DE60224730T2

DE60224730T2 - Licht emittierende fusionsproteine sowie diagnose- und therapieverfahren dafür

Info

Publication number: DE60224730T2
Application number: DE60224730T
Authority: DE
Inventors: William G. Boston KAELIN; David M. Brookline LIVINGSTON; Tae-You Boston KIM
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 2001-03-20
Filing date: 2002-03-20
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2022-03-21
Also published as: EP1483561B1; WO2002075278A2; ATE383878T1; DE60224730D1; AU2002250404A1; EP1483561A2; WO2002075278A3; US20030022198A1; CA2441673A1; EP1483561A4; US7919274B2

Description

Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung der Vereinigten Staaten gemacht. Die Regierung besitzt bestimmte Rechte an der Erfindung.
Erfindungshintergrund
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Lokalisierung von hypoxischem Gewebe in vivo. Die Erfindung zeichnet sich durch die Verwendung von Licht emittierenden Proteinen als diagnostische Werkzeuge zur Bildgebung, zur Diagnose, zum Wirkstoff-Screening und zur Wirkstoffermittlung.
Ein Schlüsselschritt im biomedizinischen Fachgebiet ist die Entdeckung von biolumineszenten Proteinresten gewesen, beispielsweise grün fluoreszierendes Protein (GFP) und Luziferase, welche in diversen Säugetierzelltypen exprimiert werden können und auf diese Weise als erfassbare Signale für biologische Signaltransduktionswege und -ereignisse dienen. Es hat sich auch ein vertieftes Verständnis ergeben, wie diverse biologische Prozesse durch die Wirkungen von zellularen Enzymen, beispielsweise Kinasen, Proteasen und Ubiquitinligasen, reguliert werden. Die Änderungen in der Aktivität dieser Enzyme können der Initiierung und/oder Progression von Krankheiten, wie etwa Krebs, zugrunde liegen.
Kürzlich sind Verfahren zur Ermittlung von biologischen Aktivitäten und Substanzen unter Verwendung von biolumineszenten Proteinen entwickelt worden. Beispielsweise können Proteinphosphorylierungsereignisse unter Verwendung von Fusionsproteinen, die GFP (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,958,713 ) oder Luziferase, Aequorin und Obelin (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,683,888 ) enthalten, erfasst werden. Um Ereignisse, wie etwa eine Parasiteninfektion, spezifisch zu lokalisieren, sind Licht erzeugende Reste in Säugetiere eingebracht worden (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,650,135 ).
Wie Zellen Änderungen des Atmosphärensauerstoffs wahrnehmen, ist ein zentrales Problem der Biologie. Bei Säugetierzellen führt ein Mangel an Sauerstoff oder Hypoxie zur Stabilisierung eines sequenz-spezifische DNA bindenden Transkriptionsfaktors, genannt HIP (Hypoxie induzierbarer Faktor), der transkriptionell eine Vielfalt von Genen aktiviert, die mit Prozessen, wie etwa die Angiogenese und der Glukose-Stoffwechsel, verknüpft sind.
Gewebeischämie ist eine Hauptursache für Morbidität und Mortalität. Ischämie kann sich aus einer chronischen Ischämie ergeben, die durch eine fehlende Blutversorgung zu dem Gewebe verursacht wurde, die beispielsweise bei Schlaganfall, tiefer Venenthrombose, pulmonalem Embolus und renalem Versagen vorkommt. Ischämisches Gewebe wird auch in Tumoren gefunden.
HIF bindet an DNA als ein Heterodimer, das aus einer Alpha-Untereinheit und einer Beta-Untereinheit (auch Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor Zellkern-Translokator oder ARNT genannt) besteht. Die Alpha-Untereinheit wird in der Gegenwart von Sauerstoff schnell polyubiquitiniert und abgebaut, wohingegen die Beta-Untereinheit konstitutiv stabil ist. Die von-Hippel-Lindau-Erkrankung (VHL) ist ein erbliches Krebssyndrom, das durch die Entwicklung von ausgeprägten vaskulären Tumoren gekennzeichnet ist, die Hypoxie induzierende mRNAs überproduzieren, wie etwa vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF). Das Produkt des VHL-Suppressorgens, pVHL, ist eine Komponente eines Multiproteinkomplexes, der Elongin B, Elongin C, Cu12 und Rbx1 enthält. Dieser Komplex weist strukturelle und funktionelle Ähnlichkeit zu SCF (Skp1/Cdc53 oder Cullin/F-box) Ubiquitin-Ligasen. In der Gegenwart von Sauerstoff bindet pVHL direkt an HIFα-Untereinheiten und zielt auf deren Polyubiquitinierung und Zerstörung ab. Zellen, denen funktionelles pVHL fehlt, können HIF nicht abbauen und überproduzieren daher mRNAs, die von HIF-Zielgenen kodiert werden.
In den vergangenen Jahren ist auch ein Fortschritt zum Verständnis der molekularen Mechanismen bei der Steuerung der Zellproliferation erzielt worden. Aberrierende Zellproliferation ist ein Markenzeichenereignis beim Ausbruch und der Progression von Krankheiten wie Krebs. Die Progression durch den Säugetierzellzyklus ist mit dem fein aufeinander abgestimmten Auftreten und der Zerstörung von Cyclinen verknüpft. Mit unterschiedlichen Zellzyklusübergängen sind unterschiedliche Cycline verbunden. Beispielsweise ist Cyclin E in der späten G1- und der frühen S-Phase aktiv, Cyclin A ist in der S-Phase aktiv und Cyclin B ist bei der Mitose aktiv. Cycline binden an cyclin-abhängige Kinasen (cdks). In diesem Zusammenhang sei erwähnt, dass Cycline die katalytische Aktivität von ihrer Partner-cdk(s) aktivieren und auch eine Rolle bei der Substraterkennung spielen.
Einige der transkriptionalen regulatorischen Proteine, wie etwa die pRB-Homologe p107 und p130, die E2F-Familienmitglieder E2F1, E2F2 und E2F3, der transkriptionale Koaktivator p300 und NPAT (Kernprotein, das am AT-Lokus kartiert ist), bilden stabile Komplexe mit Cyclin A/cdk2. Alle diese Proteine binden direkt oder indirekt an DNA. Somit könnten solche Komplexe als Vehikel zur Steigerung der Konzentration von Cyclin A/cdk2 oder Cyclin E/cdk2 an bestimmten Stellen innerhalb des Genoms dienen. Als solche könnten Cyclin A/cdk2 und Cyclin E/cdk2 vergleichsweise direkte Rollen bei Prozessen wie der Transkription und DNA-Replikation spielen. Diese zwei Prozesse sind fundamental bei der normalen Zellproliferation und sind während aberrierender Zellproliferation, wie etwa bei Krebs, gestört. WO 00/69908 betrifft den Befund, dass das VHL-Suppressorgen die α-Untereinheiten des Hypoxie induzierenden Faktors durch Targeting von HIFα zur Zerstörung in normoxischen, aber nicht hypoxischen Zellen reguliert. Jaakkola et al (Science 292, 468-472, 2001) betrifft den Befund, dass HIFα auf die Ubiquitinierung durch sauerstoff-regulierte Prolyl-Hydroxylierung gerichtet ist.
Kurzfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft zum Teil die Entdeckung von Licht erzeugenden Fusionsproteinen (oder einer Zelle, die das Licht erzeugende Fusionsprotein exprimiert), wobei sich das Licht erzeugende Fusionsprotein durch eine Ligandenbindungsstelle und einen Licht erzeugenden Polypeptidrest auszeichnet. Das Licht erzeugende Fusionsprotein („LGP") weist das Merkmal auf, dass sich die Lichterzeugung des Licht erzeugenden Polypeptidrests bei Bindung eines Liganden an die Ligandenbindungsstelle ändert. Der Ligand kann in einer Umgebung nur unter bestimmten Bedingungen, beispielsweise in einem hypoxischen Zustand, derart aktiv sein, dass das Licht erzeugende Fusionsprotein nur unter solchen Bedingungen „an- oder abgeschaltet" wird.
Bei einem Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung nicht-invasive Verfahren zum Erfassen der Lokalisierung von hypoxischem Gewebe in einem Patienten, wobei ein Licht erzeugendes Fusionsprotein eine Ligandenbindungsstelle eines HIF1α-Polypeptidrests aufweist, wobei die Ligandenbindungsstelle die Aminosäuresequenz Y-X₁-Leu-X₂-Pro_h-X₃-X₄-X₅-X₆-Y' umfasst, wobei Pro_h hydroxyliertes Prolin ist, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ und X₆ Aminosäuren sind, die so gewählt sind, dass die VHL-Bindungseigenschaften nicht modifiziert oder geändert werden, und Y und Y' unabhängig vorhanden oder nicht vorhanden sind und, wenn vorhanden, ein Peptid umfassen, das 1 bis 600 Aminosäuren aufweist, und ein Licht erzeugendes Fusionsprotein und/oder eine Zelle, die das Licht erzeugende Fusionsprotein exprimiert, in vivo verabreicht worden ist. Das Licht erzeugende Fusionsprotein und/oder die Zelle, die das Licht erzeugende Fusionsprotein exprimiert, kann bei Lokalisierung mittels Erfassung der Anwesenheit (oder Abwesenheit) von Lumineszenz im Patienten dargestellt werden, wodurch das hypoxische Gewebe lokalisiert wird.
Licht erzeugende Fusionsproteine können auf vielfache Weise verwendet werden, wie etwa zum Screening nach Modulatoren der Aktivität oder Latenz von (oder Prädisposition für) Störungen, wie Hypoxie, Krebs, Diabetes, Herzkrankheit oder Schlaganfall. Beispielsweise kann einem Versuchstier bei gesteigertem Risiko für solche Störungen eine Testsubstanz verabreicht werden, wobei das Versuchstier rekombinant ein Licht erzeugendes Fusionsprotein exprimiert, das die Lokalisierung des Licht erzeugenden Fusionsproteins, die Erfassung der Lumineszenz des Licht erzeugenden Polypeptidrests im Versuchstier nach der Verabreichung der Testverbindung und das Vergleichen der Lumineszenz des Licht erzeugenden Polypeptidrests im Versuchstier mit der Lumineszenz des Licht erzeugenden Polypeptidrests in einem Kontrolltier, dem die Testverbindung nicht verabreicht wurde, ermöglicht. Eine Änderung der Aktivität des Licht erzeugenden Polypeptidrests im Versuchstier relativ zum Kontrolltier zeigt an, dass die Testverbindung ein Modulator sein kann.
Verfahren zur Darstellung von hypoxischem Gewebe in einem Patienten, beispielsweise Säugetierpatienten, dem ein Licht erzeugendes Fusionsprotein, das eine Ubiquitinligase-Bindungsstelle und einen Licht erzeugenden Polypeptidrest umfasst, oder eine Zelle, die das Licht erzeugende Fusionsprotein exprimiert, verabreicht worden ist, ermöglicht die Lokalisierung des Licht erzeugenden Fusionsproteins oder der Zelle in hypoxischem Gewebe in einem Patienten und das Messen der Lumineszenz des lokalisierten Licht erzeugenden Fusionsproteins und Darstellung des Licht erzeugenden Fusionsproteins so, dass das hypoxische Gewebe angebildet wird. Das verfahren kann verwendet werden, um die Effekte einer anti-hypoxischen Verbindung in vivo zu bestimmen, wobei sich das Licht erzeugende Fusionsprotein durch eine Ubiquitinligase-Bindungsstelle auszeichnet. Das Verfahren wird in Anspruch 1 definiert.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 ist eine schematische Darstellung von verschiedenen Fusionsproteinen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
2 ist eine zweite schematische Darstellung von verschiedenen Fusionsproteinen, die bei der Erfindung verwendet werden.
3 zeigt pVHL-Bindung an eine modifizierte Form von HIF.
4 zeigt pVHL-Bindung an ein von HIF1α abgeleitetes Peptid, wenn Leu562 und Pro564 intakt sind.
5 zeigt Ubiquitinierung und Abbau von HIF, verknüpft mit Leu562 und Pro564.
6 stellt Prolinhydroxylierung verknüpft mit pVHL-Bindung dar.
7 veranschaulicht pVHL, welches spezifisch HIF1α mit hydroxyliertem Prolin 564 erkennt.
8 veranschaulicht die Produktion von TETr-Cyclinen A und E.
9 zeigt DNA-gebundene Cycline A und E, die die Transkription unterschiedlich beeinflussen.
10 veranschaulicht die transkriptionale Regulierung durch die Cycline A und E in Abhängigkeit von der DNA-Bindung.
11 stellt die Cyclin-Box dar, die zur transkriptionalen Repression durch DNA-gebundenes Cyclin A erforderlich ist.
12 veranschaulicht, dass die transkriptionale Aktivierung durch Cyclin E mit seiner Fähigkeit verknüpft ist, an cdk2 zu binden und mit Substraten zu interagieren.
13 zeigt, dass die transkriptionale Aktivierung durch DNA-gebundenes Cyclin E von der katalytischen Aktivität von cdk2 abhängt.
14 zeigt transkriptionale Wirkungen, die durch zellzyklusabhängige Veränderungen bei endogenen Cyclinen A und E vermittelt wird.
Die 15 bis 18 veranschaulichen das Ergebnis, das bei Beispiel 2 erhalten wird.
19 veranschaulicht die Wildtyp-Sequenz von HIF1α, Zugangsnummer Q16665 (SEQ ID NO: 6).
20 veranschaulicht, dass Kinase Cdk2, wenn es entweder an Cyclin E oder Cyclin A gebunden ist, die Phosphorylierung dieses Substrats steuern kann.
21 veranschaulicht die Verwendung eines bestimmten Licht erzeugenden Fusionsproteins der Erfindung (Beispiel 4), das eine Cyclin-Bindungsstelle („T") enthält, die mit Cyclin/cdk2-Komplexen interagiert.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen:
„Licht erzeugend" oder „lumineszent” schließt die Fähigkeit ein, Licht durch eine chemische Reaktion oder durch die Absorption von Strahlung zu erzeugen, einschließlich Phosphoreszenz, Fluoreszenz und Biolumineszenz.
„Licht" schließt elektromagnetische Strahlung ein, die eine Wellenlänge zwischen etwa 300 nm und etwa 1100 nm aufweist, kann aber eine längere oder kürzere Wellenlänge aufweisen.
„Nicht-invasive" Verfahren zur Erfassung der Lokalisation in einem Patienten schließt keine größeren invasiven Verfahren ein, wie etwa herkömmliche Chirurgie oder Biopsie.
„Licht erzeugendes Fusionsprotein” schließt Proteine der Erfindung ein, die einen Licht erzeugenden oder lumineszenten Teil aufweisen, d. h. einen Licht erzeugenden Polypeptidrest und eine Ligandenbindungsstelle. Wenn ein Ligand von Interesse an die Ligandenbindungsstelle des Licht erzeugenden Fusionsproteins bindet, ändern sich im Allgemeinen die Lichterzeugungseigenschaften des Licht erzeugenden Polypeptidrests, entweder von „dunkel" zu „hell" gehend oder umgekehrt.
„Licht erzeugender Polypeptidrest" schließt irgendein dem Fachmann bekanntes Protein ein, um eine leicht erfassbare Quelle für Licht zu liefern, wenn es in stabiler Form vorhanden ist. Nicht beschränkende Beispiele schließen die in den US-Patenten Nr. 5,683,888 , 5,958,713 und 5,650,135 beschriebenen Licht erzeugenden Proteine ein, beispielsweise Ferredoxin IV, grün fluoreszierendes Protein, rot fluoreszierendes Protein, gelb fluoreszierendes Protein, blau fluoreszierendes Protein, die Luziferasefamilie und die Aequorin-Familie. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist der Licht erzeugende Polypeptidrest ein Protein, wie etwa grün fluoreszierendes Protein, rot fluoreszierendes Protein, gelb fluoreszierendes Protein und blau fluoreszierendes Protein.
„Kolineare Effektorstelle" schließt Bereiche des Licht erzeugenden Polypeptidrests ein, die, wenn darauf durch Ereignisse im Anschluss an die Ligandenbindung eingewirkt wird, den Licht erzeugenden Polypeptidrest veranlassen, seinen momentanen Licht emittierenden Zustand (d. h. an oder aus) zu andern. Diese Bereiche, die die kolineare Effektorstelle ausmachen, können dies beispielsweise durch konformatorische Verdrehung, chemische Modifikation, beispielsweise Ubiquitinierung eines Restes oder von Resten in der kolinearen Effektorstelle, oder durch Spaltung der ganzen kolinearen Effektorstelle oder eines Teils davon tun.
„Lokalisierung" schließt Ermitteln des speziellen Bereichs des Patienten einer Entität von Unteresse ein, beispielsweise einen Tumor.
„Kemptid” schließt ein synthetisches cAMP-Peptidsubstrat entsprechend einem Teil der Phosphorylierungsstellensequenz in porciner Leber-Pyruvatkinase ein. „Melantid" schließt cAMP-abhängiges Proteinkinase- und Proteinkinase-C-Substrat in verschiedenen Geweben ein.
„Kleines Molekül" schließt Verbindungen ein, die ein Molekulargewicht von weniger als etwa 5 kD und bevorzugt weniger als etwa 4 kD aufweisen. Kleine Moleküle können beispielsweise Nukleinsäuren, Peptide, Polypeptide, Peptidmimetika, Kohlenhydrate, Lipide oder andere organische oder anorganische Moleküle sein. „Infektionsausbreitung" schließt die Ausbreitung und Kolonisierung von anderen Wirtsstellen als der ursprünglichen Infektionsstelle durch ein Pathogen ein. Der Ausdruck kann jedoch auch das des Pathogens in Größe und/oder Zahl an der ursprünglichen Infektionsstelle einschließen.
„Ligand" schließt ein Molekül, ein kleines Moleküls, ein Biomolekül, einen Wirkstoff, ein Peptid, ein Polypeptid, ein Protein, einen Proteinkomplex, einen Antikörper, eine Nukleinsäure oder eine Zelle ein.
„Ligandenbindungsstelle" schließt die Stelle am Licht erzeugenden Fusionsprotein ein, an die sich ein Ligand bindet, woraufhin der Licht erzeugende Polypeptidrest als eine direkte oder indirekte Folge der Ligandenbindung aktiviert oder inaktiviert wird. Die Bindung an die Ligandenbindungsstelle kann direkt oder indirekt erfolgen, beispielsweise über eine Proteindimerisierung in Verbindung mit anderen Proteinen, wie es hierin im Folgenden beschrieben wird.
„Targeting-Rest" schließt Reste ein, die es ermöglichen, dass das Licht erzeugende Fusionsprotein der Erfindung selektiv einem Zielorgan oder zu Zielorganen zugeführt wird. Wenn beispielsweise die Zuführung einer therapeutischen Verbindung zum Gehirn gewünscht wird, kann das Trägermolekül einen Rest enthalten, der zum Targeting der Verbindung ins Gehirn in der Lage ist, entweder durch aktiven oder passiven Transport. Beispielsweise kann das Trägermolekül einen Redoxrest enthalten, wie es beispielsweise in den US-Patenten Nr. 4,540,564 und 5,389,623 , beide von Bodor, beschrieben ist. Diese Patente offenbaren Wirkstoffe, die an Dihydropyridinreste gebunden sind, die in das Gehirn eindringen können, wo sie zu einer geladenen Pyridiniumspezies oxidiert werden können, die im Gehirn eingefangen werden. Auf diese Weise sammelt sich die Verbindung im Gehirn an. Es sind viele Targeting-Reste bekannt und sie schließen beispielsweise Asialoglycoproteine (siehe beispielsweise Wu, US-Patent Nr. 5,166,320 ) und andere Liganden ein, die über rezeptorvermittelte Endozytose transportiert werden. Targeting-Reste können kovalent oder nichtkovalent an ein Licht erzeugendes Fusionsprotein gebunden sein. Der Targeting-Rest kann auch an einem Vektor angebracht sein.
„Biolumineszente" Moleküle oder Reste schließen lumineszente Substanzen ein, die chemische Energie nutzen, um Licht zu produzieren.
„Fluoreszente" Moleküle oder Reste schließen jene ein, die über einen einfach elektronisch angeregten Zustand lumineszent sind, der nach Entfernung der Strahlungsquelle von sehr kurzer Dauer ist. Die Wellenlänge des emittierten Fluoreszenzlichts ist länger als die des Anregungslichts (Stokesches Gesetz), weil ein Teil des Anregungslichts durch das fluoreszente Molekül in Wärme umgewandelt wird.
„Entitäten" schließen ohne Beschränkung kleine Moleküle, wie etwa zyklische organische Moleküle, Makromoleküle, wie etwa Proteine, Polymere, Proteine, Polysaccharide Nukleinsäuren, Partikel, inerte Materialien, Organellen, Mikroorganismen, wie etwa Viren, Bakterien, Hefe und Pilze, Zellen, beispielsweise eukaryotische Zellen, Embryos, Prionen, Tumoren, alle Typen von Pathogenen und pathogenen Substanzen und Partikel wie etwa Beads und Liposomen ein. Bei einem anderen Gesichtspunkt können Entitäten alle oder einige der Zellen sein, die den abgebildeten Säugetierpatienten aufbauen, beispielsweise erkranktes oder beschädigtes Gewebe oder von diesen Zellen oder durch eine untersuchte Erkrankung produzierte Verbindungen oder Moleküle. Entitäten, für welche die Erfindung besonderen Nutzen besitzt, schließen, Tumoren, proliferierende Zellen, Pathogene und zellulare Milieus, die hypoxisches Gewebe umfassen.
„Infektionsmittel" schließt Parasiten, Viren, Pilze, Bakterien oder Prionen ein.
„Promotorinduktionsereignis" schließt ein Ereignis ein, das zu einer direkten oder indirekten Induktion eines gewählten induzierbaren Promotors führt.
„Heterologes Gen" schließt ein Gen ein, das in einen Wirtsorganismus transfiziert worden ist. Typischerweise bezieht sich ein heterologes Gen auf ein Gen, das ursprünglich nicht von der genomischen DNA der transfizierten oder transformierten Zellen abgeleitet ist.
„Opakes Medium" gibt ein Medium an, das „traditionell" opak ist, nicht notwendigerweise absolut opak. Demgemäß schließt ein opakes Medium ein, das üblicherweise weder als transparent noch als transluzent angesehen wird und schließt Gegenstände ein, wie ein Holzbrett und Fleisch und Haut eines Säugetiers.
„HIFα-Polypeptidrest" schließt die ganze oder einen Teil der Aminosäuresequenz von HIF1α, HIF2α oder HIF3α.
„HIF1α-Polypeptidrest" schließt die ganze oder einen Teil der Aminosäuresequenz von HIF1α ein, beispielsweise SEQ ID NO 9:, die Aminosäuresequenz entsprechend den N-terminalen Resten 1 bis 600 von HIF1α, nummeriert in Übereinstimmung mit dem Wildtyp-HIF1α, wobei einer oder beide Reste 402 und 564 Prolin oder hydroxyliertes Prolin sind, oder eine Sequenz aus 80 bis 120, 20 bis 30, 12 bis 14 oder 4 bis 12 Aminosäuren, entsprechend den an den Rest 402 und/oder 564, inklusive, von HIF1α, anschließenden und/oder diese(n) umgebenden Resten, wobei die Reste 402 und/oder 564 Prolin oder hydroxyliertes Prolin sind.
Die Erfindung betrifft zum Teil Verfahren betreffend das Erfassen, das Lokalisieren und das Quantifizieren von Enzymaktivitäten und Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo, in vitro und in silico unter Verwendung Licht emittierender Fusionsproteine. Die Fusionsproteine enthalten Domänen, die in der Lage sind, durch Enzyme und andere Liganden zu binden und als eine Folge dieser Bindung modifiziert zu werden. Die Licht erzeugende Domäne schließt ohne Beschränkung Bereiche von fluoreszenten Proteinen und biolumineszenten Proteinen ein. Die Lichtemission wird durch bekannte Methoden erfasst, wie etwa die Erfassung mit einer geeigneten Instrumentierung (wie etwa einer CCD-Kamera) in vivo, in vitro oder in silico, wie etwa bei einer lebenden Zelle oder einem intakten Organismus, einem Zellkultursystem, einem Gewebeschnitt oder einem Array.
Die bei der Erfindung verwendeten Licht erzeugende Fusionsproteine sind in der Lage, an einer Lumineszenzreaktion teilzunehmen, wodurch verschiedene biologische, biochemische, chemische und physikalische Ereignisse gemessen werden. Das Licht erzeugende Fusionsprotein ist in der Lage, derart modifiziert zu werden, dass es Licht emittiert oder kein Licht emittiert oder veranlasst, dass Licht emittiert wird. Licht erzeugende Fusionsproteine schließen eine Ligandenbindungsstelle und einen Licht erzeugenden Polypeptidrest ein, wobei sich die Biolumineszenz des Polypeptidrests bei Bindung an die Bindungsstelle ändert.
Ohne durch die Interpretation festgelegt werden zu wollen, wirkt der Ligand im Sinn eines „Schalters" für den Licht erzeugenden Polypeptidrest, d. h. wenn der Ligand an die Ligandenbindungsstelle bindet, emittiert der Licht erzeugende Polypeptidrest Licht oder hört alternativ dazu damit bei Ligandenbindung auf. Das „An- oder Ausschalten" kann bei einem Ausführungsbeispiel mittels einer „kolinearen Effektorstelle" erfolgen, die Bereiche des Licht erzeugenden Polypeptidrests enthält, die, wenn sie durch Ereignisse einwirken, die an die Ligandenbindung anschließen, den Licht erzeugenden Polypeptidrest veranlassen, seinen momentanen Lichterzeugungszustand (d. h. an oder aus) zu ändern. Die Bereiche, die die kolineare Effektorstelle ausmachen, können dies beispielsweise durch konformative Störung, chemische Modifizierung, beispielsweise Ubiquitinierung eines Restes oder von Resten in der kolinearen Effektorstelle oder durch Spaltung eines Teils oder der gesamten kolinearen Effektorstelle tun.
Die Auswahl eines Licht erzeugenden Polypeptidrests des Licht erzeugenden Fusionsproteins sollte so vorgenommen werden, dass Licht erzeugt wird, das in der Lage ist, tierisches Gewebe derart zu durchdringen, dass es äußerlich auf eine nicht-invasive Weise erfasst werden kann. Die Fähigkeit von Licht, durch ein Medium, wie etwa tierisches Gewebe (hauptsächlich aus Wasser zusammengesetzt), zu durchdringen, wird primär durch die Intensität und die Wellenlänge des Lichts bestimmt.
Je intensiver das in einem Einheitsvolumen erzeugte Licht ist, umso einfacher wird das Licht zu erfassen sein. Die Intensität von in einem Einheitsvolumen erzeugtem Licht hängt von den spektralen Eigenschaften einzelner biolumineszenter Polypeptidreste und von der Konzentration dieser Reste im Einheitsvolumen ab. Demgemäß erzeugen Schemata, die eine hohe Konzentration von biolumineszenten Polypeptidresten in oder an einer Entität einstellen (wie etwa hocheffizienzte Beladung von Liposomen oder Expression eines Licht erzeugenden Fusionsproteins in einer Zelle auf hohem Niveau), typischerweise hellere Licht erzeugende Fusionsproteine (LGPs), die durch tiefere Gewebeschichten einfacher zu erfassen sind, als Schemata, die beispielsweise nur einzelne LGM an jeder Entität konjugieren.
Ein zweiter Faktor, der die Erfassung durch Gewebeschichten beherrscht, ist die Wellenlänge des emittierten Lichts. Da die meisten Gewebe hauptsächlich aus Wasser bestehen, kann Wasser verwendet werden, um die Absorptionseigenschaften von tierischem Gewebe zu approximieren.
Demgemäß sind biolumineszente Reste, die Licht im Bereich von gelb bis rot (550 bis 1100 nm) emittieren, typischerweise jenen vorzuziehen, die bei kürzeren Wellenlängen emittieren. Allerdings können bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung mit LGMs ausgezeichnete Ergebnisse erzielt werden, die im Bereich von 486 nm emittieren, trotz der Tatsache, dass dies keine optimale Emissionswellenlänge ist.
Auf Fluoreszenz basierende Reste. Weil fluoreszente Moleküle die Aufnahme von Licht benötigen, um zu lumineszieren, kann ihre Verwendung umständlicher sein als die Verwendung von biolumineszenten Molekülen. Typischerweise werden Vorkehrungen getroffen, um das Anregungslicht so abzuschirmen, dass es das Fluoreszenzphotonensignal nicht kontaminiert, das vom Patienten erfasst wird. Offensichtliche Vorkehrungen schließen die Anordnung eines Anregungsfilters an der Strahlungsquelle ein. Ein geeignet ausgewählter Anregungsfilter blockiert die Mehrzahl an Photonen, die Wellenlängen ähnlich den Photonen aufweisen, die durch die fluoreszenten Reste emittiert werden. Gleicherweise wird am Detektor ein Barrierefilter eingesetzt, um die meisten der Photonen abzuschirmen, die andere Wellenlängen aufweisen, als die der Fluoreszenzphotonen. Filter wie jene, die oben beschrieben werden, können von einer Vielzahl von kommerziellen Quellen erhalten werden, einschließlich Omega Optical, Inc. (Brattleboro, Vt.).
Alternativ kann ein Laser verwendet werden, der ein hochintensives Licht nahe der geeigneten Anregungswellenlänge, aber nicht nahe der Fluoreszenzemissionswellenlänge produziert, um die fluoreszenten Reste anzuregen. Es kann ein x-y-Translationsmechanismus eingesetzt werden, so dass der Laser den Patienten abtasten kann, beispielsweise wie bei einem Konfokalmikroskop.
Als eine zusätzliche Vorkehrung kann die Strahlungsquelle so hinter dem Patienten platziert und abgeschirmt werden, dass die einzigen Strahlungsphotonen, die die Stelle des Detektors erreichen, jene sind, die den ganzen Weg durch den Patienten passieren. Darüber hinaus können Detektore ausgewählt werden, die eine verminderte Sensitivität auf Wellenlängen von Licht aufweisen, das verwendet wird, um den Fluoreszenzrest anzuregen.
Ein Vorteil von kleinen fluoreszenten Molekülen ist, dass sie die Bioaktivität der Entität, an die sie angebracht sind, weniger wahrscheinlich störend beeinflussen, als es ein größerer Licht erzeugender Rest tun würde. Zudem können kommerziell erhältliche fluoreszente Moleküle mit einer Vielfalt von Anregungs- und Emissionsspektren bezogen werden, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Beispielsweise vertreibt Molecular Probes (Eugene, Oreg.) eine Anzahl von Fluorophoren, einschließlich Luzifer-Gelb (absorbiert bei 428 nm und emittiert bei 535 nm) und Nil-Rot (absorbiert bei 551 nm und emittiert bei 636 nm). Darüber hinaus kann das Molekül mit einer Vielfalt an Gruppen derivatisiert zur Verwendung mit verschiedenen Konjugationsschemata erhalten werden (beispielsweise von Molecular Probes).
Auf Biolumineszenz basierende Reste. Die Themen der Chemilumineszenz (Lumineszenz als ein Ergebnis einer chemischen Reaktion) und Biolumineszenz (sichtbare Lumineszenz aus einem lebenden Organismus) sind hinsichtlich vieler Gesichtspunkte sorfältig untersucht worden.
Ein Vorteil von biolumineszenten Resten gegenüber fluoreszenten Resten ist der, dass es im Signal nahezu keinen Hintergrund gibt. Das einzige erfasste Licht ist Licht, das durch den exogenen biolumineszenten Rest erzeugt wird. Im Gegensatz dazu führt das Licht, das verwendet wird, um ein fluoreszentes Molekül anzuregen, häufig zu einer anderen Fluoreszenz als der des intendierten Ziels. Dies trifft insbesondere zu, wenn der „Hintergrund" ebenso komplex ist wie die interne Umgebung eines lebenden Tieres.
Liganden schließen bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel Enzyme ein, die in der Lage sind, einen Licht erzeugenden Polypeptidrest derart zu modifizieren, dass er Licht emittiert oder dies beendet, wenn er modifiziert wird. Bei Anwendung passiert dies beispielsweise wenn das Licht erzeugende Fusionsprotein in Kontakt mit einem Liganden an einer Entität oder von der Entität produziert kommt und der Ligand an die Ligandenbindungsstelle bindet, so dass sie Lichterzeugungseigenschaften des Licht erzeugenden Polypeptidrests geändert werden. Beispiele schließen das Folgende ein.
Bei einem besonders geeigneten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung kann zu Diagnose- und Behandlungszwecke eine Licht erzeugendes Fusionsprotein, das eine Bindungsstelle für eine E3-Ubiquitinligase umfasst, und ein Licht erzeugender Polypeptidrest, der in der Lage ist, durch E3 an einer Modifizierungsstelle modifiziert zu werden, verwendet werden. Ubiquitinligasen binden an kolineares ,T' (siehe 1), das an ihren Substraten vorhanden ist. Beispiele schließen die SCF (Skp1/Cdc53/F-Box) Ubiquitinligasen, die VBC (pVHL/Elongin B/Elongin C) Ubiquitinligase und die MDM2 Ubiquitinligase ein. Es ist bereits bekannt, dass biolumineszente Proteine, wie etwa GFP und Luziferase, an heterologe Polypeptide ohne Verlust an Aktivität fusioniert werden können. Bei einigen Ausführungsbeispielen kann der Licht erzeugende Polypeptidrest so modifiziert sein, dass er einen an der Oberfläche freiliegenden Lysinrest enthält, der als eine Ubiquitin-Akzeptorstelle zugänglich ist. Bei einem ersten Ausführungsbeispiel kann ein Licht erzeugendes Fusionsprotein der Erfindung verwendet werden, um Ischämie in lebenden Geweben und Tieren zu überwachen. Das erste Ausführungsbeispiel umfasst eine Verwendung eines Polypeptids, das vom HIF1α (Hypoxie induzierender Faktor 1α) abgeleitet ist, welches als eine Bindungsstelle für VBC wirkt. Diese Bindungsstelle wird als Ergebnis einer Prolinhydroxylierung nur von VBC in der Gegenwart von Sauerstoff erkannt. Das beim ersten Ausführungsbeispiel verwendete Licht erzeugende Fusionsprotein ist zweckmäßigerweise in hypoxischen Zellen stabil, aber in gut oxigenierten Zellen instabil.
Wie es in 1A allgemein gezeigt ist, enthält ein Ausführungsbeispiel des bei der Erfindung verwendeten Fusionsproteins eine Ligandenbindungsstelle „T", eine Reporterdomäne (beispielsweise ein Licht erzeugender Polypeptidrest) „R" und eine Modifikationsstelle „X". Die Bindung des Enzyms „E" (des Liganden) an die Zielstelle „T" fuhrt zu einer Modifikation der Modifikationsstelle „X", was verursacht, dass die Reporterdomäne entweder Licht emittiert oder nicht.
Die Stelle „T" und die Modifikationsstelle „X" können sich separat und in cis auf dem Fusionsprotein befinden, wie es in 1B gezeigt ist. „T" oder „X" können sich beide proximal oder distal zum Amino-Terminus des Fusionsproteins befinden.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel, das in 1C gezeigt ist, sind das „T" und das „X" des bei der Erfindung verwendeten Fusionsproteins innerhalb einer Domäne des Fusionsproteins kongruent. Bei verwandten Ausführungsbeispielen können sich die kongruenten „T/X" am Amino-Terminus, am Carboxy-Terminus oder an keinem Terminus des Fusionsproteins befinden.
Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel, das in 1D gezeigt ist, befindet sich das „T" auf einem Protein, das mit dem Fusionsprotein assoziiert ist, das das „X" enthält. Bei einem verwandten Ausführungsbeispiel befindet sich die Zielstelle „T" auf dem Fusionsprotein und die Modifikationsstelle „X" befindet sich auf einem Protein, das physikalisch mit dem Fusionsprotein assoziiert ist, wobei die Modifikation des assoziierten Proteins dazu führt, dass das Fusionsprotein entweder Licht emittiert oder nicht emittiert. Die Darstellung der Stelle „T" und der Modifikationsstelle „X" sind nicht dazu bestimmt, einzuschränken. „T" kann sich am Amino-Terminus, am Carboxy-Terminus oder an keinem Terminus des Fusionsproteins befinden und „X" kann sich Amino-Terminus, am Carboxy-Terminus oder an keinem Terminus des assoziierten Proteins befinden.
Ein Fusionsprotein, bei dem die Ligandenbindungsstellensequenz „T" unbekannt ist, wird ebenfalls ins Auge gefasst. Beispielsweise enthält das Fusionsprotein, wie es in 2A gezeigt ist, eine erste Hetero- oder Homo-Dimerisierungsdomäne („HD1"). Ein Enzym „E", das in der Lage ist, die Modifizierungsstelle „X" auf dem Fusionsprotein zu modifizieren, ist an eine zweite Hetero- oder Homo-Dimerisierungsdomäne („HD2") fusioniert, die mit „HD1" interagiert. Die Zielstelle „T” für ein Enzym „E” kann durch Einfügen eines oder mehrerer Polypeptidsequenzen, die aus einer zufälligen oder nicht-zufälligen Peptidbibliothek stammen, in das Fusionsprotein erzeugt werden.
Wie es in 2B gezeigt ist, kann eine Bindungsdomäne eines Proteins „A", das eine Enzymzielstelle „T" enthält, mit einer Bindungsdomäne „B" eines Fusionsproteins interagieren, was dazu führt, dass das Enzym „E" die Reporterdomäne „R" des Fusionsproteins „B" an der Modifizierungsstelle „X" derart modifiziert, dass das Fusionsprotein Licht emittiert oder nicht oder veranlasst, dass Licht emittiert wird. Beim ersten Ausführungsbeispiel umfasst die Ligandenbindungsstelle ein Polypeptid, das von HIF1α (Hypoxie induzierender Faktor 1α) abgeleitet ist, das als eine Bindungsstelle für VBC wirkt, beispielsweise die Aminosäuresequenz Y-X₁-Leu-X₂-Pro_h-X₃-X₄-X₅-X₆-Y' (SEQ ID NO: 12), wobei Pro_h hydroxyliertes Prolin ist, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ und X₆ Aminosäuren sind, die so gewählt sind, dass die VHL-Bindungseigenschaften nicht modifiziert oder geändert werden. X₁, X₂, X₄, X₅ und X₆ sind wünschenswerterweise unabhängig Gly, Ala, Val, Leu, Pro, Met, Phe oder Trp sind und X₃ ist wünschenswerterweise Ser, Thr oder Tyr und Y und Y' sind unabhängig vorhanden oder nicht vorhanden und umfassen, wenn vorhanden, ein Peptid, das 1 bis 600 Aminosäuren aufweist.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel umfasst die Ligandenbindungsstelle die Aminosäuresequenz entsprechend den N-terminalen Resten 1 bis 600 von HIF1α, wobei einer der beiden oder beide Reste 402 und 564 hydroxyliertes Prolin ist bzw. sind. Bei einem stärker bevorzugten Ausführungsbeispiel umfasst die Ligandenbindungsstelle eine Sequenz von 80 bis 120 Aminosäuren, die den an den Rest 564, inklusive, von HIF1α anschließenden und/oder ihn umgebenden Resten entsprechen, wobei der Rest 402 und/oder 564 hydroxyliertes Prolin sind/ist. Mit „anschließenden und/oder umgebenden Resten" ist gemeint, dass die relevante Sequenz von HIF1α entweder vor dem spezifizierten Rest, beispielsweise 564, danach oder ihn flankierend enthalten ist.
Solche Proteine können effektiv als Sauerstoff wahrnehmende Proteine verwendet werden. Die Fusionsproteine können durch rekombinante DNA-Standardtechniken hergestellt werden. Beispielsweise werden DNA-Fragmente, die für die verschiedenen Polypeptidsequenzen kodieren, gemäß herkömmlicher Techniken in-frame miteinander ligiert, beispielsweise durch Einsetzen von stumpf endenden oder versetzt endenden Termini zur Ligation, Restriktionsenzymverdauung, um geeignete Termini bereitzustellen, geeignetes Füllen kohäsiver Enden, alkalische Phosphatasebehandlung, um unerwünschtes Verbinden zu vermeiden, und enzymatische Ligation. Das Fusionsgen kann auch durch herkömmliche Techniken synthetisiert werden, die automatisierte DNA-Synthesizer einschließen. Alternativ kann unter Verwendung von Anker-Primern, die zu komplementären Überhängen zwischen zwei aufeinander folgenden Genfragmenten, die anschließend hybridisiert und reamplifiziert werden können, eine PCR-Amplifikation von Genfragmenten ausgeführt werden, um eine chimäre Gensequenz zu erzeugen (siehe beispielsweise Ausubel et. al. (Hrsg.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992).
Die oben angegebene Ligandenbindungsstelle leitet sich vom HIF1α-Protein ab. Das US-Patent Nr. 6,222,018 beschreibt das HIF-Protein und seine Herstellung in im Wesentlichen reiner Form. HIF ist aus Untereinheiten HIF1α und einer Isoform HIF1β aufgebaut. Das HIF1α-Polypeptid umfasst 826 Aminosäurereste. Wie es unten detaillierter beschrieben wird, umfassen die Ligandenbindungsstellen dieses besonderen Fusionsproteins eine einzigartige Ubiquitinligase-Bindungsdomäne, die von HIF1α abgeleitet ist. Bei diesem Fusionsprotein umfasst, wo vorhanden, Y zwischen 1 und 600 Aminosäurereste, vorzugsweise entsprechend der Sequenz der „N-terminalen" HIF1α-Aminosäurereste 1 bis 555. Demgemäß kann Y bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel irgendeine Sequenz von N-terminalen Aminosäuren von HIF1α repräsentieren, beispielsweise die Reste 554 bis 555, 553 bis 555, 552 bis 555 und so weiter bis zu den Resten 1 bis 555 und diese einschließend. Y' kann ebenfalls zwischen 1 und 600 Aminosäurereste umfassen, vorzugsweise entsprechend der Sequenz der „C-terminalen" HIF1α-Aminosäurereste 576 bis 826. Demgemäß kann Y' bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel irgendeine Sequenz von C- terminalen Aminosäuren von HIF1α repräsentieren, beispielsweise die Reste 576 bis 577, 576 bis 578, 576 bis 579 und so weiter bis zu den Resten 576 bis 826 und diese einschließend. Y und Y' können auch konservative Substitutionen von Aminosäuren enthalten, die in den oben beschriebenen N-terminalen und C-terminalen HIF1α-Sequenzen vorhanden sind. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der oben definierten Ligandenbindungsstelle sind Y und Y' nicht vorhanden. Bei einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel ist X₁ Met, ist X₂ Leu, ist X₃ Ala, ist X₄ Tyr, ist X₅ Pro und ist X₆ Met. Bei einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel des Fusionsproteins weist die Ligandenbindungsstelle die Aminosäuresequenz Asp-Leu-Asp-Leu-Glu-Met-Leu-Ala-Proh-Tyr-Ile-Pro-Met-Asp-Asp-Asp-Phe-Gln-Leu-Arg auf, entsprechend den HIF1α-Aminosäureresten 556 bis 575 mit einem hydroxylierten Prolin am Aminosäurerest 564.
Das bei der Erfindung verwendete Protein oder Polypeptid kann unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls hergestellt werden, das es kodiert (Die Begriffe Polypeptid und Protein sind, wie sie hierin verwendet werden, austauschbar). Ein „isoliertes" Nukleinsäuremolekül ist eines, das von anderen Nukleinsäuremolekülen separiert ist, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorhanden sind. Beispiele von isolierten Nukleinsäuremolekülen schließen rekombinante DNA-Moleküle, die in einem Vektor enthalten sind, rekombinante DNA-Moleküle, die in einer heterologen Wirtszelle bewahrt werden, teilweise oder im Wesentlichen gereinigte Nukleinsäuremoleküle und synthetische DNA- oder RNA-Moleküle ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Darüber hinaus kann ein „isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie etwa ein cDNA-Molekül, im Wesentlichen frei von zellulärem Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken oder, wenn es chemisch synthetisiert wird, aus chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien hergestellt werden.
Eine Nukleinsäure kann unter Verwendung von cDNA, mRNA oder alternativ genomische DNA als einem Templat und geeigneten Oligonukleotidprimern gemäß Standard-PCR-Amplifizierungstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Darüber hinaus können Oligonukleotide entsprechend der Nukleotidsequenz durch Standardsynthesetechniken, beispielsweise unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers, hergestellt werden. Der Vektor kann darüber hinaus einen Promotor umfassen, der mit dem Nukleinsäuremolekül funktionell verknüpft ist. Es kann eine den Vektor enthaltende Zelle bereitgestellt werden.
Das Licht erzeugende Fusionsprotein beispielsweise des ersten Ausführungsbeispiels stellt ein Mittel zur Erfassung von hypoxischen Gewebe oder von Gewebe bereit, das chronischer Hypoxie unterliegt, und bei dem deshalb das Risiko einer Ischämie besteht. Zusätzlich zu Gewebe, das beispielsweise infolge eines Schlaganfalls, einer Herzattacke oder einer Embolie ischämisch wird, stellt das Fusionsprotein auch ein Verfahren zur Erfassung von in Tumoren vorhandenem ischämischen Gewebe bereit. Somit kann die Erfindung verwendet werden, um solches Gewebe durch in Kontakt bringen von Gewebe, das im Verdacht steht, hypoxisch zu sein, mit einem Licht erzeugenden Fusionsprotein unter geeigneten Bedingungen, um die Ubiquitinierung des Fusionsproteins in normoxischen Gewebe zu veranlassen, zu erfassen, wodurch die Anwesenheit von hypoxischem Gewebe erfasst wird. Wie es im Folgenden ausführlicher beschrieben wird, stellt die Ligandenbindungsstelle des Licht erzeugenden Fusionsproteins aus eine Bindungsstelle für Ubiquitinligasen bereit, die das Protein in der Gegenwart von Sauerstoff zerstören. Unter geeigneten Bedingungen wird das bei der Erfindung verwendete Licht erzeugende Fusionsprotein deshalb in Gewebe, das nicht hypoxisch ist, d. h. die gut oxygeniert ist, „instabil" sein oder zerstört werden und seine Lichterzeugungseigenschaften werden in Gewebe, das hypoxisch ist, d. h. dem ausreichend Sauerstoff fehlt, „stabil" sein oder erhalten bleiben.
Entitäten können modifiziert oder konjugiert worden sein, so dass sie ein in der Erfindung verwendetes Licht erzeugendes Fusionsprotein enthalten. Solche konjugierten oder modifizierten Entitäten werden als Licht erzeugende Entitäten oder einfach als Konjugate bezeichnet. Die Konjugate selbst können beispielsweise die Form von Molekülen, Makromolekülen, Partikeln, Mikroorganismen oder Zellen annehmen. Die Verfahren, die verwendet werden, um ein Licht erzeugendes Fusionsprotein an eine Entität zu konjugieren, ist von der Natur des Licht erzeugenden Fusionsproteins und der Entität abhängig. Beispielhafte Konjugationsverfahren werden im Zusammenhang mit den im Folgenden beschriebenen Entitäten diskutiert werden.
Kleine Moleküle. Kleine Molekülentitäten, die bei der vorliegenden Erfindung anwendbar sind, schließen Verbindungen ein, die spezifisch mit einem Pathogen oder einem endogenen Liganden oder Rezeptor interagieren. Beispiele solcher Moleküle schließen Arzneimittel oder therapeutische Verbindungen, Toxine, wie etwa jene, die in den Giften von giftigen Organismen vorhanden sind, einschließlich bestimmte Arten von Spinnen, Schlangen, Skorpionen, Dinoflagelaten, Meeresschnecken und Bakterien, ferner Wachstumsfaktoren, wie etwa NGF, PDGF, TGF oder TNF, ferner Cytokine und bioaktive Peptide ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die kleinen Moleküle sind vorzugsweise an Licht erzeugende Fusionsproteine auf eine Weise konjugiert, dass die Bioaktivität des kleinen Moleküls nicht wesentlich beeinträchtigt wird. Konjugationen sind typischerweise chemischer Natur und können auf irgendeine Art zahlreicher dem Fachmann bekannter Verfahren ausgeführt werden.
Kleine Moleküle, die an bei der vorliegenden Erfindung verwendete Licht erzeugende Fusionsproteine konjugiert sind, können entweder in Tiermodellen von Humanzuständen oder -erkrankungen, oder direkt bei zu behandelnden menschlichen Patienten angewendet werden. Beispielsweise kann ein kleines Molekül, das mit hoher Affinität an eine Rezeptor bindet, der auf Tumorzellen exprimiert wird, in einem Tiermodell verwendet werden, um Tumoren zu lokalisieren und deren Größenabschätzungen zu erhalten und um Veränderungen des Tumorwachstums oder Metastasen in Folge einer Behandlung mit einem vermeintlichen therapeutischen Wirkstoff zu überwachen. Solche Moleküle können, wie oben beschrieben, verwendet werden, um Tumoreigenschaften in Krebspatienten zu überwachen Makromoleküle. Makromoleküle, wie etwa Polymere und Biopolymere, stellen ein anderes Beispiel von Entitäten dar, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung anwendbar sind. Exemplarische Makromoleküle schließen Antikörper, Antikörperfragmente, Licht erzeugende Fusionsproteine und bestimmte Vektorkonstrukte ein.
Antikörper und Antikörperfragmente, die von kommerziellen Quellen bezogen werden oder durch im Fachgebiet bekannte Verfahren angefertigt werden, können verwendet werden, um ihr Antigen in einem Säugetierpatienten zu lokalisieren, durch Konjugation der Antikörper an einen Licht erzeugenden Rest, Verabreichen des Konjugats beispielsweise durch Injektion, Ermöglich, dass das Konjugat sich an der Stelle des Antigens lokalisiert, und Abbilden des Konjugats. Beispielsweise können Antikörper erzeugt werden, die spezifisch für einen Proteinkomplex sind, der HIF1α und pVHL umfasst. Diese Antikörper können an einen Licht erzeugenden Rest (beispielsweise Fluorescein, Rhodamin, GFP) konjugiert sein.
Antikörper und Antikörperfragmente weisen für die Verwendung als Entitäten bei der vorliegenden Erfindung mehrere Vorteile auf. Durch ihre Natur stellen sie ihre eigenen Targeting-Reste dar. Darüber hinaus macht sie deren Größe der Konjugation mit mehreren Typen von Licht erzeugenden Fusionsproteinen zugänglich, enthaltend kleine fluoreszente Moleküle und fluoreszente und biolumineszente Proteine, ermöglicht ihnen sogar, im Vergleich beispielsweise zu Zellen oder Liposomen schnell zu diffundieren.
Die Licht erzeugenden Fusionsproteine können direkt an die Antikörper oder Antikörperfragmente konjugiert sein oder indirekt, beispielsweise unter Verwendung eines fluoreszenten sekundären Antikörpers. Die direkte Konjugation kann durch chemische Standardkupplung beispielsweise eines Fluorophors an den Antikörper oder das Antikörperfragment oder über Gentechnik bewerkstelligt werden. Es können Chimären von Fusionsproteinen konstruiert werden, die einen Antikbrper oder ein Antikörperfragment gekuppelt an ein fluoreszentes oder biolumineszentes Protein enthalten. Beispielsweise beschreiben Casadei et. al. ein Verfahren zur Anfertigung eines Vektorkonstrukts, das in der Lage ist, ein Fusionsprotein von Aequorin und ein Antikörpergen in Säugetierzellen zu exprimieren.
Konjugate, die Antikörper enthalten, können bei zahlreichen Anwendungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispielsweise kann ein markierter Antikörper, der gegen E-Selektion gerichtet ist, der an Entzündungsstellen exprimiert wird, verwendet werden, um die Entzündung zu lokalisieren und die Wirkungen von vermeintlichen antientzündlichen Wirkstoffen zu überwachen.
Vektorkonstrukte an sich können ebenso makromolekulare Entitäten darstellen, die auf die vorliegende Erfindung anwendbar sind. Beispielsweise kann ein eukaryotischer Expressionsvektor konstruiert werden, der ein therapeutisches Gen und ein Gen enthält, das unter der Kontrolle eines ausgewählten Promotors (d. h. eines Promotors, der in den Zellen exprimiert wird, auf die durch das therapeutische Gen abgezielt wird) ein Licht erzeugendes Molekül kodiert. Die Expression des Licht erzeugenden Moleküls, getestet unter Verwendung von Verfahren der vorliegenden Erfindung, kann verwendet werden, um die Stelle und den Pegel der Expression des therapeutischen Gens zu bestimmen. Dieser Ansatz kann insbesondere in Fällen sinnvoll sein, bei denen die Expression des therapeutischen Gens keinen unmittelbaren Phänotyp in der behandelten Person oder im Tiermodel aufweist.
Viren. Eine andere für bestimmte Gesichtspunkte der Erfindung verwendbare Entität sind Viren. Da viele Viren Pathogene sind, die Säugetierzellen infizieren, können Viren an ein Licht erzeugendes Fusionsprotein konjugiert und verwendet werden, um die anfängliche Stelle und Verbreitung der Infektion zu studieren. Zudem können mit einem Licht erzeugenden Fusionsprotein markierte Viren für das Screening nach Arzneimitteln verwendet werden, die die Infektion oder die Ausbreitung der Infektion inhibieren.
Ein Virus kann indirekt markiert werden, entweder mit einem Antikörper, der an ein Licht erzeugendes Fusionsprotein konjugiert ist, oder beispielsweise durch biotinilierende Virionen, wie sie im Fachgebiet bekannt sind, und dann deren Aussetzen zu Straptavidin, das mit einem detektierbaren Rest, wie etwa einem fluoreszenten Molekül, verbunden ist.
Alternativ können Virionen unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren direkt mit einem Fluorophor wie Rhodamin markiert werden. Das Virus kann auch genetisch manipuliert werden, so dass ein Licht erzeugendes Fusionsprotein exprimiert wird. Markierte Viren können in Tiermodellen verwendet werden, um eine Infektion zu lokalisieren und deren Progression zu überwachen, sowie zum Screening nach Arzneimitteln, die wirksam sind, um die Ausbreitung der Infektion zu inhibieren. Während sich beispielsweise Herpesvirusinfektionen als Hautläsionen manifestieren, kann dieses Virus auch Herpes-Enzephalitis verursachen. Solch eine Infektion kann unter Verwendung eines Virus, der durch irgendeines der oben beschriebenen Verfahren markiert wurde, lokalisiert und überwacht werden und es können verschiedene antivirale Wirkstoffe auf ihre Wirksamkeit bei Infektionen des zentralen Nervensystems (ZNS) getestet werden.
Partikel. Partikel, einschließlich Beads, Liposomen und dergleichen, stellen eine andere Entität dar, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung anwendbar ist. Infolge ihrer großen Größe können Partikel mit einer größeren Zahl an Licht erzeugenden Fusionsproteinen konjugiert werden als es beispielsweise kleine Moleküle tun können. Das führt zu einer höheren Konzentration der Lichtemission, die unter Verwendung kürzerer Expositionen oder durch dickere Gewebeschichten erfasst werden kann. Zudem können Liposomen konstruiert werden, um einen im Wesentlichen reinen Targeting-Rest oder Liganden zu erhalten, wie etwa ein Antigen oder einen Antikörper auf ihrer Oberfläche. Darüber hinaus können die Liposomen beispielsweise bis zu vergleichsweise hohen Konzentrationen mit biolumineszenten Proteinmolekülen beladen werden.
Darüber hinaus können zwei Typen von Liposomen derart auf gleichen Zelltyp gezielt ausgerichtet werden, dass Licht nur erzeugt wird, wenn beide vorhanden sind. Beispielsweise kann ein Liposom Luziferase tragen, während das andere Luziferin trägt. Die Liposomen können Targeting-Reste tragen und die Targeting-Reste auf den zwei Liposomen können gleich oder unterschiedlich sein. Virale Proteine auf infizierten Zellen können verwendet werden, um infizierte Gewebe oder Organe zu identifizieren. Zellen des Immunsystems können unter Verwendung eines einzelnen oder mehrerer Zelloberflächenmarker lokalisiert werden.
Die Liposomen sind vorzugsweise oberflächenbeschichtet, beispielsweise durch Inkorporation von Phospholipid-Polyethylenglykol-Konjugaten, um die Blutzirkulationszeit auszudehnen und ein stärkeres Targeting über den Blutstrom zu ermöglichen.
Zellen. Zellen, sowohl prokaryotische als auch eukaryotische, stellen eine andere Entität dar, die bei der vorliegenden Erfindung verwendbar ist. Wie Partikel können Zellen mit vergleichsweise hohen Konzentrationen an Licht erzeugenden Resten beladen werden, sie weisen aber den Vorteil auf, dass die Licht erzeugenden Reste beispielsweise durch ein heterologes genetische Konstrukt, das verwendet wird, um die Zelle zu transfizieren, bereitgestellt werden können. Zudem können Zellen ausgewählt werden, die „Targeting-Reste" oder Moleküle exprimieren, die wirksam sind, um sie auf gewünschte Stellen innerhalb des Patienten zu richten. Alternativ können die Zellen mit einem Vektorkonstrukt transfiziert werden, das einen geeigneten Targeting-Rest exprimiert.
Der verwendete Zelltyp hängt von der Anwendung ab. Beispielsweise können bakterielle Zellen verwendet werden, um den Infektionsprozess zu studieren und um die Wirkungen von Arzneimitteln oder therapeutischen Wirkstoffen auf den Entzündungsprozess mit einem hohen temporalen und spatialen Auflösungsniveau zu evaluieren. Bakterielle Zellen stellen wirksame Entitäten dar. Beispielsweise können sie leicht transfiziert werden, um hohe Pegel an Licht erzeugendem Fusionsprotein sowie hohe Pegel eines Targeting-Proteins zu exprimieren. Zudem ist es möglich, Bibliotheken von E. coli zu erhalten, die Bakterien enthalten, die oberflächengebundene Antikörper exprimieren, die gerastert werden können, um eine Kolonie zu identifizieren, die einen Antikörper gegen ein gewähltes Antigen (Staragene, La Jolla, Calif.) exprimieren. Bakterien aus dieser Kolonie können dann mit einem zweiten Plasmid transformiert werden, das ein Gen für ein Licht erzeugendes Protein enthält, und die Transformanten können bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung genutzt werden.
Pathogene Bakterien können mit einem Licht erzeugenden Fusionsprotein konjugiert werden und in einem Tiermodell verwendet werden, um den Infektionsprozess in vivo zu verfolgen und um potentielle anti-infektive Arzneimittel, wie etwa neue Antikörper, auf ihre Wirksamkeit beim Inhibieren der Infektion zu evaluieren.
Eukaryotische Zellen sind auch als Entitäten bei Gesichtspunkten der vorliegenden Erfindung verwendbar. Geeignete Expressionsvektoren, die gewünschte regulatorische Elemente enthalten, sind kommerziell erhältlich. Die Vektoren können verwendet werden, um Konstrukte zu erzeugen, die in der Lage sind, gewünschte Licht erzeugende Proteine in einer Vielfalt von eukaryotischen Zellen, einschließlich primären Kulturzellen, somatischen Zellen, lymphatischen Zellen etc., zu exprimieren. Die Zellen können bei transienten Expressionsstudien verwendet werden oder können im Fall von Zelllinien auf stabile Transformanten hin selektiert werden.
Die Expression des Licht erzeugenden Proteins in transformierten Zellen können unter Verwendung irgendeines aus einer Vielfalt von ausgewählten Promotoren reguliert werden. Wenn die Zellen beispielsweise als Licht erzeugende Entitäten verwendet werden sollen, die durch einen exprimierten Liganden oder Rezeptor auf eine Stelle im Patienten ausgerichtet sind, kann ein konstitutiv aktiver Promotor, wie etwa der CMV- oder SV40-Promotor verwendet werden. Die mit einem solchen Konstrukt transformierten Zellen können auch verwendet werden, um auf Verbindungen zu testen, die die Lichterzeugung inhibieren, beispielsweise durch Töten der Zellen.
Alternativ können die transformierten Zellen derart verabreicht werden, dass sie gleichmäßig im Patienten verteilt werden und das Licht erzeugende Fusionsprotein nur unter bestimmten Bedingungen exprimieren, wie etwa bei Infektion durch ein Virus oder Stimulation durch ein Cytokin. Promotoren, die auf Faktoren ansprechen, die mit diesen und anderen Stimuli verbunden sind, sind in Fachgebiet bekannt. Induzierbare Promotoren, wie etwa das Tet-System, können verwendet werden, um vorübergehend die Expression des Licht erzeugenden Proteins zu aktivieren.
Beispielsweise können lymphatische CD4⁺-Zellen mit einem Konstrukt transformiert werden, das tat-responsive HIV-LTR-Elemente enthält, und als ein Test für die Infektion mit HIV verwendet werden. Mit solch einem Konstrukt transformierte Zellen können in SCID-hu-Mäuse eingebracht und als Modell für humane HIV-Infektion und AIDS verwendet werden.
Tumorzellinien, die so transformiert wurden, dass sie das Licht erzeugende Fusionsprotein exprimieren, beispielsweise mit einem konstitutiv aktiven Promotor, können verwendet werden, um das Wachstum und die Metastase von Tumoren zu überwachen. Transformierte Tumorzellen können in ein Tiermodell injiziert werden, bei dem zugelassen wird, dass sich Tumormasse bildet, und die Größe und die Metastase der Tumormasse kann während der Behandlung mit vermeintlichen Wachstums- und Metastaseinhibitoren überwacht werden. Tumorzellen können auch aus Zellen erzeugt werden, die mit Konstrukten transformiert wurden, die regulierbare Promotoren enthalten, deren Aktivität für verschiedene invektive Agentien oder für therapeutische Verbindungen sensitiv ist.
Zelltransformation. Transformationsmethoden sowohl für prokaryotische als auch eukaryotische Zellen sind im Fachgebiet wohlbekannt. Vektoren, die die geeigneten regulatorischen Elemente und multiple Klonierungsstellen enthalten, sind weithin kommerziell erhältlich (beispielsweise Stratagene, La Jolla, Calif., oder Clontech, Palo Alto, Calif.).
Es können auch transgene Tiere verwendet werden, die ein heterologes Genkonstrukt enthalten, das ein Licht erzeugendes Fusionsprotein oder einen Komplex aus Proteinen kodiert. Das Konstrukt wird durch einen gewählten Promotor gesteuert und kann beispielsweise verschiedene akzessorische Proteine, die für die funktionale Expression des Licht erzeugenden Proteins erforderlich sind, sowie Selektionsmarker und Enhancer-Elemente einschließen.
Die Aktivierung des Promotors führt zu einer gesteigerten Expression der Gene, die die Licht erzeugenden Fusionsproteine und die akzessorischen Proteine kodieren. Die Aktivierung des Promotors wird durch die Wechselwirkung einer ausgewählten biokompatiblen Entität, oder Teilen der Entität, mit den Promotorelementen. Wenn die Aktivierung nur in einem Teil des Tieres auftritt, werden nur Zellen in diesem Teil das Licht erzeugende Protein exprimieren.
Licht erzeugende Fusionsproteine werden einem Patienten typischerweise durch irgendeine einer Vielfalt von Methoden verabreicht, ihnen wird ermöglicht, sich im Patienten zu lokalisieren, und werden abgebildet. Da die Bildgebung, oder das Messen von Photonenemission aus dem Patienten, bis zu mehreren zehn Minuten dauern kann, wird der Patient während des Bildgebungsprozesses zweckmäßigerweise immobilisiert. Die Bildgebung des Licht erzeugenden Polypeptidrestes bringt die Verwendung von beispielsweise einem Photodetektor mit sich, der in der Lage ist, extrem niedrige Pegel an lichttypische Einzelphotonenereignissen zu erfassen und die Photonenemission zu integrieren, bis ein Bild konstruiert werden kann. Beispiele solcher sensitiven Photodetektoren schließen Geräte ein, die die Einzelphotonenereignisse intensivieren, bevor die Ereignisse durch eine Kamera erfasst werden, und Kameras (beispielsweise mit flüssigem Stickstoff gekühlt), die in der Lage sind, einzelne Photonen über dem Hintergrundrauschen zu erfassen, das einem Detektionssystem inhärent ist.
Sobald ein Photonenemissionsbild erzeugt ist, wird es typischerweise auf ein „normales" reflektiertes Lichtbild des Patienten überlagert, um einen Referenzrahmen für die Quelle der emittierten Photonen bereitzustellen (d. h. um die Licht erzeugenden Fusionsproteine in Bezug auf den Patienten lokalisieren). Solch ein „Mischbild" wird dann analysiert, um die Lokalisierung und/oder die Menge eines Ziels im Patienten zu bestimmen.
Licht erzeugende Fusionsproteine, die sich an ihren intendierten Stellen in einem Patienten lokalisiert haben, können auf zahlreichen Wegen abgebildet werden. Im Folgenden werden Richtlinien für eine solche Bildgebung sowie spezifische Beispiele beschrieben.
Lokalisierung von Licht erzeugenden Fusionsproteinen. Im Fall von „zielgerichteten" Konjugaten, d. h. Konjugaten, die einen Targeting-Rest enthalten, ein Molekül oder ein Merkmal, das so entworfen ist, dass das Konjugat innerhalb eines Patienten oder Tieres an einer bestimmten Stelle oder bestimmten Stellen lokalisiert wird, wobei sich Lokalisierung auf einen Zustand bezieht, wenn ein Gleichgewicht zwischen gebundenen, „lokalisierten", und ungebundenen, „freien" Entitäten innerhalb eines Patienten im Wesentlichen erreicht worden ist. Die Rate, mit der solch ein Gleichgewicht erreicht wird, hängt vom Weg der Verabreichung ab. Ein Konjugat, das beispielsweise durch intravenöse Injektion verabreicht wird, um Thrombi zu lokalisieren, können die Lokalisierung, oder die Ansammlung an den Thrombi, innerhalb von Minuten erreichen. Demgegenüber kann ein Konjugat, das oral verabreicht wird, um eine Infektion im Darm zu lokalisieren, mehrere Stunden benötigen, um die Lokalisierung zu erreichen.
Alternativ kann sich die Lokalisierung einfach auf die Stelle der Entität innerhalb des Patienten oder Tieres zu gewählten Zeitperioden beziehen, nachdem die Entität verabreicht wurde. Bei einem verwandten Gesichtspunkt kann die Lokalisierung von beispielsweise injizierten Tumorzellen, die einen Licht erzeugenden Rest exprimieren, aus den Zellen bestehen, die eine Stelle innerhalb des Tiers kolonisieren und eine Tumormasse bilden.
Mittels eines anderen Beispiels wird die Lokalisierung erreicht, wenn eine Entität in Folge der Verabreichung verteilt wird. Beispielsweise wird im Fall eines Konjugats, das verabreicht wurde, um die Sauerstoffkonzentration im verschiedenen Organen im ganzen Patienten oder Tier zu messen, das Konjugat „lokalisiert", oder aussagefähig, wenn es einen im Wesentlichen stabilen Zustand der Verteilung im Patienten oder Tier erreicht hat.
In allen der obigen Fälle kann durch einen Fachmann eine vernünftige Abschätzung der Zeit, um die Lokalisierung zu erreichen, vorgenommen werden. Darüber hinaus kann der Zustand der Lokalisierung als eine Funktion der Zeit durch Abbilden des Licht erzeugenden Konjugats gemäß den Verfahren der Erfindung verfolgt werden.
Das verwendete „Photodetektorgerät" sollte eine ausreichend hohe Empfindlichkeit aufweisen, um die Bildgebung von schwachem Licht aus dem Inneren eines Säugetiers in einem vernünftigen Zeitraum zu ermöglichen und das Signal von einem solchen Gerät zu verwenden, um ein Bild zu konstruieren.
In Fällen, in denen es möglich ist, Licht erzeugende Reste zu verwenden, die extrem hell sind, und/oder Licht erzeugende Fusionsproteine zu erfassen, die nahe der Oberfläche des abgebildeten Patienten oder Tieres, kann eine Nachtsichtbrille oder eine hochsensitive Standard-Videokamera, wie etwa eine Silicon-Intensified-Tube-Kamera (SIT-Kamera) (beispielsweise von Hamamatsu Photonic Systems, Bridgewater, N. J.) verwendet werden.
Bei extrem niedrigen Lichtpegeln wird der Photonenfluss pro Einheitsfläche so gering, dass die abgebildete Szene nicht länger kontinuierlich erscheint. Anstelle dessen wird sie durch einzelne Photonen repräsentiert, die sich sowohl zeitlich als auch räumlich voneinander unterscheiden. Auf einem Monitor betrachtet erscheint ein solches Bild als funkelnde Lichtpunkte, die jeweils ein einzelnes erfasstes Photon repräsentieren. Durch Akkumulieren dieser erfassten Photonen in einem Digitalbildprozessor über die Zeit kann ein Bild erlangt und konstruiert werden. Im Gegensatz zu herkömmlichen Kameras, bei denen das Signal an jedem Bildpunkt einem Intensitätswert zugeordnet ist, besitzt die Amplitude bei der Bildgebung durch Photonenzählung keine Aussagekraft. Es ist lediglich das Ziel, das Vorhandensein eines Signals (Photons) zu erfassen und das Auftreten des Signals in Bezug auf seine Position mit der Zeit zu zählen.
Wenigstens zwei Typen von Photodetektorgeräten, die unten beschrieben werden, können einzelne Photonen erfassen und ein Signal erzeugen, das durch einen Bildprozessor analysiert werden kann. Rauschreduzierte Photodetektionsgeräte erreichen Empfindlichkeit durch Vermindern des Hintergrundrauschens in Photonendetektor, im Gegensatz zur Verstärkung des Photonensignals. Rauschen wird primär durch Kühlen der Detektoranordnung verringert. Die Geräte schließen Charge-Coupled-Device-Kameras (CCD-Kameras) ein, die als „back-thinned" gekühlte CCD-Kameras bezeichnet werden. Bei empfindlicheren Instrumenten wird die Kühlung beispielsweise unter Verwendung von flüssigem Stickstoff erreicht, der die Temperatur der CCD-Anordnung auf ungefähr –120°C bringt. „Backthinned" bezieht sich auf eine ultradünne Rückplatte, die die Weglänge verringert, die ein Photon zurücklegt, bis es erfasst wird, wodurch die Quanteneffizienz erhöht wird. Eine besonders empfindliche backthinned kryogene CCD-Kamera ist die „TECH 512", eine Serie 200 Kamera, die von Photometrics, Ltd. (Tucson, Ariz.) erhältlich ist.
„Photonenverstärkungsgeräte" verstärken Photonen, bevor sie den Detektionsschirm treffen. Diese Gruppe schließt CCD-Kameras mit Verstärkern ein. Ein Mikrokanalverstärker enthält typischerweise eine Metallanordnung aus Kanälen, senkrecht zu und ko-extensiv mit dem Detektionsschirm der Kamera. Die Mikrokanalanordnung wird zwischen der Probe, dem Patienten oder dem Tier, die abzubilden sind, und der Kamera platziert. Die meisten Photonen, die in die Kanäle der Anordnung eindringen, kommen mit einer Seite eines Kanals in Kontakt, bevor sie austreten. Eine quer zur Anordnung angelegte Spannung führt zur Freisetzung von vielen Elektronen aus jeder Photonenkollision. Die Elektronen aus einer solchen Kollision verlassen ihren ursprünglichen Kanal in einem „Schrotflinten"-Muster und werden durch die Kamera erfasst.
Eine noch größere Empfindlichkeit kann durch Anordnen von Mikrokanalanordnungen in Serie erreicht werden, so dass in der ersten Stufe erzeugte Elektronen wiederum zu einem verstärkten Elektronensignal an der zweiten Stufe führen. Steigerungen der Empfindlichkeit werden jedoch auf Kosten der räumlichen Auflösung erzielt, die mit jeder zusätzlichen Verstärkungsstufe sinkt. Ein beispielhaftes Photonendetektionsgerät basierend auf Mikrokanalverstärkem ist die C2400-Serie, die von Mamamatsu erhältlich ist.
Bildprozessoren verarbeiten Signale, die von Photodetektorgeräten erzeugt werden, die Photonen Zählen, um ein Bild zu konstruieren, das beispielsweise auf einem Monitor angezeigt oder auf einem Videodrucker ausgedruckt werden kann. Solche Bildprozessoren werden typischerweise als Teil von Systemen verkauft, die die oben beschriebenen empfindlichen Photonenzählkameras enthalten und demgemäß von der gleichen Quelle erhältlich sind. Die Bildprozessoren werden üblicherweise mit einem Personalcomputer verbunden, wie etwa einen IBM-kompatiblen PC oder einen Apple Macintosh (Apple Computer, Cupertino, Calif.), die als ein Teil eines erworbenen Bildgebungssystems enthalten sein können oder nicht. Sobald die Bilder in der Form von digitalen Dateien vorliegen, können sie durch eine Vielzahl von Bildverarbeitungsprogrammen (wie etwa "ADOBE PHOTOSHOP", Adobe Systems, Adobe Systems, Mt. View, Calif.) manipuliert und ausgedruckt werden.
Das Detektionsfeld des Geräts wird als die Fläche definiert, von der konsistente Messungen von Photonenemission erhalten werden können. Im Fall einer Kamera, die eine optische Linse verwendet, ist das Detektionsfeld einfach das der Kamera durch die Linse gewährte Sichtfeld. Gleicherweise ist, wenn das Photodetektorgerät eine Nachtsichtbrille ist, das Detektionsfeld das Sichtfeld der Brille.
Alternativ kann das Detektionsfeld eine Fläche sein, die durch die Enden der faseroptischen Kabel definiert wird, das in einer dicht gepackten Anordnung angeordnet ist. Die Anordnung ist so konstruiert, dass die Fläche maximiert wird, die durch die Enden der Kabel abgedeckt wird, im Gegensatz zu Leerräumen zwischen Kabeln, und in unmittelbarer Nähe zum Patienten platziert wird. Beispielsweise kann ein klares Material, wie etwa Plexiglas, an den Patienten angrenzend platziert werden und die Anordnung an das klare Material angrenzend, gegenüber dem Patienten, befestigt werden.
Das faseroptische Kabel endet gegenüber der Anordnung und kann direkt mit dem Detektions- oder Verstärkungsgerät verbunden werden, wie etwa das Eingangsende eines Mikrokanalverstärkers, was die Notwendigkeit für eine Linse beseitigt. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist, dass die Streuung und/oder der Verlust von Photonen durch Beseitigung eines großen Teils des Luftzwischenraums zwischen dem Patienten und dem Detektor und/oder Beseitigung der Linse vermindert werden. Sogar eine hochtransparente Linse überträgt nur einen Teil des Lichts, das das vordere Linsenelement erreicht.
Mit LPGs mit höherer Intensität können Photodiodenanordnungen verwendet werden, um die Photonenemission zu messen. Eine Photodiodenanordnung kann in einer vergleichsweise flexiblen Platte eingebaut werden, die es dem praktischen Arzt ermöglicht, die Anordnung um den Patienten zu „wickeln" Dieser Ansatz minimiert auch den Photonenverlust und stellt zudem ein Mittel bereit, um dreidimensionale Bilder der Biolumineszenz zu erhalten. Andere Ansätze können verwendet werden, um dreidimensionale Bilder zu erzeugen, einschließlich mehrerer Detektoren, die um den Patienten platziert sind, oder einen Rasterdetektor oder -detektoren.
Es versteht sich von selbst, dass sich nicht notwendigerweise das gesamte Tier oder der Patient im Detektionsfeld des Photodetektionsgeräts befinden muss. Wenn man beispielsweise ein Licht emittierendes Konjugat misst, das dafür bekannt ist, sich in einem bestimmten Bereich des Patienten zu lokalisieren, muss nur Licht aus diesem Bereich und eine ausreichende umgebende „dunkle" Zone gemessen werden, um die gewünschte Information zu erhalten.
Immobilisierung des Patienten. In jenen Fällen, bei denen gewünscht wird, ein zweidimensionales oder dreidimensionales des Patienten zu erzeugen, kann der Patient während der Dauer der Messung der Photonenemission im Detektionsfeld der Photodetektionsgeräte immobilisiert werden. Wenn das Signal ausreichend hell ist, dass ein Bild aus der in weniger als 20 Millisekunden gemessenen Photonenemission konstruiert werden kann und der Patient nicht besonders bewegt wird, kann es sein, dass keine speziellen Vorkehrungen zur Immobilisierung erforderlich sind, mit der Ausnahme sicherzustellen, dass sich der Patient am Beginn der Messperiode im Feld des Detektionsgeräts befindet.
Wenn andererseits die Photonenemissionsmessung länger als etwa 20 msec benötigt und der Patient bewegt wird, müssen Vorkehrungen in Betracht gezogen werden, um die Immobilisierung des Patienten während der Messung der Photonenemission sicherzustellen, entsprechend dem Grad an Bewegung des Patienten, um die räumliche Information im konstruierten Bild zu bewahren. Beispielsweise kann in einem Fall, bei dem der Patient eine Person ist und die Photonenemissionsmesszet in der Größenordnung von wenigen Sekunden liegt, der Patient einfach aufgefordert werden, während der Photonenemissionsmessung (Bildgebung) so still wie möglich zu verbleiben. Wenn demgegenüber der Patient ein Tier ist, wie etwa eine Maus, kann der Patient unter Verwendung beispielsweise eines Anästhetikums oder einer mechanischen Zähmungsvorrichtung immobilisiert werden.
In Fällen, bei denen gewünscht wird, nur die Gesamtmenge an Licht zu messen, die einem Patienten oder Tier entspringt, muss der Patient nicht notwendigerweise immobilisiert werden, gerade für lange Photonenemissionsmessperioden. Alles was nötig ist, ist dass der Patient während der Bildgebung auf das Detektionsfeld des Photodetektors eingeschränkt wird. es ist jedoch zu beachten, dass die Immobilisierung des Patienten während solch einer Messung die Konsistenz der erhaltenen Ergebnisse verbessern kann, weil die Dicke des Gewebes, durch das erfasste Photonen laufen, von Tier zu Tier gleichmäßiger sein werden.
Weitere Berücksichtigungen während der Bildgebung.
Die Visualisierung von fluoreszenten Licht erzeugenden Resten erfordert eine Anregungslichtquelle sowie eine Photonendetektor. Darüber hinaus versteht es sich von selbst, dass die Anregungslichtquelle während der Messung von Photonenemission aus dem Licht erzeugenden Rest angeschaltet wird.
Die geeignete Auswahl eines Fluorophors, Anordnung der Lichtquelle und Auswahl und Anordnung von Filtern, die alle die Konstruktion eines aussagefähigen Bildes erleichtern, werden oben im Abschnitt über fluoreszente Licht erzeugende Reste diskutiert.
Hochauflösende Bildgebung. Photonenstreuung durch Gewebe begrenzt die Auflösung, die durch Bildgebung von LGMs durch die Messung der Gesamtphotonenemission erreicht werden kann. Es versteht sich von selbst, dass die vorliegende Erfindung auch Ausführungsbeispiele einschließt, bei denen die Lichterzeugung von LGMs zu einer externen Quelle synchronisiert ist, die auf ausgewählte Punkte innerhalb des Patienten fokussiert werden kann, die aber nicht signifikant in Gewebe streut, was die Konstruktion von hochauflösenden Bildern ermöglicht. Beispielsweise kann ein fokussiertes Ultraschallsignal verwendet werden, um in drei Dimensionen zu scannen, wobei der Patient abgebildet wird. Lichterzeugung aus Bereichen, die im Ultraschallbrennpunkt liegen, können von anderen Photonenemissionen durch eine charakteristische Oszillation aufgelöst werden, die dem Licht durch den Ultraschall vermittelt wird.
Konstruieren eines Bildes der Photonenemission. In Fällen, bei denen aufgrund eines außerordentlich hellen Licht erzeugenden Restes und/oder der Lokalisierung von Licht erzeugenden Fusionsproteinen nahe der Oberfläche des Patienten eine „Nachtsicht"-Brille oder eine hochempfindliche Videokamera verwendet wurde, um ein Bild zu erhalten, wird das Bild einfach auf einem Videomonitor betrachtet oder dargestellt. Wenn erwünscht, kann das Signal von einer Videokamera durch einen Bildprozessor umgeleitet werden, der in einem Speicher einzelne Videoframes zur Analyse oder zum Ausdrucken speichern kann und/oder die Bilder zur Analyse und zum Ausdrucken auf einem Computer digitalisieren kann.
Wenn ein Photonenzählansatz verwendet wird, erzeugt die Photonenemission alternativ im Bildprozessor eine Anordnung von Zahlen, die die Zahl der an jeder Bildpunktstelle erfassten Photonen repräsentiert. Diese Zahlen werden verwendet, um ein Bild zu erzeugen, typischerweise durch Normalisierung der Photonenzählungen (entweder auf eine festen vorgewählten Wert oder auf die maximale in irgendeinem Bildpunkt erfasste Zahl) und Umwandeln der normalisierten Zahl in eine Helligkeit (Graustufen) oder in eine Farbe (Falschfarben), die auf einem Monitor dargestellt werden. Bei einer Falschfarbendarstellung sind typische Farbzuordnungen wie folgt. Bildpunkte mit null Photonenzählungen werden schwarz zugeordnet, geringe Zählungen blau und zunehmende Zählungen Farben mit zunehmenden Wellenlängen bis zu rot für die höchsten Photonenzählwerte. Die Stelle der Farben auf dem Monitor entspricht der Verteilung der Photonenemission und demgemäß der Stelle der Licht erzeugenden Fusionsproteine.
Um einen Referenzrahmen für die Konjugate bereitzustellen, wird typischerweise ein Graustufenbild des (noch immobilisierten) Patienten, von dem die Photonenemission gemessen wurde, konstruiert. Solch ein Bild kann beispielsweise durch Öffnen einer Tür der Bildgebungskammer oder -kasten bei dunklem Raumlicht und Messen von reflektierten Photonen (typischerweise beansprucht es einen Teil der Zeit die Messung von Photonenemission) konstruiert. Das Graustufenbild kann entweder vor der Messung der Photonenemission oder danach konstruiert werden. Das Bild der Photonenemission wird typischerweise auf das Graustufenbild überlagert, um ein zusammengesetztes Bild der Photonenemission in Bezug auf den Patienten zu erzeugen.
Wenn es gewünscht wird, die Lokalisierung und/oder das Signal von einem Licht emittierenden Konjugat über die Zeit zu verfolgen, beispielsweise um die Wirkungen einer Behandlung auf die Verteilung und/oder Lokalisierung eines gewählten biokompatiblen Rests aufzuzeichnen, kann die Messung der Photonenemission oder die Bildgebung in ausgesuchten Zeitintervallen wiederholt werden, um eine Serie von Bildern zu konstruieren. Die Intervalle können so kurz wie Minuten oder so lang wie Tage oder Wochen sein.
Analyse von Photonenemissionsbildern. Bilder, die durch verfahren und/oder unter Verwendung von Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, können durch eine Vielfalt von Methoden analysiert werden. Sie reichen von einer einfachen visuellen Untersuchung, mentale Evaluierung und/oder Ausdrucken eines Papierausdrucks, zur differenzierterer Bildanalyse. Die Interpretation der aus einer Analyse erhaltenen Information hängt von dem unter Beobachtung stehendem Phänomen und der verwendeten Entität ab.
Anwendungen: Lokalisierung von Tumorzellen.
Das Wachstum und die metastatische Streuung von Tumoren können unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung überwacht werden. Insbesondere in Fällen, bei denen bei einer Person ein primärer Tumor diagnostiziert wurde, können gegen die Zellen des Tumors gerichtete LGPs verwendet werden, um sowohl die Begrenzungen des Tumors zu definieren, als auch zu bestimmen, ob Zellen aus der primären Tumormasse in distale Stellen einwanderten und kolonisierten. Beispielsweise können einem Patienten LGPs, wie etwa Liposomen, die Antikörper enthalten, die gegen Tumorantigene gerichtet und mit LGPs beladen sind, verabreicht werden, ihnen ermöglicht werden, an Tumorzellen im Patienten zu binden, abgebildet werden und die Bereiche der Photonenemission können mit Bereichen von Tumorzellen korreliert werden.
Bei einem verwandten Gesichtspunkt können in ausgewählten Zeitintervallen Bilder erzeugt werden, die Tumoren lokalisierende LGPs nutzen, wie etwa solche, die oben beschrieben wurden, um das Wachstum, die Progression und Metastasen von Tumoren in einem Patienten mit der Zeit zu überwachen. Solch eine Überwachung kann sinnvoll sein, um Ergebnisse einer Antitumortherapie aufzuzeichnen, oder als Teil einer Rasterung von vermeintlichen therapeutischen Verbindungen, die dazu verwendbar sind, Tumorwachstum oder -metastasierung zu hemmen.
Bei der Ausführung der Erfindung kann das Gewebe und das Licht erzeugende Fusionsprotein in vitro derart in Kontakt gebracht werden, dass eine oder mehrere biologische Proben (beispielsweise Blut, Serum, Zellen, Gewebe) auf einem Substrat unter dem Fachmann bekannten Gewebekulturbedingungen, um die Vitalität des Gewebes zu erhalten, angeordnet und dann wird das Fusionsprotein zur Gewebekultur hinzugefügt. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Verfahren der Erfindung ist das Gewebe Säugetiergewebe, insbesondere Humangewebe.
Die Verfahren der Erfindung können auch in vivo ausgeführt werden, wobei die biologische Probe und das Licht erzeugende Fusionsprotein in Kontakt gebracht werden, nachdem das Fusionsprotein (oder ein Vektor, der selbiges kodiert) einem Patienten verabreicht worden ist, das im Verdacht steht, ischämisches Gewebe zu enthalten, unter Bedingungen, die die Erfassung des Fusionsproteins in im Patienten vorhandenen ischämischem Gewebe zu ermöglichen. Die Erfindung gehört demgemäß dem Gebiet der prädiktiven Medizin an, bei der diagnostische Tests, prognostische Tests, Pharmakogenomik und die Überwachung klinischer Tests für prognostische (prädiktive) Zwecke verwendet werden, um dadurch eine Person prophylaktisch zu behandeln. Demgemäß betrifft ein Gesichtspunkt der Erfindung diagnostische Tests zum Bestimmen des Vorhandenseins von ischämischem Gewebe in einer biologischen Probe, um dadurch zu bestimmen, ob eine Person von einer Krankheit oder Störung befallen ist oder gefährdet ist, Störungen zu entwickeln, die mit hypoxischen Zuständen assoziiert sind. Prognostische (oder prädiktive) Tests zum Bestimmen, ob eine Person gefährdet ist, Krankheiten zu entwickeln, die sich aus Ischämie ergeben, sind ebenfalls vorgesehen.
Verfahren zur Bestimmung hypoxischer Zustände, Krebs oder Infektion in einer Person, um dadurch geeignete therapeutische oder prophylaktische Wirkstoffe für diese Person auszusuchen (hierin als „Pharmakogenomik" bezeichnet) werden ebenfalls offenbart. Pharmakogenomik ermöglicht die Auswahl von Wirkstoffen (beispielsweise Arzneimitteln) zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung einer Person auf der Grundlage des Gentyps der Person (beispielsweise dem Genotyp der Person, der auf die Fähigkeit der Person untersucht wird, auf einen einzelnen Wirkstoff zu reagieren). Die Verfahren der Erfindung können auch verwendet werden, um den Einfluss der Wirkstoffe (beispielsweise Arzneimittel, Verbindungen) auf hypoxische Zustände, Krebs oder Infektion in klinischen Tests zu überwachen.
Kits zur Erfassung des Vorhandenseins von hypoxischen Zuständen, Krebs oder Infektion oder ischämische, kanzerösem oder infiziertem Gewebe in einer biologischen Probe werden ebenfalls offenbart. Beispielsweise kann das Kit das in der Erfindung verwendete Fusionsprotein umfassen, verpackt in einem geeigneten Behälter.
Somit können die hierin beschriebenen diagnostischen Methoden darüber hinaus genutzt werden, um Patienten zu identifizieren, die eine Krankheit oder Störung, die mit hypoxischen Zuständen, Krebs oder Infektion assoziiert sind, aufweisen oder gefährdet sind, diese zu entwickeln. Darüber hinaus können die hierin beschriebenen prognostischen Tests verwendet werden, um zu bestimmen, ob einem Patienten ein Wirkstoff (beispielsweise ein Agonist, ein Antagonist, ein Peptidmimetikum, ein Protein, ein Peptid, eine Nukleinsäure, ein kleines Molekül oder ein anderer Arzneimittelkandidat) verabreicht werden sollte, um eine Krankheit oder eine Störung zu behandeln, die mit hypoxischen Zuständen, Krebs oder Infektion assoziiert sind.
Ein Verfahren zum Testen einer Verbindung auf Aktivität beim Fördern der HIF-Stabilisierung, die das in Kontakt bringen der Verbindung, dem ischämischen Gewebe und dem Fusionsprotein der Erfindung unter Bedingungen umfasst, die geeignet sind, um das Fusionsprotein zu erfassen, wenn die Verbindung die HIF-Stabilisierung fördert, werden ebenfalls offenbart. Das Verfahren (hierin auch als ein „Screeningtest" bezeichnet) kann zum Identifizieren von Modulatoren verwendet werden, beispielsweise Kandidaten oder Testverbindungen oder Wirkstoffe (beispielsweise Peptide, Peptidmimetika, kleine Moleküle oder andere Arzneimittel), die die HIF-Stabilisierung fördern.
Die Testverbindungen können unter Verwendung eines der zahlreichen Ansätze bei im Fachgebiet bekannten Verfahren kombinatorischer Bibliotheken erhalten werden, die folgendes einschließen: biologische Bibliotheken, räumlich adressierbare Parallelfestphasen- oder Lösungsphasenbibliotheken, Verfahren synthetischer Bibliotheken unter Verwendung von Affinitätschromatographieselektion. Der Ansatz der biologischen Bibliothek ist auf Peptidbibliotheken beschränkt, während die anderen vier Ansätze auf peptidische, nichtpeptidische Oligomer- oder Kleinmolekülbibliotheken von Verbindungen anwendbar sind. Siehe beispielsweise Lam, 1997, Anticancer Drug Design 12:145.
Bibliotheken von chemischen und/oder biologischen Mischungen, wie etwa Pilz-, Bakterien- oder Algenextrakte sind im Fachgebiet bekannt und können wie oben beschrieben gerastert werden. Beispiele von Verfahren für die Synthese von molekularen Bibliotheken können im Fachgebiet gefunden werden, beispielsweise bei: DeWitt et. al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909; Erb et. al., 1994, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 91: 11422; Zuckermann et. al., 1994, J. Med Chem. 37: 2678; Cho et. al., 1993, Science 261: 1303; Carrell et. al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et. al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061 und Gallop et. al., 1994, J. Med Chem. 37: 1233.
Bibliotheken von Verbindungen können in Lösung (beispielsweise Houghten, 1992, Biotechniques 13: 412-421) oder auf Beads (Lam, 1991, Nature 354: 82-84), auf Chips (Fodor, 1993, Nature 364: 555-556), Bakterien (Ladner, US-Patent Nr. 5,223,409 ), Sporen (Ladner, US-Patent 5,233,409 ), Plasmids (Cull et. al., 1992, Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 1865-1869) oder auf Phagen (Scott und Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990, Science 249: 404-406; Cwirla et. al., 1990. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 87: 6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222: 301-310; Ladner, US-Patent Nr. 5,233,409 .) präsentiert werden.
1A, hier wird nun auf die Zeichnung Bezug genommen, ist eine schematische Darstellung von verschiedenen Fusionsproteinen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. „T" gibt die Enzymzielstelle auf dem Fusionsprotein an, „E" gibt das Enzym an, „X" gibt die Modifizierungsstelle auf dem Fusionsprotein an und „R" gibt die Reporterdomäne des Fusionsproteins an. Die Modifikation bei „X" durch „E" führt dazu, dass das Fusionsprotein aktiv oder inaktiv „An/Aus" wird. 1B zeigt ein Ausführungsbeispiel, bei dem das „T" und das „X" separate Domänen und in cis auf dem Fusionsprotein sind. 1C zeigt ein bei der Erfindung verwendetes Ausführungsbeispiel, wobei das „T" und das „X" des Fusionsproteins kongruent innerhalb einer Domäne des Fusionsproteins sind. 1D zeigt ein bei der Erfindung verwendetes Ausführungsbeispiel, wobei das „T" ein Protein ist, das mit dem Fusionsprotein assoziiert ist, das das „X" enthält.
2 ist eine schematische Darstellung von verschiedenen Fusionsproteinen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. 2A ist eine schematische Darstellung eines Fusionsproteins und eines assoziierten Proteins, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wobei ein Fusionsprotein und ein assoziiertes Protein „A" eine bekannte Homo- oder Heterodimerisierungsdomäne „HD" entsprechend der Enzymzielstelle eines Enzyms, wobei Bindung des enzymassoziierten „A" an das „HD" auf dem Fusionsprotein zu einer Modifikation des Fusionsproteins bei „X" führt. 2B ist ein verwandtes Fusionsprotein, das bei der Erfindung verwendet wird, bei dem eine Bindungsdomäne eines Proteins „A", das eine Enzymzielstelle „T" enthält, mit einer Bindungsdomäne „B" eines Fusionsproteins wechselwirkt, was dazu führt, dass das Enzym „E" die Reporterdomäne „R" des Fusionsproteins „B" an der Modifizierungsstelle „X" derart modifiziert, dass das Fusionsprotein Licht emittiert oder kein Licht emittiert oder veranlasst wird, Licht zu emittieren.
3 pVHL, das an eine modifizierte Form von HIF bindet. (A) zeigt pVHL-fehlerhafte renale Karzinomzellen, die mit zunehmenden Mengen an Desferoxamin (2, 10, 100, 1000 µm) oder Kobaltchlorid (2, 10, 100, 1000 µm) behandelt und mit Kontrolle (Bahn 1) oder Anti-HIF2α-Antikörper immunpräzipiert wurden. Gebundene Proteine wurden durch Anti-HIF2α-Immunblot (IB) oder durch Farwestern-(FW)-Analyse mit gereinigten pVHL/Elongin B/Elongin C Komplexen (VBC-Komplexen) analysiert. (B) zeigt die VBC-Farwestern- und Anti-HIF2α-Immunblot-Analyse von ts20-Zellen, die bei einer restriktiven Temperatur unter hypoxischen oder normoxischen Bedingungen gezüchtet wurden. (C) und (D) zeigen GST-HIF1α (530 bis 652), das die von Sauerstoff abhängende Degradationsdomäne (ODD) enthält, produziert in E. Coli, gewonnen auf Glutathion-Sepharose und 90 min lang bei 30°C mit Kaninchen-Reticulozytenlysat inkubiert. Bei (D, Bahn 3) wurde das Reticulozytenlysat zuerst 20 min lang hitzeinaktiviert. Im Anschluss an stringente Waschungen wurde das GST-ODD-Protein einem VBC-Westemblot und Anti-GST-Immunblot-Analyse unterworfen.
4 zeigt pVHL-Bindung an ein HIF1α-abgeleitetes Peptid, wenn Leu562 uns Pro564 intakt sind. (A) zeigt die Bindung des angegebenen ³⁵S-markierten Gal4-HIF1α, von Fusionsproteinen an immobilisiertes GST-pVHL, Elongin B, Elongin C Komplexe. (B) zeigt die Bindung von ³⁵S-markiertem pVHL an biotinyliertes HIF1α-Peptide (556 bis 575) mit den angegebenen Substitutionen der Reste 561 bis 568. „+" gibt die Präinkubation von Peptid mit unprogrammiertem Reticulozytenlysat vor der Zugabe von pVHL. (C und D) zeigen ³⁵S-markierte Wildtyp-(WT), Pro564Ala- und Leu562Ala- volle Länge HIF1α-(Feld C) und Gal4-HA-HIF1α-(530 bis 652) (Feld D) Proteine, immunpräzipiert mit Anti-HA-Antikörper oder eingefangen mit immobilisierten GST-VBC-Komplexen. WG = Weizenkeimextrakt; Retic = Kaninchen-Reticulozytenlysat.
5 zeigt die Ubiquitinierung und Degradation von HIF, der mit Leu562 und Pro 564 verknüpft ist. (A) zeigt die In-vitro-Ubiquitinierung von ³⁵S-markiertem Wildtyp, Leu562A und Pro564A Gal4-HA-HIF1α-(530 bis 652) in der Gegenwart von S100-Extrakten, hergestellt aus pVHL-defektiven renalen Karzinomzellen, die stabil transfiziert wurden, um Wildtyp-pVHL herzustellen, oder mit leerem Vektor. (B) zeigt die In-vitro-Degradation von ³⁵S-markiertem Wildtyp, Leu562A und Pro564A in Xenopus-Eiextrakten. (C) ist eine Anti-HA-Immunblot-Analyse von COS7-Zellen, die mit 1,5 oder 3,5 µg Plasmiden, die Wildtyp- oder P564A-HIF1α kodieren, in der Gegenwart oder Abwesenheit von Desferoxamin transient transfiziert wurden.
6 zeigt Prolinhydroxylierung, die mit pVHL-Bindung verknüpft ist. (A) ist eine MALDI-TOF-Analyse von Wildtyp, Pro564Ala und Leu562Ala biotinylierten HIF (555 bis 575) Peptiden im Anschluss an Inkubation mit Kaninchen-Reticulozytenlysat. (B) zeigt Gal4-HA-HIF (555 bis 575), translatiert in vitro in der Gegenwart von 3H-Prolin mit Kaninchen-Reticulozytenlysat oder Weizenkeimextrakt und gel-band-gereinigt. Im Anschluss an saure Hydrolyse wurden unter Verwendung von Dünnschichtchromatographie Prolin und Hydroxyprolin abgetrennt. Die gestrichelten Kreise geben Positionen von mit Ninhydrin angefärbtem Prolin- und Hydroxyprolin-Markern an.
7 zeigt, dass pVHL spezifisch HIF1α mit hydroxyliertem Prolin 564 erkennt. (A und B) zeigen die Bindung von ³⁵S-markiertem pVHL an biotinylierte HIF1α-Peptide (556 bis 575) mit den angegebenen Substitutionen der Reste 561 bis 568. (C) zeigt ts20-Zellen, die stabil transfiziert wurden, um HA-pVHL zu produzieren, die bei einer restriktiven (Bahn 1) oder einer permissiven (Bahnen 2 bis 6) Temperatur gezüchtet und mit Anti-HIF1α-(Bahn 1 und 2) oder Anti-HA-Antikörper (Bahnen 3 bis 7) immunpräzipiert wurden. Gebundene Proteine wurden durch Kochen in Probenpuffer (Bahn 1 und 2) oder Behandlung mit den angegebenen Peptiden eluiert und dann mit Anti-HIF1α-Antiköper immungeblotted. (D) zeigt pVHL-defektive renale Karzinomzellen, die stabil transfiziert wurden, um Wildtyp-pVHL (WTB) zu produzieren, oder mit leerem Vektor (RC3), der metabolisch mit ³⁵S-Methionin markiert war, lysiert und mit immobilisierten biotinylierten HIF1α-Peptiden (556 bis 575) mit den angegebenen Substitutionen der Reste 564 inkubiert. Spezifisch gebundene Proteine wurden durch Autoradiographie erfasst.
8 stellt die Produktion von TETr-Cyclinen A und E dar. (A) ist ein Schema des TET2-Cyclin-Fusionsproteins. (B) zeigt die Produktion von TETr-Cyclin A und TETr-Cyclin E. Zellen, die transfiziert wurden, um die angegebenen Cyclin-A- oder Cyclin-E-Proteine zu produzieren, wurden lysiert und mit den angegebenen Antikörpern immungeblotted (IB). (C) zeigt die Phosphorylierung von pRB durch TETr-Cycline A und E in SAOS-2-Zellen. pRB-defektive SAOS-2-Zellen, die so transfiziert wurden, dass sie mit HA versehenes pRB zusammen mit den angegebenen Cyclinen produzieren, wurden lysiert und mit HA-Antikörper immungeblotted. Der Prozentsatz an transfizierten Zellen in G1- und S-Phase wurde durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) bestimmt.
9 zeigt DNA-gebundene Cycline A und E, die die Transkription unterschiedlich beeinflussen. (A) ist ein Schema des Reporterplasmids (pUHC 13-3), das sieben TETr-Cyclin-Operatorsequenzen (TETo) stromabwärts einem minimalen CMV-Promotor enthält, der eine TATA-Box enthält. (B, C) zeigen U20S-Zellen, die mit Plasmiden kotransfiziert wurden, die die angegebenen TETr-Fusionsproteine produzieren, zusammen mit dem pUHC-13-Reporterplasmid und einem Plasmid, das β-Galaktosidase kodiert. Die im Graph unten gezeigten Zahlen geben die Menge an TETr-Plasmid (in µg) an. 48 später wurde die Luziferaseaktivität, normalisiert auf β-Galaktosidase, bestimmt. Fold-Repression ist der korrigierte Luziferasewert für TETr alleine geteilt durch die korrigierten Luziferasewerte für die angegebenen TETr-Fusionsproteine. Foldaktivierung repräsentiert die korrigierten Luziferasewerte für die angegebenen TETr-Fusionsproteine geteilt durch den korrigierten Luziferasewert für TETr alleine.
10 zeigt die transkriptionale Regulierung durch die Cycline A und E in Abhängigkeit von der DNA-Bindung. (A) zeigt U2OS-Zellen, kotransfiziert mit Plasmiden, die die angegebenen TETr-Fusionsproteine produzieren, zusammen mit dem pUHC-13-Reporterplasmid und einem Plasmid, das β-Galaktosidase kodiert. 24 Stunden später wurde Doxycyclin auf eine Endkonzentration von 2 µg/ml hinzugefügt, wo es durch ein „+" angegeben wurde. 24 Stunden später wurde die Luziferaseaktivität, korrigiert auf β-Galaktosidase-Aktivität bestimmt und als Fold-Repression oder Aktivierung relativ zu Zellen ausgedrückt, die TETr alleine produzieren. (B) zeigt U2OS-Zellen, kotransfiziert mit Plasmiden, die die angegebenen TETr-Fusionsproteine produzieren, zusammen mit dem pUHC-13-Reporterplasmid und einem Plasmid, das β-Galaktosidase kodiert. Die Fold-Repression und Aktivierung wurde wie bei (A) bestimmt. (C) zeigt U2OS-Zellen, kotransfiziert mit Plasmiden, die TETr oder TETr-Cyclin E kodieren, zusammen mit einem minimalen HSV-TK-Promotorplasmid, das die angegebenen Zahl von TETo-Bindungsstellen enthält, und einem Plasmid, das β-Galaktosidase kodiert. Wie bei (A) wurde Doxycyclin hinzugefügt.
11 zeigt, dass für die transkriptionale Repression durch an DNA gebundenes Cyclin A eine Cyclin-Box erforderlich ist. (A) U20S-Zellen wurden mit Plasmiden, die die angegebenen TETr-Cyclin-A-Varianten kodieren, zusammen mit dem pUHC-13-3-Reporterplasmid und einem Plasmid, das β-Galaktosidase kodiert, kotransfiziert. Zellextrakte wurden hergestellt und die Luziferaseaktivität, korrigiert für die β-Galaktosidase-Aktivität, wurde als Fold-Repression relativ zu Zellen ausgedrückt, die TETr alleine produzieren. (B) Die angegebenen TETr-Cyclin-A-Varianten wurden in vitro in der Gegenwart von ³⁵S-Methionin translatiert und mit GST-cdk2 und Glutathion-Sepharose inkubiert. Spezifisch gebundene Proteine wurden durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgelöst und durch Autoradiographie erfasst. Parallel dazu wurden 20% der eingebrachten Proteine durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgelöst und durch Autoradiographie erfasst. (C) pRB-defektive SAOS-2-Zellen, die so transfiziert waren, dass sie mit HA versehenes pRB zusammen mit den angegebenen TETr-Cyclin-A-Varianten produzieren, wurden lysiert und mit Anti-HA-Antikörper immungeblotted.
12 zeigt die transkriptionale Aktivierung durch Cyclin E, verknüpft mit seiner Fähigkeit, an cdk2 zu binden und mit Substraten zu interagieren. (A) U20S-Zellen wurden mit Plasmiden, die die angegebenen TETr-Cyclin-E-Varianten kodieren, zusammen mit dem pUHC-13-3-Reporterplasmid und einem Plasmid, das β-Galaktosidase kodiert, kotransfiziert. Zellextrakte wurden hergestellt und die Luziferaseaktivität, korrigiert für die β-Galaktosidase-Aktivität, wurde als Fold-Repression relativ zu Zellen ausgedrückt, die TETr alleine produzieren. (B) Die angegebenen TETr-Cyclin-E-Varianten wurden in vitro in der Gegenwart von ³⁵S-Methionin translatiert und mit GST-cdk2 und Glutathion-Sepharose inkubiert. Spezifisch gebundene Proteine wurden durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgelöst und durch Autoradiographie erfasst. Parallel dazu wurden 20% der eingebrachten Proteine durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgelöst und durch Autoradiographie erfasst. (C) pRB-defektive SAOS-2-Zellen, die so transfiziert waren, dass sie mit HA versehenes pRB zusammen mit den angegebenen TETr-Cyclin-E-Varianten produzieren, wurden lysiert und mit Anti-HA-Antikörper immungeblotted.
13 zeigt die transkriptionale Aktivierung durch an DNA gebundenes Cyclin E in Abhängigkeit von der cdk2-Aktivität. (A, B) U2OS-Zellen wurden mit Plasmiden transient kotransfiziert, die TETr-Cyclin A oder E kodieren, und, wo angegeben, zunehmenden Mengen eines Plasmids, das eine dominant negative (dn) Form von cdk2 kodiert. Es wurden Zellextrakte hergestellt und die Luziferaseaktivität, korrigiert für die β-Galaktosidase-Aktivität, wurde bestimmt. Korrigierte Luziferasewerte wurden als Fold-Repression (A) oder Aktivierung (B) relativ zu TETr alleine ausgedrückt. (C) U20S-Zellen wurden mit Plasmiden, die TETr-cdk2 oder TETr-cdk2 (N132A) kodieren, und einem Plasmid, das entweder Cyclin A oder E kodiert, transient transfiziert. Es wurden Zellextrakte hergestellt und die Luziferaseaktivität, korrigiert für die β-Galaktosidase-Aktivität, wurde bestimmt. Korrigierte Luziferasewerte wurden als Fold-Aktivierung relativ zu TETr alleine ausgedrückt.
14 zeigt transkriptionale Wirkungen, die durch zellzyklusabhängige Änderungen bei endogenen Cyclinen E und A vermittelt werden. (A, B) 3T3-Zellen, die stabil mit einem Luziferase-Reporterplasmid, das 7 TETo-Stellen enthält (pUHC 13-3), und einem Plasmid, das TETr-cdk2 kodiert, transfiziert waren, wurden 72 Stunden lang serum-ausgehungert und anschließend mit Serum rückgespeist. Zu verschiedenen Zeitpunkten danach wurden Aliquote von Zellen entfernt und entweder für die Immunblot-Analyse mit den angegebenen Antikörpern lysiert oder durch Propidiumiodid-Färbung gefolgt von fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) auf den DNA-Gehalt analysiert. (C) 3T3-Zellen, die stabil mit einem Luziferase-Reporterplasmid, das 7 TETo-Stellen enthält (pUHC 13-3) bei Abwesenheit (offene Kreise) oder bei Gegenwart eines Plasmids, das TETr-cdk2 (geschlossene Quadrate) oder TETr-cdk2 (N132A) (offene Quadrate) kodiert, transfiziert waren, wurden 72 Stunden lang serum-ausgehungert und anschließend mit Serum in der Gegenwart oder bei Abwesenheit von Doxycyclin rückgespeist. Zu verschiedenen Zeitpunkten danach wurden Luziferasetests ausgeführt. Um für allgemeine Wirkungen infolge des Serums zu korrigieren, wurden die Luziferasewerte zu jedem Zeitpunkt in Abwesenheit von Doxycyclin durch Substrahieren des Luziferasetests korrigiert, der in der Gegenwart von Doxycyclin erhalten wurde. Nach der Korrektur wurden die Luziferasewerte für die zwei Zellpopulationen relativ zu den entsprechenden Luziferasewerten ausgedrückt, die zum Zeitpunkt 0 erhalten wurden. Parallel dazu wurden die Zellen, die TETr-cdk2 produzieren, lysiert und mit Anti-Cyclin-A- oder Anti-Cyclin-E-Antikörpern immungeblotted. Die Immunpräzipitate wurden dann verwendet, um Histon H1 in vitro zu phosphorylieren.
Beispiele
Beispiel 1: Charakterisierung von auf Hypoxie ansprechenden Polypetiden
Um die Wirksamkeit des ersten Ausführungsbeispiels der Erfindung zu demonstrieren, beispielsweise die Verwendung eines auf Hypoxie ansprechenden LGP, wurde die Wechselwirkung von pVHL und HIF untersucht. Hierin wird ein HIF1α-Polypeptid offenbart, das ausreichend an pVHL bindet. pVHL bindet direkt an einen Bereich von HIF1α, der die sauerstoffabhängige Degradationsdomäne (ODD) genannt wird. pVHL erkennt in Kaninchen-Reticulocytenlysat produziertes HIF, aber kein in Weizenkeimextrakten oder in E. Coil produziertes HIF. Darüber hinaus bindet aus Weizenkeimen oder E. Coli stammendes HIF an pVHL in Folge auf Präinkubation mit Human-, Hasen- oder Xenopus-Zellextrakten bei 37°C. Beispielsweise wurden in E. Coli produzierte Glutathione-S-Transferase-ODD-Fusionsproteine in Farwestern-Tests nicht durch VBC erkannt (3C). Diese Proteine wurden jedoch nach Präinkubation mit einem Kaninchen-Reticulocytenlysat erkannt. Ähnliche Resultate wurden mit GST-ODD-Fusionsproteinen verschiedener Größe erhalten, womit die Möglichkeit ausgeschlossen wird, dass das Farwesternblot-Signal eine falsche Wechselwirkung zwischen VBC und einem aus Reticulocyten stammenden Protein repräsentiert. VBC erkannte keine GST-ODD-Fusionsproteine, die mit einem hitzeinaktivierten Reticulocytenlysat inkubiert wurden (3D). Gal4-HIF-Fusionsproteine, die die HIF-Reste 555 bis 575 enthielten, banden spezifisch an immobilisierte GST-VHL, Elongin B, Elongin C Komplexe (4A). Gekoppelte In-vitro-Transkription/Translation von ³⁵S-markierten Proteinen wurde gemäß den Anweisungen der Hersteller durchgeführt (TNT, Promega). Auch ein biotinyliertes Peptid entsprechend den HIF-Resten 556 bis 575 band an pVHL in Folge von Präinkubation mit Reticulocytenlysat (4B). Für Peptidbindungsstudien wurden 1 µg an biotinyliertem Peptid an 30 µl monomere Avidin-Sepharose gebunden (Pierce). Wo angegeben, wurde das Peptid 90 min lang bei 30°C mit 50 µl Kaninchen-Reticulocytenlysat präinkubiert. Die Sepharose wurde dann dreimal mit NEIN (20 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet P40) gewaschen und bei Bindungsreaktionen verwendet, enthaltend 4 µl ³⁵S-HA-pVHL in 500 µl EBC oder 500 µl ³⁵S-markiertem Zellextrakt (äquivalent zu Zellen aus einer subkonfluenten 100 mm Schale). Im Anschluss an 1 Stunde langes Inkubieren bei 4°C unter Schwenken der Sepharose wurde 4-mal mit NEIN gewaschen. Gebundene Proteine wurden durch Kochen in SDS enthaltendem Probenpuffer eluiert und durch Autoradiographie erfasst. Diese Region von HIF enthält ein hochkonserviertes 8-mer (MLAPYIPM), das, wenn es zu 8 konsekutiven Alaninen mutiert wurde, zur HIF-Stabilisierung in Zellen führt. Ein Alaninscan dieser Region zeigte, dass Leu562 und Pro564 für die spezifische Bindung an pVHL bei diesem Test essentiell waren (4B). Im Gegensatz dazu beeinflusste die Mutation des einen potentiellen Phosphoakzeptors in diesem Peptid, Tyr565, nicht die pVHL-Bindung, im Einklang mit einer früheren Studie, bei der eine Tyr565Phe-Mutation nicht die HIF-Satbilität beeinflusste. Zudem wurde die Bindung von pVHL an GST-ODD bei den oben beschriebenen Tests nicht durch Phosphatasebehandlung beeinflusst.
Die Bindung von pVHL an HIF1α ist kritisch von den Resten Leu562 oder Pro564 von HIF1α abhängig. Wichtig ist, die Mutation entweder von Leu562 oder Pro564 im Kontext von HIF1α voller Länge oder einem Gal4-ODD-Fusionsprotein führten auch zu einem Verlust von pVHL-Bindungsaktivität (4C bzw. 4D). Mit Reticulocytenlysat gefertigtes Gal4-ODD enthielt eine elektrophoretisch deutliche Bande im Vergleich zu Gal4-ODD, das mit Weizenkeimextrakt gefertigt wurde (4D). Dieses elektrophoretisch deutliche Protein band an VBG und war unter den Leu562Ala- und Pro564Ala-Translationsprodukten nicht erfassbar. Die isoelektrischen Punkte der zwei bekannten Banden in 4D waren im Anschluss an 2-D-Gelelektrophorese identisch, was darauf hinweist, dass die vermeintliche Modifikation keine Änderung der Proteinladung mit sich brachte.
Die Modifikation von HIF1α durch pVHL im Anschluss an die Bindung ist auch kritisch von den Resten Leu562 oder Pro564 von HIF1α abhängig. Gal4-HIF-Fusionsproteine mit der Leu562Ala-Mutation oder Pro564Ala-Mutation zeigten schwächere pVHL-abhängige Polyubiquitinierung in vitro relativ zu dem entsprechenden Wildtyp-Protein (5A). Qualitativ ähnliche Ergebnisse wurden mit den entsprechenden HIF1α-Spezies voller Länge erhalten, obwohl dieser Test weniger robust ist als mit den Gal4-HIF-Fusionsproteinen. Gleicherweise waren HIF1α-Pro564Ala und HIF1α-Leu562Ala wesentlich stabiler als Wildtyp-HIF1α bei In-vitro- Degradationstests, die mit Xenopus-Extrakten ausgeführt wurden (5B). Xenopus-Eier-Extrakte wurden hergestellt, wie es im Fachgebiet bekannt ist, und bis zur Verwendung gefroren gelagert. Degradationsreaktionen enthielten 8 µl Eiextrakt, 0,1 µl an 100 mg/ml Cyclohexamid, 0,25 µl an Energieregenerationsmischung, 0,25 µl an Rinder-Ubiquitin und 0,4 µl an ³⁵S-radiomarkiertem HIF und wurden bei Raumtemperatur ausgeführt. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde 1 µl Aliquote entfernt und in Probenpuffer eingebracht. Die Proben wurden auf 5 bis 15% Gradientengelen aufgelöst und durch Autoradiographie analysiert. Biotinylierte HIF-Peptide (556 bis 575) wurden mit Kaninchen-Reticulocytenlysat inkubiert, gewaschen, mit freiem Biotin eluiert und durch Massenspektrometrie analysiert. 1 µg HPLC-gereinigtes Peptid wurde an 30 µl monomere Avidin-Sepharose gebunden und 1 Stunde lang mit 100 µl Kaninchen-Reticulocytenlysat bei Raumtemperatur unter Taumeln inkubiert. Im Anschluss an eine kurze Zentrifugierung wurde das Reticulocytenlysat entfernt, frisches Reticulocytenlysat wurde hinzugefügt und der Zyklus wurde 6-mal wiederholt. Die Sepharose wurde dann 4-mal mit NEIN und einmal mit PBS gewaschen. Das modifizierte Peptid wurde in 50 µl 20 mM Ammoniumacetat [pH 7,0], 2 mM Biotin eluiert. Bei diesen Experimenten wurden Met561 und Met568 zu Alanin umgewandelt, um die störende Oxidation der Methioninreste während der Analyse zu verhindern. Diese Doppelalaninsubstitution beeinflusste die pVHL-Bindung, wie entsprechende Einzelsubstitutionen, nicht. Die Behandlung des HIF-Peptids (556 bis 575) mit Kaninchen-Reticulocytenlysat führte zum Auftreten eines zweiten Peaks bei MALDI-TOF-Tests, der eine Zunahme des Molekulargewichts von 16 repräsentiert (6A). Dieser Peak war vor der Inkubation mit Reticulocytenlysat nicht detektierbar und wurde nicht bei den entsprechenden mit Reticulocyten behandelten Leu562Ala- und Pro564Ala-Peptiden detektiert (6A). Postsource-Decay-Analyse unter Verwendung des gleichen Instruments belegte die Addition von +16 an Pro564. Gleicherweise war die Analyse mit Elektrospray-Ionenfallen-Massenspektroskopie/Massenspektroskopie (MS/MS) konsistent mit der Addition von +16 an Pro564 und schloss solch eine Modifikation von Leu562 aus. Schließlich erzeugte die MS/MS-Analyse des mit Reticulocyten behandelten HIF-Peptids (556 bis 575) ein Muster an Ionen, das identisch mit dem Muster war, das mit HIF-Peptid (556 bis 575) erhalten wurde, das synthetisiert wurde, so dass es Hydroxyprolin an der Position 564 enthielt. Als nächstes wurde Gal4-HIF (555 bis 575) in vitro in der Gegenwart von ³H-Prolin unter Verwendung von Kaninchen-Reticulocytenlysat oder Weizenkeimextrakt translatiert, gel-band-gereinigt und einer sauren Hydrolyse und Dünnschichtchromatographie unterzogen. 2 ml ³H-P-markiertes Gal4-HIF (555 bis 575) In-vitro-Translatat wurde mit 50 µg Anti-HA-Antikörper (12CA5, Roche) immunpräzipiert, auf einem 12% SDS-Polyacrylamidgel aufgelöst und auf eine PVDF-Membran übertragen. Gal4-HEF (555 bis 575) wurde durch Autoradiographie visualisiert und die entsprechende Region des PVDF wurde herausgeschnitten, durch 3 Stunden lange Inkubation in 100 µl 10 N HCl bei 105°C hydrolysiert. Die Proben wurden zur Trockene eingedampft, in 20 µl H₂O resuspendiert, das 10 µg unmarkiertes Prolin und 4-OH-Prolin (Sigma) enthielt, und durch 2-D-Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Phenol/destilliertem H₂O in der ersten Dimension und n-Butanol/essigsaurem H₂O in der zweiten Dimension aufgelöst. Im Anschluss an die Visualisierung von Standards mit Ninhydrin wurde durch Autoradiographie radiomarkiertes Prolin erfasst. In Kaninchen-Reticulocytenlysat, aber nicht in Weizenkeimextrakt, hergestelltes Gal4-HIF enthielt Hydroxyprolin (6B).
Das pVHL erkennt spezifisch eine Prolin hydroxylierte Determinante. Das HIF-Peptid (556 bis 575), das Hydroxyprolin an der Position 564 enthielt, band an pVHL mit oder ohne Vorbehandlung mit Reticulocytenlysat (7A). Die massenspektrometrische Analyse des Leu562Ala-Peptids zeigte, dass für die HTF-Modifikation Leu562 erforderlich war (6A). Tatsächlich band pVHL an ein HIF-Peptid (556 bis 575) mit der Leu562Ala-Substitution und Hydroxyprolin am Rest 564 (7B). Dies weist darauf hin, dass die primäre Rolle von Leu562 die ist, die Hydroxylierung von Pro564 zu ermöglichen. Zwei Ansätze wurden verwendet, um zu demonstrieren, dass hydroxyliertes HIF-Peptid mit aus Zellen stammenden pVHL-Komplexen Wechselwirken könnte. Es wurden Ts20-Zellen manipuliert, um HA-markierte pVHL herzustellen, die eine temperaturempfindliche Mutation im E1-Ubiquitinaktivierungsenzym trugen. Ts20-Zellen wurden mit pIRES-HA-VHL (Y98H) oder pIRES-Neo (Invitrogen) transfiziert und in der Gegenwart von 1 mg/ml G4 18 selektiert. Zellen, die HA-VHL oder HA-VHL (Y98H) produzierten, wurden durch Anti-HA-Immunblotanalyse identifiziert. HIF koimmunpräzipierte mit HA-pVHL bei einer restriktiven Temperatur. Auf diese Weise an pVHL gebundenes HIF konnte durch das hydroxylierte HIF-Peptid (556 bis 575) aber nicht durch das unmodifizierte Peptid eluiert werden (7C). Für die in 5C gezeigten Tests wurden ts20-Zellen 14 Stunden lang bei einer restriktiven oder permissiven Temperatur gezüchtet, 90 min lang methionin-ausgehungert und dann 90 min lang in dem methioninfreien Medium gezüchtet, das mit S³⁵-met (500 mCi/ml) ergänzt war. Die Zellen wurden einmal mit kaltem PBS gewaschen, in EBC lysiert und mit Anti-HA (12CA5; Roche oder Anti-HIF1α (NB100–105; Novus)) immunpräzipiert. Im Anschluss auf 5 Waschungen mit NEIN wurden gebundene Proteine durch Kochen in Probenpuffer oder durch Inkubation in 65 µl PBS, das 7 µg des angegebenen Peptids enthielt, eluiert. Darüber hinaus wurde HIF nicht durch das HIF-Pro564Ala (556 bis 575) oder durch ein polyhydroxyliertes Peptid eluiert (7C). Affinitätschromatographie wurde mit immobilisierten Peptiden und metabolisch markierten passenden Nierenkrebszellen ausgeführt, die Ha-pVHL produzieren (WT8) oder nicht (RC3). 786-O-Subklone wurden 1 Stunde lang ausgehungert, 3 Stunden lang in dem methioninfreien Medium gezüchtet, das mit S³⁵-met (500 mCi/ml) ergänzt war, einmal mit eiskaltem PBS gewaschen und in EBC lysiert. Das prolinhydroxylierte HIF-Peptid (556 bis 575) band spezifisch an pVHL sowie Proteine mit den elektrophoretischen Mobilitäten der pVHL-assoziierten Proteine Elongin B, Elongin C und CuI2 (7D). Die Identität von pVHL bei diesem Experiment wurde durch Westernblot-Analyse bestätigt. Gleicherweise wurde die Bindung von endogenem pVHL an das hydroxylierte Peptid unter Verwendung von 293 embryonischen Nierenzellen detektiert. Eine HIF1α-Mutante, bei der Prolin 564 zu Alanin umgewandelt war, wurde in Zellen stabilisiert und war unempfindlich auf das hypoxie-mimetische Desferoxim (5C).
Das HIF1α-Protein wird bei hypoxischen Bedingungen stabilisiert und wirken so, dass sie Hypoxie in betroffenem Gewebe, beispielsweise in einem soliden Tumor, Retinopathie oder ischämisches Herzgewebe, zum Teil durch Modulieren proangiogener Faktoren hemmt, vermindert und/oder umkehrt. Ein Licht erzeugendes Fusionsprotein, das einen HIF1α-Rest enthält, wird in hypoxischen Gewebe auch stabilisiert. Die Zerstörung von HIF1α-Protein oder ein HIF1α enthaltendes LGP über den pVHL-Ubiquitinweg tritt beispielsweise während Normoxie auf, wenn eine Prolylhydroxylase das HIF1α-Protein derart modifiziert, dass pVHL an HIF1α bindet und dieses modifiziert. Dieser Modifizierungsprozess wirkt als ein dynamischer Schalter, um die Biolumineszenz des HIF1α enthaltenden Licht erzeugenden Fusionsproteins zu regulieren, wie beim ersten Ausführungsbeispiel der Erfindung. Ein HIF1α enthaltendes Licht erzeugendes Fusionsprotein ist verwendbar, um hypoxisches Gewebe, beispielsweise Krebs, in situ dynamisch abzubilden und auf die Wirksamkeit von Hypoxie modulierenden Verbindungen zu rastern oder zu testen.
Beispiel 2
Das folgende Beispiel demonstriert die Wirksamkeit von Licht erzeugenden Fusionsproteinen, die bei der Erfindung zur Bildgebung von hypoxischen Geweben verwendet werden.
Die sauerstoffabhängige Degradationsdomäne (ODD) von HIF1α macht HIF1α in der Gegenwart von Sauerstoff instabil. Diese Region wird durch pVHL erkannt. pVHL bindet spezifisch direkt an peptidische Determinanten, entsprechend den HIF1α-Resten 555 bis 575, sie sich innerhalb der ODD befinden. Am Kern dieses Peptids gibt es einen konservierten Prolinrest (Rest 564), der in der Gegenwart von Sauerstoff enzymatisch hydroxyliert wird. Dieser Rest dient als Signal für pVHL, zu binden. Zusammengefasst, in der Gegenwart von Sauerstoff wird das HIF-Peptid hydroxyliert und wird durch pVHL erkannt. Bei Abwesenheit von Sauerstoff (Hypoxie) findet die Modifikation nicht statt und pVHL bindet nicht an HIF.
Konstruktion von ODD-LUC-Plasmiden
Bei einem ersten Satz von Experimenten wurde die Fähigkeit eines kleinen HIF-Peptids (555 bis 575) evaluiert, in cis zu wirken, um auf ein fremdes Protein mit pVHL-abhängiger Proteolyse abzuzielen. Zu diesem Zweck wurde die HIF-cDNA, die die Aminosäuren 555 bis 575 (im folgenden ODD) kodiert, durch PCR mit Oligonukleotiden amplifiziert, die geeignete Restriktionsstellen einführten, verdaut und gel-band-gereinigt. Das PCR-Fragment wurde dann in-frame, 3' von einer Glühwürmchen-Luziferase-cDNA, die im pGL3-Plasmid (Promega) enthalten war, subkloniert. Die sich ergebende Luziferase-ODD-Chimären-cDNA wurde in pcDNA3 (Invitrogen) subkloniert, um die In-vitro-Translation und Expressionsstudien in Säugetierzellen zu erleichtern. Nebenher wurden ein pcDNA3-Plasmid, das Wildtyp-Glühwürmchen-Luziferase kodiert, und ein pcDNA3-Plasmid, das Wildtyp-HIF1α kodiert, als Kontrolle verwendet.
VBC-GST-Pulldown von ODD-Luziferase
Um zu bestimmen, ob das ODD-Luziferaseprotein an pVHL binden könnte, wurden GST-VHL, Elongin B und Elongin C („GST-VBC") in E. Coli hergestellt und als ein trimerer Komplex auf Glutathion-Sepharose gewonnen. Frühere Arbeiten zeigten, dass pVHL in der Abwesenheit von Elongin B und Elongin C nicht richtig faltete. HIF1α, ODD-Luziferase und Wildtyp-Luziferase wurden in vitro unter Verwendung von Kaninchen-Reticulocytenlysat (RRL) oder Weizenkeimextrakt (WG) in der Gegenwart von ³⁵S-Methionin translatiert (15). Aliquote aus den In-vitro-Translationsreaktionen wurden zu rekombinantem VBC-GST hinzugefügt, vorgebunden an Glutathion-Sepharose, und 1 Stunde lang inkubiert. Die Sepharose wurde dann gewaschen und gebundene Proteine wurden auf einem 12% SDS-Polyacrylamidgel aufgelöst. Das Gel wurde dann getrocknet und freigelegt, um einen Film zu bilden. pVHL band an aus Reticulocyten erzeugtem HIF1α und ODD-Luc, aber nicht an Luc (vergleiche die Bahnen 4, 8 und 12). Darüber hinaus band pVHL nicht an mit Weizenkeimextrakt hergestelltes ODD-Luc, da Weizenkeimen die HIF-Prolylhydroxylase fehlt (vergleiche Bahnen 6 und 8). Somit zeigen die Daten, dass ODD-Luc spezifisch von pVHL erkannt wurde.
Peptid-Competition Assay
Die Beobachtung, dass pVHL an in RRL aber nicht in WG hergestelltem ODD-Luc band, weist stark darauf hin, dass das ODD-Luc wie HIF eine Prolylhydroxylierung durchmachen muss, um von pVHL erkannt zu werden. Um dies weiter zu studieren, wurden die GST-VBC-Bindungsexperimente in der Gegenwart von synthetischem HIF-Peptiden (555 bis 575), in denen Pro 564 hydroxyliert war (P-OH) oder nicht hydroxyliert war (P). GST-VBC wurde entweder mit dem Kontrollpeptid (P) oder dem P-OH-Peptid in zunehmenden Konzentrationen (von 0 bis 5 µg) gemischt. Als nächstes wurden dann in vitro translatiertes (in Retic-Lysat) Luc, ODD-Luc oder HIF1α hinzugefügt. Das OH-Peptid blockierte spezifisch die Bindung von HIF und ODD-Luc an pVHL. Somit rekapitulierten die Ergebnisse, die mit ODD-Luc erhalten wurden, frühere Bindungsstudien, die mit authentischem HIF ausgeführt wurden (16).
Luziferase-Aktivitat in Zellen
Bei Pilotexperimenten wurde bestätigt, dass ODD-Luc in vitro erhaltene Luziferase-Aktivität translatiert, in vitro vergleichbar mit Wildtyp-Luziferase. Um mit der Frage zu beginnen, ob das ODD-Luc in Zellen sauerstoffempfindlich war, wurden transiente Transfektionstests ausgeführt. Bei einem ersten Satz von Experimenten wurden 100 mm Gewebekulturplatten mit 8 × 10⁵ HeLa-Zellen pro Platte besiedelt. 18 Stunden später wurden die Zellen unter Lipofectamin (Gibco) mit den pcDNA3-Plasmiden, die ODD-Luc oder Wildtyp-Luc kodieren, zusammen mit einem internen Kontrollplasmid, das Renilla-Luziferase kodiert, transient transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen auf 6 Well-Platten aufgeteilt und ihnen ermöglicht, anzuhaften und 8 bis 12 Stunden lang zu wachsen. Zu diesem Zeitpunkt wurden das Hypoxiemimetikum Desferrioxamin (DFO) oder Cobaltchlorid (CoCl₂) direkt zum Medium bei Endkonzentrationen von 500 µM bzw. 200 µM in doppelten Wells hinzugefügt. Zudem wurde einige Wells nicht behandelt, so dass sie als Kontrollen dienten. 12 Stunden nach Behandlung mit DFO und CoCl₂ wurden die Zellen mit passivem Lysepuffer (Promega) lysiert, 20 min lang bei Raumtemperatur geschwenkt und gemäß den Anweisungen der Hersteller auf Glühwürmchen- und Renilla-Luziferase getestet. Die Ergebnisse wurden doppelt erhalten und gemittelt (17).
Bei den unbehandelten Zellen betrugen die Luziferasewerte für ODD-Luc ungefähr 30% der Werte, die mit Wildtyp-Luc erhalten wurden. Man beachte, dass HeLa-Zellen Wildtyp-pVHL aufweisen und diese Experimente unter Verwendung von Zellen ausgeführt wurden, die in der Gegenwart von Sauerstoff gezüchtet wurden. Die Zugabe von Hypoxiemimetika führte zu einer merklichen Zunahme der ODD-Luc-Luziferaseaktivität, wohingegen mit Wildtypluziferase keine solche Induktion festgestellt wurde. Die induzierten Pegel an ODD-Luziferase waren vergleichbar zu denen, die mit Wildtypluziferase erhalten wurden. Diese Ergebnisse sind konsistent mit der Idee, dass ODD-Luc pVHL-abhängiger Proteolyse in Zellen unterworfen ist, während es Wildtyp-Luc nicht ist.
Bildgebung von ODD -Luc in xenotransplantierten Tumoren in Nacktmäusen
Um bei einem Säugetiersystem zu verifizieren, dass das ODD-Luc-Gen tatsächlich durch Hypoxie oder Hypoxiemimetika reguliert wird, wurde das folgende Experiment ausgeführt. Bei gegebener Leichtigkeit der subkutanen Transplantation von Tumoren und ihrer Fähigkeit, zu wachsen und zu vaskularisieren, wurde die Fähigkeit, Luziferaseaktivität von Tumoren auf subkutanem Level abzubilden und die ODD-Luc-Reaktion auf Hypoxie zu beurteilen, wie folgt getestet.
Es wurden polyklonale Hela-Zellen erzeugt, die stabil mit ODD-Luc und Luc transfiziert waren. Die Klone wurden in PBS suspendiert und gezählt. 10⁶ Zellen pro Injektionsstelle wurden doppelt subkutan in die Flanken von Nacktmäusen verabreicht (18). Nach Wachstum von tastbaren Tumoren (ungefähr 3 bis 4 Tage) wurden den Mäusen intraperitoneale Injektionen an Phenobarbital zur Anästhesie verabreicht mit einer auf das Gewicht eingestellten Dosis an Luziferin injiziert und der ganze Körper mit einer Xenon-Kamera abgebildet. Um sicherzustellen, dass der Unterschied der Luziferaseaktivität nicht einfach eine Wirkung der Tumorgröße allein war, wurden zweidimensionale Tumormessungen vorgenommen und waren ungefähr gleich.
18 zeigt drei verschiedene Mäuse, denen doppelt ODD-Luc (rechts) und Luc (links) injiziert wurden. Die Stellen, an denen ODD-Luc injiziert wurde, weisen klar ein abgeschwächtes Luziferasesignal auf. Als solches zeigen die Daten eine reale Abschwächung von Luziferaseaktivität, sekundäre Ubiquitinierung und Zerstörung von ODD-Luc.
Beispiel 3: Eine DNA-Bindungsstelle enthaltende Licht erzeugende Fusionsproteine
Unter Verwendung eines LGP, das in der Lage war, mit Nukleinsäuren zu interagieren, wurde, um die Gentranskription in vivo, in vitro oder in silico kinetisch zu überwachen, wurde die Auswirkung von Cyclinen auf die Transkription untersucht. Da es sinnvoll ist, entweder die Induktion oder der Repression der Transkription zu überwachen, wurden Cyclin mit spezifischen Wirkungen auf die Transkription untersucht.
Die Kinase Cdk2 kann, wenn sie entweder an Cyclin E oder Cyclin A gebunden ist, die Phosphorylierung ihrer Substrate steuern (20). Es wurden Säugetier-Expressionsplasmide hergestellt, die Fusionsproteine kodierte, die aus der tet-Repressor-DNA-Bindungsdomäne (TetR) bestanden, die entweder an cdk2, Cyclin E oder Cyclin A fusioniert waren. Es wurde festgestellt, dass TetR-cdk2 sowie TetR-Cyclin E die Transkription aktivieren, wenn sie gegen ein Luziferase-Reporterplasmid getestet wurden, das TetR-DNA-Bindungsstellen (TetO) stromaufwärts einem Minimalpromotor enthielt. Darüber hinaus haben wird gezeigt, dass diese Aktivierung von der Fähigkeit von Cyclin E/cdk2 abhängt, als eine Kinase zu wirken. Da Luziferase nicht-invasiv überwacht werden kann, stellt diese Entdeckung ein Mittel bereit, um die cdk2-Aktivität in vivo zu überwachen. Beispielsweise konnten Tumorzellen stabil transfiziert werden, um TetR-cdk2 oder TetR-Cyclin E zusammen mit einem geeigneten TetO-Reporterplasmid herzustellen. Die Zellen konnten dann in vitro oder in vivo gezüchtet werden (wie etwa ektopisch oder orthotopisch in Nacktmäusen) und es konnte im Anschluss an Verabreichung von Luziferin mit einer geeigneten Kamera Luziferaseaktivität überwacht werden. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel konnten virale oder nichtvirale Vektorsysteme entwickelt werden, die die Expression von TetR-cdk2 (oder TetR-Cyclin E) zusammen mit einem TetO-gesteuerten Reportergen steuern. Der Vektor konnte dann verwendet werden, um die TetR-Fusion und TetO-Reportegene in abzufragende Zellen oder Gewebe einzuführen.
Das Verfahren konnte Verwendet werden, um Zellen, Gewebe oder Tiere zu erzeugen, in denen die Aktivität eines Reporters von de Cyclin/cdk2-Aktivität abhängig war. Wie oben skizziert kann dieser Ansatz wahrscheinlich auf andere enzymatische Aktivitäten verallgemeinert werden. Diese Erfindung sollte pharmakodynamische Studien größtenteils erleichtern. Beispielsweise konnten Mäuse, die Tumorxenotransplantate trugen, bei denen die Luziferaseaktivität von der Cyclin/cdk2-Aktivität abhängig war, verwendet werden, um die Bioverfügbarkeit und die Wirksamkeit von cdk2-inhibitoren in vivo zu überprüfen. Da stark proliferierende Zellen, einschließlich Krebszellen, hohe Pegel an Cyclin/cdk2-Aktivität aufweisen, könnte man diese Erfindung auch bei einem diagnostischen Rahmen verwenden.
Die Fusion eines DNA-Bindungsmotivs an ein Cyclin ändert nicht die Cyclinbindung an ein cdk oder die Kinaseaktivität des Cyclin/cdk2-Komplexes. Es wurden Säugetierexpressionsplasmide erzeugt, die Fusionsproteine kodieren, die aus der TET-Repressor-DNA-Bindungsdomäne (TETr) bestehen (Gossen und Bujard, 1992), fusioniert an Cyclin a oder Cyclin E mit einem intervenierenden flexiblen Linker, der aus Gly₄-Ser-Wiederholungen besteht (8A). Diese beiden Plasmide führten im Anschluss an die Transfektion in Säugetierzellen zu stabilen Proteinen der erwarteten Größe (8B). TETr-Cyclin A und TETr-Cyclin E banden wie ihre unfusionierten Gegenspieler an cdk2 (11 und 12) und konnten p107 in vitro phosphorylieren. Darüber hinaus förderten sowohl TETr-Cyclin A als auch TETr-Cyclin E die pRB- Phosphorylierung und leiteten einen pRB-induzierten G1/S-Block um, wenn sie mit Wildtyp-pRB in pRB-defektive Tumorzellen koeingeführt wurden (8C).
Cyclin A und Cyclin E beeinflussen die Transkription dramatisch. U2OS-Zellen wurden mit Plasmiden, die verschiedene TETr-Fusionsproteine kodieren, und ein Luziferase-Reporterplasmid, das 7 TETo-Bindungsstellen enthält, stromaufwärts zu einer TATA-Box transient transfiziert, die vom CMV-Promotor abstammt (9A). TETr bindet spezifisch an TETo-Stellen. Wie erwartet hemmt TETr-RB die Transkription aus diesem Reporterplasmid, wohingegen TETr-E2F1 den Reporter aktivierte (9B–C). Die Basalaktivität, die mit diesem Reporterplasmid beobachtet wurde, spiegelt vermutlich die Gegenwart von kryptischen Enhancersequenzen wider. Bei diesem und anschließenden Tests war die TETr-Domäne alleine im Wesentlichen inert. Überraschenderweise beeinflussten TETr-Cyclin A und TETr-Cyclin E bei diesem Test beide dramatisch die Transkription und taten dies auf entgegengesetzte Weise. TETr-Cyclin A verminderte die Transkription ungefähr 80% (5-fache Repression), wohingegen TETr-Cyclin E die Transkription 10-Fach steigerte (9B–C). Doxycyclin verhindert die Bindung von TETr an TETo und blockierte vollständig die transkriptionalen Wirkungen von TETr-Cyclin A und TETr-Cyclin E (10A). Wie erwartet blockierte Doxycyclin auch die transkriptionalen Wirkungen von TETr-RB und TETr-E2F1, welche parallel getestet wurden. Darüber hinaus wiesen unfusioniertes Cyclin A und E keine Wirkungen auf das TETo-gesteuerte Reporterplasmid (10B). Die Experimente wurden unter Verwendung von Reportern wiederholt, die 1, 2, 3 oder 7 TETo enthielten, bei denen die von CMV stammende TATA-Box mit einem minimalen HSV-TK-Promotor ersetzt war (Gossen und Bujard, 1992) (10C). TETr-Cyclin E aktivierte diese Reporter auch in doxycyclin-inhibierender Weise. Der Grad an Aktivität, der mit den HSV-TK-Seren von Reportern beobachtet wurde, war geringer als mit dem CMV-TATA-basierten Reporter, im Einklang mit früheren Ergebnissen, die mit diesen Reportern und fusionierten TETr auf die HSV-VP16-trariskriptionale Aktivierungsdomäne (Gossen und Bujard) erhalten wurden. Der niedrige Basalpegel der Transkription aus diesen Reportern schloss die Repressionsanalyse durch Cyclin A aus.
Die spezifischen Domänen des Cyclins, die an die cdks binden, sind kritisch für die cyclin-vermittelte transkriptionale Regulation. Für die transkriptionale Regulation sind Plasmide erforderlich, die TETr kodieren, das an verschiedene kolineare Fragmente von Cyclin A und E fusioniert sind (11 und 12). Alle sich ergebenden Fusionsproteine wurden in transienten Transfektionsexperimenten auf vergleichbaren Pegeln exprimiert. Cyclin A (1 bis 130) hemmte wie Wildtyp-Cyclin A die Transkription, wenn es an TETr fusioniert war (11A). Dieses Fragment von Cyclin A bindet nicht an cdk2 (11B) und kann nicht die Phosphorylierung von pRB steuern, wenn es in Zellen eingebracht wird (11C). Im Gegensatz dazu hemmte eine Cyclin A Punktmutante (E220A) (Schulman et. al. 1998), die messbar mit cdk2 interagiert (11B) und die Phosphorylierung von pRB steuert (11C), nicht die Transkription bei diesen Tests (11A). Diese Mutation kartiert auf der Cyclin-A-Box (11A). TETr-Cyclin A hemmte auch die Transkription, wenn es in p107 –/–; p130 –/– Mausfibroblasten getestet wurden, und Cyclin A (1 bis 130) bindet nicht an p107 oder p130. Nur jene Cyclin-E-Mutanten, die an cdk2 binden (12B) und die Phosphorylierung von pRB steuern konnten (12C) schnitten als transkriptionale Aktivatoren ab (12A). Beispielsweise identifizierten Schulman et al (1998) Cyclin-A-Reste, die für die Substratbindung und Zusammenfügung mit cdk2 kritisch sind. Die Mutation von analogen Resten in Cyclin E erzeugten eine Mutante (Cyclin E L134A/Q174A), die gleicherweise versagten, an cdk2 zu binden (12B), und versagten, pRB zu phosphorylieren (12C). Diese Mutante aktivierte nicht die Transkription (12). Im Einklang mit diesen Ergebnissen blockierte eine dominant negative Form von cdk2 die transkriptionale Aktivierung durch Cyclin E (13B), hatte aber keine Wirkung auf die transkriptionale Repression durch Cyclin A (13A). Gleicherweise aktivierte Cyclin E, aber nicht Cyclin A, die Transkription in Übereinstimmung mit einer TETr-cdk2-Fusion, vorausgesetzt die Kinasedomäne war intakt (13C). Eine vergleichbare Produktion von TETr-cdk2 und kinasedefektivem TETr-cdk2 (N132A) wurde durch einen Immunblotest bestätigt. Xenopus-Cyclin E (Lackson et. al., 1995) aktivierte wie seine menschlichen Gegenstücke auch die Transkription bei diesem Test (Daten sind nicht gezeigt). Diese Aktivität war spezifisch, da Xenopus-Cyclin-E-Varianten mit Punktmutationen, die die Cyclinbox beeinflussen, inert waren.
Das Verfahren ist verwendbar, um die Transkription in vivo dynamisch abzubilden. 3T3-Zellen wurden mit dem Plasmid, das einen selektierbaren Marker enthielt, und TETo-Reporterplasmid mit oder ohne Plasmid transfiziert, das TETr-cdk2 kodiert. Im Anschluss an die Arzneimittelselektion wurden die stabilen Transfektanten als polyklonale Pools bewahrt und in Ruhe serum-ausgehungert. Nach verschiedenen Zeitpunkten nach Wiederzuführung von Serum wurden Zelllysate hergestellt und bei Immunblot-, In-vitro-Kinase- und Luciferasetests verwendet (14). Nebenher wurden Aliquote der Zellen durch FACS auf DNA-Gehalt analysiert. Bei diesem System begann der S-Phase-Eintritt 18 bis 20 Stunden im Anschluss an die Zugabe von Serum. Wie erwartet nahm die Luziferaseaktivität bei den TETr-cdk2 erzeugenden Zellen übereinstimmend mit einer Zunahme der Cyclin-E-Proteinpegel und cyclin-E-assoziierten Kinaseaktivität zu (14A-C). Solch eine Zunahme wurde nicht bei den Zellen beobachtet, die äquivalente Mengen an TETr-cdk2 (N132A) produzieren oder mit dem Reporter allein transfiziert waren (14C und nicht gezeigte Daten). Man beachte, dass die Menge an TETr-cdk2 in diesen Zellen geringer war als die Menge an endogenem cdk2 (14B). Demgemäß ist es unwahrscheinlich, dass die Ergebnisse ein Artefakt der Überproduktion sind. Die Luziferasepegel nahmen ab, sowie die Cyclin-E-Pegel fielen und die Cyclin-A-Pegel begannen, anzusteigen.
Das Verfahren betrifft mm Teil die Verwendung von LGPs, die Cyclin-Bindungsdomänen enthalten. Somit sind diese LGPs verwendbar, um Änderungen in der Transkription von zellzyklus-assoziierten Genen, wie etwa Kanzerogene und Tumorsuppressoren zu quantifizieren. Ein LGP, das einen Cyclinbindungsrest enthält, kann an Regionen lokalisiert werden, die eine Zellproliferation durchmachen, wie etwa einen Tumor, und kann verwendet werden, um auf die Wirksamkeit von die Zellproliferation modulierenden Verbindungen zu rastern und diese zu bestimmen.
Materialien und Methoden
Zelllinien und Transfektion
U2OS humane Osteokarzinomzellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gezüchtet, das mit 10% hitzeinaktiviertem Fetalclone (Hyclone) (FC), 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin (PSG) ergänzt war. SAOS-2 humane Osteokarzinomzellen und NIH 3T3 Mausfibroblastenzellen wurden in DMEM gezüchtet, das mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) und PSG ergänzt war. NIH 3T3 stabile Subklone, die mit dem pCMV-neo und pUHC13-3-Reporterplasmid alleine oder mit pSG5-TETr-cdk2 oder mit pSG5-TETr-cdk2 (N132A) transfiziert waren, wurden in 0,7 mg/ml an G418 bewahrt. Die Zellen wurden unter Verwendung von 2 × Bes-gepufferter Kochsalzlösung (2 × BBS)/Calciumphosphat wie beschrieben (Chen und Okayama, 1987) transfiziert. Wo angegeben, wurde 24 Stunden nach der Transfektion Doxycyclin (Sigma) zu einer Endkonzentration von 2 µg/ml hinzugefügt. Die Zellen wurden vor der Gewinnung zusätzliche 24 Stunden lang in Doxycyclin bewahrt.
Plasmide
pRcCMV-cdk2 dominant negativ (van den Heuvel und Harlow, 1993) war eine Spende von Dr. Ed Harlow; pVL1393-cdk2 (N132A) (Xu et. al., 1994) war eine Spende von Dr. Helen Piwnica-Worms; pCD19 (Tedder und Isaacs, 1989) war eine Spende von Dr. Thomas Tedder und pUHC13-3; ptet1-T81-luc, ptet2-T81-luc, ptet3-T81-luc und ptet7-T81-luc (Gossen und Bujard, 1992) waren Spenden von Dr. Manfred Gossen. pSG5-TETr-E2F1, pSG5-TETr-RB, pSG5-HA-RB (Sellers, 1995), pGEX-2TKcdk2 (Adams et. al., 1996) sind kürzlich beschrieben worden. Um pSG5-TETr-Cyclin A herzustellen, wurde zuerst eine Proteinphosphatase 1 (PP1) cDNA mit den Oligos
5'-GCGCTGATCAGGCGGAGGCGGATCAGGAGGAGGAGGA-TCAGGCGGAGGAGGATCAGGATCCATGTCCGACAGCGAGAA-3' (SEQ ID NO: 7) und 5'-GCGCGAATTCATTTCTTGGCTTTGGCAGA-3' (SEQ ID NO: 8) PCR-amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit BclI und EcoRI geschnitten und in pSG5-TETr subkloniert, das mit BamHI und EcoRI geschnitten wurde, um pSG5-TETr-(Gly₄-Ser)₃-PP1 herzustellen. Das Cyclin A offene Leseraster (ORF) wurde mit Primern PCR-amplifiziert, die eine 5'-BamHI-Stelle und eine 3'-EcoRI-Stelle einfügten, und in pSP72 (Promega) subkloniert, das mit diesen zwei Enzymen geschnitten wurde, um pSP72-Cyclin A herzustellen. Der PPI-Füller aus pSG5-TETr-(Gly₄-Ser)₃-PP1 wurde dann durch Verdauen mit BamHI und EcoRI exzidiert und mit dem Cyclin-A-cDNA-Insert aus pSP72-Cyclin A ersetzt. Um pSG5-TETr-Cyclin E herzustellen, wurde das Cyclin E ORF in pRcCMV-Cyclin E mit Primern PCR-amplifiziert, die eine 5'-BglII- und 3'-EcoRI-Stelle einfügten. Das PCR-Produkt wurde mit diesen zwei Enzymen geschnitten und in das BamHI-EcoRI-Rückgrat von pSG5-TETr-PP1 ligiert. Parallel dazu wurden diese beschränkten Cyclin-A- und Cyclin-E-PCR-Producte in pSG5-HA subkloniert, das mit BamHI und EcoRI geschnitten wurde, um pSG5-HA-Cyclin A bzw. pSGS-HA-Cyclin E herzustellen. Plasmide, die Cyclin A und Cyclin E kodieren, mit N-terminaler und C-terminaler Deletionsmutante, wurden auf eine analoge Art und Weise unter Verwendung von PCR-Primern hergestellt, die selektiv die gewünschten Kodierungsregionen amplifizierten. Um pSG5-TETr-cdk2 und pSG5-TETr-cdk2 (N132A) herzustellen, wurde das cdk2 ORF in pRc-CMV-cdk2 bzw. pVL1393-cdk2 (N132A) mit Primern amplifiziert, die eine 5'-BamHI- und 3'-EcoRI-Stelle einfügten. Die PCR-Produkte wurden mit diesen zwei Enzymen geschnitten und in das BamHI-EcoRI-Rückgrat von pSG5-TETr-PP1 ligiert. Alle PSR-Reaktionen wurden mit Pfu-DNA-Polymerase ausgeführt und die Authentizität der Plasmide, die das gesamte Cyclin A, Cyclin E oder cdk2 offene Leseraster enthielten, wurde durch direkte DNA-Sequenzierung bestätigt. pSG5-TETr-Cyclin A (E220A) und pSG5-TETr-Cyclin E (L134A/Q174A) wurden unter Verwendung des Transformer Site-Directed Mutagenesis Kits (Clontech) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von pSG5-TETr-Cyclin A bzw. pSG5-TETr-Cyclin E als Templat erzeugt und durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Antikörper und Immunblot-Analyse
Monokionales Anti-TETr wurde von Clontech bezogen und Anti-HA (12CA5) wurde von Boehringer Mannheim bezogen. Polyklonales Anti-Cyclin A (SC-751), monoklonales und polyklonales Anti-Cyclin E (SC-247, SC-481) und polyklonales Anti-cdk2 (SC-163) wurden von Santa Cruz bezogen. Zellextrakte wurden durch Lyse in EBC-Puffer (50 mM Tris [pH8], 120 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40) hergestellt. Für die Immunblot-Analyse wurden pro Bahn –100 µg Zellextrakt beladen. Nitrozellulosefilter wurden vor der Inkubation in primärem Antikörper in 4% Milchpulver/1% Ziegenserum in TBS-T (10 mM Tris [pH 8], 0,05% Tween, 150 mM NaCl) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. Anti-HA (12CA5) wurde bei einer Konzentration von 1,0 µg/ml Anti-TETr-Antikörper bei einer Verdünnung von 1:500 (v/v), Anti-Cyclin A (SC-751) bei einer Verdünnung von 1:1000 (v/v), Anti-Cyclin E (SC-247, SC-481) bei einer Verdünnung von 1:1000 (v/v) und Anti-cdk2 (SC-163) bei einer Verdünnung von 1:1000 (v/v) verwendet. Im Anschluss an 4 Waschungen mit TBS/T, wurde gebundener Antikörper unter Verwendung von alkalischen phosphatase-konjugierten sekundären Antikörpern erfasst.
GST-Pull-Down-Test
Glutathion-S-Transferase-Pull-Down-Tests wurden im Grunde ausgeführt, wie es kürzlich beschrieben wurde (Kaelin et. al., 1991). Bindungsreaktionen enthielten 10 µl ³⁵S-radiomarkierte In-vitro-Translate, die mit einem TNT-Kit (Promega) hergestellt wurden, und ungeführ 1 µg des angegebenen Fusionsproteins in 1 ml NEIN (20 mM Tris [pH 8], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40). Im Anschluss an 1 Stunde lange Inkubation bei 4°C unter Schwenken wurde die Sepharose 5-mal mit NEIN gewaschen. Gebundene Proteine wurden durch Kochen in SDS enthaltendem Probenpuffer eluiert und durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgelöst. Vergleichbare Beladung von GST-Fusionsproteinen wurden durch Coomassie-Brilliantblau-Färbung bestätigt und ³⁵S-radiomarkierte Proteine wurden durch Fluorographie erfasst.
FACS Zellzyklenanalyse
Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) wurde im Wesentlichen vorgenommen, wie es beschrieben wurde (Quin et. al., 1995). Kurz, subkonfluente SAOS-2-Zellen, die in 100 mm Schalen gezüchtet wurden, wurden mit 2 µg an pCD19 und 10 µg an pSGS-HA-RB zusammen mit Plasmiden, die die angegebenen Cycline kodieren, transfiziert. 72 Stunden später wurden die Zellen mit Trypsin-EDTA geerntet und mit FITC-konjugiertem Anti-CD19-Antikörper (CALTAG) und Propidiumiodid angefärbt. die Proben wurden durch Zweifarben-FACS mit einem FACScan (Becton Dickinson) analysiert. Für die Zellzyklensynchronisierung wurden Zellen 72 Stunden bevor sie mit 10% FBS stimuliert werden in serumfreiem DMEM geerntet.
Luziferase-Reportergentest
Für TETr-Fusionstranskriptionstests wurden subkonfluente U20S-Zellen doppelt in 6-Well-Platten mit 1 µg pCMV-µgal, 1 µg pUHC13-3-Reporterplasmid und 3 µg der angegebenen Plasmide, die TETr-Fusionsproteine kodieren, transient transfiziert. Ausreichend parentales pSGS-TETr wurde hinzugefügt, so dass jede Reaktionsmischung die gleiche Menge an pSGS-TETr-Rückgrat enthielt. 48 Stunden nach der Transfektion wurde die Luziferaseaktivität und die β-Galaktosidaseaktivität bestimmt, wie es kürzlich beschrieben wurde (Qin, 1995).
In-vitro-Kinase-Test
500 µg Zellextrakt wurden 1 Stunde lang bei 4°C mit Protein A Sepharose und 1 µg Anti-Cyclin E (SC-481) oder Anti-Cyclin A (SC-751) Antikörper in einem Endvolumen von 0,5 ml inkubiert. Die Sepharose wurde dann 5-mal mit NEIN und 3-mal in IP-Kinase (IPK) Puffer (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT) gewaschen. Die Sepharose wurde dann in 27 µl IPK-Puffer resuspendiert, dem 2 µl Histon H1 (1 mg/ml) und 1 µl [γ-³²P] ATP (6000 Ci/mmol, 10 mCi/ml) zugegeben waren, und 30 min lang bei 30°C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von Laemmli-Probenpuffer gestoppt, gekocht, durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgelöst und einer Autoradiographie unterworfen.
Beispiel 4
Das folgende Beispiel demonstriert die Verwendung eines bestimmten Licht erzeugenden Fusionsproteins, das eine Cyclin-Bindungsstelle („T") enthält, die mit Cyclin/cdk2-Komplexen interagiert. Dieses LGP kann zur Bildgebung von hypoxischen Zuständen verwendet werden.
Das p27-Protein enthält eine Cyclin-Bindungsstelle („T"), die mit Cyclin/cdk2-Komplexen interagiert. Dies ermöglicht, dass Cyclin/cdk2 p27 am Threonin 187 („X") phosphoryliert, das auf p27 zur Ubiquitinierung durch eine Ubiquitinligase, die Skp2 enthält, abzielt. Um ein an Cyclin bindendes LGP herzustellen, wurde p27 in-frame an Luziferase fusioniert (p27-LUC). Das sich ergebende Fusionsprotein wurde, wie in 21 dargestellt, in der Gegenwart des cdk2-Inhibitors p21, aber nicht durch den cdk2-Aktivator Cyclin E, aktiviert.
Methoden:
Um pGL3-p27-LUC herzustellen, wurde p27 mit voller Länge durch PCR mit den Primern 5'-GCGCaagcttatgtcaaacgtgcgagtgtctaac-3' (SEQ ID NO: 10) und 5'-gcgcccatggtcgtttgacgtcttctgaggccagg-3' (SEQ ID NO: 11) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit Hind III und Nco I verdaut und das Fragment wurde in pGL3-Kontrollvektor (Promega) ligiert, das mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten wurde.
Luziferase-Test
2 × 10⁵ Hela-Zellen wurden 24 Stunden vor der Transfektion in 6 Well-Platten ausgesät. Die Zellen waren mit 0,1 µg Plasmid-DNA kotransfiziert, das Wildtyp- Glühwürmchen-Luziferase oder p27-Luc kodiert, mit oder ohne 0,1 bis 0,4 µg pCDNA3-HAp21 oder pRcCMV-Cyclin-E-Plasmiden (wie durch die Dreiecke angegeben), zusammen mit 5 ng Plasmid, das Renilla-Luziferase kodiert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und 10 µl wurden für den Luziferase-Test verwendet, unter Verwendung des Dual Luciferase Kit (Promega). Der relative Luziferase-Test (RLU) wurde durch Renilla-Luziferase-Aktivitäten korrigiert.
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Äquivalente
Der Fachmann wird erkennen oder in der Lage sein, unter Verwendung von nichts mehr als Routineexperimenten, zahlreiche Äquivalente zu den hierin beschriebenen Prozeduren zu finden.
Sequenzprotokoll:

Claims

Verfahren zum Lokalisieren von hypoxischem Gewebe in einem Patienten, dem ein Licht erzeugendes Fusionsprotein verabreicht worden ist, wobei das Licht erzeugende Fusionsprotein einen Licht erzeugenden Polypeptidrest und eine Ligandenbindungsstelle eines HIF1α-Polypeptidrests umfasst, wobei die Ligandenbindungsstelle die Aminosäuresequenz Y-X₁-Leu-X₂-Pro_h-X₃-X₄-X₅-X₆-Y' umfasst, wobei Pro_h hydroxyliertes Prolin ist, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ und X₆ Aminosäuren sind, die so gewählt sind, dass die VHL-Bindungseigenschaften nicht modifiziert oder geändert werden, und Y und Y' unabhängig vorhanden oder nicht vorhanden sind und, wenn vorhanden, ein Peptid umfassen, das 1 bis 600 Aminosäuren aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst, dass dem Licht erzeugenden Fusionsprotein ermöglicht wird, sich in hypoxischem Gewebe im Patienten zu lokalisieren, und die Lumineszenz des lokalisierten Licht erzeugenden Fusionsproteins abgebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei X₁, X₂, X₄, X₅ und X₆ unabhängig Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe oder Trp sind und X₃ Ser, Thr oder Tyr ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ligandenbindungsstelle des Fusionsproteins die Aminosäuresequenz entsprechend den N-terminalen Resten 1 bis 600 von HIF1α, nummeriert gemäß dem Wildtyp-HIF1α, umfasst, wobei der Rest 564 hydroxyliertes Prolin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ligandenbindungsstelle des Fusionsproteins die Aminosäuresequenz entsprechend den N-terminalen Resten 1 bis 600 von HIF1α, nummeriert gemäß dem Wildtyp-HIF1α, umfasst, wobei der Rest 402 hydroxyliertes Prolin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ligandenbindungsstelle des Fusionsproteins die Aminosäuresequenz entsprechend den N-terminalen Resten 1 bis 600 von HIF1α, nummeriert gemäß dem Wildtyp-HIF1α, umfasst, wobei einer der beiden oder beide Reste 402 und 564 hydroxyliertes Prolin ist bzw. sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ligandenbindungsstelle des Fusionsproteins eine Sequenz von 4 bis 12 Aminosäuren umfasst, die den an den Rest 564, inklusive, von HIF1α, nummeriert gemäß dem Wildtyp-HIF1α, anschließenden und/oder ihn umgebenden Resten entsprechen, wobei der Rest 564 hydroxyliertes Prolin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ligandenbindungsstelle des Fusionsproteins eine Sequenz von 12 bis 14 Aminosäuren umfasst, die den an den Rest 564, inklusive, von HIF1α, nummeriert gemäß dem Wildtyp-HIF1α, anschließenden und/oder ihn umgebenden Resten entsprechen, wobei der Rest 564 hydroxyliertes Prolin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ligandenbindungsstelle des Fusionsproteins eine Sequenz von 20 bis 30 Aminosäuren umfasst, die den an den Rest 564, inklusive, von HIF1α, nummeriert gemäß dem Wildtyp-HIF1α, anschließenden und/oder ihn umgebenden Resten entsprechen, wobei der Rest 564 hydroxyliertes Prolin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ligandenbindungsstelle eine Sequenz von 80 bis 120 Aminosäuren umfasst, die den an den Rest 564, inklusive, von HIF1α, nummeriert gemäß dem Wildtyp-HIF1α, anschließenden und/oder ihn umgebenden Resten entsprechen, wobei der Rest 564 hydroxyliertes Prolin ist.