dieser Krankheit bekannt. Kürzlich sind Reaktionsbedingungen in vitro definiert worden, in denen ROS infolge der Aktivität des Enzyms γ-GT gebildet werden (Drozdz et al., 1998).
Obwohl man im Stand der Technik eine wichtige Rolle von ROS bei dem pathologischen Mechanismus der Glomerulosklerose erkannt hat, war es nicht bekannt, welcher der vielen möglichen Mechanismen um diese Sauerstoffspezies zu erzeugen verantwortlich ist.
Daher war es das technische Problem der vorliegenden Erfindung Mittel und Verfahren bereitzustellen, die für die Behandlung und/oder Linderung von degenerativen chronischen Krankheiten verwendet werden können. Die Lösung für dieses technische Problem wird dadurch erreicht, indem man die in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen bereitstellt.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von γ-GT-Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer chronischen degenerativen Krankheit, wobei es sich bei der chronischen degenerativen Krankheit um eine chronische Nierenkrankheit oder um einen chronischen degenerativen Zustand oder eine Schädigung des Innenohrs handelt.
In dieser Erfindung hat man überraschenderweise festgestellt, dass eine Überexpression des Enzyms γ-GT eine Quelle von schädigenden ROS in der Niere und anderen Zellen darstellt, besonders von Zellen des Innenohrs. Demnach sollte die Hemmung von γ-GT (systemisch oder lokal) zu Mitteln und Verfahren zur erfolg reichen und wirksamen Verhinderung des Fortschreitens der chronischen Zellschädigung führen, die durch erhöhte ROS-Spiegel in der Niere und im Innenohr bedingt sind.
Drozdz (Free Radical Biology and Medicine 25: 786–792 (1998)) hat auf der Grundlage eines in vitro-Experiments spekuliert, dass γ-GT an der Bildung von ROS beteiligt sein könnte. Bei diesen Untersuchungen wurde jedoch die Bildung von ROS in vitro dadurch ausgelöst, dass man ein Gluthation/Transferrin-System auf gezüchtete V79-Zellen angewandt hatte. Diese Autoren zeigten eine ziemlich schnelle Bildung von ROS durch γ-GT, wenn Gluthation und Transferrin vorhanden waren. Diese in vitro-Bildung von ROS erreichte eine Maximalgeschwindigkeit in den ersten sechs Minuten. Anhand dieser veröffentlichten Daten konnten jedoch keine Schlussfolgerungen auf länger anhaltende und/oder konstante Schädigung in einer in vivo-Situation gezogen werden.
Darüber hinaus befasste man sich in dieser Veröffentlichung nicht mit der Frage, ob dieser Mechanismus irgendeine Relevanz auf der Ebene des Organismus in vivo hatte. Es gab keine Schlussfolgerungen hinsichtlich einer Rolle dieses Mechanismus bei der dauerhaften Schädigung durch ROS, die zu chronischen Gewebeläsionen führt.
Dennoch konnte es in dieser Erfindung überraschenderweise gezeigt werden (siehe beigefügte Beispiele), dass man in vivo einen Überschuss an γ-GT-Aktivität und erhöhte extrazelluläre ROS finden kann. Außerdem konnte man in dieser Erfindung und im Gegensatz zu Drozdz et al., (a. a. O., 1998), zeigen, dass in einem Modell für chronische Krankheit die erhöhten extrazellulären ROS, die als kausal für die Krankheit identifiziert wurden, von einem Überschuss an γ-GT-Aktivität begleitet waren. Darüber hinaus stellte man fest, dass das in der Membran lokalisierte γ-GT-Enzym, für das allgemein als eine vor Sauerstoff schützende Aktivität beschrieben wird (durch Erhöhen der intrazellulären Spiegel von Cys-Gly und dadurch Ermöglichen einer intrazellulären Anreicherung von Gluthation), in Wirklichkeit extrazelluläre Konzentrationen von Cys-Gly erzeugt, die an der Bildung von ROS beteiligt sind, und dass ein Überschuss an γ-GT-Aktivität erhöhte extrazelluläre ROS in in vivo-Situationen zur Folge hat. Man kann daher schlussfolgern, dass das in der Membran lokalisierte γ-GT durch ROS vermittelte chronische Schäden verursacht.
Aus diesem Grund sieht die vorliegende Erfindung die vorstehend erwähnte Verwendung von γ-GT Inhibitoren bei degenerativen chronischen Erkrankungen vor γ-GT-Inhibitoren und deren medizinische Verwendung sind auf dem Fachgebiet bekannt. Unter anderem beschreibt US 4,758,551 die Verwendung solcher Inhibitoren von γ-GT beim Schutz von Nieren vor Vergiftungen mit Metallen oder Toxinen. Es wurde jedoch in US 4,758,551 spekuliert, dass die γ-GT-Aktivität die Aufnahme und den Metabolismus dieser toxischen Substanzen ermöglicht. Eine Verbindung zu degenerativen chronischen Erkrankungen wurde weder gezeigt noch wurde darüber spekuliert.
Townsend (2000) Proceedings of the American Association for Cancer Research 41, Seite 266 lehrt, dass eine Vorbehandlung mit γ-GT-Inhibitoren oder mit einem Inhibitor der β-Lyase Mäuse vor durch Cisplatin induzierter Nephrotoxizität schützt. Auch Hanigan (1996) Am. J. Obstet. and Gynecol. 275: 270–275 und Hanigan (1998) Am. J. Obstet. and Gynecol. 179: 363–367 beziehen sich auf die Vorbehandlung von Mäusen mit γ-GT-Inhibitoren, um akute Nephrotoxizität zu verhindern (Hanigan (1996)), oder auf die Korrelation zwischen hohen Spiegeln von γ-GT im Tumor und akuter Ototoxizität in mit Cisplatin behandelten Patienten (Hanigan (1998)). Evans (1999) Anal. of New York Academy of Sciences 884, Seiten 19–40 beschreibt die schädigende Wirkung der Verabreichung des Antibiotikums Aminoglycosid und von Cisplatin und lehrt, dass diese Substanzen zu einer Ototoxizität führen. Lopez-Gonzalez (2000) J. Pineal Research 28: 73–80 verabreichten α-Tocopherol Acid Succinate, Acsorbinsäure, Gluthation und N-Acetylcystein an Ratten, die an einer akuten, mit der Verabreichung von Cisplatin in Zusammenhang stehenden Ototoxizität litten. Isao (1996) Database Biosys (online) lehrt, dass eine Aminoglycosid-Ototoxizität durch die Verabreichung von Gluthation gelindert werden kann. Das Gluthation wurde vor der Verabreichung von Amikacin verabreicht. Diese Vorbehandlung verringerte die Schäden an äußeren Haarzellen. Kil (1996) Society of Neuroscience, Band 22, S. 1621 (Abstract) vergleicht die Wirkung von Aminoglycosiden und von Cisplatin bei der Ototoxizität und Nephrotoxizität. Es wird gelehrt, dass die Spiegel von γ-GT durch Acivicin gehemmt werden können und dass diese Hemmung die Zerstörung von proximalen Tubuluszellen der Niere verhindert, die durch die Vergiftung mit Cisplatin induziert wird.
Degenerative Erkrankungen gemäß der Erfindung sind chronische Nierenkrankheiten oder degenerative Erkrankungen oder Schädigungen des Innenohrs, wobei diese Krankheiten chronische Funktionsstörungen darstellen und/oder durch ROS induziert sind.
Besonders bevorzugte Beispiele chronischer Nierenkrankheiten sind fokale und/oder segmentale Glomerulosklerose, Minimal-Change-Nephrose, entzündliche und/oder Autoimmun-Glomerulopathien. Dennoch ist es auch vorgesehen, dass es sich bei der chronischen Nierenkrankheit um diabetische Nephropathie handelt.
Im Kontext der Erfindung sind besonders bevorzugte Beispiele von Schädigungen des Innenohrs durch Alter, physiologischen Zustand und/oder metabolischen Zustand bedingte sensorineurale Schwerhörigkeit. Ein bevorzugtes Beispiel für einen chronischen degenerativen Zustand des Innenohrs gemäß der Erfindung ist Otosklerose.
Besonders bevorzugte γ-GT-Inhibitoren im Kontext dieser Erfindung und die in der vorstehend beschriebenen Verwendung eingesetzt werden können, sind AT 125 (Acivicin) oder dessen Derivate. In einer bevorzugten Ausführungsform können Peptidinhibitoren des CysGlyX-Typs eingesetzt werden, wobei X entweder für jede beliebige der natürlich vorkommenden Aminosäuren stehen kann oder eine modifizierte Aminosäure gemäß der Erfindung eingesetzt werden kann. Ferner sind Peptidinhibitoren Inhibitoren vom γ-GluXY-Typ, wobei X und Y entweder für jede beliebige der natürlich vorkommenden Aminosäuren stehen können oder eine modifizierte Aminosäure gemäß der Erfindung eingesetzt werden kann. Des Weiteren können gemäß dieser Erfindung peptidomimetische Gluthation-Analoga (Burg, Bioorg Med Chem 10: 195–205 (2002)), Verbindungen oder Derivate des Typs L-2-Amino-4-borbuttersäure (ABBA) (London und Gabel, Arch. Biochem. Biophys. 385: 250–258 (2001)) und Anilide wie z. B. γ-Glutamyl-7-amido-4-methylcoumarin (γ-Glu-AMC) (Stein, Biochemistry 40: 5804–5811 (2001)) eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können über jeden geeigneten Verabreichungsweg verabreicht werden, wie z. B. oral, buccal, sublingual, parenteral, topisch oder mittels Inhalation und können nach Verfahren formuliert werden, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Behandlung, zur Prävention und/oder Linderung einer degenerativen Erkrankung bereit, insbesondere von chronischen Nierenkrankheiten oder degenerativen Zuständen des Innenohrs oder Schädigungen des Innenohrs, umfassend den Schritt des Verabreichens eines wie hierin definierten Arzneimittels an einen Patienten, der es benötigt. Bevorzugt handelt es sich bei dem Patienten um einen menschlichen Patienten.
Üblicherweise mischt man eine wirksame Menge der wirksamen Verbindung einem pharmazeutisch verträglichen Träger bei, wobei gegebenenfalls weitere Excipienten verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind, sofern dies zweckdienlich ist.
Es wird einem Fachmann ersichtlich sein, dass der Verabreichungsweg und die tägliche Dosis von individuellen Parametern wie z. B. dem Schweregrad des zu behandelnden Zustands/der zu behandelnden Krankheit, gleichzeitig auftretenden Krankheiten und begleitender Medikation, Alter und Körpergewicht des Patienten abhängen.
Die Figuren zeigen:
1: ESR-Spektren von in Fibroblasten erzeugten DMPO-OH-Addukten.
A, B: Man ließ Mpv17–/–(LUSVX)-Zellen für 60 Min. mit DMPO reagieren. B: Reaktion wie in A in Gegenwart von 30 Einheiten/ml SOD. C: Wie in A behandelte, Mpv17 exprimierende (NIX15) Zellen. D: Referenzspektrum des DMPO-OH-Addukts, das durch Reaktion von DPMO mit H₂O₂ unter UV-Bestrahlung erzeugt wurde. Repräsentative Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten.
2: mRNA-Spiegel von Fibroblasten in Kultur.
A: Verhältnis der mRNA-Spiegel in Mpv17–/– gegenüber Mpv17 expri mierenden Zellen. B: Acivicin-abhängiges Verhältnis der mRNA-Spiegel in Mpv17–/–-Zellen. β-Actin-mRNA wurde als Referenz verwendet. (Säulen stellen Mittelwerte ± SA dar, n = 3)
Die folgenden Beispiele, die nachstehend beschrieben sind, begründen die Nützlichkeit von γ-GT-Inhibitoren für die Behandlung von durch ROS induzierten chronischen Nierenkrankheiten und degenerativen Erkrankungen und Schädigungen des Innenohrs.
Beispiel 1: Bildung von ROS in Mpv17-Mäusen und dessen experimentelle Untersuchung
Der Mausstamm Mpv17 ist ein genetisch rezessives Nagermodell für Glomerulosklerose (H. Weiher, T. Noda, D. A. Gray, A. H. Sharpe und R. Jaenisch (1990), Cell 62, S. 425–434) und sensorineurale Schwerhörigkeit (A. M. Meyer zum Gottesberge, A. Reuter und H. Weiher (1996), European Archive Otorhinolaryngology 253, S. 470–474). Niere und Innenohr zeigen deutliche Veränderungen von Bestandteilen der glomerulären und cochleären Basalmembran und der Matrixmetalloproteinase 2 (MMP-2) in der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix (A. Reuter, A. Nest!, R. M. Zwacka, J. Tuckermann, R. Waldherr, E. M. Wagner, M. Hoyhtya, A. M. Meyer zum Gottesberge, P. Angel und H. Weiher (1998) Molecular Biology of the Cell 9, S. 1675–1682). Das Mpv17-Gen, das in mutierten Mäusen durch Insertion inaktiviert ist, codiert ein 20 kDa großes peroxisomales hydrophobes Protein mit einer bislang unbekannten Funktion (R. M. Zwacka, A. Reuter, E. Pfaff, J. Moll, K. Gorgas, M. Karasawa und H. Weiher (1994), EMBO J. 13, S. 5129–5134). Eine Rolle der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) bei der Pathogenese wurde kürzlich festgestellt, da Sauerstoffradikalfänger die Entwicklung und das Fortschreiten der Krankheit mildern (C. J. Binder, H. Weiher, M. Exner und D. Kerjaschki (1999), American Journal of Pathology 154, S. 1067–1075).
In den nachstehend beschriebenen Experimenten/Beispielen wurden in Mpv17–/–-Mäusen gebildete ROS mittels Elektronenspinresonanz (ESR) nachgewiesen. Des Weiteren untersuchte man die Aktivitäten und die Expression von Enzymen der antioxidativen Verteidigungslinie in Mpv17–/–-Nieren und -Zellen in Kultur. Die Ergebnisse lassen ein Ungleichgewicht der Aktivität und/oder der Genexpression einiger schützender Enzyme erkennen. In Übereinstimmung mit einer pro-oxidativen Wirkung von hochregulierter γ-Glutamyltranspeptidase, über die kürzlich bei einer Kurzzeit-Ischämie von Rattenniere berichtet wurde (Cutrin, Kidney international 57: 526–533 (2000)), wird ein neuer Weg von γ-Glutamyltranspeptidase (γ-GT) bei der Entwicklung von oxidativen Schäden vorgeschlagen. Wie in dem Mpv17-Tiermodell kann die Regulation der γ-Glutamyltranspeptidase bei der Untersuchung von menschlicher Nieren- und Innenohr-Krankheit wichtig sein.
Nieren aus Mäusen des genetischen Hintergrunds (CFW × BALG/c) und transgene homozygote Mpv17–/–-Mäuse (H. Weiher, T. Noda, D. A. Gray, A. H. Sharpe und R. Jaenisch (1990), Cell 62, S. 425–434) wurden in einem Alter von 7 bis 9 Monaten erhalten und in flüssigem Stickstoff eingefroren. LUSVX-Zellen (mit SV40 immortalisierte Fibroblasten aus den Lungen von Mpv–/–-Mäusen) und NIX15-Zellen (Mpv+/+-Zellen, die durch stabile Transfektion eines Expressionskonstrukts für die menschliche Mpv17-cDNA aus LUSVX-Zellen abgeleitet sind) (A. Reuter, A. Nestl, R. M. Zwacka, J. Tuckermann, R. Waldherr, E. M. Wagner, M. Hoyhtya, A. M. Meyer zum Gottesberge, P. Angel und H. Weiher (1998) Molecular Biology of the Cell 9, S. 1675–1682) ließ man bei 6,5% CO₂ in DMEM wachsen, das 10% fötales Kälberserum (FCS) und 1 μg/ml Puromycin beinhaltete (NIX15-Kulturen). Die Zellen wurden durch Trypsinbehandlung geerntet und jeweils 5 × 10⁶ Zellen wurden in 1,5 ml Phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, bevor man das Pellet in flüssigem Stickstoff einfror. Wo angegeben wurde 18 Std. vor dem Ernten der Zellen Mn(III)tetrakis(4-benzoesäure)porphyrin (MnTBAP) in einer Endkonzentration von 10 μM (Y. Noda, M. Kohno, A. Mori und L. Packer (1999), Methods in Enzymology 299, S. 28–34)(Calbiochem, Schwalbach, BRD) oder der γ-GT-Inhibitor Acivicin (AT-125) in einer Endkonzentration von 50 μM (Sigma, Deisenhofen, BRD) in DMEM/10% FCS zugegeben. Nieren und Zellen wurden in gefrorenem Zustand bei –80°C gelagert.
Elektronenspinresonanz(ESR)-Messungen wurden wie folgt ausgeführt: Die Produktion von Radikalen in Lungenfibroblasten aus Mpv17–/–-Tieren (LUSVX) wurde mittels ESR identifiziert und mit Mpv17 exprimierenden Fibroblasten (NIX15) verglichen. Für die ESR-Bestimmung von erzeugten ROS (K. M. Faulkner, S. I. Liochev und I. Fridovich (1994), Journal Biological Chemistry 269, S. 23471–23476) wurde 5,5-Dimethyl-1-pyrrolin-N-oxid (DMPO)(Sigma, Deisenhofen, BRD) als Spinfalle verwendet. Zu 1 ml Zellsuspension (1,5 × 10⁶ Zellen/ml in PBS) gab man DPMO (nach Filtrierung über Aktivkohle bei –20°C unter Stickstoff gehalten) in einer Endkonzentration von 6,5 mM hinzu. Nach 1 Std. bei 37°C (für die in der nachstehenden 1C dargestellten Proben in Gegenwart von 30 E/ml Superoxiddismutase) wurden die Proben in flüssigem Stickstoff gelagert. ESR wurde auf einem Bruker ESP300-Instrument durchgeführt. Die Einstellungen waren: Modulationsamplitude: 2 G; Verstärkung: 1,6 × 10⁶; Leistung: 40 mW, Sweep: 100 G/40 s = 2,5 G/s. Ein Referenzspektrum wurde durch Reaktion von DPMO mit H₂O₂ unter UV-Bestrahlung abgeleitet.
Enzym-Assays und Gluthation-Assays wurden wie folgt durchgeführt:
Zellfraktionen wurden durch Differentialzentrifugation aus 20% Gewebe- und Zellhomogenaten (Gew./Vol.) in 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0 hergestellt, der 0,25 M Saccharose, 150 mM Kaliumchlorid, 1 mM EDTA, 2 mM Dithiothreit und 50 μM Phenylmethylsulfonylfluorid enthielt. Enzymaktivitäten wurden bei 25°C bestimmt: Katalase in dem Pellet bei 25.000 × g (10 Min.) (H. E. Aebi (1983) in Methods in Enzymatic Analysis (Hrsg. H. U. Bergmeyer), Verlag Chemie, Weinheim, S. 273–276); Gluthationperoxidase (GPx)(R. A, Lawrence und R. F. Burk (1976), Biochemical Biophysical Research Communications 71, S. 952–958), GSSG-Reduktase (Goldberg, D. M. S. R. F. (1983) in Methods in Enzymatic Analysis (Hrsg. H. U. Bergmeyer), Verlag Chemie, Weinheim, S. 258–265), Gluthationtransferase (GST) mit 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol (CDNB) (W. H. Habig, M. J. Pabst und W. B. Jakoby (1974), Journal Biological Chemistry 249, S. 7130–7139) und Superoxiddismutase (SOD)(S. Marklund und G. Marklund (1974), European Journal of Biochemistry 47, S. 469–474) im Überstand bei 105.000 × g (45 Min.); γ-Glutamyltranspeptidase (γ-GT) (S. Marklund und G. Marklund (1974), European Journal of Biochemistry 47, S. 469–474) in dem resuspendierten Pellet bei 105.000 × g, das 1% Triton X-100 enthielt. Protein wurde mit dem Bradford-Verfahren gemessen, wobei Rinderserumalbumin als Standard verwendet wurde (M. M. Bradford (1976), Analytical Biochemistry 72, S. 248–254).
Gluthation-Äquivalente (GSH + 2GSSG) wurden nach der Bildung von 5-Thio-2-nitrobenzoat (TNB) spektrophotometrisch bei 405 nm im Cytosol von Nieren getestet (T. P. Akerboorn und H. Sies (1981), Methods in Enzymology 77, S. 373–382).
mRNA-Spiegel wurden ebenfalls gemessen. Insbesondere wurden mRNA-Spiegel mittels quantitativer RT-PCR bestimmt. Fünf μg Gesamt-RNA (F. M. Ausubel (1995), Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York) wurden in jeder cDNA-Synthesereaktion eingesetzt (Superscript II-Reverse Transkriptase-System, Gibco). Primer wurden aus veröffentlichten Sequenzen ausgewählt: Maus-γ-GT (Z. Z. Shi, G. M. Habib, R. M. Lebovitz und M. W. Lieberman (1995), Gene 167, S. 233–237), zelluläre Gluthationperoxidase der Maus (cGPx) (I. Chambers, J. Frampton, P. Goldfarb, N. Affara, W. McBain und P. R. Harrison (1986), EMBO Journal 5, S. 1221–1227), Plasmagluthationperoxidase der Maus (pGPx) (R. L. Maser, B. S. Magenheimer und J. P. Calvet (1994), Journal of Biological Chemistry 269, S. 27066–27073), Nicht-Selen-Gluthationperoxidase der Maus (nsGPx) (B. Munz, S. Frank, G. Hubner, E. Olsen und S. Werner (1997), Biochemical Journal 326, S. 579–585), Phospholipid-Hydroperoxid-Gluthationperoxidase der Maus (PHGPx) (S. Nam, M. Nakamuta, M. Kurohmaru und Y. Hayashi (1997), Gene 198, S. 245–249), Gluthationreduktase der Maus (glu red) (M. Tutic, X. A. Lu, R. H. Schirmer und D. Werner (1990), European Journal of Biochemistry 188, S. 523–528), Kupfer-Zink-Superoxiddismutase der Maus (CuZnSOD) (G. C. Bewley (1988), Nucleic Acids Research 16, S. 2728), Mangan-Superoxiddismutase der Maus (MnSOD) (R. A. Hallewell, G. T. Mullenbach, M. M. Stempien und G. I. Bell (1986), Nucleic Acids Research 14, S. 9539), extrazelluläre Superoxiddismutase der Maus (ecSOD) (J. G. Suh, S. Takai, T. Yamanishi, T. Kikuchi, R. J. Folz, K. Tanaka, Y. S. Oh und K. Wada (1997), Molecules and Cells 7, S. 204–207) und Xanthinoxidase der Maus (XO) (M. Terao, G. Cazzaniga, P. Ghezzi, M. Bianchi, F. Falciani, P. Perani und E. Garattini (1992), Biochemical Journal 283, S. 863–870). Die Reaktionen wurden standardisiert, indem man β-Actin der Ratte als Kontrolle verwendete (U. Nudel, R. Zakut, M. Shani, S. Neumann, Z. Levy und D. Paffe (1983), Nucleic Acids Research 11, S. 1759–1771). Für jedes Primerpaar wurde die Anzahl der Zyklen ermittelt, für die die Anreicherung der Reaktionsprodukte linear war.
Man führte die Reaktionen für 30 s bei der Anelierungs-Temperatur, 40 s bei 72°C zur Synthese und 30 s bei 95°C zur Denaturierung durch. Amplifizierte mRNA wurde auf 1,5% Agarosegelen in Tris-Borat-Puffer aufgetrennt (F. M. Ausubel (1995), Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York), mit Vista Green (Amersham, Freiburg, BRD) sichtbar gemacht und mit einem FLA2000 (mager (Fuji) quantifiziert.
Beispiel 2: Die Expression von Mpv17 vermindert die Produktion von Superoxid in Fibroblasten aus Mpv17–/–-Mäusen
In Gegenwart von Mpv17–/–-Zellen(LUSVX) gebildete Spin-Addukte zeigten ein Profil, wie in 1A dargestellt, was somit charakteristisch für ein Profil von DMPO-OH-Addukten ist (zu vergleichen mit 1D). Addukte fand man meistens im Überstand statt innerhalb der Zellen (nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass sie entweder in der Zelle gebildet und sezerniert wurden oder durch ROS erzeugt wurden, die in das Medium freigesetzt wurden. Wenn die Reaktion in Gegenwart von exogener Superoxiddismutase (SOD) durchgeführt wurde, nahm der DMPO-OH-Peak auf etwa ein Drittel ab (1B), was darauf hindeutet, dass ein Großteil der stabilen DMPO-OH-Addukte indirekt über ein OOH-Addukt erzeugt wurde, das durch die Reaktion mit Superoxid gebildet wurde. Bei Mpv17 exprimierenden NIX15-Zellen, die durch Transfektion von Mpv17–/–-Zellen(LUSVX) erzeugt wurden, war die Konzentration von DMPO-OH im Vergleich zu Mpv17–/–-Zellen(LUSVX) um etwa 35% vermindert (1C).
Beispiel 3: Veränderungen im Gluthation-Zyklus in Nieren von Mpv17–/–-Mäusen

Da in Kultur gehaltene LUSVX-Zellen (Mpv17–/–) erhöhte Spiegel von Superoxid produzieren und es gezeigt worden ist, dass oxidative Schäden ursächlich für die Entwicklung der Krankheit in Mpv17–/–-Mäusen ist (C. J. Binder, H. Weiher, M. Exner und D. Kerjaschki (1999), American Journal Pathology 154, S. 1067–1075), bestimmte man die für die Produktion von Superoxid relevanten Enzymaktivitäten in Nieren von Mpv17–/–-Mäusen, die im Alter von 7–9 Monaten eine fortgeschrittene Glomerulosklerose zeigten (C. J. Binder, H. Weiher, M. Exner und D. Kerjaschki (1999), American Journal Pathology 154, S. 1067–1075) (Tabelle 1). Im Vergleich zu den entsprechenden Mpv17+/+-Nieren wurde kein signifikanter Unterschied in den Gluthation-Spiegeln und in den Aktivitäten von Superoxiddismutase (SOD), Katalase, GSSG-Reduktase und Gluthationtransferase (GST) in den Nieren beider Mausstamme beobachtet. In Nieren von Mpv17–/–-Mäusen war jedoch die Aktivität von γ-Glutamyltranspeptidase (γ-GT) etwa zweifach erhöht, wohingegen die Aktivität von Gluthationperoxidase (GPx) im Vergleich zu Mpv17+/+-Tieren um etwa ein Drittel vermindert war. Die folgende Tabelle stellt diese Ergebnisse dar: TABELLE 1 Enzymaktivitäten in Nieren von 7–9 Monate alten Mpv17-/-- und Mpv17+/+-Mäusen

	Mpv17–/–	Mpv17+/+
	mMol/g Nieren-Feuchtgewicht
GSH	2.19 ± 0.28 (93)^a)	2.35 ± 0.35
	E/mg Protein
Superoxiddismutase	17,1 ± 1.6 (102)	16.7 ± 0.8
Katalase	381 ± 25 (88)	431 ± 16
	nMol/min pro mg Protein
Glutathionperoxidase	176 ± 12 (68)	259 ± 16
GSSG-Reduktase	98 ± 10 (85)	115 ± 10
Glutathiontransferase	50 ± 52 (98)	520 ± 36
γ-Glutamyltranspeptidase	2,330 ± 295 (197)	1,180 ± 70

Daten sind als Mittelwerte ± SEM („standard error of the mean", Standardfehler des Mittelwerts angegeben (n = 10 Tiere) ^a)% von Mpv17+/+

Beispiel 4: Mpv17-abhängige Aktivitäten von γ-Glutamyltranspeptidase und Gluthationperoxidase in Fibroblasten

Veränderungen von Enzymaktivitäten, die in Nieren von Mpv17–/–-Mäusen bestimmt worden waren, wurden auf ähnliche Weise beobachtet, wenn man in Kultur gehaltene Mpv17–/–(LUSVX)-Zellen mit Mpv17 exprimierenden (NIX15) Zellen verglich (Tabelle 2). Am markantesten waren die Aktivitäten von γ-GT in Mpv17–/–-Zellen um etwas das Sechsfache erhöht, wohingegen die Aktivitäten von GPx um ein Drittel vermindert waren. Die Ähnlichkeit in der Veränderung der Aktivitäten von γ-GT und GPx, die in Mpv17+/+- und Mpv17–/–-Nieren und der Fibroblastenkultur gemessen wurden, legt den Schluss nahe, dass diese Veränderungen auf der zellulären Ebene statt auf der Ebene des Organismus auftreten. Die folgende Tabelle fasst die Ergebnisse zusammen. TABELLE 2 Enzymaktivitäten in LUSVX- und NIX15-Fibroblasten

	LUSVX Mpv17 – negativ	NIX15 Mpv17 – exprimierend
	E/mg Protein
Superoxiddismutase (n = 2)	10.7 (61)^a)	17,6
Katalase	410 ± 60 (87)	470 ± 90
	nMol/min pro mg Protein
Gluthationperoxidase	53 ± 5 (66)	80 ± 7
γ-Glutamyitranspeptidase	15 ± 34 (600)	2.5 ± 0.01

Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben (n = 3–4) ^a)% von NIX15

Beispiel 5: Mpv17-abhängige Veränderungen der mRNA-Expression in Fibroblasten
Die mRNA-Spiegel der γ-GT- und GPx-Gene wurden mittels quantitativer RT-PCR in Mpv17 exprimierenden (NIX15) bzw. Mpv17–/–(LUSVX)-Zellen untersucht (siehe 2A nachstehend). γ-GT-spezifische mRNA war in Mpv17–/–-Zellen etwa zweifach erhöht. Man untersuchte die Expression von zellulärer GPx (cGPx), Plasma- GPx (pGPx), Phospholipid-Hydroperoxid-GPx (PHGPx) sowie der nicht Selenabhängigen GPx (nsGPx). In Mpv17–/–-Zellen war nur die Expression von pGPx um etwa 80% vermindert (2A), was mehr oder weniger mit der Veränderung in der Aktivität von GPx (siehe Tabellen 1 und 2 vorstehend) in Einklang steht. pGPx scheint hauptsächlich für die niedrige Gesamtaktivität von GPx verantwortlich zu sein. Bemerkenswerterweise wurde die Expression von PHGPx, einem Enzym, das für den Schutz vor der Peroxidation von Phospholipiden verantwortlich ist (R. L. Maser, B. S. Magenheimer und J. P. Calvet (1994), Journal of Biological Chemistry 269, S. 27066–27073), auf der Ebene der mRNA nicht beeinflusst. Die drei verschiedenen SOD-Gene der Maus (CuZnSOD, MnSOD, ecSOD) zeigen eine geringere Expression in Mpv17–/–-Zellen, was mit der geringeren gemessenen SOD-Aktivität (siehe Tabelle 2 vorstehend) in Einklang steht. Auf der mRNA-Ebene wurde zwischen Mpv17 exprimierenden und Mpv17 nicht exprimierenden Zellen kein signifikanter Unterschied in der Xanthindehydrogenase/Xanthinoxidase (XO) nachgewiesen.
Beispiel 6: Inhibition der Aktivität der γ-Glutamyltranspeptidase stellt die Gluthationperoxidase-Aktivität in Mpv17–/–-Zellen wieder her

Man beobachtete eine inverse Regulation der Gluthation verwendenden Enzymaktivitäten γ-GT und GPx in Mpv17–/–-Tieren und -Zellen (siehe Tabellen 1 und 2 vorstehend). Da Mpv17–/–-Zellen vermehrt Superoxid produzieren, testete man eine vermutete regulatorische Funktion des Superoxidanions, indem man Mpv17–/–-Zellen (LUSVX) in Gegenwart des SOD-Mimetikums MnTBAP wachsen ließ (Y. Noda, M. Kohno, A. Mori und L. Packer (1999), Journal of Biological Chemistry 269, S. 23471–23476). Weder die γ-GT- noch die GPx-Aktivität waren signifikant verändert (Tabelle 3), was darauf hindeutet, dass Superoxid keine Rolle bei der Regulation von γ-GT und GPx in diesem System zu spielen scheint. Umgekehrt, wenn man Mpv17–/–-Zellen in Gegenwart von Acivicin, einem wirksamen Inhibitor von γ-GT, wachsen ließ, war die GPx-Aktivität um etwa das 1,6-fache erhöht. Demnach können die Enzymaktivitäten auf eine Weise voneinander abhängen, dass γ-GT die Aktivität von GPx herunterreguliert. Dieser inverse Effekt wurde auch auf der Ebene der stabilen mRNA nachgewiesen, da eine Inhibition von γ-GT zu einer signifikanten Zunahme der mRNA-Spiegel von pGPx und SOD führte (siehe 2B). TABELLE 3 Aktivität von Gluthationperoxidase und γ-Glutamyltranspeptidase in Mpv17–/–-Zellen(LUSVX) in Gegenwart von MnTBAP oder Acivicin

	LUSVX	LUSVX + MnTBAP	LUSVX	LUSVX + Acivicin
	nMol/min pro mg Protein
Gluthationperoxidase	25.0 ± 1.0	26.1 v 0.6 (104%)^a)	33.3 ± 1.3	53.5 ± 2.0 ( 162%)
γ-Glutamyltranspeptidase	0.99 ± 0.02	0.94 ± 0.03 95%	0.96 ± 0.02	nicht nachweisbar

Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben (n = 3)^a)% von Kontrollen

Beispiel 7: Regulation der Expression von γ-GT und pGPx
Die hierin vorstehend dokumentierten Beispiele veranschaulichen das Folgende:
a) Reaktive Sauerstoffspezies in Mpv17–/–-Zellen
Mit Hilfe des ESR-Verfahrens wies man Superoxid als die von Mpv17–/–-Fibroblasten freigesetzte ROS-Spezies nach. Die Produktion und die Sezernierung von Superoxid sind in Mpv17 exprimierenden Zellen im Vergleich zu nicht exprimierenden Mpv17–/–-Zellen niedriger. Diese Daten sind in Übereinstimmung mit der Bedeutung von ROS bei der Erzeugung von glomerulären Schädigungen (R. J. Johnson, D. Lovett, R. I. Lehrer, W. G. Couser und S. J. Klebanoff (1994), Kidney International 45, S. 352–359) und mit einer Untersuchung von Mpv17–/–-Nieren und isolierten Glomeruli, bei der man erfolgreich Antioxidantien zur therapeutischen Intervention in Mpv17–/–-Tieren eingesetzt hat (C. J. Binder, H. Weiher, M. Exner und D. Kerjaschki (1999), American Journal Pathology 154, S. 1067–1075).
b) Aktivität und Expression von oxidativen Enzymen
Man bestimmte die Aktivität und Expression von Enzymen, die am Metabolismus von ROS und Gluthation beteiligt sind, in Nieren und kultivierten Fibroblasten von Mpv17–/–-Mäusen. Eine Zunahme der γ-GT-Aktivität und eine Abnahme der GPx-Aktivität wurden sowohl in Mpv17–/–-Nieren als auch in -Fibroblasten beobachtet. Außerdem wurde in Mpv17–/–-Fibroblasten eine Abnahme der SOD-Aktivität beobachtet. Auf der mRNA-Ebene beobachtete man in Mpv17–/–-Zellen eine negative Korrelation zwischen der Expression von γ-GT und der Expression von GPx und der SOD-Gene. Alle drei getesteten verschiedenen SOD-mRNAs waren signifikant vermindert, aber nur die Expression der Plasma-GPx war stark verringert, wobei letzteres vermutlich für die gemessene Verringerung der GPx-Aktivität verantwortlich ist. Über negative Korrelationen zwischen der Aktivität und der Expression von γ-GT und von Enzymen, die am GSH- und ROS-Metabolismus beteiligt sind, ist früher berichtet worden. Demnach wurden inverse Veränderungen der Aktivitäten von GPx und γ-GT unter Bedingungen von oxidativem Stress in Ratten, die Zigarettenrauch ausgesetzt waren (C. V. Anand, U. Anand und R. Agarwal (1996), Indian Journal Experimental Biology 34, S. 486–488) und in fötalen Mäusen, die Alkohol ausgesetzt waren (S. A. Amini, R. H. Dunstan, P. R. Dunkley und R. N. Murdoch (1996), Free Radical Biology and Medicine 21, S. 357–365) bestimmt. Auf ähnliche Weise ist kürzlich ein inverses Verhältnis zwischen der Expression von γ-GT und CuZnSOD in Rattenlebern nach einer Eisen-Vergiftung bemerkt worden (N. Taniguchi und Y. Ikeda (1998), Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology 72, S. 239–278). Aber im Gegensatz zu diesen früher beschriebenen Modellen wurde in dem Mpv17-Maus-Modell keine chemische Verletzung verabreicht.
c) Regulation der Expression von γ-GT und pGPx
In Abwesenheit des Mpv17-Proteins ist das γ-GT-Gen hochreguliert, während der mRNA-Spiegel von pGPx vermindert ist. Das γ-GT-Gen der Maus ist ein Gen, das in einfacher Kopie vorliegt und komplizierten Kontrollmechanismen unterliegt, die mindestens sieben Promotoren einbeziehen (N. Taniguchi und Y. Ikeda (1998), Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology 72, S. 239–278). Das Membran-gebundene γ-GT ist an der Regulation des zellulären Redoxpotenzials und der intrazellulären GSH-Spiegel beteiligt (T. C. Nichols, J. M. Guthridge, D. R. Karp, H. Molina, D. R. Fletcher und V. M. Holers (1998) European Journal of Immunology 28, S. 4123–4129). Die Aktivität von γ-GT kann in verschiedenen Systemen durch Verminderung von Gluthation (R. J. van Klaveren, P. H. Hoet, J. L. Pype, M. Demedts und B. Nemery (1997), Free Radical Biology and Medicine 22, S. 525–534) oder durch Hyperoxie (A. Kugelman, H. A. Choy, R. Liu, M. M. Shi, E. Gozal und H. J. Forman (1994), American Journal Respiratory Cell and Molecular Biology 11, S. 586–592) erhöht werden.
pGPx ist eine extrazelluläre Peroxidase der Selen-enthaltenden GPx-Familie, die GSH ebenso wie Thioredoxin und Glutaredoxin als Thiol-Substrate benutzt (M. Björnstedt, J. Xue, W. Huang, B. Akesson und A. Holmgren (1994), Journal of Biological Chemistry 269, S. 29382–29384). pGPx liegt in größeren Mengen in Niere als in anderen Geweben vor und wird in den proximalen Tubuli und in den Glomeruli synthetisiert und sezerniert, in Übereinstimmung mit seiner Funktion beim Schutz der Niere vor extrazellulärer oxidativer Schädigung (R. L. Maser, B. S. Magenheimer und J. P. Calvet (1994), Journal of Biological Chemistry 269, S. 579–585; D. M. Tham, J. C. Whitin, K. K. Kim, S. X. Zhu und H. J. Cohen (1998), American Journal Physiology 275: G1463–1471). Eine Herunterregulierung von pGPx, wie in Mpv17–/–-Zellen beobachtet, schwächt den Schutz gegen eine extrazelluläre oxidative Verletzung.
Die γ-GT-Aktivität in Mpv17–/–-Zellen kontrolliert den Spiegel von pGPx-mRNA, da die Inhibition von γ-GT diese Herunterregulierung abschwächt (2B). Diese Kontrolle könnte nicht im Gleichgewicht befindliche Spiegel von intra- oder extrazellulärem GSH oder Superoxid aufgrund einer gesteigerten γ-GT-Aktivität beinhalten, die vermutlich durch die Aktivierung von Superoxid-responsiven Transkriptionsfaktoren wie z. B. NF-κB oder AP-1 vermittelt ist (H. L. Pahl und P. A. Baeuerle (1994), Bioessays 16, S. 497–502). Allerdings beeinflusst die Entfernung von Superoxid weder die γ-GT-noch die GPx-Aktivität, was gegen Superoxid als einem Regulator spricht.
Es ist früher gezeigt worden, dass mehrere Gene, die für die Entwicklung des Krankheitsphänotyps relevant sind, d. h. MMP-2 und sein Regulator TIMP-2 in Mpv17–/–Mäusen hochreguliert sind (A. Reuter, A. Nestl, R. M. Zwacka, J. Tuckermann, R. Waldherr, E. M. Wagner, M. Hoyhtya, A. M. Meyer zum Gottesberge, P. Angel und H. Weiher (1998) Molecular Biology of the Cell 9, S. 1675–1682). Da eine Intervention mit Antioxidantien in unserem Modell bei der Verhinderung des Phänotyps wirksam ist (C. J. Binder, H. Weiher, M. Exner und D. Kerjaschki (1999), American Journal of Pathology 154, S. 1067–1075), sollten diese Veränderungen Folgen statt Ursachen der Bildung von ROS sein. Im Gegensatz dazu deuten die hier vorgestellten Daten darauf hin, dass eine Überproduktion von γ-GT in diesen Tieren ursächlich für erhöhte ROS-Spiegel ist (siehe nachstehend).
d) Ursprung der erhöhten ROS-Spiegel in Mpv17–/–-Mäusen
Die am meisten betroffenen Enzyme in Mpv17–/–-Nieren und -Zellen, γ-GT und pGPx, üben ihre Enzymaktivität vor allem im extrazellulären Raum aus. Insbesondere sind die γ-GT-Expression und -Aktivität in Abwesenheit der Mpv17-Funktion verstärkt. Zellen, die γ-GT überproduzieren, sollten durch eine erhöhte Versorgung mit intrazellulärem GSH effizient gegen intrazelluläre oxidative Schädigung geschützt sein. Extrazelluläres GSH wird durch γ-GT zu Glutamat und Cysteinylglycin metabolisiert, das im Gegensatz zu GSH direkt in Zellen eindringen kann und diese somit mit einer Quelle von Cystein versorgen kann (M. W. Lieberman, A. L. Wiseman, Z. Z. Shi, B. Z. Carter, R. Barrios; C. N. Ou, P. Chevez-Barrios, Y. Wang, G. M. Habib, J. C. Goldman, S. L. Huang, R. M. Lebovitz und M. M. Matzuk (1996), Proceedings of the National Academy of Science of the U. S. A. 76, S. 5606–5610). Das letztere liegt in der geringsten Konzentration aller Aminosäuren vor und ist ein limitierender Bestandteil für die intrazelluläre de novo-Synthese von GSH. Somit spielt γ-GT, das an der zum Lumen gewandten Oberfläche der proximalen Tubuli der Niere lokalisiert ist, eine Schlüsselrolle bei der Homöostase von Cystein und Gluthation bei der Aufrechterhaltung der zellulären GSH-Spiegel (A. Kugelman, H. A. Choy, R. Liu, M. N. Shi, E. Gozal und H. J. Forman (1994), American Journal Respiratory Cell and Molecular Biology 11, S. 586–592).
Gleichzeitig könnte eine erhöhte γ-GT-Aktivität zu einer Verminderung von extrazellulärem GSH führen und dadurch die Resistenz gegen extrazelluläre ROS schwächen. Dies ist jedoch in Mäusen unwahrscheinlich, da die Plasmaspiegel von GSH etwa 100-fach höher sind als in Menschen (O. W. Griffith und A. Meister (1979), Proceedings of the National Academy of Science of the U. S. A. 76, S. 5606–5610), was weit über einer kritischen Substratkonzentration für pGPx-Aktivität von < 0,5 μM liegt (A. Wendel und P. Cikryt (1980), FEBS Letters 120, S. 209-211). Stattdessen kann erhöhte γ-GT-Aktivität in dem Mpv17–/–-System direkt Superoxid verstärken. Eine solche direkte Produktion von Superoxid durch die γ-GT-Aktivität wurde kürzlich in einem in vitro-System gezeigt, das GSH und Transferrin als eine Eisenquelle enthielt. Es wurde gezeigt, dass Superoxid durch die Reaktion des GSH-Abbauprodukts Cysteinylglycin gebildet wurde (R. Drozdz, C. Parmentier, H. Hachad, P. Leroy, G. Siest und M. Wellman (1998), Free Radicals Biology and Medicine 25, S. 786–792). Superoxid kann auf der Stelle eine Reaktion vom Fenton-Typ durchlaufen, um sich in das hoch noxische Hydroxylradikal umzuwandeln, was eine Lipid- und Protein-Peroxidierung verursacht (R. Drozdz, C. Parmentier, H. Hachad, P. Leroy, G. Siest und M. Wellman (1998), Free Radicals Biology and Medicine 25, S. 786–792). In vivo sind die Bildung von Hydroxylradikal und Lipidperoxidierung in Gegenwart von Metallen und unter Bedingungen einer erhöhten γ-GT-Aktivität in Rattenleber früher beschrieben worden (K. E. Brown, M. T. Kinter, T. D. Oberley und D. R. Spitz (1998), Free Radical Biology and Medicine 24, S. 545–555; A. A. Stark, E. Zeiger, D. A. Pagano (1993), Carcinogenesis 14, S. 183–189; A. Paolicchi, R. Tongiani, P. Tonarelli, M. Comporti und A. Pompella (1997), Free Radical Biology and Medicine 22, S. 853–860).
Die vorstehend beschriebenen Experimente zeigen eindeutig, dass γ-GT-Aktivität eine Schlüsselrolle bei der Bildung von extrazellulären ROS spielt. Kürzlich ist berichtet worden, dass eine Hochregulierung von γ-GT ursächlich für eine Oxidationsschädigung während einer kurzzeitigen Ischämie von Rattenniere ist und dass dieser Effekt durch Acivicin inhibierbar war (J. C. Cutrin, B. Zingaro, S. Camandola, A. Boveris, A. Pompella und G. Poli (2000), Kidney International 57, S. 526–533). Somit stellt die Verwendung von γ-GT-Inhibitoren auch in Menschen eine wirksame und nützliche Behandlung von degenerativen ROS-Erkrankungen und Schädigungen dar. Mpv17–/–-Mäuse, d. h. Mäuse der Glomerulosklerose-Referenzstämme, werden gemäß dieser Erfindung für mehrere Wochen mit einer oralen Verabreichung von 5 bis 50 mg/kg Activicin (AT-125) behandelt. Die schützende Verwendung von Activicin wird mit Hilfe von pathologischen Verfahren und/oder molekularen Methoden analysiert.

Claims

Verwendung von γ-GT-Inhibitoren für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer chronischen degenerativen Erkrankung, wobei die chronische degenerative Erkrankung eine chronische Nierenerkrankung oder ein(e) chronische(r) degenerative(r) Zustand oder Schädigung des Innenohrs ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die chronische Nierenerkrankung ROS-induziert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei die chronische Nierenerkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus fokaler Glomerulosclerose, segmentaler Glomerulosclerose, Minimal-Change-Nephrose, entzündlichen Glomerulopathien, diabetischer Nephropathie und Autoimmun-Glomerulopathien.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die chronische Schädigung des Innenohrs ROS-induziert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei die ROS-induzierte Schädigung des Innenohrs sensorineurale Schwerhörigkeit ist, die durch das Alter, den physiologischen Zustand oder den metabolischen Zustand induziert wird.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der chronische degenerative Zustand des Innenohrs Otosclerose ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der γ-GT-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus AT-125, Acivicin oder seinen Derivaten, γ-Glutamyl-Aminosäuren und Peptiden der allgemeinen Formel γ-Glu-XY, Peptikeln der allgemeinen Formel (CysGlyX), peptidmimetischen Glutathion-Analoga, Verbindungen oder Derivaten des Typs L-2-Amino-4-boronobuttersäure (ABBA) und Aniliden, wie γ-Glutamyl-7-amido-4-methylcumarin (γ-Glu-AMC).
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei X und Y für jedwede natürlicherweise vorkommende Aminosäure oder eine modifizierte Aminosäure stehen.