DE60127418T2

DE60127418T2 - NUCLEOTIDE SEQUENCES ENCODING THE CCPA1 GEN

Info

Publication number: DE60127418T2
Application number: DE60127418T
Authority: DE
Inventors: Bettina Möckel; Caroline Kreutzer
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-08-26
Filing date: 2001-07-19
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2021-07-20
Also published as: DE10110052A1; DE60127418D1

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin durch Ausschalten des ccpA1-Gens. Das ccpA1-Gen kodiert für das CcpA1-Protein, welches ein Katabolit-Kontroll-Protein A ist.object The invention relates to a process for the fermentative production of L-lysine by switching off the ccpA1 gene. The ccpA1 gene encodes for the CcpA1 protein, which is a catabolite control protein A.

Stand der TechnikState of technology

L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.L-amino acids, in particular L-lysine, found in human medicine and pharmaceutical Industry, in the food industry and especially in the food industry animal nutrition Application.

Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der grossen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Massnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.It is known to be amino acids by fermentation of stems coryneform bacteria, in particular Corynebacterium glutamicum, getting produced. Because of the great importance is constantly on the improvement of the manufacturing process worked. process improvements can fermentation measures such as stirring and Supply of oxygen, or the composition of the nutrient media, such as the sugar concentration during fermentation, or the work-up to the product form by, for example, ion exchange chromatography or the intrinsic performance characteristics of the microorganism concern yourself.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die Aminosäuren produzieren.to Improve the performance characteristics of these microorganisms Methods of mutagenesis, selection and mutant selection applied. In this way receives man tribes, which is resistant to antimetabolite or auxotrophic for regulatory are significant metabolites and produce the amino acids.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L-Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt.since Several years ago, methods of recombinant DNA technology were also used for strain improvement of L-amino acid producing strains used by Corynebacterium.

In Journal of Bacteriology, 1997, Seite 6657-6664 wird ein Lactobacillus casei Katabolit-Regularprotein CcpA offenbart, das jedoch keine relevante Sequenzübereinstimmung mit SEQ ID NO: 2 der vorliegenden Beschreibung besitzt. Dieses Dokument gibt keinen Hinweis bezüglich des möglichen Einflusses eines CcpA-Proteins auf die Produktion von L-Lysin.In Journal of Bacteriology, 1997, page 6657-6664 becomes a Lactobacillus casei catabolite regular protein CcpA revealed, however, no relevant sequence match having SEQ ID NO: 2 of the present specification. This document There is no reference regarding of the possible Influence of a CcpA protein on the production of L-lysine.

Aufgabe der ErfindungTask of invention

Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Massnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Lysin bereitzustellen.The Inventors have set themselves the task of taking new measures to improve to provide fermentative production of L-lysine.

Beschreibung der Erfindungdescription the invention

Werden im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt, sind damit auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.Become in the following L-lysine or lysine mentioned, so are the salts such as For example, lysine monohydrochloride or lysine sulfate.

Gegenstand der Beschreibung ist ein isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das ccpA1-Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe

a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und
d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c),

wobei das Polypeptid die Aktivität des Katabolit-Kontroll-Proteins CcpA1 aufweist.The specification describes an isolated polynucleotide from coryneform bacteria containing a polynucleotide sequence encoding the ccpA1 gene selected from the group

a) polynucleotide that is at least 70% identical to a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO. 2 contains
b) polynucleotide which codes for a polypeptide which contains an amino acid sequence which is at least 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO. 2,
c) polynucleotide which is complementary to the polynucleotides of a) or b), and
d) polynucleotide containing at least 15 consecutive nucleotides of the polynucleotide sequence of a), b) or c),

wherein the polypeptide has the activity of the catabolite control protein CcpA1.

Gegenstand der Beschreibung ist ebenfalls das oben genannte Polynukleotid, wobei es sich bevorzugt um eine replizierbare DNA handelt, enthaltend:

(i) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1 oder
(ii) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
(iii) mindestens eine Sequenz, die mit den zu den Sequenzen (i) oder (ii) komplementären Sequenzen hybridisiert, und gegebenenfalls (iv) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i).

The description also relates to the abovementioned polynucleotide, which is preferably a replicable DNA comprising:

(i) the nucleotide sequence shown in SEQ ID no. 1 or
(ii) at least one sequence corresponding to the sequence (i) within the range of the degeneracy of the genetic code, or
(iii) at least one sequence which hybridizes with the sequences complementary to sequences (i) or (ii) bridged, and optionally (iv) functionally neutral sense mutations in (i).

Weitere Gegenstände der Beschreibung sind:
eine replizierbare DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt; ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID No. 2 dargestellt enthält;
Gegenstand der Erfindung sind
ein Vektor, enthaltend Teile des Polynukleotids gemäss der Beschreibung, mindestens aber 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der beanspruchten Sequenz;
und coryneforme Bakterien, in denen das ccpA1-Gen, insbesondere durch eine Insertion oder Deletion, ausgeschaltet ist.Other items of the description are:
a replicable DNA containing the nucleotide sequence as in SEQ ID no. 1 shown; a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence as set forth in SEQ. ID. 2 shown;
Subject of the invention are
a vector containing parts of the polynucleotide according to the description, but at least 15 consecutive nucleotides of the claimed sequence;
and coryneform bacteria in which the ccpA1 gene is eliminated, in particular by an insertion or deletion.

Gegenstand der Beschreibung sind ebenso Polynukleotide, die im wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank eines coryneformen Bakteriums, die das vollständige Gen oder Teile davon enthält, mit einer Sonde, die die Sequenz des erfindungsgemässen Polynukleotids gemäss SEQ ID No. 1 oder ein Fragment davon enthält, und Isolierung der genannten Polynukleotidsequenz.object The description also includes polynucleotides that are essentially consist of a polynucleotide sequence obtainable by screening by hybridization of a corresponding gene bank of a coryneform Bacteria that complete Contains gene or parts thereof, with a probe containing the sequence of the polynucleotide according to the invention according to SEQ ID no. 1 or a fragment thereof, and isolation of said Polynucleotide sequence.

Polynukleotidsequenzen gemäss der Beschreibung sind als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide oder Gene in voller Länge zu isolieren, die für das CcpA1-Protein kodieren oder um solche Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz des ccpA1-Gens aufweisen.polynucleotide sequences according to are described as hybridization probes for RNA, cDNA and DNA suitable for nucleic acids or to isolate polynucleotides or full-length genes that for the Encode CcpA1 protein or to such nucleic acids or polynucleotides or genes that isolate a gene high similarity with the sequence of the ccpA1 gene exhibit.

Polynukleotidsequenzen gemäss der Beschreibung sind weiterhin als Primer geeignet, mit deren Hilfe mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen hergestellt werden kann, die für das CcpA1-Protein kodieren.polynucleotide sequences according to The description is still suitable as a primer, with the help of the polymerase chain reaction (PCR) DNA can be produced by genes can that for encode the CcpA1 protein.

Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide enthalten mindestens 30, bevorzugt mindestens 20, ganz besonders bevorzugt mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 40 oder 50 Nukleotiden.Such oligonucleotides serving as probes or primers contain at least 30, preferably at least 20, most preferably at least 15 consecutive nucleotides. Also suitable are oligonucleotides with a length of at least 40 or 50 nucleotides.

"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld herausgetrennt."Isolated" means from his natural Separated environment.

"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA handeln kann."Polynucleotide" refers to general to polyribonucleotides and polydeoxyribonucleotides, which is unmodified RNA or DNA or modified RNA or DNA can act.

Die Polynukleotide gemäss Beschreibung schliessen ein Polynukleotid gemäss SEQ ID No. 1 oder ein daraus hergestelltes Fragment und auch solche ein, die zu wenigstens 70%, bevorzugt zu wenigstens 80% und besonders zu wenigstens 90% bis 95% identisch sind mit dem Polynukleotid gemäss SEQ ID No. 1 oder einem daraus hergestellten Fragment.The Polynucleotides according to Description include a polynucleotide according to SEQ ID no. 1 or one of them produced fragment and also those which are at least 70%, preferably at least 80% and especially at least 90% until 95% identical to the polynucleotide according to SEQ ID no. 1 or one fragment made therefrom.

Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren enthalten.By "polypeptides" is meant peptides or proteins that have two or more linked via peptide bonds amino acids contain.

Die Polypeptide gemäss Beschreibung schliessen ein Polypeptid gemäss SEQ ID No. 2, insbesondere solche mit der biologischen Aktivität des CcpA1-Proteins, und auch solche ein, die zu wenigstens 70%, bevorzugt zu wenigstens 80% und besonders zu wenigstens 90% bis 95% identisch sind mit dem Polypeptid gemäss SEQ ID No. 2 und die genannte Aktivität aufweisen.The Polypeptides according to Description include a polypeptide according to SEQ ID no. 2, especially those with biological activity of the CcpA1 protein, and also those which are at least 70%, preferably at least 80% and especially at least 90% until 95% identical to the polypeptide according to SEQ ID no. 2 and the named activity exhibit.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits L-Lysin produzieren und in denen die für das ccpA1-Gen kodierenden Nukleotidsequenzen ausgeschaltet sind.The The invention further relates to a process for fermentative production of L-lysine using coryneform bacteria, in particular already L-lysine produce and in which the for the ccpA1 gene encoding nucleotide sequences are turned off.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Massnahmen kombiniert.Of the Term "weakening" describes in this Related to the elimination of the intracellular activity of one or more enzymes (Proteins) in a microorganism produced by the corresponding DNA be coded, for example, by a weak promoter used or a gene or allele used for a corresponding Enzyme with a low activity encodes or the corresponding gene or enzyme (protein) inactivated and, where appropriate, these measures combined.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Massnahmen kombiniert.The term "enhancement" in this context describes the enhancement of intracellular activity of one or more enzymes in a microorganism encoded by the corresponding DNA which, for example, by increasing the copy number of the gene (s), uses a strong promoter or uses a gene which codes for a corresponding enzyme with a high activity and optionally combines these measures.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Lysin aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Lysin zu produzieren.The Microorganisms which are the subject of the present invention can L-lysine from glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, Strength, Cellulose or from glycerol and ethanol. It may be to representatives coryneformer bacteria, in particular the genus Corynebacterium act. In the genus Corynebacterium is in particular the Art Corynebacterium glutamicum, which in the professional world for their ability is known to produce L-lysine.

Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), sind besonders die bekannten Wildtypstämme Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC14020 oder daraus hergestellte L-Lysin produzierende Mutanten beziehungsweise Stämme, wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 Corynebacterium glutamicum DM58-1 Corynebacterium glutamicum DG52-5 Corynebacterium glutamicum DSM 5715 und Corynebacterium glutamicum DSM 12866suitable strains the genus Corynebacterium, in particular the species Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), are especially the known wild-type strains Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium molassecola ATCC17965 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 and Brevibacterium divaricatum ATCC14020 or L-lysine producing mutants derived therefrom or strains, such as the L-lysine producing strains Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 Corynebacterium glutamicum DM58-1 Corynebacterium glutamicum DG52-5 Corynebacterium glutamicum DSM 5715 and Corynebacterium glutamicum DSM 12866

Den Erfindern gelang es, das für das CcpA1-Protein kodierende ccpA1-Gen von C. glutamicum, welches ein Katabolit-Kontroll-Protein A ist, zu isolieren.The Inventors managed to do this for the ccpA1 protein coding ccpA1 gene of C. glutamicum, which a catabolite control protein A is to isolate.

Zur Isolierung des ccpA1-Gens oder auch anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli) angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990), oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) in lambda-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) angelegt wurde. Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326 (1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmides pHC79 (Hohn und Collins, 1980, Gene 11, 291-298).to Isolation of the ccpA1 gene or other genes of C. glutamicum will be first a gene bank of this microorganism in Escherichia coli (E. coli) created. The creation of genebanks is in well-known textbooks and manuals written down. As an example, the textbook of Winnacker: Genes and Clones, An Introduction into genetic engineering (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990), or the Handbook of Sambrook et al .: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). A well-known gene bank is that of the E. coli K-12 strain W3110, which of Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) in lambda vectors has been. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996) a gene bank of C. glutamicum ATCC13032, using the cosmid vector SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) in E. coli K-12 strain NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575). Börmann et al. (Molecular Microbiology 6 (3), 317-326 (1992)) a library of C. glutamicum ATCC13032 using the cosmid pHC79 (Hohn and Collins, 1980, Gene 11, 291-298).

Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, 1979, Life Sciences, 25, 807-818) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E. coli-Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind wie beispielsweise der Stamm DH5 alpha (Jeffrey H. Miller: "A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria", Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1992).to Production of a gene bank of C. glutamicum in E. coli can also Plasmids such as pBR322 (Bolivar, 1979, Life Sciences, 25, 807-818) or pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268). When Hosts are particularly suitable for those E. coli strains that are restriction and recombination deficiencies are such as the strain DH5 alpha (Jeffrey H. Miller: "A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria ", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992).

Die mit Hilfe von Cosmiden oder anderen lambda-Vektoren klonierten langen DNA-Fragmente können anschliessend wiederum in gängige für die DNA-Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert werden.The cloned with the help of cosmids or other lambda vectors long DNA fragments can then turn in common for the DNA sequencing suitable vectors are subcloned.

Methoden zur DNA-Sequenzierung sind unter anderem bei Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA, 74: 5463-5467, 1977) beschrieben.methods for DNA sequencing include Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA, 74: 5463-5467, 1977).

Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen wie z. B. dem von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232 (1986)), dem von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) oder dem GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)) untersucht werden.The obtained DNA sequences can then with known algorithms or sequence analysis programs like z. B. Staden's (Nucleic Acids Research 14, 217-232 (1986)), by Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) or Butler's GCG program (Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)).

Auf diese Weise wurde die für das ccpA1-Gen kodierende DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die als SEQ ID No. 1 Bestandteil der vorliegenden Beschreibung ist. Weiterhin wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID No. 2 ist die sich ergebende Aminosäuresequenz des ccpA1-Genproduktes dargestellt.On this way was the for the ccpA1 gene encoding DNA sequence of C. glutamicum, the as SEQ ID no. 1 part of the present description is. Furthermore, from the present DNA sequence with those described above Methods the amino acid sequence derived from the corresponding protein. In SEQ ID no. 2 is the resulting amino acid sequence of the ccpA1 gene product shown.

Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch die Degeneriertheit des genetischen Kodes ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Beschreibung. In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Beschreibung. In der Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als "Sinnmutationen" ("sense mutations") bekannt, die zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen, d. h. funktionsneutral sind. Weiterhin ist bekannt, dass Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene 77: 237-251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240-247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender Weise aus SEQ ID No. 2 ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Beschreibung.coding DNA sequences which consist of SEQ ID no. 1 by the degeneracy of the genetic code are also part of the description. Similarly, DNA sequences SEQ ID NO. 1 or Parts of SEQ ID no. 1 hybridize, part of the description. In the professional world, conservative amino acid substitutions continue such as B. Exchange of glycine for alanine or aspartic acid against glutamic acid in proteins known as "sense mutations" that belong to no fundamental change the activity lead the protein, d. H. are functionally neutral. Furthermore, it is known that changes at the N- and / or C-terminus of a protein does not significantly affect its function or even stabilize. Information on this can be found among others at Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987)), O'Regan et al. (Gene 77: 237-251 (1989)); Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240-247 (1994)), in Hochuli et al. (Bio / Technology 6: 1321-1325 (1988)) and in known textbooks genetics and molecular biology. Amino acid sequences resulting in corresponding Way from SEQ ID no. 2, are also part of the description.

Schliesslich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Beschreibung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich aus SEQ ID No. 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.After all are DNA sequences part of the description by the polymerase chain reaction (PCR) using primers that are from SEQ ID no. 1 result. Such oligonucleotides are typically a length of at least 15 nucleotides.

Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heisst, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschliesslich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).instructions to identify DNA sequences by hybridization the expert, inter alia, in the manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization " Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) and in Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). The hybridization takes place under stringent conditions instead of, that is, only hybrids are formed, where probe and target sequence, d. H. the polynucleotides treated with the probe, at least 70% are identical. It is known that the stringency hybridization including washing by varying the buffer composition, the temperature and the salt concentration is influenced or determined. The hybridization reaction is preferably at a relatively low stringency compared to the Washing steps performed (Hybaid Hybridization Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).

Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein 5 × SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50-68°C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70% Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2 × SSC und nachfolgend 0,5 × SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50-68°C eingestellt wird. Es ist gegebenenfalls möglich, die Salzkonzentration bis auf 0,1 × SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1-2°C können Polynukleotidfragmente isoliert werden, die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% bis 95% Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No. 1603558).For the hybridization reaction For example, a 5x SSC buffer be used at a temperature of about 50-68 ° C. This can be probes also hybridize with polynucleotides having less than 70% identity to the sequence having the probe. Such hybrids are less stable and become removed by washing under stringent conditions. This can for example, by lowering the salt concentration to 2 × SSC and subsequently 0.5 × SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995), wherein a temperature of about 50-68 ° C is set becomes. It may be possible to lower the salt concentration to 0.1X SSC. By gradual increase the hybridization temperature in steps of about 1-2 ° C may polynucleotide fragments be isolated, for example, at least 70% or at least 80% or at least 90% to 95% identity to the sequence used Own probe. Further instructions for hybridization are in form so-called kits available on the market (eg DIG Easy Hyb from Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) Germany, Catalog No. 1603558).

Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).instructions for the amplification of DNA sequences by means of the polymerase chain reaction The expert will find (PCR) among others in the handbook of Gait: Oligonucleotides Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) and Newton and Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994).

Bei der Arbeit an der vorliegenden Erfindung konnte festgestellt werden, dass coryneforme Bakterien nach Abschaltung des ccpA1-Gens in verbesserter Weise L-Lysin produzieren.at the work on the present invention could be stated that coryneform bacteria in improved after switching off the ccpA1 gene Way to produce L-lysine.

Zur Erzielung einer Abschaltung können entweder die Expression des ccpA1-Gens oder die katalytischen Eigenschaften des Enzymproteins ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Massnahmen kombiniert werden.to Achieving a shutdown can either the expression of the ccpA1 gene or the catalytic properties of the enzyme protein are turned off. If necessary, both can Measures are combined.

Die Verringerung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), bei Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)), Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).The reduction of gene expression can be done by appropriate culture or by genetic modification (mutation) of the signal structures of gene expression. Signaling structures of gene expression include repressor genes, activator genes, operators, promoters, attenuators, ribosome binding sites, the start codon, and terminators. Information on this is the expert z. See, for example, in patent application WO 96/15246, Boyd and Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), Voskuil and Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58 : 191 (1998)), in Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)), Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999)) and in known textbooks of genetics and molecular biology such as: the teaching book by Knippers ("Molekulare Genetik", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995) or Winnacker's ("Gene and Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990).

Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.mutations the change or reduction of the catalytic properties of enzyme proteins to lead, are known in the art; as examples are the Works by Qiu and Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) and Möckel ("The threonine dehydratase from Corynebacterium glutamicum: abolition of allosteric regulation and structure of the enzyme, "reports of Forschungszentrum Jülich, Jül-2906 ISSN09442952, Jülich, Germany, 1994). Summary presentations may be known textbooks genetics and molecular biology such. B. that of Hagemann ("General Genetics", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar (bp) in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), in deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.When Mutations include transitions, transversions, insertions and Deletions into consideration. Dependent on from the effect of amino acid exchange on the enzyme activity is caused by missense mutations ("missense mutations ") or Nonsense mutations ("nonsense mutations "). Insertions or deletions of at least one base pair (bp) in a gene lead to frame shift mutations, as a result wrong amino acids be installed or the translation aborts prematurely. deletions lead by several codons typically to a complete one Failure of enzyme activity. instructions for generating such mutations belong to the prior art and can known textbooks genetics and molecular biology such. B. the textbook by Knippers ("Molecular genetics", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995), that of Winnacker ("Genes and Clones", VCH Publishing Company, Weinheim, Germany, 1990) or that of Hagemann ("General Genetics", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung ("gene disruption") und des Gen-Austauschs ("gene replacement").A common The method of mutating genes of C. glutamicum is that of Schwarzer and Pühler (Bio / Technology 9, 84-87 (1991)) method of gene disruption and gene replacement.

Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR^®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al.., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zentrale Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird anschliessend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"-Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'-Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.In the method of gene disruption, a central part of the coding region of the gene of interest is cloned into a plasmid vector which can replicate in a host (typically E. coli) but not in C. glutamicum. Examples of vectors used are pSUP301 (Simon et al., Bio / Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob or pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB or pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994), Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84 ; US Patent 5,487,993), pCR ^® Blunt (Invitrogen, Groningen, The Netherlands; Bernard et al .., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) or pEM1 (shrink et al, 1991, Journal of Bacteriology. 173: 4510-4516). The plasmid vector, which contains the central part of the coding region of the gene, is then converted by conjugation or transformation into the desired strain of C. glutamicum. The method of conjugation is described by Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Methods for transformation are described by Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican and Shivnan (Bio / Technology 7, 1067-1070 (1989)) and Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). After homologous recombination by means of a "cross-over" event, the coding region of the gene in question is interrupted by the vector sequence and two incomplete alleles are obtained, each of which lacks the 3 'or the 5' end. This method has been described, for example, by Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) to eliminate the recA gene of C. glutamicum.

Bei der Methode des Genaustausches ("gene replacement") wird eine Mutation wie z. B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschliessend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw. des Allels. Diese Methode wurde beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion auszuschalten.at the method of gene exchange ("gene replacement ") a mutation such as As a deletion, insertion or base exchange in the gene of interest in vitro produced. The produced allele becomes turn into one for C. glutamicum non-replicative vector is cloned and this subsequently by Transformation or conjugation into the desired host of C. glutamicum. To homologous recombination by means of a first, cross-over event causing integration and a suitable second excision-causing cross-over event in the target gene or in the target sequence to achieve the incorporation of the mutation or of the allele. This method was for example by Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) used the pyc gene of C. glutamicum by deletion.

In das ccpA1-Gen kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut werden.In The ccpA1 gene may be deleted, inserted or deleted this way a base exchange be installed.

Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Ausschaltung des ccpA1-Gens ein oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus oder des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.In addition, it may be advantageous for the production of L-lysine, in addition to the elimination of the ccpA1 gene one or more enzymes of the respective biosynthetic pathway, the glycolysis, the anaplerotic, the citric acid cycle, the pentose phosphate cycle or the amino acid export and optionally to reinforce regulatory proteins, in particular overexpress.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Massnahmen kombiniert.Of the Term "reinforcement" describes in this Related the increase the intracellular activity one or more enzymes (proteins) in a microorganism, which are encoded by the corresponding DNA, for example by the copy number of the gene (s) increases, a strong promoter used or a gene or allele used for a corresponding Enzyme (protein) encoded with a high activity and optionally combined these measures.

So kann für die Herstellung von L-Lysin gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

– das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),
– das für die Enolase kodierende Gen eno (DE: 199 47 791.4),
– das für das zwf-Genprodukt kodierende Gen zwf (JP-A-09224661),
– gleichzeitig das für die Tetradihydrodipicolinat-Succinylase kodierende dapD Gen (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 180, 3159-3165 (1998)),
– gleichzeitig das Gen für die Succinyldiaminopimelat-Desuccinylase kodierende dapE Gen (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 177: 5991-5993 (1995)),
– gleichzeitig das für die Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase kodierende gap-Gen (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
– das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc (Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998))
– gleichzeitig das für die Malat:Chinon-Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),
– das für eine feedbackresistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Kalinowski et al. (1990), Molecular and General Genetics 224, 317-324; Accession No.P26512; EP-B-0387527; EP-A-0699759; WO 00/63388),
– das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115),
– das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222)

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.Thus, for the production of L-lysine simultaneously one or more of the genes selected from the group

The gene dapA coding for the dihydrodipicolinate synthase (EP-B 0 197 335),
The gene eno coding for the enolase (DE: 199 47 791.4),
The gene zwf coding for the zwf gene product (JP-A-09224661),
Simultaneously the dapD gene coding for the tetradihydrodipicolinate succinylase (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 180, 3159-3165 (1998)),
Simultaneously the gene for the succinyldiaminopimelate-desuccinylase-encoding dapE gene (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 177: 5991-5993 (1995)),
Simultaneously the gap gene coding for the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Eikmanns (1992) Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
The gene pyc coding for the pyruvate carboxylase (Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998))
Simultaneously the mqo gene coding for the malate: quinone oxidoreductase (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),
The feedback-resistant aspartate kinase-encoding gene lysC (Kalinowski et al., 1990, Molecular and General Genetics 224, 317-324, Accession No. P26512, EP-B-0387527, EP-A-0699759, WO 00/63388). .
The zwa1 gene coding for the Zwa1 protein (DE: 199 59 328.0, DSM 13115),
The lysine gene coding for lysine export (DE-A-195 48 222)

amplified, in particular overexpressed.

Ausserdem kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Ausschaltung des ccpA1-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

– das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck ( DE 199 50 409.1 , DSM 13047),
– das für die Glucose-6-phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi (US 09/396,478, DSM 12969),
– das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE: 199 59 327.2, DSM 13113),
– das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB DE: 199 51 975.7, DSM 13114) auszuschalten.

In addition, it may be advantageous for the production of L-lysine, in addition to the elimination of the ccpA1 gene, simultaneously one or more of the genes selected from the group

The gene encoding the phosphoenolpyruvate carboxykinase pck ( DE 199 50 409.1 , DSM 13047),
The gene pgi coding for the glucose-6-phosphate isomerase (US 09 / 396,478, DSM 12969),
The zwa2 gene coding for the Zwa2 protein (DE: 199 59 327.2, DSM 13113),
- turn off the coding for the pyruvate oxidase gene poxB DE: 199 51 975.7, DSM 13114).

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Ausschaltung des ccpA1-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (Hrsg.), Academic Press, London, UK, 1982).Farther can it for the production of L-lysine may be beneficial, in addition to the elimination of the ccpA1 gene undesirable To eliminate side reactions (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (ed.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäss hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Lysin kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.The inventively produced microorganisms are also the subject of the invention and can continuous or discontinuous in the batch process (batch cultivation) or in the fed batch (feed method) or repeated fed batch method (repetitive Feed method) for the purpose of producing L-lysine become. A summary about known cultivation methods is in the textbook by Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Introduction in bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook of Storhas (bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)).

Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin und Ethanol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.The culture medium to be used must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981). As a carbon source, sugars and carbohydrates such. As glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose, oils and fats, such as soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut oil, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerol and Ethanol and organic acids, such as acetic acid used who the. These substances can be used individually or as a mixture.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.When Nitrogen source can organic nitrogen-containing Compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, Corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic Compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, Ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used. The nitrogen sources can used singly or as a mixture.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schliesslich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.When Phosphorus source can Phosphoric acid, Potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts are used. The culture medium must also contain salts of metals, such as magnesium sulfate or ferric sulfate used for the growth is necessary. Finally, essential growth substances like amino acids and vitamins in addition used for the above-mentioned substances. The culture medium can also suitable precursors are added. The specified ingredients can added to culture in the form of a unique approach or in suitable way during fed to the cultivation become.

Zur pH-Kontrolle der Kultur können basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.to pH control of the culture can basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or Sulfuric acid in be used appropriately. To control foaming can Antifoams, such as fatty acid polyglycol used become. To maintain the stability of plasmids, the Medium suitable selective substances, such as antibiotics added become. To maintain aerobic conditions, oxygen is used or oxygen-containing gas mixtures, such as air in the culture registered. The temperature of the culture is usually at 20 ° C up to 45 ° C and preferably at 25 ° C up to 40 ° C. The culture is continued until a maximum of the desired product has formed. This goal will normally be within 10 hours reached up to 160 hours.

Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann also zum Beispiel so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie mit anschliessender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie z. B. bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.methods for the determination of L-amino acids are known from the prior art. The analysis can therefore for Example as in Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) described by anion exchange chromatography with subsequent Ninhydrin derivatization is done, or it can be reversed by phase HPLC, such as. In Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

Das erfindungsgemässe Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Lysin.The invention Method is used for the fermentative production of L-lysine.

Folgender Mikroorganismus wurde am 22.08.2000 als Reinkultur bei der Deutschen Sammlung für Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäss Budapester Vertrag hinterlegt:

– Escherichia coli Stamm Top10F/pCR2.1ccpA1int DSM 13673.

The following microorganism was deposited on 22.08.2000 as a pure culture with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany) according to the Budapest Treaty:

Escherichia coli strain Top10F / pCR2.1ccpA1int DSM 13673.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.The The present invention will be described below with reference to exemplary embodiments explained in more detail.

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalischen Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) durchgeführt. Methoden zur Transformation von Escherichia coli sind ebenfalls in diesem Handbuch beschrieben.The Isolation of plasmid DNA from Escherichia coli and all techniques for restriction, Klenow and alkaline phosphatase treatment according to Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) carried out. Methods for the transformation of Escherichia coli are also described in this manual.

Die Zusammensetzung gängiger Nährmedien wie LB- oder TY-Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook et al. entnommen werden.The Composition more common Culture Media Like LB or TY medium can also be found in the Sambrook manual et al. be removed.

Beispiel 1example 1

Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus C. glutamicum ATCC 13032Producing a genomic Cosmid Genbank from C. glutamicum ATCC 13032

Chromosomale DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei Tauch et al., (1995, Plasmid 33: 168-179) beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987), Proceedings of the National Academy of Sciences; USA 84: 2160-2164), bezogen von der Firma Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.chromosomal DNA from C. glutamicum ATCC 13032 was isolated as described by Tauch et al. (1995). Plasmid 33: 168-179) isolated and with the restriction enzyme Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product description Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partially cleaved. The DNA fragments were with shrimp alkaline phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, product description SAP, code no. 1758250) dephosphorylated. The DNA of the cosmid vector SuperCos1 (Wahl et al. (1987), Proceedings of the National Academy of Sciences; USA 84: 2160-2164), purchased from the company Stratagene (La Jolla, USA, product description SuperCos1 cosmid vector kit, code no. 251301) was mixed with the restriction enzyme XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description XbaI, Code no. 27-0948-02) and also with shrimp alkaline Phosphatase dephosphorylated.

Anschliessend wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no.27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschliessend mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217) in Phagen verpackt.Subsequently the cosmid DNA with the restriction enzyme BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product description BamHI, code no. 27-0868-04). The cosmid DNA treated in this way was treated with the ATCC13032 DNA mixed and the T4 DNA ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description T4 DNA Ligase, Code no. 27-0870-04). The ligation mixture was subsequently using the Gigapack II XL Packing Extract (Stratagene, La Jolla, USA, Product description Gigapack II XL Packing Extract, code no. 200217) in Phages packed.

Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16: 1563-1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO₄ aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) + 100 μg/ml Ampicillin ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante Einzelklone selektioniert.To infect the E. coli strain NM554 (Raleigh et al 1988, Nucleic Acid Res. 16: 1563-1575), the cells were taken up in 10 mM MgSO ₄ and mixed with an aliquot of the phage suspension. Infection and titering of the cosmidbank were performed as described by Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), where the cells were plated on LB agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) + 100 μg / ml ampicillin. After incubation overnight at 37 ° C, recombinant single clones were selected.

Beispiel 2Example 2

Isolierung und Sequenzierung des Gens ccpA1Isolation and sequencing of the gene ccpA1

Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung der Cosmidfragmente im Grössenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany).The Cosmid DNA of a single colony was analyzed using the Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) according to manufacturer's instructions isolated and with the restriction enzyme Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product description Sau3AI, product no. 27-0913-02) partially split. The DNA fragments were treated with shrimp alkaline phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Product no. 1758250) dephosphorylated. After gel electrophoresis separation took place the isolation of the cosmid fragments in the size range from 1500 to 2000 bp with the QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany).

Die DNA des Sequenziervektors pZero-1 bezogen von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschliessend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences, U. S. A., 87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 μg/ml Zeocin ausplattiert.The DNA of the sequencing vector pZero-1 obtained from Invitrogen (Groningen, Netherlands, Product Description Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01) was digested with the restriction enzyme BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Product No. 27-0868-04). The ligation of the cosmid fragments into the sequencing vector pZero-1 as described by Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) carried out, the DNA mixture with T4 ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany) overnight was incubated. This ligation mixture was then in the E. coli strain DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S. S.A., 87: 4645-4649) (Tauch et al., 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) and on LB agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) at 50 μg / ml Zeocin plated.

Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Dideoxy-Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academies of Sciences, U. S. A., 74: 5463-5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wurde der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgten in einem "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29 : 1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit dem "ABI Prism 377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).The plasmid the recombinant clones were carried out with the Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Germany). The sequencing was done according to the dideoxy chain termination method of Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academies of Sciences, U.S.A., 74: 5463-5467) with modifications according to Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). It became the "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit "from PE Applied Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt, Germany). The gel electrophoretic separation and analysis of the sequencing reaction were done in a "rotiphoresis NF acrylamide / bisacrylamide "gel (29: 1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) with the "ABI Prism 377" sequencer from PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Germany).

Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschliessend unter Anwendung des Staden-Programmpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) Version 97-0 prozessiert. Die Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte Kodierbereichsanalysen wurden mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) angefertigt. Weitere Analysen wurden mit dem "BLAST search program" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 33893402) gegen die non-redundant Datenbank des "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA) durchgeführt.The obtained raw sequence data were then subsequently used the Staden Program Package (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) Version 97-0 processed. The single sequences of pZero1 derivatives became a coherent one Contig assembles. The computer-aided coding area analyzes were used with the program XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231). Further analyzes were carried out with the "BLAST search program" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 33893402) against the non-redundant Database of the "National Center for Biotechnology Information "(NCBI, Bethesda, MD, USA).

Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1 dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein offenes Leseraster von 1167 bp, welches als ccpA1-Gen bezeichnet wurde. Das ccpA1-Gen kodiert für ein Polypeptid von 388 Aminosäuren.The the nucleotide sequence obtained is shown in SEQ ID no. 1 shown. The Analysis of the nucleotide sequence revealed an open reading frame of 1167 bp, which was named ccpA1 gene. The ccpA1 gene encodes a polypeptide of 388 amino acids.

Beispiel 3Example 3

Herstellung eines Integrationsvektors für die Integrationsmutagenese des ccpA1-GensProduction of an integration vector for the Integration mutagenesis of the ccpA1 gene

Aus dem Stamm ATCC 13032 wurde nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 2 für C. glutamicum bekannten Sequenz des ccpA1-Gens wurden die folgenden Oligonukleotide für die Polymerase-Kettenreaktion ausgewählt (siehe SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 4):
ccpA1intA:
5'AGA GCT GCT TGG TCA GAC TT 3'
ccpA1intB:
5'ATC CAG ATT CTT GGC GGT AG 3'From strain ATCC 13032, the method of Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) isolated chromosomal DNA. Based on the sequence of the ccpA1 gene known from example 2 for C. glutamicum, the following oligonucleotides were selected for the polymerase chain reaction (see SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4):
ccpA1intA:
5'AGA GCT GCT TGG TCA GAC TT 3 '
ccpA1intB:
5'ATC CAG ATT CTT GGC GGT AG 3 '

Die dargestellten Primer wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase der Firma Boehringer die PCR-Reaktion durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wurde ein 362 bp grosses internes Fragment des ccpA1-Gens isoliert.The The primers shown were obtained from MWG Biotech (Ebersberg, Germany) and according to the standard PCR method of Innis et al. (PCR protocols, A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) with Pwo polymerase from Boehringer the PCR reaction carried out. With the help of the polymerase chain reaction was a 362 bp large internal fragment of the ccpA1 gene isolated.

Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit dem TOPO TA Cloning Kit der Firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalog Nummer K4500-01) in den Vektor pCR2.1-TOPO (Mead at al. (1991), Bio/Technology 9: 657-663) ligiert.The amplified DNA fragment was made with the TOPO TA cloning kit of Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Catalog Number K4500-01) into the vector pCR2.1-TOPO (Mead et al. (1991), Bio / Technology 9: 657-663).

Anschliessend wurde der E. coli Stamm TOP10F mit dem Ligationsansatz (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA 1985) transformiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschliessender Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) überprüft. Das Plasmid wurde pCR2.1ccpA1int genannt.Subsequently, the E. coli strain TOP10F was transformed with the ligation mixture (Hanahan, In: DNA cloning, A practical approach, Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA 1985). The selection of plasmid-carrying cells was made by plating out the transformation batch on LB agar (Sambrook et al, Molecular Cloning:... A Laboratory Manual 2 ^nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), the supplemented with 25 mg / l kanamycin. Plasmid DNA was isolated from a transformant using the QIAprep Spin Miniprep Kit from Qiagen and checked by restriction with the restriction enzyme EcoRI and subsequent agarose gel electrophoresis (0.8%). The plasmid was named pCR2.1ccpA1int.

Beispiel 4Example 4

Integrationsmutagenese des ccpA1-Gens in dem Lysinproduzenten DSM 5715Integrationsmutagenese of the ccpA1 gene in lysine producer DSM 5715

Der in Beispiel 3 genannte Vektor pCR2.1ccpA1int wurde nach der Elektroporationsmethode von Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)) in C. glutamicum DSM 5715 elektroporiert. Bei dem Stamm DSM 5715 handelt es sich um einen AEC-resistenten Lysin-Produzenten. Der Vektor pCR2.1ccpA1int kann in DSM 5715 nicht selbständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er ins Chromosom von DSM 5715 integriert hat. Die Selektion von Klonen mit ins Chromosom integriertem pCR2.1ccpA1int erfolgte durch Ausplattieren des Elektroporationsansatzes auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.), der mit 15 mg/l Kanamycin supplementiert worden war.The vector pCR2.1ccpA1int mentioned in Example 3 was prepared according to the electroporation method of Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)) in C. glutamicum DSM 5715 electroporated. The strain DSM 5715 is an AEC-resistant lysine producer. The vector pCR2.1ccpA1int can not self-replicate in DSM 5715 and only remains in the cell if it has integrated into the chromosome of DSM 5715. The selection of clones with integrated into the chromosome pCR2.1ccpA1int made by plating out the electroporation batch on LB agar (Sambrook et al, Molecular Cloning:... A Laboratory Manual 2 ^nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) supplemented with 15 mg / l kanamycin.

Für den Nachweis der Integration wurde das ccpA1int-Fragment nach der Methode "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) mit dem Dig-Hybridisierungskit der Firma Boehringer markiert. Chromosomale DNA eines potentiellen Integranten wurde nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) isoliert und jeweils mit den Restriktionsenzymen PstI, Sacl und HindIII geschnitten. Die entstehenden Fragmente wurden mit Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt und mit dem Dig-Hybrisierungskit der Firma Boehringer bei 68°C hybridisiert. Das in Beispiel 3 genannte Plasmid pCR2.1ccpA1int war innerhalb des chromosomalen ccpA1-Gens ins Chromosom von DSM 5715 inseriert worden. Der Stamm wurde als DSM 5715::pCR2.1ccpA1int bezeichnet.For the proof the integration was the ccpA1int fragment by the method "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization " Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) with the Dig hybridization kit marked Boehringer. Chromosomal DNA of a potential Integrants according to the method of Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) and in each case with the restriction enzymes PstI, Sacl and HindIII cut. The resulting fragments were with agarose gel electrophoresis separated and with the Dig-Hybrisierungskit Boehringer at 68 ° C hybridized. The plasmid pCR2.1ccpA1int mentioned in example 3 was inserted within the chromosomal ccpA1 gene into the chromosome of DSM 5715 Service. The strain was named DSM 5715 :: pCR2.1ccpA1int.

Beispiel 5Example 5

Herstellung von L-Lysinmanufacturing of L-lysine

Der in Beispiel 4 erhaltene C. glutamicum Stamm DSM 5715::pCR2.1ccpA1int wurde in einem zur Produktion von L-Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der L-Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt.Of the C. glutamicum strain DSM 5715 :: pCR2.1ccpA1int obtained in Example 4 was in a nutrient medium suitable for the production of L-lysine cultivated and the L-lysine content in culture supernatant certainly.

Dazu wurde der Stamm zunächst auf Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Kanamycin (25 mg/l) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII verwendet. Medium CgIII NaCl 2,5 g/l Bacto-Pepton 10 g/l Bacto-Hefeextrakt 10 g/l Glukose (getrenntautoklaviert) 2% (w/v) Der pH-Wert wird auf pH 7,4 eingestellt. For this purpose, the strain was first incubated on agar plate with the appropriate antibiotic (brain heart agar with kanamycin (25 mg / l) for 24 hours at 33 ° C. Starting from this agar plate culture, a preculture was inoculated (10 ml of medium in 100 ml Erlenmeyer flask The complete medium CgIII was used as medium for the preculture Medium CgIII NaCl 2.5 g / l Bacto-peptone 10 g / l Bacto-yeast extract 10 g / l Glucose (autoclaved separately) 2% (w / v) The pH is adjusted to pH 7.4.

Diesem wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 24 Stunden bei 33°C bei 240 rpm auf dem Schüttler inkubiert. von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so dass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD betrug. Für die Hauptkultur wurde das Medium MM verwendet. Medium MM CSL (Maisquellwasser) 5 g/l MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) 20 g/l Glukose (getrennt autoklaviert) 50 g/l Salze: (NH₄)₂SO₄ 25 g/l KH₂PO₄ 0,1 g/l MgSO₄·7H₂O 1,0 g/l CaCl₂·2H₂O 10 mg/l FeSO₄·7H₂O 10 mg/l MnSO₄·H₂O 5,0 mg/l Biotin (sterilfiltriert) 0,3 mg/l Thiamin·HCl (sterilfiltriert) 0,2 mg/l Leucin (sterilfiltriert) 0,1 g/l CaCO₃ 25 g/l To this was added kanamycin (25 mg / L). The preculture was incubated for 24 hours at 33 ° C at 240 rpm on a shaker. from this preculture, a major culture was inoculated such that the initial OD (660 nm) of the major culture was 0.1 OD. The medium MM was used for the main culture. Medium MM CSL (corn steep liquor) 5 g / l MOPS (morpholinopropanesulfonic acid) 20 g / l Glucose (autoclaved separately) 50 g / l salts: (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 25 g / l KH ₂ PO ₄ 0.1 g / l MgSO ₄ .7H ₂ O 1.0 g / l CaCl ₂ .2H ₂ O 10 mg / l FeSO ₄ .7H ₂ O 10 mg / l MnSO ₄ .H ₂ O 5.0 mg / l Biotin (sterile filtered) 0.3 mg / l Thiamine · HCl (sterile filtered) 0.2 mg / l Leucine (sterile filtered) 0.1 g / l CaCO ₃ 25 g / l

CSL, MOPS und die Salzlösung werden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschliessend werden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das trocken autoklavierte CaCO₃ zugesetzt.CSL, MOPS and saline are adjusted to pH 7 with ammonia water and autoclaved. Subsequently, the sterile substrate and vitamin solutions and the dry autoclaved CaCO _{3 are} added.

Die Kultivierung erfolgt in 10 ml Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und 80% Luftfeuchtigkeit.The Cultivation is done in 10 ml volume in a 100 ml Erlenmeyer flask with harassment. Kanamycin (25 mg / L) was added. The cultivation was at 33 ° C and 80% humidity.

Nach 72 Stunden wurde die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete L-Lysinmenge wurde mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Zonenaustausch-Chromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt.To 72 hours, the OD at a measuring wavelength of 660 nm with the Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich). The educated L-lysine was with an amino acid analyzer from Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany) by zone exchange chromatography and post column derivatization determined by ninhydrin detection.

In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt. Tabelle 1

Table 1 shows the result of the experiment. Table 1

Kurzbeschreibung der FigurBrief description of the figure

1 Karte des Plasmids pCR2.1ccpA1int. 1 Map of the plasmid pCR2.1ccpA1int.

Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung.

KmR:: Kanamycin Resistenz-Gen
EcoRI:: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
HindIII:: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
PstI:: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
SacI:: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Sacl
ccpA1int:: internes Fragment des ccpA1-Gens
ColE1ori:: Replikationsursprung des Plasmids ColE1

SEQUENZPROTOKOLL

The abbreviations and designations used have the following meaning.

Km R:: Kanamycin resistance gene
EcoRI:: Interface of the restriction enzyme EcoRI
Hind:: Interface of the restriction enzyme HindIII
Pst:: Interface of the restriction enzyme PstI
Sac:: Interface of the restriction enzyme Sacl
ccpA1int:: internal fragment of the ccpA1 gene
ColE1ori:: Origin of replication of the plasmid ColE1

SEQUENCE LISTING

Claims

Isolated coryneformes bacteria in which the Expression of a Polynucleotide Encoding a Polypeptide, The an amino acid sequence which comprises at least 90% of the amino acid sequence according to SEQ ID NO. 2 is identical, is switched off, wherein the polypeptide is the Function of a catabolite control protein has.

A bacterium according to claim 1, which is a Bacterium of the species Corynebacterium glutamicum.

A bacterium according to claim 1, wherein the polypeptide the in SEQ ID NO. 2 has shown amino acid sequence.

A bacterium according to claim 1, wherein the polynucleotide the nucleotide sequence of nucleotides 225 to 1388 of SEQ ID NO. 1 has.

A bacterium according to claim 4, wherein the polynucleotide the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 1 has.

A bacterium according to claim 1 or 2 having the ability to To enrich L-lysine in its cells or in a medium.

Process for the preparation of L-lysine, in which the L-lysine producing bacteria according to any one of claims 1 to 6 fermented.

Process for the preparation of L-lysine, in which 8.1 the bacteria according to claims 1 to 6 fermented, 8.2 the L-lysine in the medium or in the cells the bacteria accumulates and 8.3 isolated the L-lysine.

Process according to claim 7 or 8, wherein bacteria are used in which one additionally amplified further genes of the biosynthetic pathway of L-lysine.

Method according to one or more of claims 7 to 9, in which one uses bacteria, in which the metabolic pathways are turned off, which reduce the formation of L-lysine.

Process according to claim 9, wherein bacteria are used fermented in which one or more of the genes, selected from the group 11.1 that for the dihydrodipicolinate synthase encoding gene dapA, 11.2 the for the Enolase encoding gene eno, 11.3 coding for the zwf gene product Gene twelve, 11.4 the for the pyruvate carboxylase coding gene pyc, 11.5 coding for lysine export Gene lysis, 11.6 the for the tetradihydrodipicolinate succinylase encoding gene dapD, 11.7 that for the succinyldiaminopimelate-desuccinylase-encoding gene dapE, 11.8 that for the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase coding gene gap, 11.9 that coding for the malate: quinone oxidoreductase Gene mqo, 11.10 that for a feedback resistant aspartkinase encoding gene lysC and 11:11 that for the zwa1 protein encoding gene zwa1, strengthened.

The method of claim 10, wherein simultaneously one or more of the genes selected from the group 12.1 that for the phosphoenolpyruvate carboxykinase encoding gene pck, 12.2 that for the glucose 6-phosphate isomerase coding gene pgi, 12.3 coding for the pyruvate oxidase Gene poxB and 12.4 the for the zwa2 protein encoding gene zwa2, off.

In Corynebacterium glutamicum not replicative Vector for the integration mutagenesis of the gene ccpA1, where the Gene ccpA1 is a polynucleotide encoding a polypeptide which an amino acid sequence which has at least 90% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 2 shown amino acid sequence is identical, wherein the vector is at least 15 consecutive Nucleotides of the type shown in SEQ ID NO. 1 sequence carries.

Vector according to claim 13, which is pCR2.1ccpA1int, deposited in the E. coli strain Top10F / pCR2.1ccpA1int under the Number DSM 13617 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, is.

Coryneform bacterium containing the vector according to claim 13 to 14.

Coryneform bacterium according to claim 15, assigned to of the species Corynebacterium glutamicum.