DE60210127T2

DE60210127T2 - Verwendung oxidierter lipoproteine zur differenzierung von vorläuferzellen in reife dendritische zellen

Info

Publication number: DE60210127T2
Application number: DE60210127T
Authority: DE
Inventors: Vincent Lotteau; Patrice Andre
Original assignee: Biomerieux SA; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Biomerieux SA; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2001-07-09
Filing date: 2002-07-08
Publication date: 2006-10-12
Anticipated expiration: 2022-07-09
Also published as: EP1404817B1; FR2826975B1; EP1404817A2; US7259012B2; ATE321127T1; ES2258165T3; CA2452630A1; AU2002333961A1; WO2003006634A3; FR2826975A1; WO2003006634A2; DE60210127D1; US20040219672A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von zumindest einer Fraktion von oxidierten Lipoproteinen, die ausgewählt sind aus den oxidierten VLDL und/oder den oxidierten IDL und/oder den oxidierten LDL, um die Differenzierung von Vorläuferzellen, insbesondere von Monozyten, in reife dendritische Zellen zu erwirken
Die dendritischen Zellen sind in die Ausbildung einer Immunantwort und in die Initiation einer spezifischen T-Lymphozyten-Antwort durch Erkennen, Einfangen und Präsentieren von Antigenen, insbesondere von infektiösen Agenzien, involviert (Steinmann et al. 1997, Immuno. Rev., 156 : 25–37; Cella et al. 1997, Curr. Opin. Immunol., 9 : 10–16).
Die unreifen dendritischen Zellen sind in nicht-lymphoiden Geweben lokalisiert. Diese Zellen werden auch Langerhans-Zellen genannt, wenn sie im Bereich der Haut und in der gesamten Epidermis, mit Ausnahme der Eingeweide, lokalisiert sind. Diese unreifen dendritischen Zellen nehmen auf äußerst wirksame Art und Weise Antigene von infektiösen Agenzien auf und verdauen diese.
Wenn die dendritischen Zellen in den meisten Geweben im unreifen Zustand vorhanden sind, können bestimmte Signale, wie bakterielle Agenzien oder inflammatorische Cytokine diese aktivieren, indem sie einen Reifungsprozess induzieren. Die Akti vierung der dendritischen Zellen ist der erste Schritt in der Auslösung der adaptiven Immunantwort. In der Tat erwerben die dendritischen Zellen während dieser Aktivierung die Fähigkeit in die Richtung der lymphoiden Organe zu migrieren, wo diese auf T-Lymphozyten treffen, und die Fähigkeit Signale der Co-Stimulierung zu übertragen, die für die Aktivierung von natürlichen T-Lymphozyten unentbehrlich sind. Während der Migration der dendritischen Zellen in Richtung der lymphoiden Organe, erfahren die dendritischen Zellen folglich funktionelle und phänotypische Modifikationen, die unter dem Begriff der Reifung zusammengefasst werden, die charakterisiert ist durch Folgendes, nämlich:

1) eine Zunahme von Molekülen an der Oberfläche der dendritischen Zellen, die in die Aktivierung von T-Lymphozyten involviert sind (wie bspw. CD40, CD80, CD83, CD86 und Moleküle des Haupt-Histokompatibilitäts-Komplexes (MHC) der Klasse I und II),
2) die Produktion von pro-inflammatorischen Cytokinen (wie den Interleukinen IL-12, IL-1β und IL-6),
3) die Abnahme der Fähigkeit der dendritischen Zellen Antigene aufzunehmen und zu verdauen.

Wegen ihren Fähigkeiten eine Immunantwort auszubilden und eine spezifische T-Lymphozyten-Antwort zu initiieren, kommt den dendritischen Zellen ein besonderes therapeutisches Interesse zu, insbesondere in den Bereichen der anti-infektiösen und anti-tumoralen Impfung und der Immuntherapie (Austin. 1998, Curr. Opin. Hematol. 5 : 3–15, Reise Sousa et al. 1999, Curr. Opin. Immunol. 11 : 392–399).
In vivo handelt es sich bei den Monozyten um zirkulierende Zellen, die in Gewebe eindringen können. Die Monozyten durchqueren die endotheliale Gefäßwand und treten in Kontakt mit umgebenden Faktoren, die deren Entwicklung beeinflussen. Schematisch gesehen, werden drei Möglichkeiten für diese Zellen in Betracht gezogen, nämlich 1) der Austritt aus den Geweben und deren Rückkehr in Richtung der lymphatischen Ganglien, 2) die Differenzierung in Makrophagen, 3) die Differenzierung in unreife dendritische Zellen. Die Natur der umgebenden endogenen Faktoren, die die Monozyten auf den einen oder anderen dieser Wege ausrichten, wird derzeit nicht erkannt.
In vitro betrifft der erste Schritt, um ausgehend von Monozyten reife dendritische Zellen zu erhalten, eine Induktion der Differenzierung der sich in Kultur befindlichen Monozyten in unreife dendritische Zellen, insbesondere durch Interleukin IL-4 und den Faktor GM-CSF (Granulocyte Macrophage – Colony Stimulating Factor). Nach 6 Tagen sind 95 % der sich in Kultur befindlichen Zellen unreife dendritische Zellen. Der zweite Schritt betrifft eine Aktivierung der Reifung der unreifen dendritischen Zellen, die im Allgemeinen durch exogene Agenzien induziert wird, wie bspw. bakterielle oder virale Agenzien oder beliebige andere Moleküle, die in der Lage sind, die Reifung zu induzieren. Dementsprechend ist von Pacale Jeannin et al. (Nature Immunology, 2000, 1 : 502–509) beschrieben worden, dass das Protein kpOmpA von Klebsiella pneumoniae, das am sechsten Tag der Kultivierung zu unreifen dendritischen Zellen hinzugegeben wurde, in der Lage ist, die Reifung dieser Zellen zu induzieren. Als Variante des zweiten Schrittes kann die Anmeldung WO-A-97/29182 zitiert werden, in der das Hinzugeben eines konditionierten Mediums in das Kultivierungsmedium innerhalb von 3 Tagen beschrieben ist, das einen Faktor zur Reifung von dendritischen Zellen aufweist, wie bspw. Gammaglobuline oder ein bakterielles Agens von Staphylococcus aureus (Pansorbine), um die Reifung der dendritischen Zellen zu erwirken.
Dabei stellt man fest, dass die Zeit zur Erlangung von reifen dendritischen Zellen bedeutend lang ist, da zumindest 6 Tage, um den Zustand von unreifen dendritischen Zellen zu erreichen, und zumindest 2 Tage für deren Reifung erforderlich sind.
Ferner ist die Verwendung von exogenen Molekülen, die sich von infektiösen Agenzien ableiten, zur Initiation der Reifung von dendritischen Zellen im Rahmen einer Impfstoffentwicklung und Immuntherapie angesichts der Sicherheits- und finanziellen Probleme, die mit der Verwendung von infektiösen Agenzien verbunden sind, nur schwer denkbar (direkte oder indirekte Nebenwirkungen in vivo; zwingend erforderliche Notwendigkeit einer Aufreinigung nach den äußerst strengen rechtlichen oder vorgeschriebenen Auflagen).
Die Erfindung beabsichtigt sämtlichen Nachteilen aus dem Stand der Technik zu begegnen, indem einerseits die Zeit reduziert wird, die erforderlich ist, um reife dendritische Zellen zu erlangen, und indem andererseits die Verwendung von solchen exogenen Molekülen zur Aktivierung der Reifung vermieden wird, die sich von infektiösen Agenzien ableiten.
Die Erfinder konnten erstaunlicherweise nachweisen, dass oxidierte Lipoproteine, insbesondere die oxidierten LDL (oxidiertes Low Density Lipoprotein), die Differenzierung von Vorläuferzellen ermöglichen, wie insbesondere von sich in Kultur befindlichen Monozyten in Zellen, die morphologische und phänotypische Eigenschaften von reifen dendritischen Zellen aufweisen. Lipoproteine sind kugelförmige Partikel, die in Wasser löslich sind und nicht-polare Lipide transportieren. Bei dem Menschen sind die LDL die wichtigsten Transporter von Cholesterin und bestehen aus einem hydrophoben Kern, der Cholesterinestermoleküle enthält, und aus einer Hülle, die aus einer Schicht von polaren Lipiden (hauptsächlich Phospholipiden) besteht, in die Apolipoprotein B eingelagert ist. Die Plasma-LDL können das Endothel durchqueren und oxidative Modifikationen erfahren, insbesondere im subendothelialen Raum (Witztum et al. 1991, J. Clin. Invest., 88 : 1785–1792); Steinberg et al. 1988, In atherosclerosis reviews. Raven Press, NY, 1–23). Die oxidierten LDL zeigen inflammatorische Aktivitäten. Die pro-inflammatorischen oxidativen Modifikationen von LDL stehen unter Kontrolle von nativem LDL und von nativem HDL (High Density Lipoprotein). Es ist gezeigt worden, dass insbesondere die Enzyme Paraoxonase und „Plättchen-aktivierender-Faktor-Acetylhydrolase" (oder PAF-AH) verhindern, dass sich unter normalen Bedingungen oxidiertes LDL akkumuliert (Mackness et al. 1991, FEBS Lett., 286 : 152–154; Watson et al. 1995, J. Clin. Invest 96 : 2882–2891; Watson et al. 1995, J. Clin. Invest. 95 : 774–782). während der kritischen Phase einer Belastung kommt es zu wichtigen Modifikationen im Plasma und insbesondere in der Zusammensetzung der Lipoproteine. Beispielsweise variiert die Zusammensetzung von HDL, was zur Folge hat, dass anti-inflammatorische HDL in pro-inflammatorische HDL umgewandelt werden. Die oxidierten LDL stimulieren insbesondere die Expression von MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1), M-CSF (Macrophage – Colony Stimulating Factor) und GM-CSF (Granulocyte Macrophage – Colony Stimulating Factor) durch die endothelialen Zellen und erhöhen die Adhärens der Monozyten und deren Transmigration durch die endothelialen Zellen (Kruth, 1985, Atherosclerosis, 57 : 337–341; Simionescu et al., 1986, Am. J. Pathol., 123 : 109–125; Frank et al. 1989, J. Lipid Res., 30 : 967–978; Rajavashisth et al. 1990, Nature, 344 : 254–257; Navab et al. 1991, J. Clin. Invest., 88 : 2039–2046).
Bis heute findet man keine Information im Stand der Technik, die die Differenzierung von Vorläuferzellen, wie insbesondere Monozyten, in Gegenwart von oxidierten LDL in reife dendritische Zellen beschreibt oder vorschlägt.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von zumindest einer Fraktion von oxidierten Lipoproteinen, die ausgewählt sind aus den oxidierten VLDL (Very Low Density Lipoprotein) und/oder den oxidierten IDL (Intermediate Density Lipoprotein) und/oder oxidierten LDL (Low Density Lipoprotein), um die Differenzierung von Vorläuferzellen in reife dendritische Zellen zu erwirken. Unter Vorläuferzellen werden solche Zellen verstanden, die in der Lage sind, in dendritische Zellen zu differenzieren, wie insbesondere Monozyten oder CD34⁺-Zellen, die insbesondere ausgehend von Nabelschnurblut oder aus Knochenmark isoliert wurden. Unter Vorläuferzellen werden ferner pluripotente oder unreife Zellen verstanden, die die Kapazität haben, in unreife und reife dendritische Zellen zu differenzieren. Es kann sich um isolierte oder gereinigte Zellen oder um in vitro kultivierte Zelllinien handeln. In einer Aus führungsform der Erfindung differenzieren die Vorläuferzellen in Gegenwart von IL-4 und GM-CSF in unreife dendritische Zellen. Gemäß einem bevorzugten Modus der Erfindung handelt es sich bei den Vorläuferzellen um Monozyten. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Monozyten aus humanem peripherem Blut isoliert. Gemäß weiteren Ausführungsformen sind die Monozyten aus Mäusen, Ratten, Kaninchen, Affen oder jedem weiteren beliebigen Säugetier isoliert.
Gemäß einem bevorzugten Modus der Erfindung wird die Differenzierung der Monozyten in reife dendritische Zellen in vitro realisiert.
Die Fraktionen werden ausgehend von der Zentrifugation von Plasma gemäß einem dem Fachmann bekannten konventionellen Protokoll erhalten und durch deren Dichte definiert: Dichte unter 1,0063 g/ml für die Fraktion VLDL, Dichte, die bei 1,025 bis 1,0063 liegt für IDL, und Dichte, die bei ungefähr 1,06 bis 1,025 g/ml, vorzugsweise bei 1,055 bis 1,025 g/ml liegt, für LDL.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung von zumindest einer Fraktion von oxidierten Lipoproteinen, die ausgewählt sind aus den oxidierten VLDL und/oder den oxidierten IDL und/oder oxidierten LDL, zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur Differenzierung von Vorläuferzellen, insbesondere von Monozyten, in reife dendritische Zellen vorgesehen ist.
Gemäß einem bevorzugten Modus der Erfindung kann das Arzneimittel dazu dienen, reife dendritische Zellen nach dem In-Kontakt-Bringen mit einem biologischen Agens zu produzieren. Es werden so aufgrund des Arzneimittels reife dendritische Zellen erhalten, die ein bestimmtes Antigen präsentieren, das die Immunantwort des Patienten, der dieses Arzneimittel erhält, induziert und/oder verstärkt.
Dieses biologische Agens kann insbesondere ausgewählt sein aus den Antigenen von Bakterien, von Viren, von Hefen, von Parasiten, von Pilzen, aus tumorösen Antigenen, aus Lysaten von autologen und/oder heterologen tumorösen Zellen. Dieses biologische Agens kann ferner eine Nukleinsäure sein, die für zumindest ein Antigen kodiert, das ausgewählt ist aus den Antigenen von Bakterien, von Viren, von Hefen, von Parasiten, von Pilzen, aus tumorösen Antigenen.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein tumoröses Antigen als ein tumoröses Protein oder Peptid definiert, und insbesondere als ein Epitop, insbesondere ein CTL (cytotoxische T-Lymphozyten)-Epitop (peptidische Sequenzen, die mit Molekülen der Klasse I interagieren und an CD8⁺-T-Lymphozyten präsentieren), oder als Nukleinsequenz, die für dieses Antigen kodiert. Es können, ohne eine Einschränkung hierauf, die folgenden tumorösen Antigene zitiert werden: MAGE-2, MAGE-3, MART, MUC-1, MUC-2, HER-2, GD2, carcinoembryonisches Antigen (CEA), Tag-72, ovar-assoziierte Antigene OV-TL3 und MOV18, TUAN, Alpha-Feto-Protein (AFP), OFP, CA-125, CA-50, CA-19-9, renales tumorassoziiertes Antigen G250, EGP-40 (oder EpCAM), S100 (malignes meanoma-assoziiertes Antigen), p53, prostata-assoziierte Antigene (z.B. PSA und PSMA) und p21ras.
Im Sinne der Erfindung werden unter autologen tumorösen Zellen solche Zellen eines Subjektes verstanden, das das erfin dungsgemäße Arzneimittel erhält. Unter heterologen tumorösen Zellen werden solche Zellen verstanden, die aus Tumoren stammen, die zu einem Subjekt gehören, das sich von jenem unterscheidet, das das erfindungsgemäße Arzneimittel erhält. Die Verwendung von heterologen tumorösen Zellen ermöglicht es insbesondere ein Arzneimittel zu erhalten, das die Behandlung von Patienten ermöglicht, bei denen eine Entnahme von tumorösen Zellen nicht möglich ist. Die tumorösen Zellen können durch Entnahme von krebsartigem Gewebe, insbesondere durch eine Biopsie oder einer chirurgischen Resektion, erhalten werden.
Im Sinne der Erfindung wird unter einem zellulärem Lysat eine Mischung von intrazellulären und/oder membranösen Antigenen verstanden, die gemäß einem dem Fachmann wohl bekannten Protokoll zur zellulären Lyse, insbesondere durch mechanische, chemische oder enzymatische Lyse der Zellen, erhalten werden.
Gemäß einem bevorzugten Modus der Erfindung ist das erfindungsgemäße Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prävention einer Infektion mit bakteriellem, viralem, pilzartigem, parasitärem Ursprung, oder einer solchen, die durch eine Hefe hervorgerufen wurde, bzw. zur Behandlung und/oder Prävention von Krebs, d.h. gegen sämtliche Krankheiten bestimmt, die auf eine anormale zelluläre Vermehrung zurückzuführen sind, insbesondere Myelome, Lymphome, Leukämien, Karzinome der Niere, des Gehirns, der Prostata, des Rektums, des Kolons, des Pankreas, der Ovarien, der Lunge, der Leber, der Brust, Hautkrebs, der ausgewählt ist aus Keratinomen und Karzinomen, den Melanomen.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann insbesondere zur Verabreichung über den oralen Weg, bspw. in Form einer Tablet te, einer Gelatinekapsel, einer Trinklösung, etc., auf rektalem Weg, in Form eines Zäpfchens, auf parenteralem Weg, insbesondere in Form einer injizierbaren Lösung, insbesondere auf intravenösem, intrakutanem Weg, unter die Haut, auf topischem Weg, in Form einer Creme, einer Salbe, Lotionen, gemäß konventionellen Verabreichungsprotokollen, die dem Fachmann wohl bekannt sind, bestimmt sein. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann ferner ein Transportagens aufweisen, das es ermöglicht, zumindest eine Fraktion von oxidierten Lipoproteinen zu befördern, die ausgewählt sind aus den oxidierten VLDL und/oder den oxidierten IDL und/oder oxidierten LDL, und zwar in einer Form, die es ermöglicht, deren Stabilität und/oder deren immunstimulierende Aktivität und/oder deren Fähigkeit eine anti-tumorale Immunantwort zu induzieren, zu verbessern. Dieses Transportagens kann insbesondere in Form einer Lipidemulsion, eines Partikels vom Typ Liposom, einer Mikrokugel, einer Nanokugel oder eines jeden Strukturtyps vorliegen, der die Verkapselung und die Darbietung der Fraktion von Lipoproteinen in partikulärer Form ermöglicht.
Die Dosierung hängt von der Schwere der Erkrankung ab und wird eingestellt, um eine passende therapeutische Behandlung zu erwirken.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren, um in vitro Vorläuferzellen, insbesondere Monozyten, in reife dendritische Zellen zu differenzieren, nachdem Vorläuferzellen in ein geeignetes Medium gegeben werden, das deren Differenzierung ermöglicht, und zu dem Medium in einer bestimmten Menge zumindest eine Fraktion von oxidierten Lipoproteinen hinzugegeben wird, die ausgewählt sind aus den oxidierten VLDL und/oder den oxidierten IDL und/oder oxidierten LDL. Vorzugsweise sind die Vorläuferzellen Monozyten.
Unter geeignetem Medium wird ein Kulturmedium verstanden, das sämtliche Elemente aufweist, die für die Lebensfähigkeit der Zellen erforderlich sind. Es kann bspw. das RPMI 1640 Medium und dessen Derivate zitiert werden. Vorzugsweise weist das Kulturmedium Induktoren für die Differenzierung der Vorläuferzellen in unreife dendritische Zellen auf. Vorzugsweise weist das Kulturmedium Interleukin IL-4 und den Faktor GM-CSF (Granulocyte Macrophage – Stimulating Factor) auf.
Gemäß einem bevorzugten Modus der Erfindung erfolgt die Zugabe der oxidierten Lipoproteine zu dem Medium in vitro, und zwar in einer Menge, die insbesondere bei ungefähr 1 bis 20 μg/ml, vorzugsweise bei 2,5 bis 15 μg/ml und vorteilhafterweise bei ungefähr 8 bis 12 μg/ml liegt. Gemäß einem bevorzugten Modus der Erfindung wird oder werden die Fraktion(en) von oxidierten Lipoproteinen in das Medium zwischen dem ersten und sechsten Tag der Differenzierung der Vorläuferzellen, vorzugsweise zwischen dem vierten und dem fünften Tag der Differenzierung der Vorläuferzellen hinzugegeben. Vorzugsweise sind die Vorläuferzellen Monozyten.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren ferner die Zugabe eines biologischen Agens in das Kulturmedium. Vorzugsweise wird das biologische Agens in das Kulturmedium am T5 oder T6 hinzugegeben.
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der dendritischen Zellen und zumindest eines biologischen Agens zur Her stellung eines Arzneimittels, das zur Behandlung und/oder Prävention einer Infektion von bakteriellem, viralem, pilzartigem, parasitärem Ursprung oder die von einer Hefe verursacht wurde, oder zur Behandlung und/oder der Prävention von Krebs bestimmt ist. Folglich kann, ohne dass dies einschränkend zu verstehen ist, einem Patienten, der von Krebs oder einer Infektionskrankheit betroffen ist, eine Blutprobe entnommen werden, um Monozyten zu erhalten. Diese Monozyten werden anschließend in reife dendritische Zellen differenziert, welche gemäß dem wie zuvor definierten Verfahren erhalten werden, und zwar in Gegenwart eines anti-tumoralen Antigens oder eines Antigens eines infektiösen Agens, gegen das die Immunantwort des Patienten verstärkt werden soll, und die dann zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Aktivierungsagens für die Differenzierung der Vorläuferzellen, insbesondere von Monozyten, in reife dendritische Zellen, das zumindest eine Fraktion von oxidierten Lipoproteinen aufweist, die ausgewählt sind aus den oxidierten VLDL und/oder den oxidierten IDL und/oder oxidierten LDL. Unter Aktivierungsagens wird ein Molekül verstanden, das in einer pharmazeutischen Zusammensetzung die Wirkungen einer Medikation induziert oder die Wirkungen oder Hauptmedikation verstärkt oder vervollständigt. Im Falle einer Impfstoffzusammensetzung ist das Aktivierungsagens ein Adjuvans, welches vorzugsweise ein Molekül ist, das die Immunantwort des Wirtsorganismus stimuliert.
Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Fraktion von oxidierten Lipoproteinen, die ausgewählt sind aus den oxidierten VLDL und/oder den oxidierten IDL und/oder oxidierten LDL, und zumindest ein biologisches Agens in Kombination mit zumindest einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten aufweist. Der pharmazeutisch akzeptable Exzipient wird entsprechend seiner pharmazeutischen Darreichungsform und der gewünschten Darreichungsform ausgewählt, und die pharmazeutische Zusammensetzung wird gemäß den einem Fachmann aus dem Bereich der Galenik wohl bekannten Prinzipien erhalten. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist insbesondere zur Behandlung und/oder Prävention einer Infektion mit bakteriellem, viralem, pilzartigem, parasitärem Ursprung, oder die durch eine Hefe hervorgerufen wurde bzw. zur Behandlung und/oder Prävention von Krebs vorgesehen.
Die Erfindung betrifft schließlich ein Verfahren zur Aktivierung von T-Lymphozyten gegen ein bestimmtes biologisches Agens, dadurch gekennzeichnet, dasss

• Vorläuferzellen in einem Kulturmedium bereitgestellt werden, das deren Differenzierung ermöglicht;
• zu dem Medium eine bestimmte Menge von zumindest einer Fraktion von oxidierten Lipoproteinen hinzugegeben wird, die ausgewählt sind aus den oxidierten VLDL und/oder den oxidierten IDL und/oder oxidierten LDL;
• zumindest ein biologisches Agens in das Kulturmedium hinzugegeben wird; und
• die reifen dendritischen Zellen in Gegenwart von T-Lymphozyten cokultiviert werden.

Vorzugsweise sind die Vorläuferzellen Monozyten. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Aktivierung der T-Lymphozyten in vitro.
Die nachfolgenden Beispiele werden exemplarisch gegeben und haben keinen einschränkenden Charakter. Sie ermöglichen es die Erfindung besser zu verstehen.
Beispiel 1 – Differenzierung von sich in Kultur befindlichen Monozyten in dendritische Zellen in Abwesenheit von oxidierten LDL in dem Kulturmedium
Isolierung, In-Kultur-Bringen und Initiation der Differenzierung der Monozyten – Die Monozyten werden von humanem peripherem Blut durch eine erste Zentrifugation gemäß dem Dichtegradienten (400 g; 20 Minuten) in Ficoll-Hypaque, gefolgt von einer zweiten Zentrifugation (400 g; 20 Minuten) in einer 50%igen Percoll-Lösung isoliert. Die Monozyten werden anschließend durch immunmagnetische Depletion (Dynal, Oslo, Norwegen) gereinigt, indem eine Mischung von monoklonalen Antikörpern verwendet wurde, nämlich CD19 (Hybridom 4G7) (Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA), Anti-CD3 (OKT3, American Type Culture Collection, Rockeville, MD) und Anti-CD56 (NKH1, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Die so erhaltenen Monozyten werden dann auf zumindest 90 % gereinigt, wie dies durch die Abwesenheit der Marker CD1a und CD14 ersichtlich wird. Die Differenzierung der Monozyten in dendritische Zellen wird durch 40 ng/ml von rekombinantem humanem GM-CSF (Granulycte Macrophage-Colony Stimulating Factor) und 250 U/ml von rekonbinantem humanem Interleukin IL-4 induziert.
Die Monozyten werden in dem Medium RPMI 1640 (Life technologies, Rockeville, MD, USA) in Kultur gebracht, das mit 2 mM Glutamin (Life technologies), 10 mM Hepes (Life Technologies), 40 ng/ml Gentamycin (Life technologies) angereichert ist, und mit

• entweder 10 % fötalem Kälberserum (Biowest, Nuailles Frankreich) (oder FCS-Kulturmedium)
• oder 10 % fötales Kälberserum ohne Lipoproteine (Sigma, St Quentin-Fallavier, Frankreich) (oder LPDS-Kulturmedium). Dieses Medium wird ausgewählt, um für die Monozyten optimale Bedingungen zu schaffen, um einen Effekt der oxidierten LDL zu erzielen.

Phänotyp der sich in Kultur befindlichen Zellen – Der Phänotyp der sich in Kultur befindlichen Zellen wurde 6 Tage nach der Initiation der Differenzierung der Monozyten durch Cytometrie auf einem FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) unter Verwendung eines der folgenden FITC(Fluoresceinisothiocyanat)-konjugierten Antikörper analysiert, nämlich Anti-CD14, Anti-HLA-DR, Rnti-CD80 und eines der folgenden PE(Phycoerythrin)-konjugierten Antikörper analysiert, nämlich Anti-CD1a, Anti-CD83, Anti-CD86, Anti-CD40 (Beckman Coulter). Dem Fachmann ist es bekannt, dass Monozyten vorzugsweise einen Phänotyp CD14⁺ CD1a^–, unreife dendritische Zellen vorzugsweise einen Phänotyp CD14^– CD1a⁺ -CD86^–, reife dendritische Zellen vorzugsweise einen Phänotyp CD14^– CD1a intermediär^– CD86⁺ aufweisen.
Nach 5-stündiger Kultivierung in Gegenwart von GM-CSF und IL-4 weisen mehr als 95 % der sich in Kultur befindlichen Monozyten einen Phänotyp auf, der vergleichbar ist mit jenem von unreifen dendritischen Zellen. Die Ergebnisse sind mit denen für die Kultivierung von Monozyten in einem FCS-Medium oder in einem LPDS-Medium vergleichbar.
Beispiel 2 – Differenzierung von sich in Kultur befindlichen Monozyten in dendritische Zellen in Gegenwart von oxidierten LDL in dem Kulturmedium
Präparation von LDL – Die LDL (Low Density Proteine; mit einer Dichte von 1,025 bis 1,055 g/ml) werden von humanem Plasma durch Zentrifugation isoliert. Die Dichte des Plasmas wurde durch die Verwendung von NaBr auf 1,025 g/ml gebracht. Nach einer bei 100.000 Umdrehungen pro Minute und bei einer Temperatur von 4 °C für 4 Std. durchgeführten ersten Zentrifugation (Zentrifuge Beckman TL 100) wird die obere Fraktion, die die Chylomikronen, die VLDL (Very Low Density Proteine) und die IDL (Intermediate Density Lipoprotein) enthielt, wird entfernt. Die Dichte wird dann mit NaBr auf 1,055 g/ml eingestellt. Es erfolgt eine zweite Zentrifugation, die mit der zuvor beschriebenen ersten Zentrifugation vergleichbar ist. Die oberste Fraktion, die die LDL enthält, wird zurückgewonnen, gegen eine Lösung aus 150 mM NaCl, 2,4 mM EDTA, pH 7,2 bei 4 °C dialysiert, und bei 0,45 μm filtriert und in Stickstoff konserviert.
Der Proteingehalt dieser LDL-Fraktion wird durch die sog. Coomassie-Protein-Micro-Assay-Technik (Handelsname, Pierce, Rockford, IL, USA), bestimmt.
Der Lipidgehalt dieser LDL-Fraktion wird durch Verwendung der Kits RTU-Cholesterol, Triglyceride enzymatic PAP150 und Phospholipide enzymatic PAP 150 (Handelsname, bioMérieux, Marcy l'Etoile, Frankreich), bestimmt.
Die Analyse ergibt, dass die LDL aus 23 ± 1 % Proteinen (allein Apo-B-Protein), aus 41 ± 4 % Cholesterin, aus 24 ± 1 % Phospholipiden und aus 13 ± 4 % Triglyceriden bestehen. Die in der Fraktion enthaltenden Endotoxine werden durch ein E-Toxat-Test (Handelsname Sigma, St. Quentin-Fallavier, Frankreich) abgeschätzt. Die Konzentration von Endotoxinen liegt unterhalb von 0,6 pg/ml in der Endkonzentration der LDL oder der oxidierten LDL.
Oxidation der LDL – Die Konzentration von LDL wird durch Verdünnung in PBS auf 1 mg/ml eingestellt. Das EDTA wird durch Dialyse gegen PBS bei 4 °C entfernt. Die Oxidation durch Cu²⁺ erfolgt bei 37 °C für 24 Std. durch Dialyse gegen eine PBS-Lösung, CuSO₄, 5 μM. Die Reaktion wird durch Zugabe von Hydroxy-butyltoluol (Ref. B1378, Sigma, St Quentin-Fallavier, Frankreich), 40 μM, gestoppt und gründlich bei 4 °C gegen PBS dialysiert, das 100 μM Diethylendiaminpentaacetat enthält. Der Oxidationsgrad wird durch die Produktion von Malondialdehyd bestimmt, der durch die sog. LPO-586-Assay-Technik (Oxis, Portland, OR, USA) gemessen wird.
Isolierung, In-Kultur-Bringen und Initiation der Differenzierung der Monozyten in Gegenwart von oxidierten LDL – Die Schritte erfolgen gemäß dem Protokoll aus Beispiel 1, in Gegenwart von oxidierten LDL. Hierzu werden 10 μg/ml von oxidierten LDL in das FCS-Kulturmedium oder LPDS bei T0, dem Tag, an dem die Monozytenkultur initiiert wird, T1, T2, T3, T4, T5 und T6 hinzugeben, was jeweils der ersten, zweiten, dritten, vierten, fünften und sechsten Kultur entspricht.
Phänotyp der sich in Kultur befindlichen Zellen – Der Phänotyp der sich in Kultur befindlichen Zellen wird in Bezug auf das Vorhandensein des Markers CD86 gemäß dem Protokolls aus dem Beispiel 1 analysiert.

• Sechs Tage nach der Initiation der Differenzierung der Monozyten, wenn die oxidierten LDL bei T0, T3, T4, T5 hinzugegeben wurden,
• sieben Tage nach der Initiation der Differenzierung der Monozyten, wenn die oxidierten LDL bei T6 hinzugegeben wurden.

Die Zellen, die durch Differenzierung von Monozyten in FCS und in Gegenwart von oxidierten LDL ausgehend von T0 erhalten wurden, exprimieren den Marker CD86 stärker, als die Zellen, die durch Differenzierung von Monozyten in Abwesenheit von oxidierten LDL erhalten wurden. Die Ergebnisse sind, was das Vorhandensein des Markers CD86 (ausgedrückt als mittlere Fluoreszenzintensität) auf sich in Kultur befindlichen Zellen in einem LPDS-Medium in Abwesenheit (Kontrolle) oder Gegenwart von 10 μg/ml von oxidierten LDL, hinzugegeben bei T0, T3, T4, T5 und T6, betrifft, in der Tabelle 1 dargestellt.
TABELLE 1 – Expression des Markers CD86 in Abwesenheit oder in Gegenwart von oxidierten LDL (10 μg/ml), hinzugegeben bei T0, T3, T4, T5 oder T6
Die Induktion der Expression von CD86 ist am vierten oder am fünften Tag der Differenzierung der Monozyten optimal und hängt ab von der Dosis der hinzugegebenen oxidierten LDL, wie in Tabelle 2 dargestellt.
TABELLE 2 – Expression des Markers CD86 in Abwesenheit oder in Gegenwart von oxidierten LDL in einer Konzentration von 2,5; 5 oder 10 μg/ml, hinzugegeben bei T5
Außerdem induziert in dem LPDS-Medium die Zugabe von oxidierten LDL bei T0 und, auf noch deutlichere Art und Weise, bei T5 in das Medium zur Kultivierung von Monozyten auf dem Weg zur Differenzierung einen Phänotyp, der charakteristisch ist für reife dendritische Zellen, was ersichtlich ist durch die Marker CD83, CD80, CD86, MHC Klasse II, CD40, im Vergleich zu sich in Kultur befindlichen Monozyten in Abwesenheit von oxidierten LDL (Kontrolle) (Tabelle 3).
TABELLE 3 – Expression der Marker CD83, CD80 und CD86 in Abwesenheit (Kontrolle) oder in Gegenwart von oxidierten LDL (10 μg/ml), hinzugegeben bei T0 oder T5
Nach 6 Stunden des Kultivierens in Gegenwart von GM-CSF und IL-4 und LDLox, die insbesondere zwischen dem vierten und dem fünften Tag der Differenzierung hinzugegeben werden, weisen die erhaltenen Zellen einen Phänotyp auf, der vergleichbar ist mit jenem von reifen dendritischen Zellen.
Beispiel 3 – Differenzierung von sich in Kultur befindlichen Monozyten in dendritische Zellen in Gegenwart von nicht-oxidierten LDL und/oder oxidierten LDL in dem Kulturmedium
Das in diesem Beispiel verwendete Protokoll ist vergleichbar mit jenem, das in Beispiel 2 dargestellt ist.
Folglich werden die in diesem Beispiel dargestellten Zellen nach 6 Tagen der Differenzierung der Monozyten in LPDS-Medium wie folgt erhalten, nämlich:

• in Abwesenheit von oxidierten LDL (gemäß dem Protokoll aus Beispiel 1),
• in Gegenwart von nicht-oxidierten LDL (50 μg/ml; Präparation gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Protokoll), hinzugegeben in das Kulturmedium am fünften Tag der Differenzierung der Monozyten,
• in Gegenwart von oxidierten LDL (10 μg/ml; Präparation gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Protokoll), hinzugegeben in das Kulturmedium am fünften Tag der Differenzierung der Monozyten,
• in Gegenwart von oxidierten LDL (10 μg/ml) und von nicht-oxidiertem LDL (50 μg/ml), hinzugegeben in das Kulturmedium am fünften Tag der Differenzierung der Monozyten.

Phänotyp der sich in Kultur befindlichen Zellen – Der Phänotyp der sich in Kultur befindlichen Zellen wird im Hinblick auf das Vorhandensein des Markers CD86, gemäß dem Protokoll aus dem Beispiel 1, sechs Tage nach der Initiation der Differenzierung der Monozyten analysiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 dargestellt.
TABELLE 4 – Expression des Markers CD86 in Abwesenheit oder in Gegenwart von oxidierten LDL, von nicht-oxidierten LDL, von oxidierten LDL plus nicht-oxidierten LDL
Folglich haben die nicht-oxidierten LDL, die in das Kulturmedium bei T5 hinzugegeben werden, keine Auswirkung auf die Expression des Markers CD86, was darauf hindeutet, dass, im Gegensatz zu oxidierten LDL, die nicht-oxidierten LDL keine Auswirkung auf die Differenzierung der Monozyten in reife dendritische Zellen haben. Ferner blockiert ein Überschuss von nicht-oxidierten LDL in dem Kulturmedium die Wirkung der oxidierten LDL auf die Differenzierung der Monozyten in reife dendritische Zellen.
Nach 6 Tagen der Kultivierung in Gegenwart von GM-CSF und IL-4 und nicht-oxidierten LDL oder nicht-oxidierten LDL im Überschuss im Vergleich zu oxidierten LDL, die insbesondere zwischen dem vierten und dem fünften Tag der Differenzierung hinzugegeben werden, weisen die erhaltenen Zellen einen Phänotyp auf, der nahe jenem von unreifen dendritischen Zellen ist.
Beispiel 4 – Fähigkeit der durch Differenzierung von Monozyten in Abwesenheit oder in Gegenwart von oxidierten LDL in dem Kulturmedium erhaltenen Zellen zur Internalisierung
Die Zellen werden nach 6 Tagen der Differenzierung von Monozyten in LPDS-Medium wie folgt erhalten, nämlich:

• in Abwesenheit von oxidierten LDL (gemäß dem Protokoll aus Beispiel 1),
• in Gegenwart von 10 μg/ml von oxidierten LDL, die am fünften Tag der Differenzierung der Monozyten zu dem Kulturmedium hinzugegeben werden (T5, gemäß dem Protokoll aus Beispiel 2)

Am sechsten Tag der Kultivierung werden die Zellen in einem FCS-Kulturmedium in Suspension gebracht und bei 37 °C inkubiert, und zwar:

• für 30 Minuten mit 1 mg/ml von FITC-T70-Dextran (Sigma), um die Fähigkeit dieser Zellen zur Internalisierung durch Rezeptor-vermittelte Endozytose abzuschätzen,
• für 30 Minuten mit 1 mg/ml von Lucifer Yellow (Ref. L0259, Sigma, St Quentin-Fallavier, Frankreich), um die Fähigkeit dieser Zellen zur Internalisierung durch Pinozytose abzuschätzen,
• für 3 Stunden mit Carboxylat-modifizierten yellow-green FluoSphares (Handelsname, 0,45 μm, Molecular Probes, Leiden, Niederlande), um die Kapazität dieser Zellen zur Internalisierung durch Makropinozytose abzuschätzen.

Die Internalisierung wird auf Eis durch einen kalten PBS-Puffer abgestoppt, der 1 % BSA (Bovine Serum Albumin, Rinderserumalbumin) und 0,05 % NaN₃ enthält. Die Zellen werden dreimal bei 4 °C mit dem gleichen Puffer gewaschen, und die Fluoreszenz wird durch FACScalibur (Handelsname, Becton Dickinson) quantifiziert.
Wie in der Tabelle 5 gezeigt, werden die Fähigkeiten zur Internalisierung durch Endozytose, Pinozytose und Makropinozytose im Vergleich zur Kontrolle, bei der kein oxidiertes LDL vorhanden war, stark reduziert, wenn bei T5 10 μg/ml oxidiertes LDL in das Kulturmedium hingegeben werden.
TABELLE 5 – Fähigkeit der Monozyten, die in Abwesenheit (Kontrolle) oder in Gegenwart von oxidierten LDL (10 μg/ml, zugegeben bei T5) differenzieren, zur Internalisierung durch Endozytose, Pinozytose und Makropinozytose
Die Reduzierung der Fähigkeiten zur Internalisierung ist eines der Charakteristika von reifen dendritischen Zellen. Es ist festzuhalten, dass die in Gegenwart von nicht-oxidierten oder von überschüssigen nicht-oxidierten LDL im Vergleich zu oxidierten LDL erhaltenen Zellen diese Reduktion der Fähigkeiten zur Internalisierung nicht zeigen, was darauf hindeutet, dass die so erhaltenen Zellen keine reifen dendritischen Zellen sind.
Diese Ergebnisse zeigen, dass in Gegenwart von oxidierten LDL, die am fünften Tag der Differenzierung hinzugegeben werden, die Monozyten eine starke Tendenz aufweisen, sich in Zellen zu differenzieren, die funktionelle Eigenschaften von reifen dendritischen Zellen aufweisen.
Beispiel 5 – Quantifizierung der Sekretion von Cytokinen durch Zellen, die durch die Differenzierung von Monozyten in Abwesenheit oder in Gegenwart von oxidierten LDL erhalten wurden
Die Zellen werden nach 6 Tagen der Differenzierung von Monozyten in LPDS wie folgt erhalten, nämlich:

• in Abwesenheit von oxidierten LDL (Protokoll aus Beispiel 1),
• in Gegenwart von 10 μg/ml oxidierten LDL, die am fünften Tag der Differenzierung der Monozyten in das Kulturmedium hinzugegeben werden (T5, Protokoll aus Beispiel 2).

Das Vorhandensein von Cytokinen, insbesondere von Interleukinen IL10 (anti-inflammatorisches Cytokin) und IL12p70 (pro-inflammatorisches Cytokin), die von reifen dendritischen Zellen sekretiert werden, wird durch ein ELISA-Kit bestimmt, das spezifisch ist für Cytokine (Endogen, Woburn, MA, USA). Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 dargestellt.
TABELLE 6 – Sekretion von Cytokinen durch in Abwesenheit (Kontrolle) oder in Gegenwart von oxidierten LDL (10 μg/ml, hinzugegeben bei T5) differenzierten Monozyten
Die Zellen, die durch Differenzierung von Monozyten in Gegenwart von oxidierten LDL erhalten wurden, die in das Kulturmedium am fünften Tag der Differenzierung der Monozyten hinzugegeben wurden, haben in Bezug auf jene Zellen, die durch Differenzierung von Monozyten in Abwesenheit von oxidierten LDL (Kontrolle) erhalten wurden, die Fähigkeit erworben, Interleukin IL12p70 zu sekretieren, welches eines der Cytokine ist, das grundsätzlich von reifen dendritischen Zellen sekretiert wird. Die Sekretion von IL10 wird unter keiner der Bedingungen erhalten.
Die Ergebnisse zeigen eine sehr starke Tendenz der Monozyten sich direkt in Zellen zu differenzieren, die einen Phänotyp und eine Funktionalität aufweisen, die vergleichbar ist mit jenen von reifen dendritischen Zellen, wenn die Zugabe der oxidierten LDL am fünften Tag der Differenzierung erfolgt.
Beispiel 6 – Fähigkeit der durch Differenzierung von Monozyten in Abwesenheit oder in Gegenwart von oxidierten LDL erhaltenen Zellen T-Lymphozyten zu stimulieren
Die Zellen werden nach 6 Tagen der Differenzierung von Monozyten in LPDS-Medium wie folgt erhalten, und zwar:

• in Abwesenheit von oxidierten LDL in einem LPDS-Kulturmedium gemäß dem Protokoll aus Beispiel 1,
• in Gegenwart von 10 μg/ml oxidierten LDL, die in ein LPDS-Kulturmedium am fünften Tag der Differenzierung der Monozyten hinzugegeben werden (T5, Protokoll aus Beispiel 2)

Natürliche T-Lymphozyten werden aus humanem peripherem Blut isoliert. Die mononukleären Zellen des peripheren Blutes werden durch Zentrifugation (400 g, 20 Minuten) über einen Dichtegradienten in Gegenwart von Ficoll-Hypaque isoliert. Nach der Entfernung der Monozyten auf dem Percoll-Gradienten, befinden sich die Lymphozyten des peripheren Blutes in der dichten Fraktion. Die T-Lymphozyten werden durch immunmagnetische Depletion unter Verwendung einer Mischung der folgenden monoklonalen Antikörpern gereinigt, nämlich Anti-CD19 (Antikörper 4G7), Anti-CD16 (Antikörper 3G8), Anti-CD56 (Antikörper NKH1), Anti-Glycophorin A (Antikörper 11E4B7.6) und Anti-CD14 (Antikörper RMPo52) vertrieben durch Beckman Coulter.
Die gereinigten T-Lymphozyten, wie dies das Vorhandensein des Markers CD3 anzeigt, werden in Kulturplatten mit 96 sich auf dem Boden befindlichen Vertiefungen mit Antigen-präsentierenden Zellen kultiviert. Unter Antigen-präsentierenden Zellen werden Monozyten verstanden, die in Gegenwart oder Abwesenheit von oxidierten LDL differenzieren. 2 × 10⁵ allogene oder syngene T-Zellen werden in 200 μl Kulturmedium in einem Verhältnis von 1:5, 1:10 oder 1:20 Antigen-präsentierenden Zellen/T-Zellen kultiviert. Nach 4 Tagen werden 50 μl des Kulturüberstandes dazu verwendet, um die Sekretion von IL-2 (Interleukin 2) durch ein ELISA-Kit (Endogen, Woburn, MA, USA) zu bestimmen, und werden durch 50 μl eines Mediums ersetzt, das 1 μCi von [³H]-Thymidin enthält. Nach 16 Std. der Kultivierung werden die Zellen über einen Papierfilter gesammelt und die Inkorporation von Thymidin, die die Proliferation der T-Lymphozyten widerspiegelt, wird durch Verwendung eines Matrix-Zählers 9600 Direct beta (Handelsnamen, Packard, Meriden, CT, USA) gemessen.
a) Sekretion von Interleukin 2 (IL-2)
Wie in Tabelle 7 dargestellt, wird die Sekretion von IL2 durch die allogenen T-Lymphozyten (konventionell ausgedrückt gemäß dem Verhältnis von dendritischen Zellen/T-Lymphozyten, Verhältnis DZ/TL) wird induziert, wenn die dendritischen Zellen aus der Differenzierung von Monozyten stammen, die in Gegenwart von oxidierten LDL erhalten wurden, das bei T5 hinzugegeben wurde, und zwar im Vergleich zu den Ergebnissen, die in Abwesenheit von oxidierten LDL erhalten wurden (Kontrolle).
TABELLE 7 – Stimulation der Sekretion von IL2 durch allogene T-Lymphozyten (gemäß dem Verhältnis DZ/TL), induziert durch Monozyten, die in Abwesenheit (Kontrolle) oder in Gegenwart von oxidierten LDL (10 μg/ml hinzugegeben bei T5) differenziert wurden
Die Ergebnisse zeigen eine Erhöhung der Fähigkeiten zur Allostimulation der Zellen, die nach der Differenzierung der Monozyten in Gegenwart von oxidierten LDL erhalten wurden.
b) Proliferation von T-Lymphozyten
Wie in der Tabelle 8 dargestellt, ist die Proliferation von allogenen T-Lymphozyten, die Proliferation wird durch die Inkorporation von ³H-Thymidin abgeschätzt, induziert durch die Antigen-präsentierenden Zellen, im Vergleich zu Ergebnissen, die in Abwesenheit von oxidierten LDL (Kontrolle) erhalten werden, stark erhöht, wenn die Zellen durch Differenzierung von Monozyten in Gegenwart von oxidierten LDL bei T5 erhalten wurden. Diese Wirkung hängt von der Dosis von oxidierten LDL ab, die in dem Kulturmedium vorhanden ist (2,5; 5 oder 10 μg/ml).
TABELLE 8 – Inkorporation von ³H-Thymidin (Zählimpulse pro Minute) durch die allogenen T-Lymphozyten, induziert durch Monozyten, die in Abwesenheit (Kontrolle) oder in Gegenwart von oxidierten LDL bei einer Konzentration von 2,5, 5 oder 10 μg/ml, hinzugegeben bei T5, differenziert wurden
Die in Gegenwart von oxidierten LDL (10 μg/ml) bei T5 differenzierten Monozyten sind ferner in der Lage, die Proliferation von syngenen T-Lymphozyten wesentlich wirksamer zu induzieren als Monozyten, die in Abwesenheit von oxidierten LDL (Kontrolle) differenziert wurden, d.h. die klassischen unreifen dendritischen Zellen, wie in Tabelle 9 dargestellt.
TABELLE 9 – Inkorporation von ³H-Thymidin (Zählimpulse pro Minute) durch die allogenen T-Lymphozyten, induziert durch Monozyten, die in Abwesenheit (Kontrolle) oder in Gegenwart von oxidierten LDL (10 μg/ml), hinzugegeben bei T5, differenziert wurden
Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass die oxidierten LDL die Produktion von Zellen begünstigen, die in der Lage sind, Peptide zu präsentieren, die aus der Degradation von internalisierten exogenen Proteinen stammen, welche deshalb funktionelle Eigenschaften von reifen dendritischen Zellen aufweisen. Es ist festzuhalten, dass diese Fähigkeit zur Präsentation von Peptiden nicht beobachtet wird, wenn die Zellen ausgehend von Monozyten erhalten werden, die in Gegenwart von nicht-oxidierten LDL oder von nicht-oxidierten LDL im Überschuss in Bezug auf oxidierte LDL kultiviert werden, die nach dem Protokoll aus Beispiel 2 erhalten werden.
Beispiel 7 – Primäre Aktivierung von für die Protease des Hepatitis C-Virus spezifischen T-Lymphozyten durch erfindungsgemäß erhaltene reife dendritische Zellen
Die in diesem Beispiel verwendeten dendritischen Zellen werden gemäß dem Protokoll aus Beispiel 3 in Gegenwart des Antigens NS3 der Protease des Hepatitis C-Virus präpariert. Nach 6 Stunden der Differenzierung der Monozyten in Gegenwart von oxidierten LDL (10 μg/ml) und/oder von nicht-oxidierten LDL (50 μg/ml), die bei T5 in das Kulturmedium hingegeben wurden, werden die so erhaltenen Zellen für 5 Tage cokultiviert, und zwar in Gegenwart von Antigen NS3 der Protease des Hepatitis C-Virus und:

• von Gesamt-T-Lymphozyten, erhalten gemäß dem Protokoll aus Beispiel 5, oder
• von CD4⁺-T-Lymphozyten, erhalten gemäß dem Protokoll aus Beispiel 5, mit der Variante, die darin besteht, in das Gemisch von monoklonalen Antikörpern (Beckman Coulter) einen Anti-CD8-Antikörper (Beckman Coulter) bei der Depletion hinzuzugegen.

Es wird nun die Sekretion von Interferon-gamma durch die Gesamt-T-Lymphozyten oder CD4⁺-T-Lymphozyten, die repräsentativ ist für eine Antwort vom Typ Th1, gemessen (ELISA-Kit (Endogen, Woburn, MA, USA)).
Die mit den Gesamt-T-Lymphozyten erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 10 dargestellt, und die mit den CD4⁺-T-Lymphozyten erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 11 dargestellt.
TABELLE 10 – Sekretion von Interferon-gamma (pg/ml) durch für das Antigen NS3 spezifischen und durch die Differenzierung von Monozyten in Gegenwart von oxidierten LDL, nicht-oxidierten LDL oder oxidierten LDL + nicht-oxidierten LDL erhaltenen Zellen aktivierten syngenen T-Lymphozyten
Die Ergebnisse legen nahe, dass die vorhandenen Gesamt-Lymphozyten, die in Gegenwart von reifen dendritischen Zellen cokultiviert wurden, die durch Differenzierung von Monozyten in Gegenwart von oxidierten LDL erhalten wurden, eine verstärkte Fähigkeit entwickelt haben, Interferon-gamma zu sekretieren, was eine Immunantwort vom Typ Th1 definiert, die gegen das Antigen NS3 des Hepatitis C-Virus gerichtet ist.
TABELLE 11 – Sekretion von Interferon-gamma (pg/ml) durch für das Antigen NS3 spezifische und durch solche Zellen aktivierte CD4⁺-T-Lymphozyten, die durch Differenzierung von Monozyten in Gegenwart von oxidierten LDL, nicht-oxidierten LDL oder oxidierten LDL + nicht-oxidierten LDL erhalten wurden
Diese Ergebnisse legen nahe, dass die CD4⁺-Lymphozyten, die in Gegenwart von reifen dendritischen Zellen cokultiviert wurden, die durch Differenzierung von Monozyten in Gegenwart von oxidierten LDL erhalten wurden, eine verstärkte Fähigkeit erworben haben, Interferon-gamma zu sekretieren, was eine Im munantwort vom Typ Th1 definiert, die gegen das Antigen NS3 des Hepatitis C-Virus gerichtet ist.
Die Ergebnisse legen nahe, dass die dendritischen Zellen, die in Gegenwart von oxidierten LDL erhalten wurden, in der Lage sind, eine primäre T-Antwort zu induzieren, eine wesentliche Eigenschaft eines Adjuvans.
Als Schlussfolgerung ist festzuhalten, dass es die Zugabe von oxidierten LDL in das Kulturmedium ermöglicht, ausgehend von Monozyten dendritische Zellen zu erhalten, die Eigenschaften von reifen dendritischen Zellen zeigen, insbesondere in Bezug auf ihre Fähigkeit, die Endozytose zu reduzieren und ihrer Fähigkeit, allogene T-Lymphozyten zu stimulieren und natürliche für ein Antigen spezifische syngene T-Lymphozyten zu aktivieren. Diese Ergebnisse werden nicht bei der Zugabe von nicht-oxidierten LDL in das Kulturmedium erzielt, und die Zugabe von nicht-oxidierten LDL im Überschuss in das Kulturmedium inhibiert die Wirkungen der oxidierten LDL auf die Differenzierung der Monozyten in reife dendritische Zellen. Es ist allerdings festzuhalten, dass die erfindungsgemäß erhaltenen Zellen auch Eigenschaften zeigen, die diesen eigen sind, insbesondere im Hinblick auf die Sekretion von bestimmten Cytokinen.

Claims

Verwendung von zumindest einer Fraktion von oxidierten Lipoproteinen, die ausgewählt sind aus den oxidierten VLDL und/oder den oxidierten IDL und/oder den oxidierten LDL, um in vitro die Differenzierung von Vorläuferzellen in reife dendritische Zellen zu erwirken.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorläuferzellen Monozyten sind.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktion von oxidierten Lipoproteinen aus einer Fraktion von oxidierten LDL besteht.
Verwendung von zumindest einer Fraktion von oxidierten Lipoproteinen, die ausgewählt sind aus den oxidierten VLDL und/oder den oxidierten IDL und/oder den oxidierten LDL, zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur Differenzierung von Vorläuferzellen in reife dendritische Zellen vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorläuferzellen Monozyten sind.
Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktion von oxidierten Lipoproteinen aus einer Fraktion von oxidierten LDL besteht.
Verwendung nach Anspruch 4 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass diese zusätzlich die Verwendung von zumindest einem biologischen Agens umfasst.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Agens ausgewählt ist aus den Antigenen von Bakterien, von Viren, von Hefen, von Parasiten, von Pilzen, aus tumorösen Antigenen, aus Lysaten von autologen und/oder heterologen tumorösen Zellen.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Agens eine Nukleinsäure ist, die für zumindest ein Antigen kodiert, das ausgewählt ist aus den Antigenen von Bakterien, von Viren, von Hefen, von Parasiten, von Pilzen, aus tumorösen Antigenen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention einer Infektion mit bakteriellem, viralem, pilzartigem Ursprung, oder einer solchen, die durch eine Hefe hervorgerufen wurde.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Krebs.
Verfahren, um in vitro Vorläuferzellen in reife dendritische Zellen zu differenzieren, nach dem a) Vorläuferzellen in ein geeignetes Medium gegeben werden, das deren Differenzierung ermöglicht, b) zu dem Medium in einer bestimmten Menge zumindest eine Fraktion von oxidierten Lipoproteinen hinzugegeben wird, die ausgewählt sind aus den oxidierten VLDL und/oder den oxidierten IDL und/oder oxidierten LDL.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorläuferzellen Monozyten sind.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, nach dem eine Fraktion von oxidierten LDL hinzugegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, nach dem die Fraktionen von oxidierten Lipoproteinen oder die Fraktion von oxidierten Lipoproteinen zu dem Medium in einer Menge, die bei etwa 1 bis 20 μg/ml, vorzugsweise bei etwa 2,5 bis 15 μg/ml und vorteilhafterweise bei 8 bis 12 μg/ml liegt, hinzugegeben werden bzw. hinzugegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, nach dem die Fraktionen von oxidierten Lipoproteinen oder die Fraktion von oxidierten Lipoproteinen in das Medium zwischen dem dritten und dem sechsten Tag der Differenzierung der Vorläuferzellen, vorzugsweise zwischen dem vierten und dem fünften Tag der Differenzierung der Monozyten, hinzugegeben werden bzw. hinzugegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich ein biologisches Agens in das Kultivierungsmedium gegeben wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die zumindest eine Fraktion von oxidierten Lipoproteinen, die ausgewählt sind aus den oxidierten VLDL und/oder den oxidierten IDL und/oder oxidierten LDL, als Aktivierungsagens aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktion von oxidierten Lipoproteinen aus einer Fraktion von oxidierten LDL besteht.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder 19, die zumindest ein biologisches Agens in Kombination mit zumindest einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten aufweist.
Verfahren, um in vitro T-Lymphozyten zu aktivieren, dadurch gekennzeichnet, dass: c) Vorläuferzellen in ein geeignetes Medium gegeben werden, das deren Differenzierung ermöglicht, d) zu dem Medium eine bestimmte Menge von zumindest einer Fraktion von oxidierten Lipoproteinen hinzugegeben wird, die ausgewählt sind aus den oxidierten VLDL und/oder den oxidierten IDL und/oder oxidierten LDL; e) zumindest ein biologisches Agens in das Kultivierungsmedium gegeben wird, und die reifen dendritischen Zellen in Gegenwart von T-Lymphozyten cokultiviert werden.