DE602004006388T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur diagnose und behandlung von diabetes und assoziierten krankheiten mit beta-trp (mtr1 / ltrpc5 / trpm5) - Google Patents

Verfahren und zusammensetzungen zur diagnose und behandlung von diabetes und assoziierten krankheiten mit beta-trp (mtr1 / ltrpc5 / trpm5) Download PDF

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Description

  • Mit der vorliegenden Anmeldung wird die Priorität der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 60/452,596 , eingereicht am 5. März 2003, beansprucht.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Diabetes mellitus kann in zwei klinische Syndrome eingeteilt werden, Typ I- und Typ II-Diabetes mellitus. Typ I- oder insulinabhängiger Diabetes mellitus (IDDM) ist eine chronische Autoimmunkrankheit, die durch einen umfangreichen Verlust von Betazellen in den Langerhans-Inselzellen im Pankreas gekennzeichnet sind, welche Insulin erzeugen. Wenn diese Zellen nach und nach zerstört werden, verringert sich die Menge an abgesondertem Insulin, was schließlich zur Hyperglykämie (abnormal hoher Blutglukosespiegel) führt, wenn die Menge an abgesondertem Insulin unter den für Euglykämie (normaler Blutglukosespiegel) erforderlichen Spiegel fällt. Obwohl der genaue Auslöser für diese Immunantwort nicht bekannt ist, weisen Patienten mit IDDM hohe Spiegel von Antikörpern gegen Pankreas-Betazellen auf. Jedoch entwickeln nicht alle Patienten mit hohen Spiegeln dieser Antikörper IDDM.
  • Typ II-Diabetes (auch als insulinunabhängiger Diabetes mellitus (NIDDM) bezeichnet) entwickelt sich, wenn Muskel-, Fett- und Leberzellen auf Insulin nicht normal reagieren können. Diese Störung zu reagieren (Insulinresistenz genannt) kann auf eine verringerte Anzahl an Insulinrezeptoren an diesen Zellen oder auf eine Funktionsstörung des Signalweges innerhalb der Zellen oder beides zurückgeführt werden. Die Betazellen kompensieren anfangs diese Insulinresistenz durch Erhöhen ihres Insulinausstoßes. Mit der Zeit werden diese Zellen unfähig, genügend Insulin zu produzieren, um die normalen Glukosespiegel aufrechtzuerhalten, was Progression zu Typ II-Diabetes anzeigt.
  • Typ II-Diabetes wird durch eine Kombination von kaum verstandenen genetischen und erworbenen Risikofaktoren – einschließlich fettreicher Ernährung, Bewegungsmangel und Altern – verursacht. Weltweit ist Typ II-Diabetes eine Epidemie geworden, angetrieben durch die Zunahmen an Übergewicht und eine sitzende Lebensweise, weitverbreitete Annahme von westlichen Ernährungsgewohnheiten und das allgemeine Altern der Populationen in vielen Ländern. 1985 hatten geschätzte 30 Millionen Menschen weltweit Diabetes – um 2000 hatte sich diese Zahl auf das 5-fache, auf geschätzte 154 Millionen Menschen erhöht. Es wird erwartet, dass sich die Anzahl der Menschen mit Diabetes von nun bis 2025 auf etwa 300 Millionen verdoppelt.
  • Typ II-Diabetes ist eine komplexe Krankheit, die durch Defekte im Glukose- und Lipidmetabolismus gekennzeichnet ist. Typischerweise gibt es Störungen bei vielen metabolischen Parametern, die die Zunahme der Nüchternplasmaglukosespiegel, den Spiegel der freien Fettsäuren und den Triglyzeridspiegel sowie eine Abnahme des HDL/LDL-Verhältnisses einschließen. Wie vorstehend diskutiert, ist eine der zugrundeliegenden hauptsächlichen Ursachen von Diabetes die Unfähigkeit von Betazellen, ausreichend Insulin zu produzieren, um die Glukosespiegel aufrechtzuerhalten. Deshalb ist ein wichtiges therapeutisches Ziel bei der Behandlung von Diabetes, die Insulinproduktion zu erhöhen. Die vorliegende Erfindung spricht dieses und andere Probleme an. US-Patent Nr. 5,932,417 offenbart ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen zum Regulieren des kapazitativen Calciumioneneintritts in Säugetierzellen.
  • Kurze Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, das die Glukose-stimulierte Insulinproduktion in einem Tier induziert, bereit. Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren die Schritte des:
    • (i) In-Kontakt-Bringens eines Mittels mit einem funktionellen Kationenkanalpolypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80% mit SEQ ID Nr. 2 identisch ist, wobei das Polypeptid in einer Zelle exprimiert wird und der Schritt des In-Kontakt-Bringens das In-Kontakt-Bringen des Mittels mit der Zelle umfasst;
    • (ii) Auswählens eines Mittels, das eine differenzielle Änderung des elektrischen Potenzials der Plasmamembran der Zelle induziert, und
    • (iii) Bestimmens, ob das Mittel, das in Schritt (ii) ausgewählt wird, die Glukose-stimulierte Insulinsekretion erhöht, wodurch ein Mittel identifiziert wird, das die Glukose-stimulierte Insulinproduktion in einem Tier induziert.
  • Bei einigen Ausführungsformen umfasst das Polypeptid SEQ ID Nr. 2.
  • Bei einigen Ausführungsformen wird ein Mittel ausgewählt, das die Polypeptidaktivität erhöht, und wird die Aktivität des Polypeptids durch einen Schritt bestimmt, der das Messen der Änderung des Calciumflusses in der Zelle umfasst.
  • Bei einigen Ausführungsformen wird das Membranpotenzial der Zelle durch Detektieren einer Änderung der Fluoreszenz eines Farbstoffes ermittelt, dessen Fluoreszenz von der Zelldepolarisierung abhängig ist und wobei die Änderung der Fluoreszenz mit einer Vorrichtung detektiert wird, die für das Screenen mit hohen Durchsatz ausreicht. Bei einigen Ausführungsformen ist die Zelle eine Pankreas-β-Zelle.
  • Bei einigen Ausführungsformen wird das Polypeptid in der Zelle rekombinant exprimiert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Exprimieren von β-TRP in einer Pankreasinselzelle bereit, wobei das Verfahren das Einbringen eines Polynukleotids, das ein funktionelles Kationenkanalpolypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 80% mit SEQ ID Nr. 2 identisch ist, in eine Inselzelle in vitro umfasst. Bei einigen Ausführungsformen mangelt es der Inselzelle an Glukose-stimulierter Insulinsekretion.
  • Bei einigen Ausführungsformen ist das Polypeptid zu mindestens 90% mit SEQ ID Nr. 2 identisch. Bei einigen Ausführungsformen umfasst das Polypeptid SEQ ID Nr. 2. Bei einigen Ausführungsformen umfasst das Polynukleotid SEQ ID Nr. 1.
  • In einigen Ausführungsformen ist die Inselzelle eine β-Zelle.
  • Alle Verfahren sind wie in den Ansprüchen auf in vitro-Verfahren beschränkt.
  • Definitionen
  • Eine Person ist „für Diabetes prädisponiert", wenn die Person hochgefährdet ist, Diabetes zu entwickeln. Mehrere Risikofaktoren sind dem Fachmann bekannt und schließen ein: genetische Faktoren (z.B. Tragen von Allelen, die ein höheres Auftreten von Diabetes als im Durchschnitt der Population zur Folge haben, oder Eltern oder Geschwister mit Diabetes), Übergewicht (z.B. eine Körpermassenzahl (BMI) von größer oder gleich 25 kg/m2), gewöhnlich körperliche Inaktivität, Rasse/Ethnie (z.B. Afro-Amerikaner, Hispano-Amerikaner, gebürtige Amerikaner, Asien-Amerikaner, pazifische Insulaner), vorher identifizierte Nüchternglukosestörung oder Störung der Glukosetoleranz, Bluthochdruck (z.B. größer oder gleich 140/90 mmHg bei Erwachsenen), HDL-Cholesterin von größer oder gleich 35 mg/dl, Triglyzeridspiegel von größer oder gleich 250 mg/dl, Krankengeschichte von Schwangerschaftsdiabetes oder Entbindung eines Babys mit über neun Pfund und/oder polyzystisches Ovarialsyndrom. Siehe z.B. „Report of the Expert Committee an the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus" und „Screening for Diabetes", Diabetes Care 25(1):S5-S24 (2002).
  • Ein „β-TRP"- oder „beta-TRP"-Polypeptid bezieht sich auf ein funktionelles Kationenkanalpolypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80% mit SEQ ID Nr. 2 identisch ist. Bei einigen Ausführungsformen liegen Aminosäurereste, die zwischen Maus und Mensch (siehe 7), Ratte und Mensch, Ratte und Maus oder zwischen allen drei Sequenzen konserviert sind, in β-TRP-Sequenzen gemäß der Erfindung vor. In einigen Fällen umfasst β-TRP ein Glutamin (z.B. kodiert durch das Codon CAG) oder ein Arginin (z.B. kodiert durch das Codon CGG) bei Position 579. β-TRP-Polypeptide weisen typischerweise ein „TRP"-Motiv und Transmembrandomänen auf. Siehe z.B. 8, die diese Motive und Domänen in der β TRP-Sequenz des Menschen veranschaulicht.
  • Der hier verwendete Begriff „β-TRP-Aktivität" bezieht sich auf die Fähigkeit eines Proteins, ein elektrisches Potenzial der Plasmamembran einer Zelle einzustellen oder zu modulieren. Man kann Fluoreszenzfarbstoffe oder Fluoreszenzresonanzenergietransfer-(FRET-)Reagenzien verwenden, die für ein Membranpotenzial empfindlich sind, um die Aktivität eines Kanals in einer Zelle zu detektieren. Siehe z.B. Miller et al., Eur. J. Pharmacol. 370(2):179-85 (1999); Fedida, et al., Prog. Biophys. Mol. Biol. 75(3):165-99 (2000). In einer anderen Ausführungsform können Calciumflussassays unter Verwendung von calciumabhängigen Fluoreszenzfarbstoffen verwendet werden, um Kanalaktivität zu detektieren. Aktivität kann auch z.B. unter Verwendung von Patch-clamp-Verfahren gemessen werden. Die Patch-clamp-Analyse schließt im Allgemeinen die Erzeugung einer Hochwiderstandsabdichtung zwischen der Zellmembran und der Glaswand einer Mikropipette ein. Die Stromleitung durch die Ionenkänale in der Membrane wird dann gemessen.
  • Ein „Aktivator von β-TRP" bezieht sich auf ein Mittel, das die Aktivität oder die Expression von β-TRP öffnet, stimuliert, sensibilisiert oder hochreguliert. „Erhöhte β-TRP-Aktivität" bezieht sich auf die Aktivität eines β-TRP-Kanals, der geöffnet, stimuliert, sensibilisiert oder hochreguliert ist, verglichen mit einer Kontrolle (z.B. einer Probe, die keinen potenziellen β-TRP-Modulator enthält).
  • „Ein Farbstoff, dessen Fluoreszenz von der Zelldepolarisierung abhängig ist”, bezieht sich auf Farbstoffe oder Sonden, die potenzialabhängige Änderungen in ihrer Transmembranverteilung zeigen, die von einer Fluoreszenzänderung begleitet sind. Die Größenordnung ihrer optischen Reaktionen kann etwa 1% Fluoreszenzänderung pro mV betragen. Diese Farbstoffe, die gelegentlich als „Langsamreaktionssonden" bezeichnet werden, schließen z.B. kationische Carbocyanine und Rhodamine und anionische Oxonole sowie Spezialitätenfarbstoffe ein, die für FLEXstation und FLIPR-Systeme von Molecular Devices (Sunnyvale, CA) erhältlich sind. Farbstoffe, die in Reaktion auf Änderungen im Membranpotenzial und Zelldepolarisierung fluoreszieren, sind beschrieben worden z.B. in Zochowski, M. et al. Biol. Bull. 198, 1-21 (2000); Shapiro, H.M., Methods 21, 271-279 (2000); Nicholls, D.G. et al. Trends Neurosci. 23, 166-174 (2000); Loew, L.M. Cell Biology. A Laboratory Handbook, 2. Aufl., Bd. 3, Celis, J.E., Hrsg. S. 375-379 (1998); Plasek, J. et al. J. Photochem. Photobiol. B 33, 101-124 (1996); Loew, L.M. Pure Appl. Chem. 68, 1405 (1996); Loew, L.M. Adv. Chem. Ser. 235, 151 (1994); und Smith, J.C. Biochim. Biophys. Acta 1016, 1-28 (1990).
  • Zunahmen oder Abnahmen des Membranpotenzials werden auch als „Membranhyperpolarisation" beziehungsweise „Membrandepolarisation" bezeichnet.
  • „Eine Vorrichtung, die für das Screen mit hohem Durchsatz ausreicht", bezieht sich auf eine Vorrichtung, die von einer Person verwendet werden kann, um eine große Anzahl von Proben (z.B. mindestens 96 und gelegentlich mindestens 200, 384, 500 oder sogar 1000 Proben auf einer täglichen Basis) zu analysieren. Beispiele von Vorrichtungen zum Screen mit hohem Durchsatz zur Verwendung beim Messen der Zelldepolarisierung und von Membranpotenzialänderungen schließen z.B. die FLIPR- und FLEXstation-Vorrichtungen von Molecular Devices (Sunnyvale, CA) ein. Verfahren, wie Patch-Clamp, sind für Assays mit hohem Durchsatz nicht praktisch.
  • „Antikörper" bezieht sich auf ein Polypeptid, das im Wesentlichen durch ein Immunglobulin-Gen oder durch Immunglobulin-Gene kodiert wird, oder dessen Fragmente, welche spezifisch an einen Analyten (Antigen) binden und diesen erkennen. Die erkannten Immunglobulin-Gene schließen die Gene der konstanten κ-, λ-, α-, γ-, δ-, ϵ- und μ-Regionen sowie die unzähligen Gene der variablen Regionen der Immunglobuline ein. Leichte Ketten werden entweder als κ oder λ klassifiziert. Schwere Ketten werden als γ, μ, α, δ oder ϵ klassifiziert, welche wiederum die Immunglobulinkategorien, IgG, IgM, IgA, IgD beziehungsweise IgE definieren.
  • Eine Beispiel-Immunglobulin-(Antikörper-)Struktureinheit umfasst ein Tetramer. Jedes Tetramer besteht aus zwei identischen Paaren von Polypeptidketten, wobei jedes Paar eine „leichte" (etwa 25 kDa) und eine „schwere" Kette (etwa 50–70 kDa) aufweist. Der N-Terminus jeder Kette definiert eine variable Region von etwa 100 bis 110 oder mehr Aminosäuren, die hauptsächlich für die Antigenerkennung verantwortlich sind. Die Begriffe variable leichte Kette (VL) und variable schwere Kette (VH) beziehen sich auf diese leichten beziehungsweise schweren Ketten.
  • Antikörper existieren z.B. als intakte Immunglobuline oder als mehrere gut beschriebene Fragmente, die durch Spaltung mit verschiedenen Peptidasen produziert werden. Folglich spaltet z.B. Pepsin einen Antikörper unterhalb der Disulfidbindungen in der Scharnierregion, um F(ab)'2, ein Dimer von Fab, welches selbst eine leichte Kette ist, die durch eine Disulfidbindung mit VH-CH1 verbunden ist, zu produzieren. Das F(ab)'2 kann unter milden Bedingungen reduziert werden, um die Disulfidbindung in der Scharnierregion zu brechen, wodurch das F(ab)'2-Dimer in ein Fab'-Monomer umgewandelt wird. Das Fab'-Monomer ist im Wesentlichen ein Fab mit einem Teil der Scharnierregion (siehe Paul (Hrsg.) Fundamental Immunology, Dritte Auflage, Raven Press, N.Y. (1993)). Während verschiedene Antikörperfragmente bezüglich der Spaltung eines intakten Antikörpers definiert sind, erkennt der Fachmann, dass derartige Fragmente entweder chemisch oder unter Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren de novo synthetisiert werden können. Folglich schließt der hier verwendete Begriff Antikörper auch Antikörperfragmente, die entweder durch die Modifikation von vollständigen Antikörpern produziert wurden, oder solche ein, die unter Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren de novo synthetisiert wurden (z.B. Single-Chain-Fv).
  • Die Begriff „Gen" bedeutet das Segment von DNA, das an der Produktion einer Polypeptidkette beteiligt ist; es schließt Regionen, die der Kodierungsregion vorangehen und dieser folgen (Vorläufer und Nachläufer), sowie intervenierende Sequenzen (Introns) zwischen einzelnen Kodierungssegmenten (Exons) ein.
  • Wenn der Begriff „isoliert" auf eine Nukleinsäure oder ein Protein angewendet wird, hat er die Bedeutung, dass die Nukleinsäure oder das Protein im Wesentlichen frei von anderen zellulären Komponenten ist, mit welchen sie/es im natürlichen Zustand verbunden ist. Sie/es befindet sich vorzugsweise in einem homogenen Zustand, obwohl sie/es entweder in trockener oder wässriger Lösung vorliegen kann. Reinheit und Homogenität werden typischerweise unter Verwendung von Verfahren der analytischen Chemie, wie Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, bestimmt. Ein Protein, das die vorherrschende Spezies ist, die in einer Präparation vorliegt, wird im Wesentlichen gereinigt. Insbesondere wird ein isoliertes Gen aus den offenen Leserastern, die das Gen flankieren und ein anderes Protein als das interessierende Gen kodieren, getrennt. Der Begriff „gereinigt" bedeutet, dass eine Nukleinsäure oder ein Protein im Wesentlichen eine Bande in einem Elektrophoresegel entstehen lässt. Insbesondere bedeutet es, dass die Nukleinsäure oder das Protein mindestens 85% rein, stärker bevorzugt mindestens 95% rein und am meisten bevorzugt mindestens 99% rein ist.
  • Der Begriff „Nukleinsäure" oder „Polynukleotid" bezieht sich auf Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide und deren Polymere entweder in Einzel- oder Doppelstrangform. Soweit nicht besonders beschränkt, umfasst der Begriff die Nukleinsäuren, die bekannte Analoga von natürlichen Nukleotiden enthalten, die ähnliche Bindungseigenschaften wie die Referenznukleinsäure aufweisen, und auf eine Art und Weise metabolisiert werden, die der natürlich vorkommender Nukleotide ähnlich ist. Soweit nicht etwas Anderes angezeigt ist, umfasst eine bestimmte Nukleinsäuresequenz implizit auch deren konservativ modifizierte Varianten (z.B. degenerierte Codonsubstitutionen) und komplementäre Sequenzen sowie die ausdrücklich angezeigte Sequenz. Spezifisch können degenerierte Codonsubstitutionen durch Erzeugen von Sequenzen erreicht werden, in welchen die dritte Position von einem Codon oder mehreren ausgewählten (oder allen) Codons mit Mischbasen und/oder Desoxyinosinresten substituiert ist (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); und Cassol et al. (1992); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). Der Begriff Nukleinsäure wird austauschbar für Gen, cDNA und mRNA, die durch ein Gen kodiert wird, verwendet.
  • Die Begriffe „Polypeptid", „Peptid" und „Protein" werden hier austauschbar verwendet, so dass sie sich auf ein Polymer von Aminosäureresten beziehen. Die Begriffe finden Anwendung auf Aminosäurepolymere, bei welchen ein Aminosäurerest oder mehrere Aminosäurereste zu einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure artifiziell chemisch nachahmend sind, sowie auf natürlich vorkommende Aminosäurepolymere und nicht natürlich vorkommende Aminosäurepolymere. Die hier verwendeten Begriffe umfassen Aminosäureketten jeder beliebigen Länge, einschließlich Proteine voller Länge (d.h. Antigene), wobei die Aminosäurereste durch kovalente Peptidbindungen verbunden sind.
  • Der Begriff „Aminosäure" bezieht sich auf natürlich vorkommende und synthetische Aminosäuren sowie auf Aminosäureanaloga und nachahmende Aminosäuren, die auf eine Art und Weise wirken, die der natürlich vorkommender Aminosäuren ähnlich ist. Natürlich vorkommende Aminosäuren sind solche, die durch den genetischen Code kodiert sind, sowie solche Aminosäuren, die später modifiziert werden, z.B. Hydroxyprolin, γ-Carboxyglutamat und O-Phosphoserin. Der Begriff Aminosäureanaloga bezieht sich auf Verbindungen, die dieselbe grundlegende chemische Struktur wie eine natürlich vorkommende Aminosäure aufweisen, d.h. ein α-Kohlenstoffatom, das an ein Wasserstoffatom, einen Carboxyl-, Amino- und einen Rest R gebunden ist, z.B. Homoserin, Norleucin, Methioninsulfoxid, Methioninmethylsulfonium. Derartige Analoga wiesen modifizierte Reste R (z.B. Norleucin) oder modifizierte Peptidgerüste auf, behalten aber dieselbe grundlegende chemische Struktur wie eine natürlich vorkommende Aminosäure. „Nachahmende Aminosäuren" bezieht sich auf chemische Verbindungen, die eine Struktur aufweisen, die von der allgemeinen chemischen Struktur einer Aminosäure verschieden ist, welche aber auf eine Art und Weise wirken, die der einer natürlich vorkommenden Aminosäure ähnlich ist.
  • Aminosäuren können hier entweder mit den allgemein bekannten Dreibuchstabensymbolen oder mit den Einbuchstabensymbolen, die von der IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission (Biochemischer Nomenklaturausschuss) empfohlen sind, bezeichnet werden. Nukleotide können ebenfalls mit ihren allgemein geltenden Einbuchstabencodes bezeichnet werden.
  • Der Begriff „konservativ modifizierte Varianten" findet sowohl auf Aminosäure- als auch auf Nukleinsäuresequenzen Anwendung. In Bezug auf bestimmte Nukleinsäuresequenzen bezieht sich „konservativ modifizierte Varianten" auf solche Nukleinsäuren, welche identische oder im Wesentlichen identische Aminosäuresequenzen kodieren, oder wo die Nukleinsäure keine Aminosäuresequenz kodiert, auf im Wesentlichen identische Sequenzen. Wegen der Degeneration des genetischen Codes kodiert eine große Anzahl funktionell identischer Nukleinsäuren jedes beliebige bestimmte Protein. Z.B. kodieren die Codons GCA, GCC, GCG und GCU alle die Aminosäure Alanin. Folglich kann das Codon in jeder Position, in der ein Alanin durch ein Codon spezifiziert wird, zu jedem der entsprechenden beschriebenen Codons geändert werden, ohne das kodierte Polypeptid zu ändern. Derartige Nukleinsäureveränderungen sind „stille Veränderungen", welche eine Spezies von konservativ modifizierten Veränderungen sind. Jede hier genannte Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid kodiert, beschreibt auch jede mögliche stille Veränderung der Nukleinsäure. Der Fachmann erkennt, dass jedes Codon in einer Nukleinsäure (ausgenommen AUG, welches gewöhnlich das einzige Codon für Methionin ist, und TGG, welches gewöhnlich das einzige Codon für Tryptophan ist) modifiziert werden kann, um ein funktionell identisches Molekül zu erhalten. Demgemäß ist jede stille Veränderung einer Nukleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, in jeder beschriebenen Sequenz implizit.
  • Hinsichtlich der Aminosäuresequenzen erkennt der Fachmann, dass einzelne Substitutionen, Deletionen oder Additionen zu einer Nukleinsäure, einem Peptid, einem Polypeptid oder einer Proteinsequenz, welche eine einzelne Aminosäure oder einen kleinen Prozentsatz der Aminosäuren in der kodierten Sequenz ändern, zufügen oder löschen, „konservativ modifizierte Varianten" sind, bei denen die Änderung zu einer Substitution einer Aminosäure mit einer chemisch ähnlichen Aminosäure führt. Tabellen mit konservativer Substitution, die funktionell ähnliche Aminosäuren bereitstellen, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Derartige konservativ modifizierte Varianten bestehen zusätzlich zu und schließen nicht aus polymorphe Varianten, Interspezieshomologe und Allele gemäß der Erfindung.
  • Die folgenden acht Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die füreinander konservative Substitutionen sind:
    • 1) Alanin (A), Glycin (G);
    • 2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
    • 3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
    • 4) Arginin (R), Lysin (K);
    • 5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V);
    • 6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W);
    • 7) Serin (S), Threonin (T); und
    • 8) Cystein (C), Methionin (M)
    (siehe z.B. Creighton, Proteins (1984)).
  • Der „Prozentsatz der Sequenzidentität" wird durch einen Vergleich von zwei optimal abgeglichenen Sequenzen gegenüber einem Vergleichsfenster bestimmt, wobei der Teil der Polynukleotidsequenz im Vergleichsfenster, verglichen mit der Bezugssequenz (welche keine Additionen oder Deletionen aufweist), zur optimalen Abgleichung der beiden Sequenzen Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) umfassen kann. Der Prozentsatz wird berechnet durch Bestimmen der Anzahl von Positionen, bei welchen die identische Nukleinsäurebase oder der Aminosäurerest in beiden Sequenzen vorkommt, so dass die Anzahl übereinstimmender Positionen erhalten wird, Dividieren der Anzahl übereinstimmender Positionen durch die Gesamtanzahl von Positionen im Vergleichsfenster und Multiplizieren des Ergebnisses mit 100, so dass der Prozentsatz der Sequenzidentität erhalten wird.
  • Die Begriffe „identisch" oder „Identität" in Prozent im Zusammenhang mit zwei oder mehr Nukleinsäuren oder Polypeptidsequenzen beziehen sich auf zwei oder mehr Sequenzen oder Untersequenzen, die gleich sind. Der Begriff „im Wesentlichen identisch" bezieht sich auf zwei oder mehr Sequenzen, die einen bestimmten Prozentsatz von Aminosäureresten oder Nukleotiden aufweisen, die gleich sind (d.h. 60% Identität, gegebenenfalls 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder 95% Identität gegenüber einer bestimmten Region), wenn sie für maximale Übereinstimmung gegenüber einem Vergleichsfenster oder einer festgelegten Region, gemessen unter Anwendung von einem der folgenden Sequenzvergleichsalgorithmen oder durch manuellen Abgleich und durch Sichtkontrolle, verglichen und abgeglichen werden. Wahlweise liegt die Identität gegenüber einer Region vor, die mindestens etwa 50 Nukleotide lang ist, oder stärker bevorzugt gegenüber einer Region, die 100 bis 500 oder 1000 oder mehr Nukleotide lang ist. Die vorliegende Erfindung betrifft Polynukleotide und Polypeptide, die mit den SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 im Wesentlichen identisch sind.
  • Der Begriff „Ähnlichkeit" oder „Ähnlichkeit" in Prozent im Zusammenhang mit zwei oder mehr Polypeptidsequenzen bezieht sich auf zwei oder mehr Sequenzen oder Untersequenzen, die einen bestimmten Prozentsatz von Aminosäureresten aufweisen, die entweder gleich oder ähnlich sind, wie in den vorstehend definierten acht konservativen Aminosäuresubstitutionen definiert (d.h. 60%, wahlweise 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder 95% ähnlich gegenüber einer bestimmten Region), wenn sie für maximale Übereinstimmung gegenüber einem Vergleichsfenster oder einer festgelegten Region, gemessen unter Anwendung von einem der folgenden Sequenzvergleichalgorithmen oder durch manuellen Abgleich und durch Sichtkontrolle, verglichen und abgeglichen werden. Von derartigen Sequenzen wird dann gesagt, dass sie „im Wesentlichen ähnlich" sind. Wahlweise liegt diese Identität gegenüber einer Region vor, die mindestens etwa 50 Aminosäuren lang ist, oder stärker bevorzugt gegenüber einer Region, die mindestens etwa 100 bis 500 oder 1000 oder mehr Aminosäuren lang ist. Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide, die mit den SEQ ID Nr. 2, 4 und 6 im Wesentlichen ähnlich sind.
  • Zum Sequenzvergleich dient typischerweise eine Sequenz als Bezugssequenz, mit welcher Testsequenzen verglichen werden. Wenn ein Sequenzvergleichalgorithmus angewendet wird, werden Test- und Bezugssequenzen in einen Computer eingegeben, sofern erforderlich Untersequenzkoordinaten festgelegt und Sequenzalgorithmus-Programmparameter bestimmt. Standardprogrammparameter können verwendet werden, oder alternative Parameter können festgelegt werden. Mit dem Sequenzvergleichsalgorithmus werden dann die Sequenzidentitäten in Prozent für die Testsequenzen im Verhältnis zu der Bezugssequenz, bezogen auf die Programmparameter, berechnet.
  • Der hier verwendete Begriff „Vergleichsfenster" schließt einen Bezug auf ein Segment irgendeiner der Anzahl von benachbarten Positionen ein, die ausgewählt sind aus einer Gruppe, bestehend aus 20 bis 600, normalerweise etwa 50 bis etwa 200, meistens etwa 100 bis etwa 150, in welcher eine Sequenz mit einer Bezugssequenz mit der gleichen Anzahl von benachbarten Positionen verglichen werden kann, nachdem die beiden Sequenzen optimal abgeglichen worden sind. Verfahren zum Abgleich von Sequenzen zum Vergleich sind auf dem Fachgebiet bekannt. Ein optimaler Abgleich von Sequenzen zum Vergleich kann z.B. durch den Algorithmus der lokalen Homologie von Smith und Waterman (1970), Adv. Appl. Math. 2:482c, durch den Homologieabgleichalgorithmus von Needleman und Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443, durch das Verfahren der Suche nach Ähnlichkeit von Pearson und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, durch computerisierte Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASIA und TFASTA im Wisconsin Genetiksoftwarepaket (Wisconsin Genetics Software Package), Genetikcomputergruppe (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch manuellen Abgleich und durch Sichtkontrolle durchgeführt werden (siehe z.B. Ausubel et al., „Current Protocols in Molecular Biology" (Ergänzung 1995)).
  • Ein Beispiel eines Algorithmus', der zur Bestimmung der Sequenzidentität in Prozent und der Sequenzähnlichkeit geeignet ist, sind die BLAST- und BLAST 2.0-Algorithmen, welche in Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 bzw. Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 beschrieben sind. Software zum Durchführen von BLAST-Assays ist vom Nationalen Zentrum für Biotechnologie-Information (National Center for Biotechnology Information) öffentlich erhältlich (http://www.ncbi.nhn.nih.gov/). Dieser Algorithmus umfasst zunächst das Identifizieren von Sequenzpaaren mit hoher Trefferzahl (HSPs) durch Identifizieren von kurzen Wörtern der Länge W in der Suchsequenz, welche entweder mit einer ziemlich positiv bewerteten Schwellentrefferzahl T übereinstimmen oder sie erfüllen, wenn sie mit einem Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz abgeglichen werden. T wird als die Nachbarschaftswort-Trefferzahlschwelle bezeichnet (Altschul et al., ibid.). Diese anfänglichen Nachbarschaftswort-Treffer dienen als Keime zum Initiieren von Suchläufen, um längere HSPs zu finden, die sie enthalten. Die Worttreffer werden in beiden Richtungen entlang jeder Sequenz verlängert, soweit die kumulative Abgleichtrefferzahl erhöht werden kann. Kumulative Trefferzahlen werden für Nukleotidsequenzen unter Verwendung der Parameter M (Belohnungstrefferzahl für ein Paar übereinstimmender Reste; immer > 0) und N (Straftrefferzahl für falsche Reste; immer < 0) berechnet. Für Aminosäuresequenzen wird eine Trefferzahlmatrix verwendet, um die kumulative Trefferzahl zu berechnen. Die Verlängerung der Worttreffer in jeder Richtung wird angehalten, wenn: die kumulative Abgleichtrefferzahl um die Quantität X gegenüber ihrem maximal erreichten Wert abfällt; die kumulative Trefferzahl durch eine Ansammlung von einer oder mehreren negativ zählenden Restabgleichungen auf Null abfällt oder darunter absinkt; oder das Ende einer von beiden Sequenzen erreicht wird. Die BLAST-Algorithmusparameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit des Abgleichs. Das BLASTN-Programm (für Nukleotidsequenzen) verwendet als Standards eine Wortlänge (W) von 11, einen Erwartungswert (E) von 10, M = 5, N = –4 und einen Vergleich von beiden Strängen. Für Aminosäuresequenzen verwendet das BLASTP-Programm als Standards eine Wortlänge von 3 und einen Erwartungswert (E) von 10, und die BLOSUM62-Trefferzahlmatrix (siehe Henikoff und Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) Abgleichungen (B) von 50, einen Erwartungswert (E) von 10, M = 5, N = –4 und einen Vergleich von beiden Strängen.
  • Der BLAST-Algorithmus führt auch eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (siehe z.B. Karlin und Altschul (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Ein Maß für die Ähnlichkeit, die von dem BLAST-Algorithmus geliefert wird, ist die Wahrscheinlichkeit der kleinsten Summe (P(N)), welche die Wahrscheinlichkeit angibt, durch welche eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen durch Zufall vorkommen würde. Z.B. gilt eine Nukleinsäure als einer Bezugssequenz ähnlich, wenn die Wahrscheinlichkeit der kleinsten Summe in einem Vergleich der Testnukleinsäure zur Bezugsnukleinsäure kleiner als etwa 0,2, stärker bevorzugt kleiner als etwa 0,01 und am meisten bevorzugt kleiner als etwa 0,001 ist.
  • Ein Anzeichen dafür, dass zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptide im Wesentlichen identisch sind, besteht, wie nachstehend beschrieben, darin, dass das Polypeptid, das durch die erste Nukleinsäure kodiert wird, mit den Antikörpern immunologisch kreuzreaktiv ist, die gegen das Polypeptid gezüchtet wurden, das durch die zweite Nukleinsäure kodiert wird. Folglich ist ein Polypeptid mit einem zweiten Polypeptid Z.B. typischerweise im Wesentlichen identisch, wenn sich die beiden Peptide nur durch konservative Substitutionen unterscheiden. Wie nachstehend beschrieben, besteht ein anderes Anzeichen dafür, dass zwei Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, darin, dass die beiden Moleküle oder ihre Komplementäre unter stringenten Bedingungen aneinander hybridisieren. Noch ein anderes Anzeichen dafür, dass zwei Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, besteht darin, dass dieselben Primer verwendet werden können, um die Sequenz zu amplifizieren.
  • Der Ausdruck „hybridisiert selektiv (oder spezifisch) mit bezieht sich auf das Binden an, Duplizieren oder Hybridisieren eines Moleküls mit nur einer bestimmten Nukleotidsequenz unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch vorliegt (z.B. Gesamtzell- oder Bibliothek-DNA oder -RNA).
  • Der Ausdruck „stringente Hybridisierungsbedingungen" bezieht sich auf Bedingungen, unter welchen eine Sonde an ihre Zieluntersequenz, typischerweise in einem komplexen Gemisch aus Nukleinsäure, aber an keine andere Sequenzen, hybridisiert. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und sind unter verschiedenen Umständen verschieden. Längere Sequenzen hybridisieren bei höheren Temperaturen spezifisch. Ein umfangreiches Handbuch zur Hybridisierung von Nukleinsäuren ist Tijssen, „Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Probes", "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Allgemein werden stringente Bedingungen ausgewählt, die etwa 5–10°C niedriger sind als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einem pH-Wert definierter Ionenstärke. Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke, definiertem pH-Wert und definierter Nukleinsäurekonzentration), bei welcher 50% der Sonden, die komplementär zum Ziel sind, im Gleichgewicht an die Zielsequenz hybridisieren (weil die Zielsequenzen im Überschuss vorliegen, werden 50% der Sonden bei Tm im Gleichgewicht besetzt). Stringente Bedingungen sind solche, bei welchen die Salzkonzentration kleiner als etwa 1,0 M Natriumion, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Natriumionenkonzentration (oder von anderen Salzen), bei pH 7,0 bis 8,3 ist, und die Temperatur mindestens etwa 30°C für kurze Sonden (z.B. 10 bis 50 Nukleotide) und mindestens etwa 60°C für lange Sonden (z.B. größer als 50 Nukleotide) beträgt. Stringente Bedingungen können auch mit der Zugabe von destabilisierenden Mitteln, wie Formamid, erreicht werden. Für die selektive oder spezifische Hybridisierung beträgt ein positives Signal mindestens das Zweifache des Hintergrundsignals, wahlweise das 10fache der Hintergrundhybridisierung. Beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingungen können wie folgt sein: 50% Formamid, 5× SSC und 1% SDS, Inkubation bei 42°C, oder 5× SSC, 1% SDS, Inkubation bei 65°C, mit Waschen in 0,2× SSC und 0,1% SDS bei 65°C. Derartige Waschschritte können 5, 15, 30, 60, 120 oder mehr Minuten lang durchgeführt werden.
  • Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen nicht aneinander hybridisieren, sind noch im Wesentlichen identisch, wenn die Polypeptide, die sie kodieren, im Wesentlichen identisch sind. Dieses kommt z.B. vor, wenn eine Kopie einer Nukleinsäure unter Anwendung der maximalen Codon-Degeneration erzeugt wird, die durch den genetischen Code erlaubt ist. In solchen Fällen hybridisieren die Nukleinsäuren typischerweise unter gemäßigt stringenten Hybridisierungsbedingungen. Beispielhafte „gemäßigt stringente Hybridisierungsbedingungen" schließen eine Hybridisierung in einem Puffer aus 40% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und einen Waschschritt in 1× SSC bei 45°C ein. Derartige Waschschritte können 5, 15, 30, 60, 120 oder mehr Minuten lang durchgeführt werden. Eine positive Hybridisierung beträgt mindestens das Zweifache des Hintergrundsignals. Ein Fachmann erkennt leicht, dass alternative Hybridisierungs- und Wasch-Bedingungen verwendet werden können, um Bedingungen ähnlicher Stringenz zu schaffen.
  • Der Ausdruck „eine kodierende Nukleinsäuresequenz" bezieht sich auf eine Nukleinsäure, welche eine Sequenzinformation für eine strukturelle RNA, wie eine rRNA, tRNA oder die Primäraminosäuresequenz eines spezifischen Proteins oder Peptids oder eine Bindungsstelle für ein Transaktionsregulationsmittel enthält. Dieser Ausdruck umfasst genauer degenerierte Codons (d.h. verschiedene Codons, welche eine einzelne Aminosäure kodieren), der nativen Sequenz oder von Sequenzen, die eingebracht werden können, um sich mit Codonpräferenz in einer spezifischen Wirtszelle anzupassen.
  • Der Begriff „rekombinant", wenn er mit Bezug z.B. auf eine Zelle oder Nukleinsäure, ein Protein oder einen Vektor verwendet wird, zeigt an, dass die Zelle, Nukleinsäure, das Protein oder der Vektor durch das Einbringen einer heterologen Nukleinsäure oder eines Proteins oder durch die Änderung einer nativen Nukleinsäure oder eines Proteins modifiziert worden ist, oder dass die Zelle von einer so modifizierten Zelle abgeleitet ist. Folglich exprimieren zum Beispiel rekombinante Zellen Gene, die innerhalb der nativen (nichtrekombinanten) Form der Zelle nicht gefunden werden, oder es exprimieren native Gene, die anderweitig abnormal exprimiert, unterexprimiert oder überhaupt nicht exprimiert werden.
  • Wenn der Begriff "heterolog" unter Bezugnahme auf Teile einer Nukleinsäure verwendet wird, zeigt er an, dass die Nukleinsäure zwei oder mehr Untersequenzen enthält, die nicht im gleichen Verhältnis zueinander in der Natur gefunden werden. Z:B: wird die Nukleinsäure typischerweise rekombinant produziert, die zwei oder mehr Sequenzen aus nicht verwandten Genen aufweist, die so angeordnet sind, dass eine neue funktionelle Nukleinsäure hergestellt wird, z.B. einen Promotor aus einer Quelle und eine Kodierungsregion aus einer anderen Quelle. In ähnlicher Weise zeigt ein heterologes Protein an, dass das Protein zwei oder mehr Untersequenzen umfasst, die nicht im gleichen Verhältnis zueinander in der Natur gefunden werden (z.B. ein Fusionsprotein).
  • Ein „Expressionsvektor" ist ein rekombinant oder synthetisch erzeugtes Nukleinsäurekonstrukt mit einer Reihe von bestimmten Nukleinsäureelementen, die die Transkription einer bestimmten Nukleinsäure in einer Wirtszelle ermöglichen. Der Expressionsvektor kann Teil eines Plasmids, Virus' oder Nukleinsäurefragments sein. Typischerweise enthält der Expressionsvektor eine zu transkribierende Nukleinsäure, die mit einem Promotor funktionsfähig verbunden ist.
  • Wenn sich die Ausdrücke „bindet spezifisch (oder selektiv) an einen Antikörper" oder „spezifisch (oder selektiv) immunreaktiv mit" auf ein Protein oder Peptid beziehen, beziehen sie sich auf eine Bindungsreaktion, welche durch die Anwesenheit des Proteins in Gegenwart einer heterogenen Population von Proteinen und anderen Biomolekülen bestimmt wird. Folglich binden die spezifizierten Antikörper unter festgelegten Immunassaybedingungen an ein bestimmtes Protein und binden nicht in einer wesentlichen Menge an andere in der Probe enthaltene Proteine. Spezifische Bindung an einen Antikörper unter derartigen Bedingungen kann einen Antikörper erfordern, der für seine Spezifität für ein bestimmtes Protein ausgewählt ist. Z:B: können Antikörper, die gegen ein Protein mit einer durch irgendeines der Polynukleotide gemäß der Erfindung kodierenden Aminosäuresequenz gezüchtet ist, ausgewählt sein, um Antikörper zu erhalten, die mit diesem Protein und nicht mit anderen Proteinen, außer polymorphen Varianten, spezifisch immunreaktiv sind. Eine Vielzahl von Immunassayformaten kann verwendet werden, um Antikörper auszuwählen, die mit einem bestimmten Protein spezifisch immunreaktiv sind. Zum Beispiel werden Festphasen-ELISA-Immunassays, Westernblots oder Immunhistochemie routinemäßig verwendet, um monoklonale Antikörper auszuwählen, die mit einem Protein spezifisch immunreaktiv sind. Siehe Harlow und Lane „Antibodies, A Laborstory Manual", Cold Spring Harbor Publications, NY (1988) bezüglich einer Beschreibung der Immunassayformate und -bedingungen, die angewendet werden können, um die spezifische Immunreaktivität zu bestimmen. Typischerweise ist eine spezifische oder selektive Reaktion mindestens zweimal so hoch wie das Hintergrundsignal oder -rauschen und insbesondere typischerweise mehr als 10- bis 100mal so hoch wie das Hintergrundsignal.
  • Die Begriffe „Inhibitoren", „Aktivatoren" und „Modulatoren" der β-TRP-Expression oder der β-TRP-Aktivität werden verwendet, um sich auf hemmende, aktivierende bzw. modulierende Moleküle zu beziehen, die unter Anwendung von in vitro- und in vivo-Assays für die β-TRP-Expression oder β-TRP-Aktivität identifiziert werden, z.B. Liganden, Agonisten, Antagonisten und deren Homologe und Nachahmer. Der Begriff „Modulator" schließt Inhibitoren und Aktivatoren ein. Inhibitoren, z.B. Antagonisten, sind Mittel, die z.B. die Expression von β-TRP hemmen oder daran binden, die Stimulierung oder enzymatische Aktivität teilweise oder vollständig blockieren, die Aktivierung verringern, verhindern, verzögern, die Aktivität von β-TRP inaktivieren, desensibilisieren oder herunterregulieren. Aktivatoren, z.B. Agonisten, sind Mittel, die z.B. die Expression von β-TRP induzieren oder aktivieren oder daran binden, die Aktivierung oder enzymati sche Aktivität stimulieren, vergrößern, eröffnen, aktivieren, erleichtern, erhöhen, die Aktivität von β-TRP sensibilisieren oder hochregulieren. Modulatoren schließen natürlich vorkommende und synthetische Liganden, Antagonisten, Agonisten, kleine chemische Moleküle und dergleichen ein. Wie vorstehend beschrieben, schließen derartige Assays für Inhibitoren und Aktivatoren z.B. die Anwendung mutmaßlicher Modulatorverbindungen auf Pankreaszellen oder andere Zellen ein, die β-TRP in Gegenwart oder bei Fehlen von β-TRP-Modulatoren exprimieren, und dann die Bestimmung der funktionellen Wirkungen auf die β-TRP-Aktivität. β-TRP enthaltende Proben oder Assays, die mit einem potenziellen Aktivator, Inhibitor oder Modulator behandelt werden, werden mit Kontrollproben ohne den Inhibitor, Aktivator oder Modulator verglichen, um den Umfang einer Wirkung zu überprüfen. Den Kontrollproben (nicht mit Modulatoren behandelt) wird ein relativer β-TRP-Aktivitätswert von 100% zugewiesen. Hemmung von β-TRP wird erreicht, wenn der β-TRP-Aktivitätswert im Verhältnis zur Kontrollprobe etwa 80%, wahlweise 50% oder 25–1 % beträgt. Die Aktivierung von β-TRP wird erreicht, wenn der β-TRP-Aktivitätswert im Verhältnis zur Kontrollprobe 110%, wahlweise 150%, wahlweise 200–500% oder 1000–3000% höher liegt.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt Array-Expressionsdaten für β-TRP. 1A zeigt eine kundenspezifische Oligonukleotid-Arrayanalyse von Mäuseinselzellen des Sondensatzes MBXMUSISL08907. Die mittleren Differenzwerte reflektieren die relative Häufigkeit an β-TRP in den Mäuseinselzellen und der insulinabsondernden Mäusezelllinie betaHC9. 1B zeigt, wie das kundenspezifische Oligonukleotidarray von Ratteninselzellen verwendet wurde, um Genänderungen in Tiermodellen von Diabetes zu betrachten. Die β-TRP-mRNA (Sondensatz MBXRATISL12881) ist im Verhältnis zu mageren Kontrolltieren in weiblichen ZDF-Ratten 2-3fach verringert (p = 0,002) und wird durch begleitende Behandlung mit Troglitazon im Wesentlichen wieder hergestellt.
  • 2 veranschaulicht die Insulinsekretion in ZDF-Inselzellen, die mit dem Ad-β-TRP-Virus infiziert wurden. Inselzellen von männlichen ZDF-Ratten wurden mit einem Adenovirus infiziert, das β-TRP oder eGFP exprimiert, und die Insulinreaktionen auf 16 mM Glukose wurden durch Perifusion in Krebs-Ringers-Bicarbonatmedium bestimmt. Überexpression von β-TRP in den ZDF-Inselzellen erhöhte beide Phasen der Insulinsekretion, die durch Glukose stimuliert wurde.
  • 3 zeigt intrazelluläres freies Calcium [Ca2+], und Membranpotenzialreaktionen auf ATP in CHO-K1-Zellen, die mit β-TRP stabil transfiziert wurden. Die Kontrollprobe und β-TRP-CHO-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen 2 Tage vor dem Assay plattiert. [Ca2+], und Mem branpotenzial-(MP-)Reaktionen auf ATP (30 μM, zugefügt nach 20 Sek) wurden mit FLEXStation® und entsprechenden Farbstoffen von Molecular Devices (Sunnyvale, CA) gemessen.
  • 4 veranschaulicht MP-Reaktionen auf ATP und MTX bei verschiedenen Ca2+-Spiegeln in β-TRP-CHO-Zellen. MP-Reaktionen auf Maitotoxin (MTX) wurden, wie in 3 beschrieben, mit FLEXstation® überwacht. Der reguläre Assaypuffer enthielt 1,26 mM Ca2+. Um die Calciumkonzentration auf 2,5 oder 5 mM zu erhöhen, wurde eine Extramenge CaCl2 zur gleichen Zeit wie andere Testreagenzien zugefügt.
  • 5 veranschaulicht dosisabhängige Wirkungen der Dosis von ATP und Calcimycin auf das Membranpotenzial in β-TRP-CHO-Zellen. Das MP wurde wie in 3 mit FLEXstation® gemessen. Für keine der Verbindungen wurde in den Kontrollzellen irgendeine Wirkung beobachtet.
  • 6 veranschaulicht die Wirkungen von bekannten TRP-Blockern auf die ATP-induzierte Depolarisation in β-TRP-CHO-Zellen. Das MP wurde wie in 3 mit FLEXstation® gemessen. Die Inhibitoren wurden entweder gleichzeitig (rechtes Bild) oder vor der ATP-Stimulierung (linkes Bild) zugefügt.
  • Die 7A–D stellen einen Abgleich der β-TRP-Aminosäuresequenzen von Mensch (SEQ ID Nr. 7), Ratte (SEQ ID Nr. 6) und Maus (SEQ ID Nr. 4) dar. Die übereinstimmende β-TRP-Sequenz = SEQ ID Nr. 8.
  • 8 stellt die β-TRP-Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) des Menschen dar. Transmembrandomänen sind unterstrichen. Das TRP-Motiv ist in Fettdruck.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • I. Einleitung
  • In der vorliegenden Anmeldung ist dargelegt, dass die β-TRP-Expression in den Inselzellen des Pankreas überraschenderweise Insulinsekretion bewirkt. Die Expression von β-TRP ist für die Inselzellen verhältnismäßig spezifisch. In ZDF-Ratten (ein Tiermodell für Diabetes) ist die β-TRP-Expression im Vergleich zu Wildtypratten, verringert. Wenn β-TRP in ZDF-Inselzellen exprimiert wird, ist die Glukose-stimulierte Insulinsekretion im Vergleich zu leeren Vektorkontroll proben wesentlich erhöht. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Erhöhung der Expression oder Aktivität von β-TRP in Insulin-absondernden Zellen die Glukose-stimulierte Insulinproduktion erhöht. Deshalb betrifft die vorliegende Anmeldung Verfahren zum Identifizieren von Mitteln, die die β-TRP-Expression oder -Aktivität in Insulin-absondernden Zellen erhöhen. Die Anmeldung betrifft auch in vitro-Verfahren zum Einbringen von β-TRP-kodierenden Polynukleotiden in β-Zellen des Pankreas zur Expression von β-TRP.
  • II. Allgemeine rekombinante Nukleinsäureverfahren zur Anwendung mit der Erfindung
  • Soweit geeignet, können die gemäß der vorliegend Erfindung verwendeten Nukleinsäurezusammensetzungen alle oder einen Teil der, gewöhnlich zumindest im Wesentlichen alle, β-TRP-Polypeptide kodieren. Fragmente der DNA-Sequenz können durch chemische Synetese von Oligonukleotiden mit herkömmlichen Verfahren, durch Restriktionsenzymspaltung, durch PCR-Amplifikation usw. erhalten werden. In den meisten Fällen bestehen DNA-Fragmente aus mindestens etwa 10 zusammenhängenden Nukleotiden, üblicherweise mindestens etwa 15 Nukleotiden, insbesondere mindestens etwa 18 Nukleotiden bis etwa 20 Nukleotiden, ganz besonders mindestens etwa 25 Nukleotiden bis etwa 50 Nukleotiden. Derartige kleine DNA-Fragmente sind als Primer für die PCR, für das Hybridisierungsscreenen, für siRNA usw. nützlich. Größere DNA-Fragmente, d.h. mit mehr als 100 Nukleotiden, sind zur Produktion des kodierten Polypeptids nützlich. Zur Verwendung in Amplifikationsreaktionen, wie PCR, wird ein Primerpaar verwendet. Die genaue Zusammensetzung der Primersequenzen ist für die Erfindung nicht kritisch, aber für die meisten Anwendungen hybridisieren die Primer, wie auf dem Fachgebiet bekannt oder wie hier beschrieben, unter stringenten Bedingungen an die vorliegende Sequenz. In einigen Ausführungsformen wird ein Primerpaar ausgewählt, das ein Amplifikationsprodukt von mindestens etwa 50 Nukleotiden oder mindestens etwa 100 Nukleotiden erzeugt. Algorithmen zur Auswahl der Primersequenzen sind allgemein bekannt, und sind in kommerziellen Softwarepaketen erhältlich. Amplifikationsprimer hybridisieren an komplementäre DNA-Stränge und werden in Richtung zueinander gestartet.
  • Die β-TRP-kodierenden Nukleinsäuren werden isoliert und in erheblicher Reinheit, allgemein anders als ein intaktes Säugetierchromosom, erhalten. Üblicherweise kann die DNA, die im Wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuresequenzen erhalten wird, typischerweise „rekombinant" sein, d.h. durch ein oder mehrere Nukleotide flankiert sein, mit welchen sie auf einem natürlich vorkommenden Chromosom gewöhnlich nicht verbunden ist.
  • Die Sequenz der β-TRP-Polypeptide (oder der Polynukleotidkodierungsregionen oder der flankierenden Promotorregionen) kann auf verschiedene auf dem Fachgebiet bekannte Arten mutiert sein, so dass zielgerichtete Änderungen in der Promotorstärke, in der Sequenz des kodierten Proteins usw. erzeugt werden. Die DNA-Sequenz oder das -Produkt einer derartigen Mutation ist im Wesentlichen den Sequenzen ähnlich, die hier bereitgestellt werden, d.h. sie unterscheidet sich durch mindestens ein Nukleotid bzw. eine Aminosäure, und kann sich durch mindestens zwei oder durch mindestens etwa 10 oder mehr Nukleotide oder Aminosäuren unterscheiden. Im Allgemeinen können die Sequenzänderungen Substitutionen, Insertionen oder Deletionen sein. Deletionen können ferner größere Änderungen, wie Deletionen einer Domäne oder eines Exons, enthalten. Es sollte beachtet werden, dass TRP-Kanalsequenzen hauptsächlich innerhalb der Transmembrandomäne konserviert sind und dass Regionen außerhalb dieser Domäne deshalb wahrscheinlichere Ziele für Mutagenese sind, ohne die Funktion zu beeinträchtigen. Zum Beispiel veranschaulicht 7 die Abgleichung der Sequenzen von Ratte, Maus und Mensch. In einigen Ausführungsformen kodieren die β-TRP-Nukleinsäuren der Erfindung Polypeptide oder deren Fragmente, die die zwischen Maus- und Menschsequenzen konservierten Aminosäuren enthalten. In anderen Ausführungsformen kodieren die β-TRP-Nukleinsäuren Polypeptide oder deren Fragmente, die die zwischen Mensch- und Ratte- oder zwischen Ratte-, Maus- und Menschsequenzen konservierten Aminosäuren enthalten.
  • Verfahren zur in vitro-Mutagenese von klonierten Genen sind bekannt. Beispiele von Protokollen zum Absuchen von Mutationen können in Gustin et al., Biotechniques 14:22 (1993); Barany, Gene 37:111-23 (1985); Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. 199:537-9 (1985); und Prentki et al., Gene 29:303-13 (1984) gefunden werden. Verfahren zur stellenspezifischen Mutagenese können in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (CSH Press, 1989), S. 15.3-15.108; Weiner et al., Gene 126:35-41 (1993); Sayers et al., Biotechniques 13:592-6 (1992); Jones und Winistorfer, Biotechniques 12:528-30 (1992); Barton et al., Nucleic Acids Res. 18:7349-55 (1990); Marotti und Tomich, Gene Anal. Tech. 6:67-70 (1989); und Zhu, Anal. Biochem. 177:120-4 (1989) gefunden werden.
  • In zahlreichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden ein interessierendes β-TRP kodierende Nukleinsäuren isoliert und unter Anwendung von rekombinanten Verfahren kloniert. Derartige Ausführungsformen werden anwendet, um z.B. β-TRP-Polynukleotide (z.B. SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 5) zur Proteinexpression oder während der Erzeugung von Varianten, Derivaten, Expressionskassetten oder andere Sequenzen, die ein β-TRP-Polypeptid kodieren (z.B. SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 6), zu isolieren, um die β-TRP-Genexpression zur Isolierung oder Detektion von β-TRP-Sequenzen in verschiedenen Spezies für Diagnosezwecke bei einem Patienten zu überwachen, um z.B. Mutationen in β-TRP zu detektieren oder um Expressionsspiegel von β-TRP-Nukleinsäuren oder β-TRP-Polypeptiden zu detektieren. In einigen Ausführungsformen werden die das β-TRP der Erfindung kodierenden Sequenzen mit einem heterologen Promotor funktionsfähig verknüpft. In einer Ausführungsform stammen die Nukleinsäuren der Erfindung von irgendeinem Säugetier, einschließlich insbesondere z.B. von einem Menschen, einer Maus, einer Ratte usw.
  • Die vorliegende Erfindung beruht auf routinemäßigen Verfahren auf dem Gebiet der rekombinanten Genetik. Grundlegende Texte, die die allgemeinen Verfahren der Anwendung in dieser Erfindung offenbaren, schließen Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual (3. Aufl. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); und Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Hrsg., 1994)) ein.
  • Im Allgemeinen werden die die vorliegenden Proteine kodierenden Nukleinsäuren aus DNA-Sequenzbibliotheken kloniert, die erzeugt sind, um cDNA oder genomische DNA zu kodieren. Die jeweiligen Sequenzen können durch Hybridisieren an eine Oligonukleotid-Sonde aufgefunden werden, deren Sequenz sich von den β-TRP kodierenden Sequenzen (z.B. SEQ ID Nr. 1) ableitet, die eine Referenz für PCR-Primer darstellen und geeignete Regionen zum Isolieren von β TRP-spezifischen Sonden definieren. In einer anderen Ausführungsform, in der die Sequenz in eine Expressionsbibliothek kloniert wird, kann das exprimierte rekombinante Protein mit Antiseren oder gereinigten Antikörpern, die gegen das interessierende β-TRP hergestellt worden sind, immunologisch detektiert werden.
  • Verfahren zum Herstellen und Screenen von genomischen und cDNA-Bibliotheken sind dem Fachmann bekannt (siehe z.B. Gubler und Hoffman, Gene 25:263-269 (1983); Genton und Davis, Science, 196:180-182 (1977); und Sambrook, ibid.). Zellen des Pankreas stellen ein Beispiel von geeigneten Zellen zum Isolieren von β-TRP-RNA und -cDNA dar.
  • In Kürze, zum Herstellen der cDNA-Bibliothek sollte eine Quelle ausgewählt werden, die reich an mRNA ist. Die mRNA kann dann zu cDNA gebildet, in einen rekombinanten Vektor ligiert und zur Vermehrung, zum Screen und Klonieren in einen rekombinanten Wirt transfiziert werden. Für eine genomische Bibliothek wird die DNA aus einem geeigneten Gewebe extrahiert und entweder mechanisch geschert oder enzymatisch gespalten, um Fragmente von vorzugsweise etwa 5–100 kb zu erhalten. Die Fragmente werden dann durch Gradientenzentrifugation von unerwünschten Größen abgetrennt und in Bakteriophage λ-Vektoren eingebaut. Diese Vektoren und dieser Phage werden in vitro verpackt, und die rekombinanten Phagen werden durch Plaquehybridisierung analysiert. Koloniehybridisierung wird durchgeführt, wie allgemein in Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3961-3965 (1975) beschrieben ist.
  • In einem alternativen Verfahren wird die Verwendung von synthetischen Oligonukleotid-Primern mit Polymeraseverlängerung an einer mRNA- oder DNA-Matrize kombiniert. Geeignete Primer können aus spezifischen β-TRP-Sequenzen, beispielsweise den in SEQ ID Nr. 1 aufgezeigten Sequenzen, entworfen werden. Dieses Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert die das interessierende Protein kodierenden Nukleinsäuren direkt von mRNA, cDNA, genomischen Bibliotheken oder von cDNA-Bibliotheken.
  • Restriktionsendonukleasestellen können in die Primer eingebracht werden. Die Polymerase-Kettenreaktion oder andere in vitro-Amplifikationsverfahren können auch nützlich sein, um beispielsweise spezifische Proteine kodierende Nukleinsäuren zu klonieren und diese Proteine zu exprimieren, um Nukleinsäuren zu synthetisieren, die als Sonden zum Nachweis der Anwesenheit von ein β-TRP-Polypeptid der Erfindung kodierender mRNA in physiologischen Proben, zum Nukleinsäure-Sequenzieren oder für andere Zwecke verwendet werden (siehe US-Patente Nr. 4,683,195 und 4,683,202 ). Durch eine PCR-Reaktion amplifizierte Gene können aus Agarosegelen gereinigt und in einen geeigneten Vektor kloniert werden.
  • Geeignete Primer und Sonden zum Identifizieren der ein β-TRP-Polypeptid der Erfindung kodierenden Gene aus Säugetiergeweben können sich von darin enthaltenen Sequenzen ableiten, wie SEQ ID Nr. 1, oder Aminosäuresequenzen innerhalb der β-TRP-Polypeptide, z.B. SEQ ID Nr. 2, kodieren. Für einen allgemeinen Überblick über PCR siehe Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego (1990).
  • Synthetische Oligonukleotide können verwendet werden, um Gene zu konstruieren. Dies wird unter Verwendung einer Reihe von überlappenden Oligonukleotiden, gewöhnlich mit einer Länge von 40–120 bp, durchgeführt, die sowohl die Sense- als auch Antisense-Stränge des Gens darstellen. Diese DNA-Fragmente werden dann angelagert, ligiert und kloniert.
  • Ein ein β-TRP-Polypeptid der Erfindung kodierendes Gen kann vor der Transformation in Säugetierzellen unter Verwendung von Zwischenproduktvektoren zur Expression kloniert werden. Diese Zwischenproduktvektoren sind typischerweise Prokaryotenvektoren oder Pendelvektoren. Die Proteine können, wie nachstehend beschrieben, unter Verwendung von dem Fachmann bekannte Standardverfahren entweder in Prokaryoten oder in Eukaryoten exprimiert werden.
  • III. Einbringen von β-TRP kodierenden Polynukleotiden in Zellen
  • Wenn die in eine Zelle einzubringende β-TRP-Nukleinsäure DNA ist, kann jedes Konstrukt mit einem Promotor (z.B. einem Promotor, der in einer eukaryotischen Zelle funktionell ist), der mit einer interessierenden β-TRP-DNA funktionsfähig verbunden ist oder der die Bindung an einen endogenen Promotor nach dem Einbringen in ein Genom erlaubt, in der Erfindung verwendet werden. Die Konstrukte, die die β-TRP-DNA-Sequenz (oder die entsprechende RNA-Sequenz) enthalten, können jedes eukaryotische Expressionskonstrukt sein, das die interessierende β-TRP-DNA- oder RNA-Sequenz enthält. Zum Beispiel kann ein Plasmid- oder Virenkonstrukt (z.B. Adenovirus) gespalten werden, so dass lineare DNA mit ligierbaren Enden erhalten wird. Diese Enden werden an exogene DNA mit komplementärartigen ligierbaren Enden gebunden, wobei ein biologisch funktionelles rekombinantes DNA-Molekül mit einem intakten Replikon und einer gewünschten phänotypischen Eigenschaft gebildet wird. Vorzugsweise ist das Konstrukt in eukaryotischen und/oder prokaryotischen (Viren in eukaryotischen, Plasmide in prokaryotischen) Wirten zur Replikation in der Lage, wobei die Konstrukte auf dem Fachgebiet bekannt und im Handel erhältlich sind.
  • Die Konstrukte können unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Desgleichen sind Verfahren zum Erhalten von Expression von exogenen DNA- oder RNA-Sequenzen in einer genetisch geänderten Wirtszelle auf dem Fachgebiet bekannt (siehe zum Beispiel Kormal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:2150-2154 (1987); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).
  • Bei einigen Ausführungsformen enthält das DNA-Konstrukt einen Promotor, um die Expression der interessierenden DNA innerhalb einer Zelle des Pankreas (z.B. einer Inselzelle) zu erleichtern. Der Promotor kann ein starker Virenpromotor sein, der in eukaryotischen Zellen, wie einem Promotor vom Cytomegalovirus (CMV), Mausbrusttumorvirus (MMTV), Rous-Sarkom-Virus (RSV) oder Adenovirus, wirkt. Insbesondere schließen Beispiel-Promotoren den Promotor vom sofortigen frühen Gen (immediate early gene) des CMV des Menschen (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)), und den Promotor des langen periodischen Endstückes (LTR) von RSV (Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781 (1982)) ein.
  • In einer anderen Ausführungsform kann der verwendete Promotor ein starker allgemeiner eukaryotischer Promotor, wie der Actingenpromotor, sein. In einer Ausführungsform kann der verwendete Promotor ein gewebsspezifischer Promotor sein. Zum Beispiel kann der im Konstrukt verwendete Promotor ein Pankreas-spezifischer Promotor, ein Duktuszellen-spezifischer Promotor oder ein Stammzellen-spezifischer Promotor sein. Beispiel-β-Zellen-spezifische Promotoren schließen die Insulin- und Amylinpromotoren ein. Die Konstrukte gemäß der Erfindung können zusätzlich zu den Promotoren auch Sequenzen (z.B. Verstärker) einschließen, welche die Expression in den Zielzellen verstärken.
  • In einer anderen Ausführungsform ist der Promotor ein regulierter Promotor, wie ein Tetracyclin-regulierter Promotor, dessen Expression durch Einwirken eines exogenen Stoffs (z.B. von Tetracyclin) reguliert wird.
  • Andere Komponenten, wie ein Marker (z.B. ein Antibiotikumresistenzgen (wie ein Ampicillinresistenzgen) oder β-Galaktosidase), ein Startpunkt der Replikation für stabile Replikation des Konstrukts in einer Bakterienzelle (vorzugsweise ein Startpunkt der Replikation mit hoher Kopienanzahl) oder andere Elemente, welche die Produktion des DNA-Konstrukts, des dadurch kodierten Proteins oder von beiden erleichtern, helfen bei der Selektion oder Identifizierung von das Konstrukt enthaltenden und/oder exprimierenden Zellen.
  • Für die eukaryotische Expression sollte das Konstrukt mindestens einen eukaryotischen Promotor enthalten, der mit einer interessierenden DNA funktionsfähig verbunden ist, welche wiederum mit einer Polyadenylierungssignalsequenz funktionsfähig verbunden ist. Die Polyadenylierungssignalsequenz kann aus irgendeiner der Vielzahl von Polyadenylierungssignalsequenzen ausgewählt sein, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Eine Beispiel-Polyadenylierungssignalsequenz ist die frühe SV40-Polyadenylierungssignalsequenz. Das Konstrukt kann, wenn geeignet, auch ein oder mehrere Introns enthalten, welche die Spiegel der Expression der interessierenden DNA erhöhen können, besonders wenn die interssierende DNA eine cDNA ist (enthält z.B. keine Introns in der natürlich vorkommenden Sequenz). Irgendeines der Vielzahl von Introns, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, kann verwendet werden.
  • In einer alternativen Ausführungsform ist die der Zelle zugeführte Nukleinsäure eine β-TRP kodierende RNA. In dieser Ausführungsform ist die RNA an die Expression (d.h. Translation der RNA) in einer Zielzelle angepasst. Verfahren zur Herstellung von ein interessierendes Protein kodierender RNA (z.B. von mRNA) sind auf dem Fachgebiet bekannt und können leicht auf das Produkt von RNA, die gemäß der vorliegenden Erfindung nützliches β-TRP kodiert, angewendet werden.
  • A. Zuführung von β-TRP-kodierender Nukleinsäure
  • Die Zuführung von β-TRP-kodierenden Nukleinsäuren kann unter Verwendung beliebiger Mittel, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, erreicht werden. Zum Beispiel kann die Zuführung unter Verwendung eines Virus- oder Nichtvirusvektors erreicht werden. In einigen Ausführungsformen wird die Nukleinsäure innerhalb eines Viruspartikels, wie einem Adenovirus, zugeführt. In einer anderen Ausführungsform wird die Nukleinsäure in einer Formulierung zugeführt, die die nackte DNA enthält, der ein Hilfsstoff, wie einen Viruspartikel (z.B. Adenovirus), oder kationische Lipide oder Liposomen beigemischt werden. Ein „Hilfsstoff" ist ein Stoff, der selbst nicht die gewünschte Wirkung erzeugt, sondern wirkt, um die Wirkung der aktiven Verbindung zu verstärken oder anders zu verbessern. Der verwendete richtige Vektor und die verwendete Vektorformulierung hängen von mehreren Faktoren ab, wie der Größe der zu transferierenden DNA, des zu anzuwendenden Zuführungsprotokolls und der dergleichen. Beispiel-Nichtvirus- und Virusvektoren werden nachstehend ausführlicher beschrieben.
  • 1. Virusvektoren
  • Im Allgemeinen bestehen Virusvektoren, die gemäß der Erfindung verwendet werden, aus einem Viruspartikel, das sich von einem natürlich vorkommenden Virus ableitet, welcher genetisch verändert worden ist, um die Virusreplikation defekt zu machen und um ein interessierendes rekombinantes Gen zur Expression in einer Zielzelle gemäß der Erfindung zuzuführen. Zahlreiche Virusvektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen z.B. Retrovirus-, Adenovirus-, adeno-assoziierte Virus-, Herpessimplexvirus-(HSV), Cytomegalovirus-(CMV), Vaccinia- und Poliovirusvektoren ein. Der Virusvektor kann gemäß seiner bevorzugten Infektion der Zielzellen ausgewählt werden.
  • Wenn ein replikationsdefizientes Virus als der Virusvektor verwendet wird, kann die Produktion von infektiösen Viruspartikeln, die entweder DNA oder RNA entsprechend der interessierenden DNA enthalten, durch Einbringen des Viruskonstrukts in eine rekombinante Zelllinie erreicht werden, welche die für eine Virusreplikation wesentlichen, aber fehlenden Komponenten bereitstellt. In einer Ausführungsform führt die Transformation der rekombinanten Zelllinie mit dem rekombinanten Virusvektor nicht zur Produktion oder erheblichen Produktion von replikationskompetenten Viren, z.B. durch homologe Rekombination der Virussequenzen der rekombinanten Zelllinie im eingebrachten Virusvektor. Verfahren zur Produktion von replikationsdefizienten Viruspartikeln, die eine interessierende Nukleinsäure enthalten, sind auf dem Fachgebiet bekannt und beispielsweise in Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991) und Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992) (Adenovirus); US-Patent Nr. 5,139,941 (adeno-assoziiertes Virus); US-Patent Nr. 4,861,719 (Retrovirus); und US-Patent Nr. 5,356,806 (Vacciniavirus) beschrieben. Verfahren und Materialien zur Handhabung des Mumpsvirusgenoms, Charakterisierung von Mumpsvirusgenen, die für Virenfusion und Virusreplikation verantwortlich sind, und die Struktur und Sequenz des Mumpsvirusgenoms sind in Tanabayashi et al., J. Virol. 67:2928-2931 (1993); Takeuchi et al., Archiv. Virol., 128:177-183 (1993); Tanabayashi et al., Virol. 187:801-804 (1992); Kawano et al., Virol., 179:857-861 (1990); Elango et al., J. Gen. Virol. 69:2893-28900 (1988) beschrieben.
  • 2. Nichtvirusvektoren
  • Die interessierenden Nukleinsäuren können unter Verwendung eines Nichtvirusvektors in eine Zelle eingebracht werden. Der hier verwendete Begriff „Nichtvirusvektor" hat die Bedeutung der nackten DNA (z.B. einer DNA, die nicht in einem Viruspartikel enthalten und frei von Trägermolekülen, wie Lipiden, ist), von chemischen Formulierungen, die eine nackte Nukleinsäure enthalten (z.B. eine Formulierung von DNA (und/oder RNA), und kationischen Verbindungen (z.B. von Dextransulfat, kationischen Lipiden)) und von nackter Nukleinsäure, der ein Hilfsstoff, wie ein Viruspartikel, beigemischt ist (z.B. ist die interessierende DNA nicht in dem Viruspartikel enthalten, aber die Formulierung besteht sowohl aus nackter DNA und Viruspartikeln (z.B. Adenovirusteilchen) (siehe z.B. Curiel et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 6:247-52 (1992)).
  • In einigen Ausführungsformen enthält die Formulierung Viruspartikel, welche vor der Verabreichung mit dem nackten DNA-Konstrukt gemischt werden. In einigen Ausführungsformen sind die Viruspartikel Adenoviruspartikel. Siehe z.B. Curiel et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 6:247-52 (1992)).
  • In einer anderen Ausführungsform oder zusätzlich dazu kann die Nukleinsäure mit polykationischen Stoffen, wie Poly-L-lysin oder DEAC-Dextran und Zielliganden und/oder DNA-Bindungsproteinen (z.B. Histonen), komplexiert sein. DNA- oder RNA-Liposom-Komplex-Formulierungen enthalten ein Gemisch aus Lipiden, welche an genetisches Material (DNA oder RNA) binden und die Zuführung der Nukleinsäure in die Zelle erleichtern. Liposome, welche gemäß der Erfindung verwendet werden können, schließen DOPE (Dioleylphosphatidylethanolamin), CUDMEDA (N-(5-Cholestrum-3-β-ol-3-urethanyl)-N',N'-dimethylethylendiamin) ein.
  • Zum Beispiel kann die nackte DNA in einer Lösung verabreicht werden, die LipofectinTM (LTI/BRL) in Konzentrationen enthält, die im Bereich von etwa 2,5 Vol.-% bis 15 Vol.-%, z.B. etwa 6 Vol.-% bis 12 Vol.-%, liegen. Beispielhafte Verfahren und Zusammensetzungen für die Formulierung von DNA zur Zuführung gemäß dem Verfahren der Erfindung sind in US-Patent Nr. 5,527,928 beschrieben.
  • Die interssierende Nukleinsäure kann auch als chemische Formulierung von DNA oder RNA, die an ein Trägermolekül (z.B. einen Antikörper oder einen Rezeptorligand) gekoppelt ist, verabreicht werden, was die Zuführung zu Wirtszellen erleichtert. Der Begriff „chemische Formulierungen" bedeutet Modifikationen von Nukleinsäuren, welche Koppelung der Nukleinsäureverbindungen an ein Trägermolekül, wie ein Protein oder Lipid oder dessen Derivat, erlauben. Beispiel-Proteinträgermoleküle schließen Antikörper ein, die zu den Zellen einer zielgerichteten Pankreaszelle oder zu Rezeptorliganden spezifisch sind, z.B. Moleküle, die in der Lage sind, mit Rezeptoren in Wechselwirkung zu treten, die mit einer Zelle einer zielgerichteten Pankreaszelle verbunden sind.
  • B. Einbringung von β-TRP-Nukleinsäuren in Pankreaszellen in vitro
  • Die β-TRP kodierenden Nukleinsäuren können in eine Zelle in vitro eingebracht werden, um Expression in der Zelle zu erreichen, um zumindest transiente Expression bereitzustellen. Die Zellen, in welche die Nukleinsäure eingebracht wird, können differenzierte Epithelzellen (z.B. Pankreaszellen (einschließlich z.B. Inselzellen, wie β-Zellen), Darmzellen, Leberzellen oder Duktuszellen), pluripotente erwachsene oder embryonale Stammzellen oder irgendwelche Säugetierzellen sein, die in der Lage sind, sich zu β-Zellen oder Zellen zu entwickeln, die fähig sind, Insulin in vitro zu exprimieren. Die Zelle kann anschließend in eine Person mit einer Erkrankung implantiert werden, die durch einen Mangel an Insulin (z.B. Typ I- oder -II-Diabetes) gekennzeichnet ist, wobei die Erkrankung einer Behandlung durch Inselzellen-Ersatztherapie zugänglich ist. In einigen Ausführungsformen leitet sich die Wirtszelle, in welcher die β-TRP-Expression vorgenommen wird und welche in die Person implantiert wird, von der Einzelperson ab, die das Transplantat empfängt (z.B. um ein autologes Transplantat bereitzustellen). In einer anderen Ausführungsform könnten Zellen von einer anderen Person (dem „Spender") modifiziert werden, um β-TRP zu exprimieren, und die Zellen anschließend in die betroffene Person implantiert werden, um Insulinproduktion zu erreichen.
  • Einbringung der Nukleinsäure in die Zelle in vitro kann gemäß den Verfahren erreicht werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (z.B. durch die Anwendung der Elektroporation, Microinjektion, Lipofektionsinfektion mit einem rekombinanten (vorzugsweise replikationsdefizienten) Virus und andere Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind). Die Nukleinsäure ist im Allgemeinen mit einem Promotor funktionsfähig verbunden, der einen gewünschten Spiegel von Polypeptidexpression erleichtert (z.B. mit einem Promotor, der sich vom CMV, SV40, Adenovirus oder einem gewebsspezifischen oder zelltypspezifischen Promotor ableitet). Die transformierten Zellen, die die rekombinante Nukleinsäure enthalten, können zum Beispiel über die Expression eines selektierbaren Markergens, das in dem eingebrachten Konstrukt vorliegt oder das auf einer Nukleinsäure vorliegt, die mit dem Konstrukt co-transfiziert wird, selektiert und/oder angereichert werden. Typischerweise führen selektierbare Marker zu Resistenz gegenüber Antibiotika, wie Tetracyclin, Hygromycin, Neomycin und dergleichen. Andere Marker können Thymidinkinase und dergleichen einschließen. Andere Marker können Marker einschließen, die verwendet werden können, um β-TRP-exprimierende Zellen zu identifizieren, wie β-Galaktosidase oder grün fluoreszierendes Protein.
  • Expression der eingebrachten Nukleinsäure in die transformierte Zelle kann mit verschiedenen auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren bewertet werden. Zum Beispiel kann die Expression des eingebrachten Gens durch Northernblot überprüft werden, um mRNA zu detektieren, welche mit einer sich vom relevanten Gen ableitenden DNA-Sonde hybridisiert. Solche Zellen, die das gewünschte Gen exprimieren, können ferner isoliert und unter Anwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren in in-vitro-Kultur vermehrt werden. Die Wirtszellen, die zur Transformation selektiert sind, variieren mit dem Zweck der ex vivo-Therapie (z.B. zur Insulinproduktion), der Stelle der Implantation der Zellen und anderen Faktoren, die mit einer Vielzahl von Faktoren variieren, die für den Fachmann ersichtlich sind.
  • Die transformierte Zelle kann auch zur Insulinproduktion überprüft werden. Zum Beispiel könnte die Expression von Insulin durch PCR, Northernblot, Immunzytochemie, Westernblot oder ELISA detektiert werden. In einer anderen Ausführungsform könnte ein Markergen, wie grün fluoreszierendes Protein, oder ein Antibiotikumresistenzgen, das mit einem Inselzellen-spezifischen Promotor, wie dem Insulingenpromotor, funktionell verbunden ist, zur Identifizierung oder Selektion von transformierten Inselzellen verwendet werden.
  • Verfahren zur Konstruktion einer Wirtszelle zur Expression von (einem) gewünschten Genprodukt(en) und Implantation oder Transplantation der konstruierten Zellen (z.B. ex vivo-Therapie) sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z.B. Gilbert et al., Transplantation, 56:423-427 (1993)). Zur Expression eines gewünschten Gens in exogenen oder autologen Zellen und Implantation der Zellen (z.B. von Inselzellen) in den Pankreas, siehe z.B. Docherty, Clin. Sci. (Colch), 92:321-330 (1997); Hegre et al., Acta Endocrinol. Suppl. (Copenh), 205:257-281 (1976); Sandler et al., Transplantation, 63:1712-1718 (1997); Calafiore, Diabetes Care, 20:889-896 (1997); Kenyon et al., Diabetes Metab. Rev., 12:361-372 (1996); Chick et al., Science, 197:780-782 (1977). Im Allgemeinen können die Zellen in den Pankreas oder an jede praktische oder günstige Stelle, z.B. eine subkutane Stelle, in die Leber, das Peritoneum, implantiert werden.
  • Verfahren zum Transplantieren von Inselzellen sind auf dem Fachgebiet bekannt, siehe z.B. Hegre et al., Acta Endocrinol. Suppl. (Copenh), 205:257-281 (1976); Sandler et al., Transplantation, 63:1712-1718 (1997); Calafiore, Diabetes Care, 20:889-896 (1997); Kenyon et al., Diabetes Metab. Rev., 12:361-372 (1996); Chick et al., Science, 197:780-782 (1977).
  • Im Allgemeinen können die Zellen nach der Expansion der transformierten Zellen in vitro durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren in die Säugetierperson implantiert werden. Die Anzahl der implantierten Zellen reicht aus, um Expression von Spiegeln von Insulin zu erreichen, um die Blutglukosespiegel zu senken. Die Anzahl der zu transplantierenden Zellen kann auf Grundlage von solchen Faktoren, wie dem Spiegel der Polypeptidexpression, der in vitro erreicht wird, und/oder der Anzahl von Zellen, die die Implantation überleben, bestimmt werden. Die transformierten Zellen werden in einen Bereich von dichter Vaskularisation, wie der Leber, und auf eine Art und Weise implantiert, die den chirurgischen Eingriff an der Person minimiert. Das Aufpfropfen des Implantats von transformierten Zellen wird durch Überprüfen der Säugetierperson auf klassische Anzeichen der Transplantatabstoßung, d.h. Entzündung und/oder Exfoliation an der Stelle der Implantation und Fieber, und durch Überwachen der Blutglukosespiegel überwacht.
  • C. Einbringung von β-TRP-Nukleinsäuren in Pankreaszellen in vivo (für Informationszwecke)
  • β-TRP-Nukleinsäuren können einer Person direkt zugeführt werden, um β-TRP-Expression in einer Zielzelle (z.B. einer Inselzelle des Pankreas) bereitzustellen, wodurch die Glukose-stimulierte Insulinproduktion gefördert wird. Verfahren zur in vivo-Zuführung einer interessierenden Nukleinsäure zur Expression in einer Zielzelle sind auf dem Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel verwenden in vivo-Verfahren der Genzuführung gewöhnlich entweder biologische Mittel zum Einbringen der DNA in die Zielzellen (z.B. ein die interessierende DNA enthaltendes Virus) oder mechanische Mittel, um die DNA in die Zielzellen einzubringen (z.B. direkte Injektion von DNA in die Zellen, Liposomfusion oder pneumatische Injektion unter Verwendung eines Gengewehrs).
  • Im Allgemeinen produzieren die transformierten Zellen, die das durch die interessierende DNA kodierende Protein exprimieren, eine therapeutisch wirksame Menge von β-TRP, um Inselzellen, insbesondere β-Zellen bei dem Säugetierpatienten zu produzieren, die zur Glukose-stimulierten Insulinproduktion in der Lage sind. In einigen Ausführungsformen kodiert die eingebrachte DNA auch einen Inselzellen-spezifischen Transkriptionsfaktor oder ein anderes Polypeptid, das die Insulinproduktion in Inselzellen reguliert oder stimuliert.
  • Allgemein gesprochen, umfasst das Zuführungsverfahren das Einbringen des die interessierende Nukleinsäure enthaltenden Vektors in eine Pankreaszelle. Beispielsweise kann ein β-TRP-DNA-enthaltender Vektor entweder einen Virus- oder einen Nichtvirusvektor (einschließlich nackter DNA) umfassen, welcher über das Duktussystem in den Pankreas in vivo eingebracht wird. Intraduktale Verabreichung kann durch Kanulation zum Beispiel durch Einführen der Kanüle durch ein Lumen des Gastrointestinaltrakts, durch Einführen der Kanüle durch eine externe Öffnung oder durch Einführen der Kanüle durch den gewöhnlichen Gallentrakt erreicht werden. Retrograde duktale Verabreichung kann im Pankreas durch endoskopische retrograde Cholangiopankreatikographie (ECRP) erreicht werden. Beispiel-Verfahren zum Erreichen der intraduktalen Zuführung zum Pankreas sind in US-Patent Nr. 6,004,944 beschrieben.
  • Die exakte Menge von verabreichter β-TRP-kodierender Nukleinsäure variiert stark gemäß mehreren Faktoren, die die Empfänglichkeit der Zielzellen für Transformation, die Größe und das Gewicht der Person, die Spiegel der gewünschten Proteinexpression und den zu behandelnden Zustand einschließen. Die Menge von Nukleinsäure und/oder die Anzahl der infektiösen Viruspartikel, die wirksam sind, um das zielgerichtete Gewebe zu infizieren, eine ausreichende Anzahl an Zellen zu transformieren, und die Produktion eines gewünschten Spiegels an Insulin bereitzustellen, kann leicht auf Grundlage solcher Faktoren, wie Wirksamkeit der in vitro-Transformation und die Empfänglichkeit der zielgerichteten Zellen für Transformation, bestimmt werden. Zum Beispiel beträgt die Menge von DNA, die in den pankreatischen Duktus eines Menschen eingebracht wurde, zum Beispiel allgemein etwa 1 μg bis etwa 750 mg, z.B. etwa 500 μg bis etwa 500 mg, z.B. von etwa 10 mg bis etwa 200 mg, z.B. etwa 100 mg. Im Allgemeinen können die Mengen von DNA aus den Mengen von DNA, die zur Zuführung und Expression des gewünschten Gens in einem Tiermodell wirksam ist, extrapoliert werden. Zum Beispiel beträgt die Menge von DNA zur Zuführung in einen Menschen ungefähr die 100fache Menge von DNA, die in einer Ratte wirksam ist.
  • Die modifizierten Pankreaszellen können genügend hohe Expressionsspiegel einer interessierenden Nukleinsäure ernöglichen, z.B. wenn die zugeführte Nukleinsäure DNA ist und die interessierende DNA mit einem starken eukaryotischen Promotor (z.B. CMV, MMTV) funktionsfähig verbunden ist. Das exprimierte Protein kann Glukose-stimulierte Insulinproduktion in Inselzellen induzieren. Folglich sind die Verfahren beim Behandeln einer Säugetierperson mit einer Vielzahl von Insulin-verbundenen Zuständen nützlich.
  • Die tatsächliche Anzahl an transformierten Pankreaszellen, die erforderlich sind, um therapeutische Spiegel des interessierenden Proteins zu erreichen, variiert gemäß mehreren Faktoren, einschließlich des zu exprimierenden Proteins, des Expressionsspiegels des Proteins durch die transformierten Zellen, der Rate, mit welcher das Protein die Insulinproduktion induziert, und der Behandlungsbedingungen.
  • Unabhängig davon, ob die Inselzelltranskriptionsfaktor-kodierende Nukleinsäure in vivo oder ex vivo eingebracht wird, kann die Nukleinsäure (oder können die Inselzellen, die in vitro produziert werden, oder die rekombinanten Zellen, die die β-TRP-Nukleinsäure exprimieren, die zur Entwicklung zu Inselzellen in einer in vivo-Posttransplantation zu transplantieren sind), in Kombination mit anderen Genen und anderen Mitteln verabreicht werden.
  • D. Beurteilung der Therapie
  • Die Wirkungen der ex vivo- oder in vivo-Therapie können auf eine Vielzahl von Arten überwacht werden. Im Allgemeinen kann eine Blutprobe von der Person zum Beispiel auf Glukose-, Proinsulin-, C-Peptid- und Insulinspiegel geprüft werden. Geeignete Assays zum Detektieren von Proinsulin, C-Peptid, Insulin und Glukose in den Blutproben sind auf dem Fachgebiet bekannt.
  • IV. Identifizierung von Modulatoren von β-TRP
  • Modulatoren von β-TRP, d.h. Agonisten oder Antagonisten der β-TRP-Aktivität oder β-TRP-Polypeptid- oder -polynukleotidexpression, sind zum Behandeln mehrerer Krankheiten beim Menschen, einschließlich Diabetes, nützlich. Verabreichung von β-TRP-Aktivatoren kann anwendet werden, um Diabetiker zu behandeln (z.B. Typ II).
  • A. Mittel, die β-TRP modulieren
  • Die Mittel, die als Modulatoren von β-TRP geprüft werden, können beliebige kleine chemische Verbindungen oder eine biologische Einheit, wie ein Protein, Zucker, eine Nukleinsäure oder ein Lipid, sein. Typischerweise sind Testverbindungen kleine chemische Moleküle und Peptide. Im Wesentlichen kann jede chemische Verbindung als ein möglicher Modulator oder Ligand in den Assays der Erfindung verwendet werden, obwohl am häufigsten Verbindungen verwendet werden, die in wässrigen oder organischen Lösungen (besonders auf DMSO-Basis) gelöst werden können. Die Assays sind entworfen, um große chemische Bibliotheken durch Automatisieren der Assayschritte und Bereitstellen von Verbindungen aus jeder günstigen Quelle für die Assays zu screenen, welche typischerweise parallel laufen gelassen werden (z.B. in Mikrotiterformaten auf Mikrotiterplatten in Roboterassays). Aktivatoren schließen Moleküle ein, die β-TRP sowie Moleküle direkt aktivieren (öffnen), als auch Moleküle, die Regulatoren aktivieren (GPCRs, G-Proteine usw.), die anschließend β-TRP aktivieren. Modulatoren schließen auch Mittel ein, die entworfen wurden, um den Spiegel von β-TRP-mRNA (z.B. Antisensemoleküle, Ribozyme, DNAzyme, kleine hemmende RNAs (siRNAs) und dergleichen) oder den Spiegel der Translation von einer mRNA zu verringern (z.B. Translationsblocker, wie Antisense-Moleküle, die zum Translationsanfang oder anderen Sequenzen auf einem mRNA-Molekül komplementär sind). Es ist ersichtlich, dass es viele Lieferanten von chemischen Verbindungen gibt, einschließlich Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Schweiz) und dergleichen. Im Allgemeinen liegen die zu prüfenden Verbindungen im Bereich von 1 pM bis 100 mM vor.
  • Bei einigen Ausführungsformen schließen Sceeningverfahren mit hohem Durchsatz das Bereitstellen einer kombinatorischen chemischen oder Peptidbibliothek ein, die eine große Anzahl potenzieller therapeutischer Verbindungen enthält (potenzieller Modulatorverbindungen). Derartige „kombinatorische chemische Bibliotheken" oder „Ligandbibliotheken" werden dann, wie hier beschrieben, in einem oder mehreren Assays gescreent um diejenigen Bibliothekenmitglieder (bestimmte chemische Spezies oder Unterklassen) zu identifizieren, die eine gewünschte charakteristische Aktivität zeigen. Die so identifizierten Verbindungen können als herkömmliche „Führungsverbindungen" dienen, oder können selbst als potenzielle oder tatsächliche Therapeutika verwendet werden.
  • Eine kombinatorische chemische Bibliothek ist eine Ansammlung von verschiedenen chemischen Verbindungen, die entweder durch chemische Synthese oder durch biologische Synthese erzeugt werden, indem eine Anzahl von chemischen „Bausteinen", wie Reagenzien, kombiniert wird. Zum Beispiel wird eine lineare kombinatorische chemische Bibliothek, wie eine Polypeptidbibliothek, durch Kombinieren eines Satzes von chemischen Bausteinen (Aminosäuren) auf jede mögliche Art und Weise für eine gegebene Verbindungslänge (d.h. die Anzahl der Aminosäuren in einer Polypeptidverbindung) erzeugt. Millionen chemischer Verbindungen können durch ein derartiges kombinatorisches Mischen der chemischen Bausteine synthetisiert werden.
  • Die Herstellung und das Screenen von kombinatorischen chemischen Bibliotheken sind dem Fachmann bekannt. Derartige kombinatorische chemische Bibliotheken schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Peptidbibliotheken (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,010,175 , Furka, Int. J. Pept. Prot. Res., 37:487-493 (1991) und Houghton et al., Nature, 354:84-88 (1991)). Auch andere Chemie zum Erzeugen von diversen chemischen Bibliotheken können verwendet werden. Derartige Chemie schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf: Peptoide (z.B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/19735 ), kodierte Peptide (z.B. PCT-Veröffentlichung WO 93/20242 ), statistische Bio-Oligomere (z.B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/00091 ), Benzodiazepine (z.B. US-Patent Nr. 5,288,514 ), Diversomere, wie Hydantoine, Benzodiazepine und Dipeptide (Hobbs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6909-6913 (1993)), vinyloge Polypeptide (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc., 114:6568 (1992)), nichtpeptidische Peptid-Nachahmer mit Glukosegerüst (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc., 114:9217-9218 (1992)), analoge organische Synthesen von Bbibliotheken kleiner Verbindungen (Chef et al., J. Amer. Chem. Soc., 116:2661 (1994)), Oligocarbamate (Cho et al., Science, 261:1303 (1993)) und/oder Peptidylphosphonate (Campbell et al., J. Org. Chem., 59:658 (1994)), Nukleinsäurebibliotheken (siehe Ausubel, Berger und Sambrook, alle ibid.), Peptidnukleinsäurebibliotheken (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,539,083 ), Antikörperbibliotheken (siehe z.B. Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996) und PCT/US96/10287 ), Kohlenhydratbibliotheken (z.B. Lang et al., Science, 274:1520-1522 (1996) und US-Patent Nr. 5,593,853 ), Bbibliotheken kleiner organischer Moleküle (siehe z.B. Benzodiazepine, Baum C&EN, 18. Januar, Seite 33 (1993); Isoprenoide, US-Patent Nr. 5,569,588 ; Thiazolidinone und Metathiazanone, US-Patent Nr. 5,549,974 ; Pyrrolidine, US-Patente Nr. 5,525,735 und 5,519,134 ; Morpholinoverbindungen, US-Patent Nr. 5,506,337 ; Benzodiazepine, US-Patent Nr. 5,288,514 und dergleichen).
  • Vorrichtungen zur Herstellung von kombinatorischen Bibliotheken sind im Handel erhältlich (siehe z.B. 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Redford, MA). Zusätzlich sind zahlreiche kombinatorische Bibliotheken selbst im Handel erhältlich (siehe z.B. ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, usw.).
  • B. Verfahren zum Screenen nach Modulatoren von β-TRP
  • Mehrere verschiedene Screeningprotokolle können verwendet werden, um Mittel zu identifizieren, die den Spiegel der Expression oder Aktivität von β-TRP in Zellen, besonders Säugetierzellen und insbesondere menschlichen Zellen, modulieren. Allgemein gesprochen, schließen die Screeningverfahren das Sceenen einer Mehrzahl von Mitteln ein, um ein Mittel zu identifizieren, das die Aktivität von β-TRP z.B. durch Binden an ein β-TRP-Polypeptid, durch Hindern eines Inhibitors oder Aktivators am Binden an β-TRP, durch Verstärken des Verbindens eines Inhibitors oder Aktivators mit β-TRP oder durch Aktivieren oder Hemmen der Expression oder Aktivität von β-TRP moduliert.
  • Bei einigen Ausführungsformen werden verschiedene TRP-Polypeptide (z.B. TRPC1, TRPC1, TRPC2, TRPC3, TRPC4, TRPC5, TRPC6, TRPC7, TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPV5, TRPV6, TRPM1, TRPM2, TRPM3, TRPM4, TRPM5, TRPM6, TRPM7 und TRPM8) parallel gescreent, um ein Mittel zu identifizieren, das β-TRP moduliert, aber mindestens einen anderen TRP-Kanal nicht.
  • 1. β-TRP-Bindungsassays
  • Vorläufige Screeningläufe können durch Screenen auf Mittel durchgeführt werden, die in der Lage sind, an β-TRP zu binden, so dass mindestens einige der so identifizierten Mittel wahrscheinliche β-TRP-Modulatoren sind. Bindungsassays sind auch nützlich, z.B. zum Identifizieren von endogenen Proteinen, die mit β-TRP in Wechselwirkung treten. Zum Beispiel können Antikörper, Rezeptoren oder andere β-TRP bindende Moleküle in Bindungsassays identifiziert werden.
  • Bindungsassays schließen gewöhnlich das In-Kontakt-Bringen eines β-TRP-Proteins mit einem oder mehreren Testagenzien ein und erlauben dem Protein und dem Testagens ausreichende Zeit, einen Bindungskomplex zu bilden. Alle gebildeten Bindungskomplexe können unter Anwendung einer von mehreren etablierten analytischen Verfahren detektiert werden. Proteinbindungsassays schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Verfahren, die die Co-Präzipitation oder Co-Migration auf nicht-denaturierenden SDS-Polyacrylamidgelen und Co-Migration auf Westernblots messen (siehe z.B. Bennet, J.P. und Yamamura, H.I. (1985) „Neurotransmitter, Hormone or Drug Receptor Binding Methods", in Neurotransmitter Receptor Binding (Yamamura, H.I., et al., Hrsg.), S. 61-89. Andere Bindungsassays schließen die Anwendung von Massenspektrometrie oder von NMR-Verfahren ein, um an β-TRP gebundene Moleküle oder den Ersatz markierter Substrate zu identifizieren. Das β-TRP-Protein, das in derartigen Assays verwendet wird, kann natürlich exprimiert, kloniert oder synthetisiert werden.
  • Außerdem können Säugetier- oder Hefe-Zweihybrid-Annäherungen (siehe z.B. Bartel, P.L. et al., Methods Enzymol., 254:241 (1995)) angewendet werden, um Polypeptide oder andere Moleküle zu identifizieren, die miteinander in Wechselwirkung treten oder binden, wenn sie zusammen in einer Zelle exprimiert werden.
  • 2. Expressionsassays
  • Das Screenen auf eine Verbindung, die die Expression von β-TRP moduliert, wird ebenfalls bereitgestellt. Screeningverfahren schließen im Allgemeinen das Durchführen von zellbasierten Assays, in welchen Testverbindungen mit einer oder mehreren β-TRP exprimierenden Zellen in Kontakt gebracht werden, und dann das Detektieren einer Zunahme oder Abnahme der β-TRP-Expression ein (jedes Transkript-, Translationsprodukt). Assays können mit Zellen, die β-TRP natürlich exprimieren, oder in Zellen durchgeführt werden, die rekombinant geändert werden, um β-TRP zu exprimieren.
  • β-TRP-Expression kann auf mehrere verschiedene Arten und Weisen detektiert werden. Wie nachstehend beschrieben, kann der Expressionsspiegel von β-TRP in einer Zelle durch Untersuchen der in einer Zelle exprimierten mRNA mit einer Sonde bestimmt werden, die mit einem Transkript (oder einer daraus ableiteten komplementären Nukleinsäure) von β-TRP spezifisch hybridisiert. Die Untersuchung kann durch Lysieren der Zellen und Durchführen von Northernblots oder ohne Lysieren der Zellen unter Anwendung von in situ-Hybridisierungsverfahren durchgeführt werden. In einer anderen Ausführungsform kann das β-TRP-Protein unter Anwendung von immunologischen Verfahren detektiert werden, bei welchen ein Zelllysat mit spezifisch an β-TRP bindenden Antikörpern untersucht wird.
  • Andere zellbasierte Assays schließen die Reporterassays ein, die mit Zellen unter Anwendung von Standardreportergenassays durchgeführt werden. Diese Assays können in allen Zellen durchgeführt werden, die β-TRP exprimieren oder nicht. Einige dieser Assays werden mit einem heterologen Nukleinsäurekonstrukt durchgeführt, das einen β-TRP-Promotor einschließt, der mit einem ein detektierbares Produkt kodierenden Reportergen funktionsfähig verbunden ist. Mehrere verschiedene Reportergene können verwendet werden. Einige Reporter sind inhärent detektierbar. Ein Beispiel eines derartigen Reporters ist ein grün fluoreszierendes Protein, das Fluoreszenz emittiert, die mit einem Fluoreszenzdetektor detektiert werden kann. Andere Reporter erzeugen ein detektierbares Produkt. Häufig sind derartige Reporter Enzyme. Beispiel-Enzymreporter schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf β-Glucuronidase, CAT (Chloramphenicolacetyltransferase; Alton und Vapnek (1979) Nature, 282:864-869), Luziferase, β-Galaktosidase und alkalische Phosphatase (Toh, et al. (1980) Eur. J. Biochem., 182:231-238; und Hall et al. (1983) J. Mol. Appl. Gen., 2:101).
  • Bei diesen Assays werden die Zellen, die das Reporterkonstrukt beherbergen, mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht. Modulierte Promotorexpression wird durch Detektieren des Spiegels eines detektierbaren Reporters überwacht. Mehrere verschiedene Arten von β-TRP-Modulatoren können mit diesem Assay identifiziert werden. Zum Beispiel kann eine Testverbindung identifiziert werden, die den Promotor durch Binden an ihn hemmt, den Promotor durch Binden an Transkriptionsfaktoren oder andere Regulationsfaktoren hemmt, an ihren Promotor bindet oder eine Kaskade auslöst, die ein Molekül produziert, das den Promotor hemmt. In ähnlicher Weise kann auch eine Testverbindung identifiziert werden, die z.B. den Promotor durch Binden an ihn aktiviert, den Promotor durch Binden an Transkriptionsfaktoren oder andere Regulationsfaktoren aktiviert, an ihren Promotor bindet oder eine Kaskade auslöst, die ein Molekül produziert, das den Promotor aktiviert.
  • Der Spiegel der Expression oder Aktivität kann mit einem Basiswert verglichen werden. Der Basiswert kann ein Wert für eine Kontrollprobe oder ein statistischer Wert sein, der repräsentativ für die β-TRP-Expressionsspiegel für eine Kontrollpopulation (z.B. magere Einzelpersonen ohne oder mit Risiko für Typ II-Diabetes) oder für Kontrollzellen ist (z.B. Gewebekulturzellen, die einem β-TRP-Modulator nicht ausgesetzt sind). Expressionsspiegel können auch für Zellen, die β-TRP nicht exprimieren, als Negativkontrolle bestimmt werden. Derartige Zellen sind ansonsten im Allgemeinen im Wesentlichen genetisch dieselben wie die Testzellen.
  • Eine Vielzahl von verschiedenen Zelltypen kann in den Reporterassays verwendet werden. Zellen, die ein endogenes β-TRP exprimieren, umfassen z.B. Pankreaszellen, wie Inselzellen, z.B. β-Zellen. Zellen, die nicht endogen β-TRP exprimieren, können prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Die eukaryotischen Zellen können zu den Zellen gehören, die typischerweise beim Erzeugen von Zellen verwendet werden, die ein rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt beherbergen. Beispielhafte eukaryotische Zellen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Hefe und ver schiedene höhere eukaryotische Zellen, wie die HepG2-, COS-, CHO- und HeLa-Zelllinien. Xenopus Oozyten können ebenfalls verwendet werden.
  • Verschiedene Kontrollversuche können durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass eine beobachtete Aktivität authentisch ist, indem parallel laufende Umsetzungen mit Zellen durchgeführt werden, denen das Reporterkonstrukt fehlt, oder indem eine Zelle, die das Reporterkonstrukt beherbergt, nicht mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird. Verbindungen können ferner auch validiert werden, wie nachstehend beschrieben.
  • 3. Aktivität
  • Die Analyse der β-TRP-Polypeptidaktivität wird gemäß den allgemeinen biochemischen Verfahren durchgeführt. Derartige Assays umfassen zellbasierte Assays als auch in vitro-Assays, bei denen gereinigte oder teilweise gereinigte β-TRP-Polypeptide oder Rohzelllysate verwendet werden. Bei einigen Ausführungsformen wird das β-TRP-Polypeptid auf einer Zelle exprimiert, und die Zelle wird mit einem Testagens in Kontakt gebracht.
  • Der Spiegel der β-TRP-Aktivität in einer Zelle oder einer anderen Probe wird bestimmt und mit einem Basiswert verglichen (z.B. einem Kontrollwert). Die Aktivität kann mit einem Rohextrakt oder mit teilweise oder im Wesentlichen gereinigtem β-TRP aus einer Probe gemessen werden. Zur Messung der β-TRP-Aktivität wird die Kationen-(z.B. Ca2+) Kanalaktivität gemessen, wie beispielsweise beschrieben in Lesage et al., Am. J. Physiol. Renal. Physiol., 279:F793-F801 (2000) und Girad et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 282:249-256 (2001). Beispielsweise können Änderungen im Ionenfluss durch Bestimmen von Änderungen in der Polarisation (d.h. des elektrischen Potenzials) der Zelle oder der ein β-TRP-Polypeptid exprimierenden Membran bewertet werden. Bei einigen Ausführungsformen werden Änderungen in der zellulären Polarisation durch Messen von Änderungen im Strom (wodurch Änderungen in der Polarisation gemessen werden) mit Spannungs-Klammer-(Voltage-Clamp-) und Patch-Clamp-Verfahren überwacht, z.B. mit dem „zellverbundenen" Modus (cell-attached mode), dem „von-innen-nach-außen"-Modus (inside-out mode) und dem „Gesamtzell"-Modus (whole cell mode) (siehe z.B. Ackerman et al., New Engl. J. Med., 336:1575-1595 (1997)). Gesamtzellströme werden unter Anwendung des Standardverfahrens bequem bestimmt (siehe z.B. Hamil et al., PFlugers. Archiv., 391:85 (1981). Andere bekannte Assays schließen ein: 45Ca2+ und Fluoreszenzassays unter Verwendung von spannungssensitiven Farbstoffen oder innensensitiven Farbstoffen (siehe z.B. Vestergarrd-Bogind et al., J. Membrane Biol., 88:67-75 (1988); Daniel et al., J. Pharmacol. Meth., 25:185-193 (1991); Holevinsky et al., J. Membrane Biology, 137:59-70 (1994)). Assays für Verbindungen, die in der Lage sind, den Kationfluss durch die ein β-TRP-Polypeptid enthaltenden Kanalproteine zu hemmen oder zu erhöhen, können durch Einbringen der Verbindungen in eine Radlösung durchgeführt werden, die in Kontakt mit Zellen mit einem Kanal gemäß der vorliegenden Erfindung steht und diese enthält (siehe z.B. Blatz et al., Nature, 323:718-720 (1986); Park, J. Physiol., 481:555-570 (1994)).
  • Die Wirkungen der Testverbindungen auf die Funktion der Kanäle können durch Änderungen der elektrischen Ströme oder des Ionenflusses oder durch die Auswirkungen der Änderungen der Ströme und des Flusses gemessen werden. Änderungen des elektrischen Stroms oder des Ionenflusses werden entweder durch eine Zunahme oder eine Abnahme des Flusses der Ionen, wie von Calciumionen, gemessen. Die Ionen können auf eine Vielzahl von Standard-Vorgehensweisen gemessen werden. Sie können direkt über Konzentrationsänderungen der Ionen, z.B. über Änderungen der intrazellulären Konzentrationen, oder indirekt durch das Membranpotenzial oder durch Radiomarkierung der Ionen oder durch Verwendung von calciumabhängigen Fluoreszenzfarbstoffen gemessen werden.
  • Wie in 3 veranschaulicht, liefert das Membranpotenzial im Vergleich zu Calciumflussmessungen ein besonders sauberes Signal:Rausch-Verhältnis für die Messung der β-TRP-Aktivität. Die Zellmembrandepolarisation bei Aktivierung von β-TRP kann mit Membranpotenzialabhängigen Fluoreszenzfarbstoffen, wie kationischen Carbocyaninen und Rhodaminen und anionischen Oxonolen sowie mit Spezialitätenfarbstoffen gemessen werden, die für FLEXstation® und FLIPR®systems von Molecular Devices (Sunnyvale, CA) erhältlich sind. Die Fluoreszenz, die durch Zelldepolarisierung ausgelöst wird, kann mit auf dem Fachgebiet bekannten Vorrichtungen, z.B. FLEXstation®, detektiert werden.
  • Die Auswirkungen der Testverbindung auf den Ionenfluss können ziemlich variieren. Demgemäß kann jede geeignete physiologische Änderung angewendet werden, um den Einfluss einer Testverbindung auf die Kanäle gemäß dieser Erfindung zu bewerten. Die Wirkungen einer Testverbindung können mit einem Toxinbindungsassay gemessen werden. Wenn die funktionellen Auswirkungen unter Verwendung von intakten Zellen oder Tieren bestimmt werden, kann auch eine Vielzahl von Wirkungen gemessen werden, wie Transmitterfreisetzung, intrazelluläre Calciumänderungen, Hormonfreisetzung (z.B. Insulin), transkriptionelle Änderungen sowohl auf bekannte als auch auf nichtcharakterisierte genetische Marker (z.B. Northernblots), Zellenvolumenänderungen (z.B. in roten Blutzellen), Immunreaktionen (z.B. T-Zellenaktivierung), Änderungen des Zellenmetabolismus', wie Zellenwachstum oder -pH-Änderungen, Änderungen der intrazellulären Second messenger, wie zyklischer Nukleotide, und Modulation (z.B. Abnahme) der Apoptosis.
  • 4. Validierung
  • Agenzien, die anfangs durch eines der vorhergehenden Screeningverfahren identifiziert worden sind, können weiter geprüft werden, um die ersichtliche Aktivität zu validieren. Bei einigen Ausführungsformen wird ein β-TRP-Aktivator durch ein oder alle der folgenden Kriterien ausgewählt: (i) der Aktivator induziert eine Depolarisationsreaktion spezifisch in einer Zelle, die ein heterologes β-TRP-Polypeptid exprimiert (aber nicht in den Zellen, die β-TRP nicht exprimieren); (ii) der Aktivator ist durch PLC-Inhibitoren nicht supprimierbar (d.h. er wird nicht durch einen stromaufwärts gelegenen Regulator von β-TRP aktiviert); und (iii) die aktivierende Wirkung des Aktivators ist durch TRP-Blocker, wie 2-APB, unterdrückbar.
  • Validierungsassays können z.B. in vitro-Einzelzellbilddarstellung oder Patch Clamp-Verfahren einschließen, um die Wirkungen auf den Ionenfluss zu bestätigen. In vitro-Insulinsekretionsassays unter Verwendung von isolierten (normalen oder diabetischen) Inselzellen können in Gegenwart oder bei Fehlen des Kandidatenaktivators durchgeführt werden.
  • Bei einigen Ausführungsformen werden Validierungsstudien mit geeigneten Tiermodellen durchgeführt. Das Grundformat derartiger Verfahren umfasst das Verabreichen einer Führungsverbindung, die bei einem ersten Screening identifiziert worden ist, an ein Tier, das als Modell für Menschen dient, und dann die Bestimmung, ob β-TRP tatsächlich moduliert wird. Die Tiermodelle, die bei den Validierungsstudien verwendet werden, sind im Allgemeinen Säugetiere irgendeiner Art. Spezifische Beispiele von geeigneten Tieren schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Primaten, Mäuse und Ratten. Zum Beispiel können monogene Modelltiere für Diabetes (z.B. ob/ob- und db/db-Mäuse, Zucker-Ratten und Zucker-Diabetes-Fett(ZDF-)Ratten usw.) oder polygene Modelltiere für Diabetes (z.B. ein Hochfettfutter-Mäusemodell) zur Validierung der β-TRP-Modulation und ihre Wirkung auf ein diabetisches Tier nützlich sein.
  • Idealerweise sollte die β-TRP-Aktivierung die Insulinsekretion nur bei hohem Glukosewert erhöhen. Deshalb verringert eine ausgewählte Aktivatorverbindung bei einigen Ausführungsformen Hyperglykämie bei ZDF-Ratten und db/db-Mäusen und induziert weder bei diabetischen noch bei Kontrolltieren Hypoglykämie.
  • C. Festphasen- und Löslichkeitsassays mit hohem Durchsatz
  • Bei den Assays gemäß der Erfindung mit hohem Durchsatz ist es möglich, bis zu mehrere tausend verschiedene Modulatoren oder Liganden an einem einzigen Tag zu screenen. Insbesondere kann jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte verwendet werden, um einen getrennten Assay gegen einen ausgewählten potenziellen Modulator laufen zu lassen, oder, wenn Konzentrations- oder Inkubationszeitwirkungen beobachtet werden sollen, es kann ein einzelnder Modulator in jeweils 5–10 Vertiefungen geprüft werden. Folglich kann eine einzelne Standardmikrotiterplatte etwa 100 (z.B. 96) Modulatoren bewerten. Wenn Platten mit 1536 Vertiefungen verwendet werden, dann können mit einer einzelnen Platte etwa 100 bis etwa 1500 verschiedene Verbindungen leicht geprüft werden. Es ist möglich, mehrere verschiedene Platten pro Tag zu prüfen; Assayscreens für bis zu etwa 6.000–20.000 oder mehr verschiedene Verbindungen sind unter Verwendung der integrierten Systeme gemäß der Erfindung möglich. Außerdem können mikrofluide Vorgehensweisen an die Reagenshandhabung angewendet werden.
  • Das interessierende Molekül (z.B. β-TRP oder dessen Fragmente) kann an eine Festkörperkomponente direkt oder indirekt über eine kovalente oder nichtkovalente Bindung, z.B. über eine Markierung, gebunden werden. Die Markierung kann irgendeine einer Vielzahl von Komponenten sein. Im Allgemeinen wird ein die Markierung bindendes Molekül (ein Markierungsbinder), an einen festen Träger fixiert, und das markierte interessierende Molekül (z.B. β-TRP oder dessen Fragmente) wird am festen Träger durch Wechselwirkung der Markierung und des Markierungsbinders angebracht.
  • Mehrere Markierungen und Markierungsbinder können verwendet werden, die auf bekannten molekularen Wechselwirkungen beruhen, die in der Literatur beschrieben sind. Zum Beispiel kann eine Markierung, die einen natürlichen Binder aufweist, z.B. Biotin, Protein A oder Protein G, in Verbindung mit geeigneten Markierungsbindern (Avidin, Streptavidin, Neutravidin, der Fc-Region eines Immunglobulins, poly-His usw.) verwendet werden. Antikörper an Molekülen mit natürlichen Bindern, wie Biotin, sind auch in weitem Umfange erhältliche und geeignete Markierungsbinder (siehe SIGMA Immunchemikalien 1998 Katalog SIGMA, St. Louis MO).
  • Ähnlich kann jede haptene oder antigene Verbindung in Kombination mit einem geeigneten Antikörper verwendet werden, um ein Markierungs/Markierungsbinder-Paar zu erzeugen. Tausende von spezifischen Antikörpern sind im Handel erhältlich und viele zusätzliche Antikörper sind in der Literatur beschrieben. Zum Beispiel ist die Markierung in einer häufigen Konfiguration ein erster Antikörper, und der Markierungsbinder ist ein zweiter Antikörper, der den ersten Antikörper erkennt. Zusätzlich zu den Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen sind auch Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen für Markierungs- und Markierungsbinder-Paare, wie Agonisten und Antagonisten von Zellmembranrezeptoren (z.B. Zellrezeptor-Ligand-Wechselwirkungen, wie Transferrin, C-Kit, Virenrezeptor-Liganden, Zytokinrezeptoren, Chemokinrezeptoren, Interleukinrezeptoren, Immunglobulinrezeptoren und Antikörper, die Cadherin-Familie, die Integrin-Familie, die Selectin-Familie und dergleichen; siehe z.B. Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book I (1993)) geeignet. Ähnlich können Toxine und Venome, Virusepitope, Hormone (z.B. Opiate, Steroide usw.), intrazelluläre Rezeptoren (z.B. diejenigen, die Wirkungen von verschiedenen kleinen Liganden, einschließlich von Steroiden, Schilddrüsenhormonen, Retinoiden und Vitamin D, vermitteln; Peptide), Arzneistoffe, Lektine, Zucker, Nukleinsäuren (sowohl lineare als auch zyklische Polymerkonfigurationen), Oligosaccharide, Proteine, Phospholipide und Antikörper alle mit verschiedenen Zellrezeptoren in Wechselwirkung treten.
  • Synthetische Polymere, wie Polyurethane, Polyester, Polycarbonate, Polyharnstoffe, Polyamide, Polyethylenimine, Polyarylensulfide, Polysiloxane, Polyimide und Polyacetate, können ebenfalls eine geeignete Markierung oder einen geeigneten Markierungsbinder erzeugen. Viele andere Markierungs/Markierungsbinder-Paare sind auch bei Assaysystemen nützlich, die hier beschrieben sind, wie dem Fachmann bei Durchsicht dieser Offenbarung ersichtlich wird.
  • Gewöhnliche Linker, wie Peptide, Polyether und dergleichen, können ebenfalls als Markierungen dienen und schließen Polypeptidsequenzen, wie poly-Gly-Sequenzen mit zwischen etwa 5 und 200 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 9) ein. Derartige flexible Linker sind dem Fachmann bekannt. Zum Beispiel sind Poly(ethylenglykol)-Linker von Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama erhältlich. Diese Linker weisen gegebenenfalls Amidbindungen, Sulfhydrylbindungen oder heterofunktionelle Bindungen auf.
  • Markierungsbinder werden unter Anwendung einer Vielzahl von gegenwärtig verfügbaren Verfahren an feste Substrate gebunden. Feste Substrate werden in üblicher Weise durch Einwirken eines chemischen Reagenzes auf den gesamten oder einen Teil des Substrats derivatisiert oder funktionalisiert, wobei ein chemischer Rest an die Oberfläche gebunden wird, der mit einem Teil des Markierungsbinders reagieren kann. Zum Beispiel schließen Reste, die zum Binden an einen längeren Kettenteil geeignet sind, Amine, Hydroxyl-, Thiol- und Carboxylreste ein. Aminoalkylsilane und Hydroxyalkylsilane können verwendet werden, um eine Vielzahl von Oberflächen, wie Glasoberflächen, zu funktionalisieren. Der Aufbau derartiger Festphasenbiopolymerarrays ist in der Literatur beschrieben (siehe z.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963) (beschreibt Festphasensynthese z.B. von Peptiden); Geysen et al., J. Immun. Meth., 102:259-274 (1987) (beschreibt die Synthese von Festphasenkomponenten an Stiften); Frank und Doring, Tetrahedron, 44:6031-6040 (1988) (beschreibt die Synthese verschiedener Peptidsequenzen an Cellulosescheiben); Fodor et al., Science, 251:767-777 (1991); Sheldon et al., Clinical Chemistry, 39(4):718-719 (1993); und Kozal et al., Nature Medicine, 2(7):753-759 (1996) (alle beschreiben Arrays von Biopolymeren, die an feste Substrate gebunden sind). Nicht-chemische Vorgehensweisen zum Binden von Markierungsbindern an Substrate schließen andere übliche Verfahren, wie Wärme, Vernetzung durch UV-Strahlung und dergleichen, ein.
  • Die Erfindung betrifft in vitro-Assays zum Identifizieren von Verbindungen in einem Format mit hohem Durchsatz, die die Expression oder Aktivität von β-TRP modulieren können. Kontrollreaktionen, die die β-TRP-Aktivität der Zelle bei einer Reaktion messen, die keinen potenziellen Modulator einschließt, sind fakultativ, weil die Assays hoch einheitlich sind. Derartige fakultative Kontrollreaktionen sind geeignet und erhöhen die Zuverlässigkeit des Assays. Demgemäß schließen die Verfahren der Erfindung bei einer Ausführungsform eine derartige Kontrollreaktion ein. Für jedes der beschriebenen Assayformate liefern „Nichtmodulator"-Kontrollreaktionen, die keinen Modulator einschließen, einen Hintergrundspiegel der Bindungsaktivität.
  • Bei einigen Assays wäre es wünschenswert, über Positivkontrollproben zu verfügen. Mindestens zwei Arten von Positivkontrollproben sind geeignet. Zuerst kann ein bekannter Aktivator von β-TRP gemäß der Erfindung mit einer Probe des Assays inkubiert werden, und die so erhaltene Zunahme des Signals, das sich aus einem erhöhten Expressionsspiegel oder einer erhöhten Aktivität von β-TRP ergibt, werden gemäß den hier beschriebenen Verfahren bestimmt. Beispiel-Aktivatoren schließen z.B. Calcimycin ein. Zweitens kann ein bekannter Inhibitor von β-TRP zugefügt werden, und die so erhaltene Abnahme des Signals für die Expression oder Aktivität von β-TRP kann auf ähnliche Art und Weise detektiert werden. Beispiel-Inhibitoren schließen z.B. 2-APB oder U73122, einen PLC-Inhibitor von Sigma Chemicals, ein. Es ist ersichtlich, dass Modulatoren auch mit Aktivatoren oder Inhibitoren kombiniert werden können, um Modulatoren aufzufinden, die die Zunahme oder Abnahme hemmen, die ansonsten durch die Gegenwart des bekannten Modulators von β-TRP verursacht wird.
  • D. Computergestützte Assays
  • Noch ein anderer Assay für Verbindungen, die die Aktivität von β-TRP modulieren, schließt einen computergestützten Arzneistoffentwurf ein, bei welchem ein Computersystem verwendet wird, um eine dreidimensionale Struktur von β-TRP, bezogen auf die Strukturinformation, die durch seine Aminosäuresequenz kodiert wird, zu erzeugen. Die eingegebene Aminosäuresequenz tritt direkt und aktiv mit einem vorher festgesetzten Algorithmus in einem Computerprogramm in Wechselwirkung, wobei Sekundär-, Tertiär- und Quartärstrukturmodelle des Proteins erhalten werden. Die Modelle der Proteinstruktur werden dann untersucht, um Regionen (z.B. die aktive Stelle) der Struktur zu identifizieren, die die Eignung aufweisen, Liganden zu binden oder auf andere Weise moduliert zu werden. Ähnliche Analysen können an potenziellen Rezeptoren oder Bindungspartnern von β-TRP durchgeführt werden und können angewendet werden, um Regionen von Wechselwirkung mit β-TRP zu identifizieren. Diese Regionen werden dann angewendet, um Polypeptide zu identifizieren, die an β-TRP binden.
  • Sobald die Tertiärstruktur eines interessierenden Proteins erzeugt worden ist, können durch das Computersystem potenzielle Modulatoren identifiziert werden. Dreidimensionale Strukturen für potenzielle Modulatoren werden durch Eingeben chemischer Formeln von Verbindungen erzeugt. Die dreidimensionale Struktur des potenziellen Modulators wird dann mit der von β-TRP verglichen, um Bindungsstellen von β-TRP zu identifizieren. Bindungsaffinität zwischen dem Protein und den Modulatoren wird unter Verwendung von Energietermen bestimmt, um zu bestimmen, welche Liganden eine erhöhte Wahrscheinlichkeit aufweisen, an das Protein zu binden.
  • V. Verabreichung und Arzneimittel (lediglich zur Information)
  • Modulatoren von β-TRP (z.B. Antagonisten oder Agonisten) können der Säugetierperson zur Modulation der β-TRP-Aktivität in vivo direkt verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt auf einem der Wege, die normalerweise zum Einbringen einer Modulatorverbindung in elementaren Kontakt mit dem zu behandelnden Gewebe verwendet werden, und ist dem Fachmann bekannt. Obwohl mehr als ein Weg angewendet werden kann, um eine bestimmte Zusammensetzung zu verabreichen, kann ein bestimmter Weg häufig eine sofortigere und wirksamere Reaktion als ein anderer Weg hervorrufen.
  • Pharmazeutisch verträgliche Träger werden teilweise durch die bestimmte Zusammensetzung, die verabreicht wird, sowie durch das bestimmte Verfahren, das angewendet wird, um die Zu sammensetzung zu verabreichen, bestimmt (siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Aufl. 1985)).
  • Die Modulatoren (z.B. Agonisten oder Antagonisten) der Expression oder Aktivität von β-TRP können alleine oder in Kombination mit anderen geeigneten Komponenten zur Injektion oder zur Verwendung in einer Pumpenvorrichtung hergestellt werden. Die Pumpenvorrichtungen (auch bekannt als „Insulinpumpen"), werden üblicherweise verwendet, um den Patienten Insulin zu verabreichen, und können deshalb leicht so angepasst werden, dass sie Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten. Hersteller von Insulinpumpen schließen Animas, Disetronic und MiniMed ein.
  • Die Modulatoren (z.B. Agonisten oder Antagonisten) der Expression oder Aktivität von β-TRP können alleine oder in Kombination mit anderen geeigneten Komponenten zu Aerosolformulierungen (d.h., sie können „zerstäubt" werden) hergestellt werden, um über Inhalation verabreicht zu werden. Aerosolformulierungen können in unter Druck gesetzte verträgliche Treibmittel, wie Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und dergleichen, eingebracht werden.
  • Zur Verabreichung geeignete Formulierungen schließen wässrige und nichtwässrige Lösungen, isotonische sterile Lösungen, welche Antioxidationsmittel, Puffer, Bakteriostate und gelöste, die Formulierung isotonisch machende Stoffe enthalten können, sowie wässrige und nichtwässrige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel, Lösungsvermittler, Verdickungsmittel, Stabilisierungsmittel und Konservierungsmittel enthalten können, ein. Zusammensetzungen können zum Beispiel oral, nasal, topisch, intravenös, intraperitoneal oder intrathekal verabreicht werden. Die Formulierungen von Verbindungen können in Einheitsdosis- oder Mehrfachdosis-Siegelbehältern, wie Ampullen und Fläschchen, dargestellt werden. Lösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der vorher beschriebenen Art hergestellt werden. Die Modulatoren können auch als Teil einer hergestellten Nahrung oder eines Arzneistoffes verabreicht werden.
  • Die einem Patienten verabreichte Dosis sollte ausreichend sein, um im Laufe der Zeit eine vorteilhafte Reaktion bei der Person zu induzieren. Die optimale Dosismenge für jeden Patienten hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, die die Wirksamkeit des verwendeten spezifischen Modulators, das Alter, das Körpergewicht, die körperliche Aktivität und die Ernährungsweise des Patienten einschließen, von einer möglichen Kombination mit anderen Arzneistoffen und von der Schwere des Falles von Diabetes. Es wird empfohlen, dass die tägliche Dosierung des Modulators für jeden einzelnen Patienten durch den Fachmann auf eine ähnliche Art und Weise wie für bekannte Insulinzusammensetzungen bestimmt wird. Die Größe der Dosis wird auch durch das Bestehen, die Natur und den Umfang von irgendwelchen Nebenwirkungen bestimmt, die die Verabreichung einer bestimmten Verbindung oder eines bestimmten Vektors in einer bestimmten Person begleiten.
  • Beim Bestimmen der wirksamen Menge des zu verabreichenden Modulators kann der Arzt zirkulierende Plasmaspiegel des Modulators, die Modulatortoxizität und die Produktion von Anti-Modulatorantikörpern bewerten. Im Allgemeinen beträgt das Dosisäquivalent eines Modulators etwa 1 ng/kg bis 10 mg/kg für eine typische Person.
  • Zur Verabreichung können β-TRP-Modulatoren gemäß der vorliegenden Erfindung mit einer Rate verabreicht werden, die durch den LD-50-Wert des Modulators und die Nebenwirkungen des Modulators bei verschiedenen Konzentrationen bestimmt wird, wenn diese auf die Masse und Gesamtgesundheit der Person angewendet werden. Die Verabreichung kann über Einzel- oder geteilte Dosen erreicht werden.
  • Die Verbindungen, die durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert werden, können auch in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen Wirkstoffen in Abhängigkeit von der gewünschten Zieltherapie wirksam verwendet werden (siehe z.B. Turner, N. et al., Prog. Drug Res., (1998) 51: 33-94; Haffner, S., Diabetes Care, (1998) 21: 160-178; und DeFronzo, R. et al. (Hrsg.), Diabetes Reviews (1997) Bd. 5, Nr. 4). In mehreren Studien wurde der Nutzen der Kombinationstherapien mit oralen Mitteln untersucht (siehe z.B. Mahler, R., J. Clin. Endocrinol. Metab. (1999) 84:1165-71; United Kingdom Prospective Diabetes Study Group: UKPDS 28, Diabetes Care (1990) 21: 87-92; Bardin, C.W., (Hrsg.), Current Therapy In Endocrinology And Metabolism, 6. Aufl. (Mosby – Year Book, Inc., St. Louis, MO. 1997); Chiasson, J. et al., Ann. Intern. Med. (1994) 121: 928-935; Coniff, R. et al., Clin. Ther. (1997) 19: 16-26; Coniff, R. et al., Am. J. Med. (1995) 98: 443-451; und Iwamoto, Y. et al., Diabet. Med. (1996) 13:365-370; Kwiterovich, P., Am. J. Cardiol. (1998) 82(12A):3U-17U). Diese Studien zeigen an, dass die Modulation von Diabetes unter anderen Krankheiten durch die Zugabe eines zweiten Mittels zum Therapieregime weiter verbessert werden kann. Die Kombinationstherapie schließt die Verabreichung einer einzelnen pharmazeutischen Dosierungsformulierung, die einen β-TRP-Modulator gemäß der Erfindung und einen oder mehrere zusätzliche Wirkstoffe enthält, sowie die Verabreichung eines β-TRP-Modulators und jedes Wirkstoffes in seiner eigenen getrennten pharmazeutischen Dosierungsformulierung ein. Zum Beispiel können der menschlichen Person ein β-TRP-Modulator und ein Thiazolidindion zusammen in einer einzelnen oralen Dosierungszusammensetzung, wie einer Tablette oder Kapsel, verabreicht werden, oder jedes Mittel kann in getrennten oralen Dosierungsformulierungen verabreicht werden. Wenn getrennte Dosierungsformulierungen verwendet werden, können ein β-TRP-Modulator und ein oder mehrere zusätzliche Wirkstoffe im Wesentlichen zur gleichen Zeit (d.h. gleichzeitig) oder zu getrennten versetzten Zeitpunkten (d.h. nacheinander) verabreicht werden. Es ist selbstverständlich, dass die Kombinationstherapie alle diese Regime einschließt.
  • Ein Beispiel der Kombinationstherapie kann beim Modulieren von Diabetes (oder Behandeln von Diabetes und seinen verwandten Symptomen, Komplikationen und Störungen) gesehen werden, wobei die β-TRP-Modulatoren zum Beispiel in Kombination mit Sulfonylharnstoffen (wie Chlorpropamid, Tolbutamid, Acetohexamid, Tolazamid, Glyburid, Gliclazid, Glynase, Glimepirid und Glipizid); Biguaniden (wie Metformin); einem PPARβδ-Agonisten; einem Liganden oder Agonisten von PPARγ, wie Thiazolidindionen (wie Ciglitazon, Pioglitazon (siehe z.B. US-Patent Nr. 6,218,409 ), Troglitazon und Rosiglitazon (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,859,037 )); PPARα-Agonisten, wie Clofibrat, Gemfibrozil, Fenofibrat, Ciprofibrat und Bezafibrat; Dehydroepiandrosteron (auch als DHEA bezeichnet, oder dessen konjugiertem Sulfatester, DHEA-SO4); Antiglukokortikoiden; TNFα-Inhibitoren; α-Glukosidase-Inhibitoren (wie Acarbose, Miglitol und Voglibose); Amylin und Amylinderivaten (wie Pramlintid, (siehe auch US-Patente Nr. 5,902,726 ; 5,124,314 ; 5,175,145 und 6,143,718 .)); Insulinsekretagogen (wie Repaglinid, Gliquidon und Nateglinid (siehe auch US-Patente Nr. 6,251,856 ; 6,251,865 ; 6,221,633 ; 6,174,866 )) und Insulin wirksam verwendet werden.
  • VI. Verfahren zum Identifizieren von Modulatoren von Polypeptiden, die β-TRP regulieren
  • Wie in 3 veranschaulicht, kann die Aktivierung von β-TRP durch Detektieren von Änderungen des Membranpotenzials leicht gemessen werden. Membranpotenzialabhängige Fluoreszenzfarbstoffe liefern ein signifikantes Signal, das unter Verwendung von Vorrichtungen gemessen werden kann, die bei Screeningassays mit hohen Durchsatz nützlich sind. Nach Kenntnis der Erfinder ist kein Kanal in der TRP-Familie beschrieben worden, der ein derartig klares, leicht messbares Membranpotenzial-/Zelldepolarisierungssignal bei Aktivierung liefert. Außerdem ist es nicht vorhersagbar, dass ein Calciumkanal eine derartig große Änderung des Membranpotenzials vermitteln würde, so dass es bei anderen Assays als dem Patch-Clamp-Verfahren leicht gemessen werden kann. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Identifizieren von Modulatoren von Polypeptiden, die β-TRP durch Identifizieren von Mitteln regulieren, die eine Änderung des Membranpotenzials von Zellen induzieren, die β-TRP exprimieren.
  • Bei einigen Ausführungsformen umfassen die Verfahren das in-Kontakt-Bringen eines Mittels mit einer Zelle, bei der die Zelle β-TRP und einen stromaufwärts gelegenen Regulator von β-TRP exprimiert; und das Detektieren einer Änderung des Membranpotenzials der Zelle, wobei eine Änderung des Membranpotenzials der Zelle in Gegenwart des Mittels im Vergleich zum Fehlen des Mittels anzeigt, dass das Mittel die Aktivität des Regulators moduliert. Beispiel-Regulatoren von β-TRP schließen z.B. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) und G-Proteine ein. Beispielsweise wird der GPCR bei einigen Ausführungsformen ausgewählt aus den Gq-, Gi- und Gs-Rezeptoren. Beispiel-Gq-Rezeptoren enthalten z.B. einen Muscarin- oder PT2Y-Rezeptor. Bei den Ausführungsformen, bei denen die Gi-Rezeptoren involviert sind, wird auch ein promiskuoses G-Protein, wie Gqi5, Galpha16, Gqs5, Gqo5, in der Zelle exprimiert, so dass die Signalisierung zwischen dem GPCR und β-TRP vermittelt wird.
  • Die Verfahren gemäß der Erfindung können das Detektieren von Änderungen des Membranpotenzials unter Verwendung einer Vorrichtung umfassen, die zum Screenen mit hohem Durchsatz ausreicht. Zum Beispiel können Änderungen des Membranpotenzials auf zellbasierten Assays in Gegenwart von Farbstoffen detektiert werden, die fluoreszierend auf Membranpotenzialänderungen reagieren. Wegen der signifikanten Änderung des Membranpotenzials, das durch Aktivierung von β-TRP induziert wird, können Vorrichtungen zum Messen der Fluoreszenz, wie FLEXstation® und FLIPR®systems (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) verwendet werden, um die β-TRP-Aktivierung zu messen. Diese Vorrichtungen sind im Gegensatz zu Patch-Clamp-Verfahren nützliche Vorrichtungen zum Screenen mit hohem Durchsatz. Folglich kann eine signifikante Anzahl (z.B. mindestens 96, 384, 500 oder 1000 oder mehr) potenzieller Modulatoren (z.B. in einer kombinatorischen Bibliothek) auf eine Wirkung auf einen Regulator von β-TRP an einem einzigen Tag von einer Person analysiert werden. Folglich können, wie hier beschrieben, große kombinatorische Bibliotheken von Verbindungen gescreent werden, um kleine Moleküle zu identifizieren, die die Regulatoraktivität modulieren.
  • Bei einigen Ausführungsformen werden das Regulatorpolypeptid und/oder das β-TRP-Polypeptid in einer Zelle rekombinant exprimiert. Beispiel-Zellen zur rekombinanten Expression schließen z.B. Säugetierzellen (z.B. HEK293, CHO, Cos7), Insektenzellen (z.B. sf21), Bakterienzellen (z.B. E. Coli) oder Hefe (z.B. Pichia oder S. cervisiae) ein.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Dieses Beispiel zeigt, dass β-TRP in den Inselzellen des Pankreas exprimiert wird, und zeigt, dass das Einbringen von β-TRP in Inselzellen von diabetischen Tieren die Glukose-stimulierte Insulinsekretion verbessert.
  • Custom AffymetrixTM-Oligonukleotidarrays wurden verwendet, um Inselzellen-Genexpression aufzunehmen. Der Microarray-Sondensatz MBXRATISL12881 wurde durch die Affymetrix GeneChipTMAnalysesoftware in 5 unabhängigen Ratteninselzellen-mRNA-Proben „vorliegend" und in 10 anderen untersuchten Geweben abwesend genannt. Der Maussondensatz MBXMUSISL22609 zeigte ebenfalls ein hohes Maß an Anreicherung an Inselzellen und in den mRNA-Proben der gezüchteten Betazelllinie (betaHC9) im Verhältnis zu denen anderer Gewebe (1B). Mehrfache Klone für die entsprechenden cDNAs wurden in Inselzellbibliotheken von Mensch, Ratte und Maus gefunden, und deren Sequenzierung ließ erkennen, dass das kodierte Protein ein vorausgesagter TRP-Kanal war, welchen wir β-TRP nannten. Das menschliche Gen für β-TRP war als Teil einer Untersuchung des Locus' des Beckwith-Wiedemann-Syndroms sequenziert worden und war MTR1 genannt worden. Siehe PCT-Anmeldung WO0132693 . Im Gegensatz zu den Aussagen in der PCT-Anwendung WO0132693 sind β-TRP-ESTs in Inselzellbibliotheken von Mensch, Ratte und Maus gut dargestellt. Oligonukleotid-Arraydaten bestätigten, dass Inselzellen des Pankreas für β-TRP hochangereichert sind. In situ-Hybridisierung wurde angewendet, um zu bestimmen, dass β-TRP-mRNA in der Mehrheit der Kernzellen von Inselzellen der Ratte reichlich vorhanden ist, was anzeigt, dass viele, wenn nicht die meisten β-Zellen β-TRP exprimieren.
  • Bei der Aufgabe, Gene zu identifizieren, die zur geeigneten Regulation der Insulinsekretion funktionell wichtig sind und die im Diabeteszustand verändert sind, verwendeten wir ein Rattemodell vom Typ II-Diabetes. Die übliche Arrayhybridisierung von Inselzellen der Ratte für die mRNA, die β-TRP (Sondensatz MBXRATISL12881) entspricht, ist bei Inselzellen von diabetischen (9 Wochen alten ZDF-) Ratten im Verhältnis zu nichtdiabetischen (9 Wochen alten ZLC-) Kontrolltieren (1B) 2,4fach verringert. Die β-TRP-Expression wurde im Wesentlichen durch begleitende Behandlung mit Troglitazon (1B) wiederhergestellt. Ein ähnliches Ergebnis wurde bei weiblichen ZDF-Ratten beobachtet, denen eine Hochfettdiät zugeführt wurde. β-TRP-mRNA ist bei männlichen ZDF-Ratten im Alter von 9 Wochen im Verhältnis zu mageren Kontrollratten (Daten nicht gezeigt) auch mehr als 2-fach verringert.
  • Die Inselzellen von diesen diabetischen Tieren sind bei der Glukose-stimulierten Insulinsekretion (GSIS) im Verhältnis zu den Inselzellen der Kontrolltiere mangelhaft. Jedoch stellte die Adenovirusexpression von β-TRP in den ZDF-Inselzellen ihr Reaktionsvermögen auf Glukose bei einem statischen Insulinsekretionsassay oder bei einem Inselzellperfusionsexperiment (2) wieder her. Die Expression von β-TRP erhöhte die basale Insulinsekretion nicht und hatte wenig Wirkung auf die Inselzellen von nichtdiabetischen Tieren. Diese Daten zeigen an, dass der β-TRP-Mangel, der bei ZDF-Inselzellen festgestellt wurde, mit der Abnahme der GSIS in diesen Inselzellen funktionell verbunden ist.
  • Beispiel 2
  • Dieses Beispiel zeigt Verfahren zum Screenen von Modulatoren von β-TRP mit hohem Durchsatz.
  • Aktivierung (Öffnung) des β-Zellkationenkanals des Pankreas, β-TRP, stellt einen neuen Mechanismus zur Erhöhung der Glukose-stimulierten Insulinsekretion bei Einzelpersonen mit Typ II-Diabetes dar. Typ II-Diabetes ergibt sich, wenn β-Zellen des Pankreas nicht in der Lage sind, den erhöhten Insulinbedarf zu kompensieren, der durch periphere Insulinresistenz verursacht wird. Therapeutische Mittel, wie Sulphonylharnstoffe und Meglitinide, fördern die Insulinsekretion über denselben molekularen Mechanismus (KATP-Kanalschließen) wie der Hauptweg, durch welchen Glukose die Insulinsekretion reguliert. Obwohl diese Mittel häufig verwendet werden, können sie dadurch weniger als ideal sein, dass sie ein tatsächliches Potenzial aufweisen, Hypoglykämie zu verursachen, und auch wesentliche Raten des Primär- und Sekundärversagens aufweisen. Die Aktivierung eines Mechanismus' in der β-Zelle, die die Insulinsekretion nicht selbst auslöst, aber den Ca++-Einstrom nach Glukose-abhängigem KATP-Kanalschließen potenziert, kann die Insulinsekretion auf eine physiologisch geeignetere Art und Weise erhöhen. Der β-TRP-Kationenkanal stellt eine Komponente eines derartigen Potenziatormechanismus zur Erhöhung des Ca++-Einstroms und der Insulinsekretion dar. Diese Art der therapeutischen Annäherung bietet auch eine neue Therapie für Diabetespatienten, bei denen Sulphonylharnstoffe/Meglitinide versagen.
  • Die TRP-Familie (von welcher β-TRP ein Mitglied ist) schließt eine mannigfaltige Gruppe von Proteinen ein, die eine gemeinsame Kerndomäne teilen, die dem kanalbildenden Kern von Drosophila-TRP (transientes Rezeptorpotenzial (Transient Receptor Potential), einem lichtaktivierten Ca2+-selektiven Kanal des Fliegensehsystems, ähnlich ist. TRP-Kanäle vermitteln den Einstrom von Ca2+ und/oder anderen Kationen, wenn die Ca2+-Speicher des endoplasmatischen Retikulums (ER) verbraucht sind oder wenn Rezeptoren mit Gq gekoppelt sind und Phospholipase-β (PLC) aktiviert wird. Wir haben gezeigt, dass β-TRP den Ca2+-Einstrom als Reaktion auf die PLC-Aktivierung und die Entleerung der Ca2+-Speicher des ER erleichtert, wenn es in HEK293- und COS-1-Zellen exprimiert wird.
  • Die Aktivierung (Öffnung) von β-TRP (TRPM5) führt zu einem robusten Ca2+-Einstrom und zu einer Membrandepolarisation, was mit spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen für Ca2+ und über das Membranpotenzial (MP) indirekt detektiert werden kann. 3 zeigt repräsentative Aufnahmen von [Ca2+]i und MP-Reaktionen auf ATP in Kontroll- und β-TRP-OHO-Zellen. Die MP-Antwort auf ATP liegt nur in β-TRP-Zellen vor. Als eine Option zum Durchführen von Screeningversuchen auf β-TRP-Modulatoren mit hohem Durchsatz werden CHO-K1-basierte β-TRP-stabile Zelllinien unter Anwendung des FLIPR®-Membranpotenzialassays von Molecular Devices (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) mit kleinen Änderungen verwendet, um auf Kleinmolekülmodulatoren zu screenen.
  • Das Ziel des Screenens besteht darin, spezifische und Direktoraktivatoren (Öffner) eines β-TRP-Kanals zu finden. Die Aktivierung des Kanals ist idealerweise vollständig und in der Lage, einen Anstieg von [Ca2+]i und eine Plasmamembrandepolarisation seiner Wirtszellen auszulösen.
  • Das folgende Protokoll ist zum Messen des Membranpotenzials (MP) im Format von 96 Vertiefungen unter Verwendung von Membranpotenzialfarbstoff von Molecular Devices (Kat.# R-8034) an einer FLEXStation (Molecular Devices) optimiert. Es wird erwartet, dass es auf ein Assayformat von 384 Vertiefungen mit dem FLIPR384-System anwendbar und anpassungsfähig ist.
  • Eine CHO-K1-basierte stabile Zelllinie, die β-TRP exprimiert (hier bezeichnet als „Linie A2-18") wird zum β-TRP-Screenen mit hohem Durchsatz gemäß dem folgenden Protokoll verwendet:
    • 1. Aussäen einer A2-18-β-TRP-CHO-Zell- und der Kontrolllinie (A1-5) auf Platten mit 96 Vertiefungen.
    • 2. Wachsenlassen der Zellen 24–48 h lang in DMEM-Medium zu 85–95% Konfluenz.
    • 3. Herstellen der folgenden Reagenzien unmittelbar vor dem Assay: i. Assaypuffer: Verdünnen von Komponente B des FLIPR®-Assaykits und Einstellen des pH-Werts auf 7,4 mit 1 N NaOH. Es war kein Probenecid erforderlich. ii. MP-Farbstoff: Suspendieren eines Fläschchens von Komponente A des FLIPR®-Assaykits mit 10 ml des Assaypuffers. iii. Verbindungslösungen: Verdünnen von DMSO-Stammlösungen der Testverbindungen auf eine 5× Lösung mit dem Assaypuffer. Anheben der Ca2+-Konzentration in den Verbindungslösungen auf 12,5 mM mit 1 M CaCl2.
    • 4. Sorgfältiges Entfernen des Kulturmediums aus allen Vertiefungen.
    • 5. Zufügen von 50 μl Assaypuffer und 50 μl MP-Farbstoff.
    • 6. Inkubieren der Platten bei 37°C 30–60 Minuten lang.
    • 7. Einstellen der FLEXStation auf MP-Assaymodus und auf 37°C.
    • 8. Überführen der Zellenplatte und Verbindungsplatte auf FLEXStation.
    • 9. Aufzeichnen einer Grundlinie 18 Sekunden lang (Ex 530, Em560).
    • 10. Zufügen der 5× Verbindungslösungen zu den Zellen und Lesen weitere 100 Sekunden lang.
    • 11. Sichern und Analysieren der Daten.
  • Reagenzliste
    • 1. Assaypuffer: Hank's Balanced Salt Solution (Hanks ausgeglichene Salzlösung) (HBSS) mit 20 mM Hepes, pH 7,4
    • 2. MP-Farbstoff: Molecular Devices Corporation, Kat.#8034 (für FLIPR)
    • 3. Positivkontrollprobe: ATP 10–100 μM (ein purinerger Rezeptoragonist) Calcimycin (A23187) 5–10 μM (ein Calciumionophor)
    • 4. Antagonistenkontrollprobe: i. 2-APB 75 μM (von Tocris, TRP-Kanal und IP3-Rezeptorblocker); ii. U73122 10 μM (von SigmaChemicals, PLC-Inhibitor).
  • Andere experimentelle Bedingungen
    • 1. Die Zellen: iii. Haltung: DMEM mit 10% FCS und 200 μg/ml G418; passagiert 1–2 Mal/Woche mit Trypsin-EDTA. iv. Konfluenz: 85–95% zum Zeitpunkt des Assays. v. Ausplattieren: reguläre oder vorbeschichtete Platten; 24–48 h vor dem Assay. vi. Passage: bis zur zehnten Passage.
    • 2. Ca2+-Konzentration im Assaysystem: Der relative niedrige Ca2+-Gehalt (1,26 mM) in den Originalassaysystemen von Molecular Devices kann den Einstrom von extrazellulärem Ca2+ durch einen TRP-Kanal und die damit einher gehende Depolarisation, wie durch den Mangel an Aktivität von Maitotoxin (MTX) in β-TRP-CHO-Zellen nahegelegt, beschränken. MTX ist ein Meerespolyethertoxin, das bekannt ist, eine direkte Aktivierung von nichtselektiven Kationenkanälen (einschließlich β-TRP) darzustellen. Das Ansteigen der Ca2+-Konzentration auf 2,5–5 mM im Assaysystem erhöhte die Eignung für das MP und die Calciumassaykits signifikant, um die Zunahme der [Ca2+]i oder des MP, das durch MTX induziert wird, zu ermitteln (4).
  • Beispiel 3
  • Dieses Beispiel zeigt die Lösungsmitteldosisreaktionen und Reaktionen auf andere Kanalmodulatoren dar.
  • Wirkung von DMSO
  • Beim FLEXStation-Assay neigten die CHO-β-TRP-Zellen bei Zugabe der Testverbindung (25 μl der Verbindungslösung wurden zu jeder Vertiefung zugefügt, welche 100 μl des verdünnten Farbstoffs enthielt) dazu, in geringem Umfange Intensität des Fluoreszenzsignals zu verlieren. Das Abfallen des RFU-Signals war zwischen dem Assaypuffer und der niedrigen Konzentration von DMSO (< 0,5%) nicht wahrnehmbar, wurde aber durch 2,5% DMSO erheblich überhöht ( 5). Auf der anderen Seite beobachteten wir keine nichtspezifischen Depolarisationsreaktionen auf DMSO.
  • Beispiel 4
  • Dieses Beispiel liefert die Positivkontrollproben, die in den Assays gemäß der Erfindung nützlich sind.
  • Wirkungen anderer Kanalmodulatoren auf das MP der β-TRP-CHO-Zellen
  • Um die Spezifität der Depolarisationsreaktionen auf ATP in den β-TRP-CHO-Zellen zu testen, testeten wir die Wirkungen von 80 Verbindungen von dem Sigma-RBI-Ionenkanalmodulatorenliganden-Satz (Sigma #L6912) sowohl bei der Kontroll- (A1-5) als auch einer β-TRP-CHO-Zelllinie (A2-18). Der Sigma Ligand-Satz besteht aus Modulatoren von mehreren Mitgliedern der K+-, Na+-, Ca2+- und Cl–-Kanäle, sowie aus mehreren kanalbildenden Aminosäuretransportern. Unter den 80 Verbindungen induzierte nur A23187 (Calcimycin) eine β-TRP-Zellen-spezifische Depolarisation, die der von ATP ähnlich ist. Calcimycin ist ein Ca2+-Ionophor, von dem bekannt ist, das er in der Lage ist, intrazelluläre Ca2+-Speicher zu leeren. Außerdem löst auch das Klasse III-Antiarrythmikum Clofilium Depolarisation sowohl in Kontroll- als auch β-TRP-Zellen aus. Der Mechanismus von Clofilium ist nicht bekannt.
  • Aktivatorkontrolle für einen TRP-Kanal
  • ATP- und Calcimycin induzierten dosisabhängig Depolarisation in β-TRP-CHO-Zellen, aber nicht in Kontrollzellen, wie erwartet (6). Der geschätzte EC50 von ATP und Calcimycin beträgt 11 bzw. 0,8 μM. ATP aktiviert TRP-Kanäle durch Erzeugen von IP3 durch den Gq-gekoppelten P2Y-Rezeptor, wohingegen Calcimycin durch eine direkte Entleerung von intrazellulären Ca2+-Speichern wirkt.
  • Beispiel 5
  • Dieses Beispiel liefert die Negativ-(Antagonisten-)Kontrollproben, die in den Assays gemäß der Erfindung nützlich sind.
  • Die MP-Reaktionen auf ATP und Calcimycin wurden durch 2-APB über 50% unterdrückt, wenn es zu den Zellen zum selben Zeitpunkt wie die beiden Stimuli zugefügt wurde. Es ist bekannt, dass 2-APB den IP3-Rezeptor am ER (Ligand-gesteuerter Ca2+-Kanal) und TRP-Kanäle in der Plasmamembran blockiert. Die Wirkung von ATP auf MP in den β-TRP-CHO-Zellen wurde auch durch eine 30 Minuten lange Vorinkubation der Zellen mit dem PLC-Inhibitor U73122 gehemmt (6).
  • Es ist selbstverständlich, dass die hier beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen nur zu veranschaulichenden Zwecken da sind und dass dem Fachmann verschiedene Abwandlungen oder Änderungen in deren Lichte nahegelegt sind und in den Schutzbereich der angefügten Patentansprüche eingeschlossen sind.
  • Sequenzverzeichnis
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  • Sequenzverzeichnis
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Claims (13)

  1. In vitro-Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, das die Glukose-stimulierte Insulinproduktion in einem Tier induziert, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (i) In-Kontakt-Bringen eines Mittels mit einem funktionellen Kationenkanal-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 80% mit SEQ ID Nr. 2 identisch ist, wobei das Polypeptid in einer Zelle exprimiert wird und der Schritt des In-Kontakt-Bringens das In-Kontakt-Bringen des Mittels mit der Zelle umfasst, (ii) Auswählen eines Mittels, das eine differenzielle Änderung des elektrischen Potentials der Plasmamembran der Zelle induziert, und (iii) Bestimmen, ob das Mittel, das in Schritt (ii) ausgewählt wird, die Glukose-stimulierte Insulinsekretion erhöht, wodurch ein Mittel identifiziert wird, das die Glukose-stimulierte Insulinproduktion in einem Tier induziert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die SEQ ID Nr. 2 umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Mittel ausgewählt wird, das die Polypeptidaktivität erhöht, und die Aktivität des Polypeptids durch einen Schritt bestimmt wird, der das Messen der Änderung des Calciumflusses in der Zelle umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Membranpotential der Zelle durch Detektieren einer Änderung der Fluoreszenz eines Farbstoffs ermittelt wird, dessen Fluoreszenz von der Zelldepolarisierung abhängig ist, und wobei die Änderung der Fluoreszenz mit einer Vorrichtung detektiert wird, die für das Screenen mit hohem Durchsatz ausreicht.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle eine Pankreas-β-Zelle ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid in der Zelle rekombinant exprimiert wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 90% mit SEQ ID Nr. 2 identisch ist.
  8. Verfahren zum Exprimieren von β-TRP in einer Pankreas-Inselzelle, wobei das Verfahren das in vitro-Einbringen eines Polynukleotids, das ein funktionelles Kationenkanal-Polypeptid kodiert, das eine zu mindestens 80% mit SEQ ID Nr. 2 identische Aminosäuresequenz umfasst, in eine Inselzelle.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei es der Inselzelle an Glukose-stimulierter Insulinsekretion mangelt.
  10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Polypeptid zu mindestens 90% mit SEQ ID Nr. 2 identisch ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Polypeptid die SEQ ID Nr. 2 umfasst.
  12. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Polynukleotid die SEQ ID Nr. 1 umfasst.
  13. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Inselzelle eine β-Zelle ist.
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7364867B2 (en) * 2000-04-17 2008-04-29 The Mount Sinai School Of Medicine Method of identifying bitter compounds by employing TRP8, a transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells
CA2486712C (en) * 2002-05-21 2012-01-03 Cv Therapeutics, Inc. Method of treating diabetes
US8822473B2 (en) * 2002-05-21 2014-09-02 Gilead Sciences, Inc. Method of treating diabetes
GB0217503D0 (en) * 2002-07-29 2002-09-04 Novartis Ag Organic compounds
US20060177847A1 (en) * 2004-12-09 2006-08-10 Perlegen Sciences, Inc. Markers for metabolic syndrome obesity and insulin resistance
JP2009514535A (ja) * 2005-11-03 2009-04-09 レッドポイント バイオ コーポレイション Ｔｒｐｍ５イオンチャネルのためのハイスループットスクリーニングアッセイ
KR20080070848A (ko) * 2005-11-03 2008-07-31 레드포인트 바이오 코포레이션 히드라존 유도체 및 이의 용도
EP2021798B1 (de) * 2006-05-25 2013-04-24 The Queen's Medical Center Screening-verfahren für trpm4-modulatoren der insulinsekretion
AU2008214338A1 (en) * 2007-02-02 2008-08-14 Redpoint Bio Corporation Use of a TRPM5 inhibitor to regulate insulin and GLP-1 release
JP2010518171A (ja) * 2007-02-13 2010-05-27 ギリアード・パロ・アルト・インコーポレイテッド 非冠微小血管疾患の処置のためのラノラジンの使用
CA2678319A1 (en) * 2007-02-13 2008-08-21 Cv Therapeutics, Inc. Use of ranolazine for the treatment of coronary microvascular diseases
US20090111826A1 (en) * 2007-02-13 2009-04-30 Louis Lange Use of ranolazine for the treatment of cardiovascular diseases
CA2677931A1 (en) * 2007-02-13 2008-08-21 Cv Therapeutics, Inc. Use of ranolazine for the treatment of cardiovascular diseases
US20080233191A1 (en) * 2007-03-22 2008-09-25 Brent Blackburn Use of ranolazine for elevated brain-type natriuretic peptide
EA200971073A1 (ru) * 2007-05-31 2010-08-30 Джилид Пало Альто, Инк. Применение ранолазина при повышенном уровне натрийуретического пептида мозгового типа
JP2010539245A (ja) 2007-09-14 2010-12-16 日東電工株式会社 薬物担体
KR101035574B1 (ko) 2009-04-09 2011-05-23 대한민국 제 2형 당뇨병 치료효과를 판정하는 방법
WO2013022948A1 (en) 2011-08-08 2013-02-14 The Coca-Cola Company Cell lines comprising endogenous taste receptors and their uses

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932417A (en) * 1996-10-15 1999-08-03 The Regents Of The University Of California Method of screening compounds for controlling capacitative calcium ion entry into mammalian cells
US20020081658A1 (en) * 2000-07-31 2002-06-27 Curtis Rory A.J. 18610, a novel human transient receptor and uses thereof
DE19953167A1 (de) 1999-11-04 2001-07-26 Univ Mainz Johannes Gutenberg Mit TRP-Proteinen verwandtes Protein MTR1 und dieses codierende DNA-Sequenz
ATE397663T1 (de) * 2000-11-13 2008-06-15 Queens Medical Ct Humane ltrpc7 proteine, dafür kodierende nukleinsäuren und deren verwendungen
US20020164645A1 (en) * 2000-12-29 2002-11-07 The Regents Of The University Of California Assays for taste receptor cell specific ion channel
AU2004214977B2 (en) * 2003-02-21 2008-05-08 The Queen's Medical Center Methods of screening for TRPM5 modulators

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