DE60113131T2 - NUCLEIC ACIDS CODING FOR THE TMK GEN - Google Patents
NUCLEIC ACIDS CODING FOR THE TMK GEN Download PDFInfo
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Description
Gebiet der ErfindungTerritory of invention
Die Erfindung stellt isolierte coryneforme Bakterien, wobei die Expression von Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien, die für das tmk-Gen codieren, ausgeschaltet ist, und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von Bakterien, in denen das tmk-Gen ausgeschaltet ist, bereit.The Invention provides isolated coryneform bacteria, wherein expression of nucleotide sequences from coryneform bacteria responsible for the tmk gene encode, off, and a process for fermentative Production of L-lysine using bacteria in which the tmk gene is off, ready.
Stand der TechnikState of technology
L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.L-amino acids, in particular L-lysine, found in human medicine and pharmaceutical Industry, in the food industry and especially in the food industry animal nutrition Application.
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.It is known to be amino acids by fermentation of stems coryneform bacteria, in particular Corynebacterium glutamicum, getting produced. Because of the great importance is constantly on the improvement of the manufacturing process worked. process improvements can fermentation measures, like emotion and supply of oxygen, or the composition of the nutrient media, like the sugar concentration during the fermentation, or the work-up to the product form by Example ion exchange chromatography or the intrinsic performance properties of the microorganism itself.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die Aminosäuren produzieren.to Improve the performance characteristics of these microorganisms Methods of mutagenesis, selection and mutant selection applied. In this way receives man tribes, which is resistant to antimetabolite or auxotrophic for regulatory are significant metabolites and produce the amino acids.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Erzeugung von L-Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion untersucht.since Several years ago, methods of recombinant DNA technology were also used for producing L-amino acid producing strains of Corynebacterium, by using single amino acid biosynthetic genes amplified and investigated the effect on amino acid production.
Aufgabe der ErfindungTask of invention
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Lysin bereitzustellen.The Inventors have set themselves the task of taking new measures to provide improved fermentative production of L-lysine.
Kurzdarstellung der ErfindungSummary the invention
Wenn im Folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen, sondern auch die Salze, wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat, gemeint.If L-lysine or lysine are not mentioned below only the bases, but also the salts, such as. B. lysine monohydrochloride or lysine sulfate, meant.
Ein isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das tmk-Gen codierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
- a) einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz unter SEQ ID Nr. 2 codiert,
- b) einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu wenigstens 90% mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 2 identisch ist,
- c) einem Polynukleotid, das zu den Polynukleotiden in a) oder b) komplementär ist, ist offenbart.
- a) a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
- b) a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence in SEQ ID NO: 2,
- c) a polynucleotide complementary to the polynucleotides in a) or b) is disclosed.
Das Polypeptid weist die Aktivität der Thymidylatkinase auf.The Polypeptide has the activity the thymidylate kinase.
Die
Offenbarung enthält
auch:
ein replizierbares Polynukleotid, insbesondere DNA, enthaltend
die Nukleotidsequenz wie in SEQ ID Nr. 1 dargestellt;
ein Polynukleotid,
das für
ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz
wie in SEQ ID Nr. 2 dargestellt codiert.The disclosure also includes:
a replicable polynucleotide, especially DNA, containing the nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 1;
a polynucleotide coding for a polypeptide having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2.
Beansprucht
werden:
ein Vektor pXK99Etmk, enthaltend Teile des beschriebenen
Polynukleotids mit SEQ ID NO: 1,
und coryneforme Bakterien,
in denen das tmk-Gen durch eine Insertion oder Deletion ausgeschaltet
ist.Claimed:
a vector pXK99Etmk containing parts of the polynucleotide described with SEQ ID NO: 1,
and coryneform bacteria in which the tmk gene is switched off by an insertion or deletion.
Die Erfindung stellt bereit:
- 1. Isolierte coryneforme Bakterien, wobei die Aktivität oder Konzentration des Proteins mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens 90% Identität mit der unter SEQ ID NO: 2 aufgeführten Aminosäuresequenz sowie Thymidylatkinaseaktivität aufweist, auf 0% der Aktivität oder Konzentration des Proteins des Ausgangsmikroorganismus reduziert ist.
- 2. Coryneforme Bakterien gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz des Proteins unter SEQ ID NO: 2 aufgeführt ist.
- 3. Isolierte coryneforme Bakterien, wobei die Aktivität oder Konzentration des von dem unter SEQ ID NO: 1 aufgeführten Polynukleotid codierten Proteins auf 0% der Aktivität oder Konzentration der Aktivität oder Konzentration des Proteins des Ausgangsmikroorganismus reduziert ist.
- 1. Isolated coryneform bacteria, wherein the activity or concentration of the protein having an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence listed under SEQ ID NO: 2 and thymidylate kinase activity is reduced to 0% of the activity or concentration of the protein of the starting microorganism.
- 2. Coryneform bacteria according to claim 1, wherein the amino acid sequence of the protein is listed under SEQ ID NO: 2.
- 3. Isolated coryneform bacteria, wherein the activity or concentration of the protein encoded by the polynucleotide listed under SEQ ID NO: 1 is reduced to 0% of the activity or concentration of the activity or concentration of the protein of the parent microorganism.
Die Offenbarung stellt auch Polynukleotide bereit, die im Wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz be stehen, die durch Screening mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank eines coryneformen Bakteriums, die das vollständige Gen oder Teile davon enthält, mit einer Sonde, die die Sequenz des in der Erfindung beschriebenen Polynukleotids gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein Fragment davon enthält und Isolierung der genannten Polynukleotidsequenz erhältlich sind.The Revelation also provides polynucleotides that are essentially from a polynucleotide sequence which can be screened by Hybridization of a corresponding gene bank of a coryneform bacterium, the complete one Contains gene or parts thereof, with a probe containing the sequence of that described in the invention Polynucleotide according to SEQ ID No. 1 or a fragment thereof and isolation of said Polynucleotide sequence available are.
Genaue Beschreibung der ErfindungPrecise description the invention
Polynukleotide, die die in der Erfindung beschriebenen Sequenzen enthalten, sind als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um Nukleinsäuren oder Polynukleotide oder Gene, die für die Thymidylatkinase codieren, in voller Länge zu isolieren oder um solche Nukleinsäuren oder Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz des tmk-Gens aufweisen. Sie sind ebenso zum Einbau in so genannte "Arrays", "Mikroarrays" oder "DNA-Chips" geeignet, um die entsprechenden Polynukleotide zu detektieren und zu bestimmen.polynucleotides which contain the sequences described in the invention are as hybridization probes for RNA, cDNA and DNA suitable for nucleic acids or polynucleotides or Genes for encode the thymidylate kinase, isolate it in full length or such nucleic acids or to isolate polynucleotides or genes that are highly similar having the sequence of the tmk gene. They are also for installation in so-called "arrays", "microarrays" or "DNA chips" suitable for the corresponding polynucleotides to detect and determine.
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Offenbarung umfassen, sind weiterhin als Primer geeignet, mit deren Hilfe mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen hergestellt werden kann, die für die Thymidylatkinase codieren.polynucleotides the sequences according to the disclosure are still suitable as primers, with their help with the polymerase chain reaction (PCR) DNA can be produced by genes can that for encode the thymidylate kinase.
Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide umfassen mindestens 25, 26, 27, 28, 29 oder 30, bevorzugt mindestens 20, 21, 22, 23 oder 24, ganz besonders bevorzugt mindestens 15, 16, 17, 18 oder 19 aufeinander folgende Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40 oder mindestens 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Nukleotiden. Gegebenenfalls sind auch Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 100, 150, 200, 250 oder 300 Nukleotiden geeignet.Such oligonucleotides serving as probes or primers include at least 25, 26, 27, 28, 29 or 30, preferably at least 20, 21, 22, 23 or 24, most preferably at least 15, 16, 17, 18 or 19 consecutive nucleotides. Also suitable are oligonucleotides with a length of at least 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 or 40 or at least 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 or 50 nucleotides. Possibly are also oligonucleotides with a length of at least 100, 150, 200, 250 or 300 nucleotides suitable.
"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld herausgetrennt."Isolated" means from his natural Separated environment.
"Polynukleotid" bezieht sich im Allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA handeln kann."Polynucleotide" refers to Generally to polyribonucleotides and polydeoxyribonucleotides, which is unmodified RNA or DNA or modified RNA or DNA can act.
Die Polynukleotide gemäß der Offenbarung enthalten ein Polynukleotid gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein daraus hergestelltes Fragment.The Polynucleotides according to the disclosure contain a polynucleotide according to SEQ ID No. 1 or a fragment made therefrom.
Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren umfassen.By "polypeptides" is meant peptides or proteins that have two or more linked via peptide bonds amino acids include.
Die Polypeptide gemäß der Offenbarung schließen ein Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 2 mit der biologischen Aktivität der Thymidylatkinase und auch solche ein, die zu 90% und bevorzugt zu wenigstens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% identisch sind mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 2 sind und die genannte Aktivität aufweisen.The Polypeptides according to the disclosure shut down a polypeptide according to SEQ ID No. 2 with the biological activity of thymidylate kinase and also those which are 90% and preferably at least 91%, 93%, 95%, 97% or 99% are identical to the polypeptide according to SEQ ID No. 2 and have the said activity.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits L-Lysin produzieren und in denen die für das tmk-Gen codierenden Nukleotidsequenzen ausgeschaltet sind.The The invention further relates to a process for fermentative production of L-lysine using coryneform bacteria, in particular already L-lysine produce and in which the for the tmk gene coding nucleotide sequences are turned off.
Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA codiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität codiert oder das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert, und gege benenfalls diese Maßnahmen kombiniert.The term "attenuation" in this context describes the reduction or elimination of the intracellular activity of one or more enzymes (proteins) in a microorganism which are encoded by the corresponding DNA, for example by using a weak promoter or by using a gene or allele coded for a corresponding enzyme with a low activity or inactivating the appropriate gene or enzyme (protein) and, if appropriate, combining these measures.
Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im Allgemeinen auf 0% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins oder der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, gesenkt.By the measures the weakening becomes the activity or concentration of the corresponding protein in general 0% of the activity or concentration of wild-type protein or activity or concentration of the protein in the initial microorganism, lowered.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.The Microorganisms which are the subject of the present invention can amino acids from glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch, cellulose or from glycerol and ethanol. It can be representative Coryneformer bacteria in particular of the genus Corynebacterium act. In the genus Corynebacterium is in particular the Art Corynebacterium glutamicum, which in the professional world for their ability is known, L-amino acids to produce.
Geeignete
Stämme
der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium
glutamicum (C. glutamicum), sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium
glutamicum ATCC 13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC
15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium
melassecola ATCC 17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM
BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC 14067
Brevibacterium
lactofermentum ATCC 13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC
14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten
oder Stämme.Suitable strains of the genus Corynebacterium, in particular of the species Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), are especially the known wild-type strains
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium molassecola ATCC 17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC 14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 and
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
and L-amino acid producing mutants or strains derived therefrom.
Das für die Thymidylatkinase (EC 2.7.4.9) codierende tmk-Gen von C. glutamicum wurde isoliert.The for the Thymidylate kinase (EC 2.7.4.9) coding tmk gene of C. glutamicum was isolated.
Zur Isolierung des tmk-Gens oder auch anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli) angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990), oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die des E. coli-K-12-Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495–508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255–265, 1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC 13032, die mithilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160–2164) im E. coli-K-12-Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563–1575) angelegt wurde.to Isolation of the tmk gene or other genes of C. glutamicum will be first a gene bank of this microorganism in Escherichia coli (E. coli) created. The creation of genebanks is in well-known textbooks and manuals written down. As an example, the textbook of Winnacker: Genes and Clones, An Introduction into genetic engineering (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990), or the Handbook of Sambrook et al .: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). A well-known gene bank is that of the E. coli K-12 strain W3110, which is described by Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) in λ vectors was created. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996) describe a gene bank of C. glutamicum ATCC 13032, the using the cosmid vector SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) E. coli K-12 strain NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) was created.
Börmann et al. (Molecular Microbiology 6 (3), 317–326 (1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. gluta-micum ATCC 13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und Collins, 1980, Gene 11, 291–298).Börmann et al. (Molecular Microbiology 6 (3), 317-326 (1992)) a gene bank of C. glutamicum ATCC 13032 using the Cosmids pHC79 (Hohn and Collins, 1980, Gene 11, 291-298).
Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, 1979, Life Sciences, 25, 807–818) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259–268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E. coli-Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind, wie beispielsweise der Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645–4649) beschrieben wurde. Die mithilfe von Cosmiden oder anderen λ-Vektoren klonierten langen DNA-Fragmente können anschließend wiederum in gängige für die DNA-Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert werden, so wie es z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463–5467, 1977) beschrieben ist.to Production of a gene bank of C. glutamicum in E. coli can also Plasmids such as pBR322 (Bolivar, 1979, Life Sciences, 25, 807-818) or pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268). When Hosts are particularly suitable for those E. coli strains that are restriction and are recombination deficient, such as the strain DH5αmcr, the by Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649) has been described. Using cosmids or other λ vectors subsequently cloned long DNA fragments can turn in common for the DNA sequencing subcloned suitable vectors and then sequenced be, as it is z. In Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467, 1977) is described.
Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten Algorithmen oder Sequenzanalyse-Programmen wie z. B. dem von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217–232 (1986)), dem von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829–1836 (1988)) oder dem GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74–97 (1998)) untersucht werden.The obtained DNA sequences can then with known algorithms or sequence analysis programs like z. B. Staden's (Nucleic Acids Research 14, 217-232 (1986)), by Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) or the GCG program Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)) to be examined.
Auf diese Weise wurde die für das tmk-Gen codierende DNA-Sequenz von C. glutamicum gefunden, die als SEQ ID Nr. 1 Bestandteil der vorliegenden Offenbarung ist. Weiterhin wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID Nr. 2 ist die sich ergebende Aminosäuresequenz des tmk-Genprodukts dargestellt.On this way was the for found the tmk gene encoding DNA sequence of C. glutamicum, the SEQ ID NO: 1 is part of the present disclosure. Farther was prepared from the present DNA sequence with those described above Methods the amino acid sequence derived from the corresponding protein. In SEQ ID No. 2 is the resulting amino acid sequence of the tmk gene product.
Codierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID Nr. 1 durch die Degeneriertheit des genetischen Codes ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Offenbarung. In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID Nr. 1 oder Teilen von SEQ ID Nr. 1 hybridisieren, Bestandteil der Offenbarung. In der Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche, wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als "Sinnmutationen" (sense mutations) bekannt, die zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen, d. h. funktionsneutral sind. Weiterhin ist bekannt, dass Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751–757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene 77: 237–251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240–247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321–1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender Weise aus SEQ ID Nr. 2 ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung.coding DNA sequences resulting from SEQ ID NO. 1 by the degeneracy of the genetic code are also part of the revelation. In the same way are DNA sequences with SEQ ID NO. 1 or Hybridize parts of SEQ ID NO: 1, part of the disclosure. In the professional world conservative amino acid substitutions are still such as B. Exchange of glycine for alanine or aspartic acid against glutamic acid in proteins as "sense mutations" (sense mutations) known to none of the fundamental change the activity lead the protein, d. H. are functionally neutral. Furthermore, it is known that changes at the N- and / or C-terminus of a protein its function is not essential impair or even stabilize. Information on this can be found among others at Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987)), O'Regan et al. (Gene 77: 237-251 (1989)), in Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240-247 (1994)), in Hochuli et al. (Bio / Technology 6: 1321-1325 (1988)) and in known textbooks genetics and molecular biology. Amino acid sequences resulting in corresponding Manner of SEQ ID NO. 2, are also part of the invention.
In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID Nr. 1 oder Teilen von SEQ ID Nr. 1 hybridisieren, Bestandteil der Offenbarung. Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Offenbarung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich aus SEQ ID Nr. 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.In Likewise, DNA sequences corresponding to SEQ ID NO: 1 or parts of SEQ ID NO: 1, part of the disclosure. Finally are DNA sequences part of the disclosure by the polymerase chain reaction (PCR) using primers that are from SEQ ID NO. Such oligonucleotides are typically a length of at least 15 nucleotides.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System User's Guide for Filter Hybridization" von Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255–260 (1991)). Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst oder bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, Großbritannien, 1996).instructions to identify DNA sequences by hybridization the expert, inter alia, in the manual "The DIG System User's Guide for Filter Hybridization" by Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) and Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). The hybridization takes place under stringent conditions, that is, it will be only hybrids are formed in which the probe and target sequence, i. H. the polynucleotides treated with the probe, at least 70% identical are. It is known that the stringency of hybridization including the Wash steps by varying the buffer composition, the temperature and the salt concentration is influenced or determined. The hybridization reaction is preferably at relatively low stringency compared to carried out the washing steps (Hybaid Hybridization Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein 5 × SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50ºC–68ºC eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70% Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2 × SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5 × SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von etwa 50ºC–68ºC eingestellt wird. Es ist gegebenenfalls möglich, die Salzkonzentration auf 0,1 × SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1–2ºC von 50ºC auf 68ºC können Polynukleotidfragmente isoliert werden, die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% bis 95% Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form so genannter Kits am Markt erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb von Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Katalognr. 1603558).For the hybridization reaction For example, a 5x SSC buffer used at a temperature of about 50 ° C-68 ° C become. It can Probes also hybridize with polynucleotides that are less than 70% identity to the sequence of the probe. Such hybrids are less stable and are removed by washing under stringent conditions. This can be done, for example, by lowering the salt concentration 2 × SSC and optionally subsequently 0.5 × SSC (The DIG System User's Guide for Filters Hybridization, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995) be reached, setting a temperature of about 50 ° C-68 ° C becomes. It may be possible the salt concentration to 0.1x SSC to lower. By gradually increasing the hybridization temperature in steps of about 1-2 ° C from 50 ° C to 68 ° C, polynucleotide fragments be isolated, for example, at least 70% or at least 80% or at least 90% to 95% identity to the sequence used Own probe. Further instructions for hybridization are in form so-called kits available on the market (eg DIG Easy Hyb from Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat. 1603558).
Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, Großbritannien, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).instructions for the amplification of DNA sequences using the polymerase chain reaction The expert will find (PCR) among others in the handbook of Gait: Oligonucleotides Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) and Newton and Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994).
Es hat sich herausgestellt, dass coryneforme Bakterien nach Ausschaltung des tmk-Gens in verbesserter Weise L-Lysin produzieren.It has been found to be coryneform bacteria after elimination of the tmk gene in an improved manner to produce L-lysine.
Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression des tmk-Gens oder die katalytischen Eigenschaften des Enzymproteins ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.to Achieving a slowdown can either the expression of the tmk gene or the catalytic properties of the enzyme protein are turned off. If necessary, both can Measures combined become.
Die Verringerung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen.The Reduction of gene expression can be achieved by appropriate culture guidance or through genetic modification (Mutation) of the signal structures of gene expression.
Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startcodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998)), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), bei Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)), Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie, wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).Signaling structures of gene expression include repressor genes, activator genes, operators, promoters, attenuators, ribosome binding sites, the start codon, and terminators. Information on this is the expert z. In WO 96/15246, Boyd and Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)) Voskuil and Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998)), Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)), Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999)) and in known textbooks of genetics and molecular biology, such as. B. the textbook by Knippers ("Molecular Genetics", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995) or Winnacker ("Gene and clones", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990).
Mutationen, die zu einer Veränderung oder Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611–8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760–1762 (1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN 09442952, Jülich, Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.mutations the change or lowering the catalytic properties of enzyme proteins to lead, are known in the art; as examples are the Works by Qiu and Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) and Möckel ("Threonine dehydratase from Corynebacterium glutamicum: abolition of allosteric regulation and structure of the enzyme ", Reports of Forschungszentrum Jülichs, Jül-2906, ISSN 09442952, Jülich, Germany, 1994). Summaries can be known textbooks of the Genetics and molecular biology such. B. that of Hagemann ("General Genetics", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar (bp) in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), in deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Codonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie, wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.When Mutations include transitions, transversions, insertions and Deletions into consideration. Dependent on from the effect of amino acid exchange on the enzyme activity is caused by missense mutations ("missense mutations ") or Nonsense mutations ("nonsense mutations "). Insertions or deletions of at least one base pair (bp) in a gene lead to frame shift mutations, as a result wrong amino acids be installed or the translation aborts prematurely. deletions of several codons typically to a complete one Failure of enzyme activity. instructions for generating such mutations belong to the prior art and can known textbooks genetics and molecular biology, such as B. the textbook by Knippers ("Molecular genetics", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995), that of Winnacker ("Genes and Clones", VCH Publishing Company, Weinheim, Germany, 1990) or that of Hagemann ("General Genetics", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung ("gene disruption") und des Gen-Austauschs ("gene replacement").A common The method of mutating genes of C. glutamicum is that of Schwarzer and Pühler (Bio / Technology 9, 84-87 (1991)) method of gene disruption and gene replacement.
Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler Teil der Codierregion des betreffenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784–791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69–73 (1994)), pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462–65 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994), Journal of Biological Chemistry 269: 32678–84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534–541 (1993)) oder pEMl (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510–4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zentrale Teil der Codierregion des Gens enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756–759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067–1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343–347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines Crossover-Ereignisses wird die Codierregion des fraglichen Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei unvollständige Allele, wobei einem das 3'- und einem das 5'-Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575–580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.In the method of gene disruption, a central part of the coding region of the gene in question is cloned into a plasmid vector which can replicate in a host (typically E. coli) but not in C. glutamicum. Examples of vectors used are pSUP301 (Simon et al., Bio / Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob or pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB or pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994), Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84 ; US Patent 5,487,993), pCR ® Blunt (Invitrogen, Groningen, The Netherlands; Bernard et al, Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993).) or pEMl (shrink et al, 1991, Journal of Bacteriology 173:. 4510-4516) in question. The plasmid vector containing the central part of the coding region of the gene is then converted by conjugation or transformation into the desired strain of C. glutamicum. The method of conjugation is described by Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Methods for transformation are described by Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican and Shivnan (Bio / Technology 7, 1067-1070 (1989)) and Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). After homologous recombination by means of a crossover event, the coding region of the gene in question is interrupted by the vector sequence and two incomplete alleles are obtained, one missing the 3 'and one 5' ends. This method has been described, for example, by Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) to eliminate the recA gene of C. glutamicum.
Bei der Methode des Genaustausches ("gene replacement") wird eine Mutation wie z. B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem betreffenden Gen in vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden Crossover-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden Crossover-Ereignisses im Zielgen oder in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation oder des Allels. Diese Methode wurde beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915–927 (1998)) zur Ausschaltung des pyc-Gens von C. glutamicum durch eine Deletion verwendet.at the method of gene exchange ("gene replacement ") a mutation such as As a deletion, insertion or base exchange produced in vitro in the gene in question. The produced allele will turn into a for C. glutamicum is not cloned replicative vector and this subsequently by Transformation or conjugation into the desired host of C. glutamicum. To homologous recombination by means of a first, effect integration Crossover event and a suitable second, causing an excision Achieved crossover event in the target gene or in the target sequence one the incorporation of the mutation or the allele. This method was for example, by Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) to eliminate the pyc gene of C. glutamicum by a deletion used.
In das tmk-Gen kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut werden.In this way, a deletion, insertion or base exchange can be incorporated into the tmk gene become.
Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des tmk-Gens eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glycolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.In addition, can it for the production of L-amino acids be beneficial, in addition to the weakening of the tmk gene one or several enzymes of the respective biosynthetic pathway, glycolysis, anaplerotic, the citric acid cycle, the pentose phosphate cycle, amino acid export and optionally regulatory To amplify proteins, especially overexpress.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechenden DNA codiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens oder der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) mit einer hohen Aktivität codiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.Of the Term "reinforcement" describes in this Related the increase the intracellular activity one or more enzymes (proteins) in a microorganism, which are encoded by the corresponding DNA, for example by the copy number of the gene or genes increases, a strong promoter used or a gene or allele used for a corresponding Enzyme (protein) encoded with a high activity and optionally these measures combined.
Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im Allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp-Proteins oder der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.By the measures the reinforcement, in particular overexpression, becomes the activity or concentration of the corresponding protein in general at least 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500%, at most up to 1000% or 2000% relative to the wild-type protein or the activity or increased concentration of the protein in the starting microorganism.
So kann beispielsweise für die Herstellung von L-Aminosäuren neben der Ausschaltung des tmk-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
- • dem für die Dihydrodipicolinat-Synthase codierenden Gen dapA (EP-B-0197335),
- • dem für die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase codierenden Gen gap (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
- • dem für die Triosephosphat-Isomerase codierenden Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
- • dem für die Phosphoglycerat-Kinase codierenden Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
- • dem für die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase codierenden Gen zwf (JP-A-09224661),
- • dem für die Pyruvat-Carboxylase codierenden Gen pyc (DE-A-19 831 609),
- • dem für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase codierenden Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395–403 (1998)),
- • dem für eine feedbackresistente Aspartatkinase codierenden Gen lysC (Zugriffsnummer P26512; EP-B-0387527; EP-A-0699759),
- • dem für den Lysin-Export codierenden Gen lysE (DE-A-19 548 222),
- • dem für die Homoserin-Dehydrogenase codierenden Gen hom (EP-A-0131171),
- • dem für die Threonin-Dehydratase codierenden Gen ilvA (Möckel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065–8072)) oder dem für eine "feedback-resistente" Threonin-Dehydratase codierenden Allel ilvA(Fbr) (Möckel et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833–842),
- • dem für die Acetohydroxysäure-Synthase codierenden Gen ilvBN (EP-B-0356739),
- • dem für die Dihydroxysäuredehydratase codierenden Gen ilvD (Sahm und Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973–1979),
- • dem für das Zwa1-Protein codierendem Gen zwa1 (DE 19959328.0, DSM 13115)
- The gene dapA coding for the dihydrodipicolinate synthase (EP-B-0197335),
- The gene gap coding for the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- The gene tpi coding for the triosephosphate isomerase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- The gene pgk coding for the phosphoglycerate kinase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- The gene coding for glucose-6-phosphate dehydrogenase, zwf (JP-A-09224661),
- The gene pyc coding for the pyruvate carboxylase (DE-A-19 831 609),
- The mqo gene coding for the malate quinone oxidoreductase (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),
- The feedback-resistant aspartate kinase-encoding gene lysC (accession number P26512, EP-B-0387527, EP-A-0699759),
- The lysine gene coding for lysine export (DE-A-19 548 222),
- The homoserine dehydrogenase-encoding gene hom (EP-A-0131171),
- The ilvA gene coding for the threonine dehydratase (Möckel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065-8072) or the allele ilvA (Fbr) encoding a feedback-resistant threonine dehydratase (Möckel et al. , (1994) Molecular Microbiology 13: 833-842),
- The gene ilvBN coding for the acetohydroxy acid synthase (EP-B-0356739),
- The gene for the dihydroxy acid dehydratase ilvD (Sahm and Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973-1979),
- The gene Zwa1 coding for the Zwa1 protein (DE 19959328.0, DSM 13115)
Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren vorteilhaft sein, neben der Ausschaltung des tmk-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
- • das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codierende Gen pH (DE 19950409.1, DSM 13047),
- • das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase codierende Gen pgi (US 09/396,478, DSM 12969),
- • das für die Pyruvatoxidase codierende Gen poxB (DE 19951975.7, DSM 13114),
- • das für das Zwa2-Protein codierende Gen zwa2 (DE 19959327.2, DSM 13113)
- The gene PH coding for the phosphoenolpyruvate carboxykinase (DE 19950409.1, DSM 13047),
- The gene pgi coding for the glucose-6-phosphate isomerase (US 09 / 396,478, DSM 12969),
- The gene poxB coding for pyruvate oxidase (DE 19951975.7, DSM 13114),
- The zwa2 gene coding for the Zwa2 protein (DE 19959327.2, DSM 13113)
Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren vorteilhaft sein, neben der Ausschaltung des tmk-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vartek (Hrsg.), Academic Press, London, Großbritannien, 1982).Farther can it for the production of amino acids be advantageous, in addition to the elimination of the tmk gene unwanted side reactions to turn off (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms ", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vartek (ed.), Academic Press, London, United Kingdom, 1982).
Die Erfindung stellt auch erfindungsgemäß hergestellte Mikroorganismen bereit, und diese können kontinuierlich oder diskontinuierlich im Batch-Verfahren (Satzkulti vierung) oder im Fed-Batch- (Zulaufverfahren) oder Repeated-Fed-Batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.The invention also provides microorganisms prepared according to the invention, and these can be cultivated continuously or batchwise (Satzculti vation) or in the fed-batch (feed process) or repeated-fed-batch process (repetitive feed process) for the purpose of producing L-amino acids. A summary of known cultivation methods is described in the textbook by Chmiel (Bioprocess 1. Introduction to Bioprocess Engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (Bioreactors and Peripheral Facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)) ,
Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.The The culture medium to be used must suitably meet the requirements of respective strains suffice. Descriptions of culture media for various microorganisms are in the manual "Manual of Methods for General Bacteriology "of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981).
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate, wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole, wie zum Beispiel Glycerol und Ethanol, und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure, verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.When Carbon source can Sugar and carbohydrates, such as Glucose, sucrose, lactose, Fructose, maltose, molasses, starch and cellulose, oils and fats, such as soybean oil, Sunflower oil, peanut oil and coconut oil, fatty acids, such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, Alcohols, such as glycerol and ethanol, and organic acids, such as acetic acid, be used. These substances can used singly or as a mixture.
Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff, oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.When Nitrogen source can organic nitrogenous compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, Malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea, or inorganic compounds, such as ammonium sulfate, ammonium chloride, Ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate become. The nitrogen sources can used singly or as a mixture.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essenzielle Wuchsstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine, zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Ausgangsstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.When Phosphorus source can Phosphoric acid, Potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts are used. The culture medium must continue to salts of metals, such as magnesium sulfate or ferrous sulfate, the for the growth is necessary. Finally, essential growth substances, like amino acids and vitamins, in addition used for the above-mentioned substances. The culture medium can also suitable precursors are added. The stated starting materials can added to culture in the form of a unique approach or in suitable way during fed to the cultivation become.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder Ammoniakwasser, oder saure Verbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglycolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20ºC bis 45ºC und vorzugsweise bei 25ºC bis 40ºC. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produkts gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.to pH control of the culture are basic compounds, such as sodium hydroxide, Potassium hydroxide, ammonia or ammonia water, or acidic compounds, like phosphoric acid or sulfuric acid, used in a suitable manner. To control foaming can Anti-foaming agents, such as fatty acid polyglycol esters used become. To maintain the stability of plasmids can the medium suitable selective substances, such as antibiotics, added become. To maintain aerobic conditions, oxygen is used or oxygen-containing gas mixtures, such as air, in the culture registered. The temperature of the culture is usually at 20 ° C up to 45ºC and preferably at 25 ° C to 40 ° C. The culture is continued until a maximum of the desired Product has formed. This goal is usually within from 10 hours to 160 hours.
Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch Umkehrphasen-HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167–1174) beschrieben.methods for the determination of L-amino acids are known from the prior art. The analysis can be for example as in Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) described by anion exchange chromatography with subsequent ninhydrin derivatization or may be by reverse phase HPLC, as in Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Lysin.The inventive method is used for the fermentative production of L-lysine.
Folgende Mikroorganismen wurden als Reinkulturen am 31. Juli 2001 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
- • Escherichia coli DH5alphamcr/pXK99E (= DH5αmcr/pXK99E) als DSM 14440,
- • Escherichia coli DH5alphamcr/pXK99Etmk (= DH5αmcr/pXK99Etmk) als DSM 14439.
- Escherichia coli DH5alphamcr / pXK99E (= DH5αmcr / pXK99E) as DSM 14440,
- Escherichia coli DH5alphamcr / pXK99Etmk (= DH5αmcr / pXK99Etmk) as DSM 14439.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.The The present invention will be described below with reference to exemplary embodiments explained in more detail.
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalischen Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) durchgeführt. Methoden zur Transformation von Escherichia coli sind ebenfalls in diesem Handbuch beschrieben.The isolation of plasmid DNA from Escherichia coli as well as all techniques for restriction, Klenow and alkaline phosphatase treatment were according to Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). Methods for Transformation of Escherichia coli are also described in this manual.
Die Zusammensetzung gängiger Nährmedien, wie LB- oder TY-Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook et al. entnommen werden.The Composition more common Culture Media, Like LB or TY medium can also be found in the Sambrook manual et al. be removed.
Beispiel 1example 1
Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus C. glutamicum ATCC 13032Producing a genomic Cosmid Genbank from C. glutamicum ATCC 13032
Chromosomale DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei Tauch et al., (1995, Plasmid 33: 168–179) beschrieben, isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3A2, Codenr. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit Shrimp-alkalischer-Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Codenr. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84: 2160–2164), bezogen von Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Codenr. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Codenr. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit Shrimpalkalischer-Phosphatase dephosphoryliert.chromosomal DNA from C. glutamicum ATCC 13032 was isolated as described by Tauch et al. (1995). Plasmid 33: 168-179) described isolated and with the restriction enzyme Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description Sau3A2, Codenr. 27-0913-02) partially split. The DNA fragments were digested with shrimp alkaline phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Product Description SAP, code no. 1758250) dephosphorylated. The DNA of the cosmid vector SuperCos1 (Wahl et al., 1987), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84: 2160-2164), purchased from Stratagene (La Jolla, USA, product description SuperCos1 Cosmid Vector Kit, Codenr. 251301) was digested with the restriction enzyme XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description XbaI, Codenr. 27-0948-02) and also with shrimp alkaline phosphatase dephosphorylated.
Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Codenr. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC 13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Codenr. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend mithilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Codenr. 200217) in Phagen verpackt.Subsequently was the cosmid DNA with the restriction enzyme BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Codenr. 27-0868-04). The cosmid DNA treated in this way was treated with the ATCC 13032 DNA mixed and the T4 DNA ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description T4 DNA Ligase, Code no. 27-0870-04). The ligation mixture was then used Gigapack II XL Packing Extract (Stratagene, La Jolla, USA, Product description Gigapack II XL Packing Extract, code no. 200217) packed in phages.
Zur Infektion des E. coli-Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16: 1563–1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO4 aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titrierung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) + 100 μg/ml Ampicillin ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden rekombinante Einzelklone selektioniert.To infect the E. coli strain NM554 (Raleigh et al 1988, Nucleic Acid Res. 16: 1563-1575), the cells were taken up in 10 mM MgSO 4 and mixed with an aliquot of the phage suspension. Infection and titration of the cosmidbank were performed as described by Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), where the cells were plated on LB agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) + 100 μg / ml ampicillin. After overnight incubation at 37 ° C, recombinant single clones were selected.
Beispiel 2Example 2
Isolierung und Sequenzierung des Gens tmkinsulation and sequencing of the gene tmk
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Produktnr. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Produktnr. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit Shrimp-alkalischer-Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Produktnr. 1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Produktnr. 20021, Qiagen, Hilden, Deutschland).The Cosmid DNA of a single colony was analyzed using the Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer's instructions isolated and with the restriction enzyme Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product description Sau3AI, product no. 27-0913-02) partially split. The DNA fragments were treated with shrimp alkaline phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, product description SAP, product no. 1758250) dephosphorylated. After gel electrophoresis separation, the isolation was carried out the cosmid fragments in the size range from 1500 to 2000 bp with the QiaExII Gel Extraction Kit (product no. 20021, Qiagen, Hilden, Germany).
Die DNA des Sequenziervektors pZero-1, bezogen von der Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Produktnr. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Produktnr. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli-Stamm DH5αmcr (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 87: 4645–4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol. Letters, 123: 343–7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 mg/l Zeocin ausplattiert.The DNA of the sequencing vector pZero-1, obtained from Invitrogen (Groningen, Netherlands, Product Description Zero Background Cloning Kit, Product no. K2500-01) was digested with the restriction enzyme BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Product no. 27-0868-04) split. The ligation of the cosmid fragments into the sequencing vector pZero-1 was prepared as described by Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), wherein the DNA mixture with T4 ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany) overnight was incubated. This ligation mixture was then in the E. coli strain DH5αmcr (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 87: 4645-4649) electroporated (Tauch et al., 1994, FEMS Microbiol. Letters, 123: 343-7) and on LB agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) with 50 mg / l zeocin plated.
Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Produktnr. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Dideoxy-Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 74: 5463–5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wurde der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Produktnr. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgte in einem "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid"-Gel (29: 1) (Produktnr. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit dem "ABI Prism 377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).The plasmid preparation of the recombinant clones was carried out with the Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Germany). The sequencing was carried out according to the dideoxy chain termination method of Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74: 5463-5467) with modifications according to Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). It became the "RR dRhodamin Ter minator Cycle Sequencing Kit "from PE Applied Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt, Germany) The gel electrophoretic separation and analysis of the sequencing reaction were carried out in a" Rotiphoresis NF acrylamide / bisacrylamide "gel (29: 1) (Product No. A124.1 , Roth, Karlsruhe, Germany) with the "ABI Prism 377" sequencer from PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Germany).
Die erhaltenen Rohsequenzdaten wurden anschließend unter Anwendung des Staden-Programpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) Version 97-0 verarbeitet. Die Einzelsequenzen der pZerol-Derivate wurden zu einem zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützten Codierbereichsanalysen wurden mit dem Pragramm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) angefertigt. Weitere Analysen wurden mit den "BLAST search programs" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389–3402) gegen die nonredundante Datenbank des "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA) durchgeführt.The The crude sequence data obtained were subsequently analyzed using the Staden program package (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) version 97-0. The single sequences of the pZerol derivatives became a related Contig assembles. The computer-aided coding area analyzes were determined by the formula XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) prepared. Further analyzes were carried out with the "BLAST search programs" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402) against the nonredundant Database of the "National Center for Biotechnology Information "(NCBI, Bethesda, MD, USA).
Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID Nr. 1 dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein offenes Leseraster von 612 bp, welches als tmk-Gen bezeichnet wurde. Das tmk-Gen codiert für ein Polypeptid von 203 Aminosäuren (siehe SEQ ID Nr. 2).The The nucleotide sequence obtained is shown in SEQ ID NO: 1. The Analysis of the nucleotide sequence revealed an open reading frame of 612 bp, which was called tmk gene. The tmk gene encodes a polypeptide of 203 amino acids (see SEQ ID NO: 2).
Beispiel 3Example 3
Herstellung des Expressionsvektors pXK99Etmk zur IPTG-induzierten Expression des tmk-Gens in C. glutamicumProduction of the expression vector pXK99Etmk for IPTG-induced Expression of the tmk gene in C. glutamicum
3.1 Klonierung des tmk-Gens3.1 Cloning of the tmk gene
Aus
dem Stamm ATCC 13032 wurde nach der Methode von Eikmanns et al.
(Microbiology 140: 1817–1828
(1994)) chromosomale DNA isoliert. Auf der Grundlage der aus Beispiel
2 für C.
glutamicum bekannten Sequenz des tmk-Gens wurden die folgenden Oligonukleotide
für die
Polymerase-Kettenreaktion ausgewählt
(siehe SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4):
tmk for:
5'-TG GGT ACC-ATT CAA GCC GGA GCA CTA CC-3'
tmk int:
5'-GA TCT AGA-CAG CGC CGA ATC CGA TTC AT-3'From strain ATCC 13032, the method of Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) isolated chromosomal DNA. Based on the sequence of the tmk gene known from Example 2 for C. glutamicum, the following oligonucleotides were selected for the polymerase chain reaction (see SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4):
tmk for:
5'-TG GGT ACC- SAT CAA GCC GGA GCA CTA CC-3 '
tmk int:
5'-GA TCT AGA -CAG CGC CGA ATC CGA TTC AT-3 '
Dabei wurden die Primer so ausgewählt, dass das amplifizierte Fragment das unvollständige Gen, beginnend mit der nativen Ribosomen-Bindestelle ohne Promotor-Region, sowie den vorderen Bereich des tmk-Gens enthält. Außerdem enthält der Primer tmk for die Sequenz für die Spaltstelle der Restriktionsendonuklease KpnI, und der Primer tmk int die Spaltstelle der Restriktionsendonuklease XbaI, die in der oben dargestellten Nukleotidabfolge durch Unterstreichen markiert sind.there the primers were chosen that the amplified fragment is the incomplete gene, starting with the native ribosome binding site without promoter region, as well as the anterior Contains the area of the tmk gene. Furthermore contains the primer tmk for the sequence for the cleavage site of the restriction endonuclease KpnI, and the primer tmk int the cleavage site of the restriction endonuclease XbaI, which in marked by underlining the nucleotide sequence shown above are.
Die dargestellten Primer wurden von MWG-Biotech AG (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und die PCR-Reaktion nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase von Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion ermöglichen die Primer die Amplifikation eines 520 bp großen DNA-Fragments, welches das unvollständige tmk-Gen einschließlich der nativen Ribosomen-Bindestelle trägt.The The primers shown were obtained from MWG Biotech AG (Ebersberg, Germany). synthesized and the PCR reaction according to the standard PCR method of Innis et al. (PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) with Pwo polymerase by Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Germany). aid the polymerase chain reaction, the primers allow amplification a 520 bp big one DNA fragment containing the incomplete tmk gene including the carries native ribosome binding site.
Das 520 bp große tmk-Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und XbaI gespalten und anschließend aus dem Agarosegel mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Produktnr. 20021, Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert.The 520 bp in size tmk fragment was digested with the restriction endonucleases KpnI and XbaI split and then from the agarose gel with the QiaExII Gel Extraction Kit (product no. 20021, Qiagen, Hilden, Germany).
3.2 Konstruktion des Expressionsvektors pXK99E3.2 Construction of the expression vector pXK99E
Nach dem Stand der Technik wurde der IPTG-induzierbare Expressionsvektor pXK99E konstruiert. Der Vektor basiert auf dem Escherichia coli-Expressionsvektor pTRC99A (Amann et al., Gene 69: 301–315 (1988)) und enthält den durch Zugabe des Lactose-Derivats IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) induzierbaren trc-Promotor, die Terminationsregionen T1 und T2, den Replikationsursprung ColE1 aus E. Coli, das lacIq-Gen (Repressor des lac-Operons von E. coli), eine Mehrfachklonierschnittstelle (mcs) (Norrander, J. M. et al. Gene 26, 101–106 (1983)) und das Kanamycin-Resistenzgen-Gen aph(3')-IIa aus E. coli (Beck et al. (1982), Gene 19: 327–336).In the prior art, the IPTG-inducible expression vector pXK99E was constructed. The vector is based on the Escherichia coli expression vector pTRC99A (Amann et al., Gene 69: 301-315 (1988)) and contains the trc promoter inducible by addition of the lactose derivative IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside), the termination regions T1 and T2, the replication origin ColE1 from E. coli, the lacI q gene (repressor of the lac operon of E. coli), a multiple cloning site (mcs) (Norrander, JM et al., Gene 26, 101-106 ( 1983)) and the kanamycin resistance gene gene aph (3 ') - IIa from E. coli (Beck et al., 1982, Gene 19: 327-336).
Es hat sich herausgestellt, dass sich der Vektor pXK99E ganz speziell dazu eignet, die Expression eines Gens zu regulieren, insbesondere die abgeschwächte Expression in coryneformen Bakterien zu bewirken. Der Vektor pXK99E ist ein E. coli-Expressionsvektor und kann in E. coli zur verstärkten Expression eines Gens eingesetzt werden.It It turned out that the vector pXK99E is very special suitable for regulating the expression of a gene, in particular the weakened Effect expression in coryneform bacteria. The vector pXK99E is an E. coli expression vector and can be expressed in E. coli for enhanced expression of a gene.
Da der Vektor in coryneforme Bakterien nicht selbstständig replizieren kann, bleibt dieser nur dann in der Zelle erhalten, wenn er in das Chromosom integriert. Die Besonderheit dieses Vektors hierbei ist der Einsatz zur regulierten Expression eines Gens nach Klonierung eines Genabschnitts aus dem vorderen Bereich des entsprechenden Gens in den Vektor, enthaltend das Startcodon und die native Ribosomen-Bindestelle, mit anschlie ßender Integration des Vektors in coryneformen Bakterien, insbesondere C. glutamicum. Durch Zugabe dosierter Mengen von IPTG zum Nährmedium wird die Genexpression reguliert. Dabei bewirken Mengen von 1 μM/l bis zu 10 M/l IPTG eine sehr schwache Expression des entsprechenden Gens und Mengen von 10 μM/l bis zu 100 μM/l eine leicht abgeschwächte bis normale Expression des entsprechenden Gens.There the vector does not self-replicate in coryneform bacteria can only stay in the cell if it is in the Chromosome integrated. The peculiarity of this vector here is the use for the regulated expression of a gene after cloning a gene section from the front of the corresponding Gene into the vector containing the start codon and the native ribosome binding site, with following Integration of the vector into coryneform bacteria, in particular C. glutamicum. By adding dosed amounts of IPTG to the nutrient medium the gene expression is regulated. This effect amounts of 1 uM / l up to 10 M / l IPTG a very weak expression of the corresponding gene and amounts of 10 μM / l up to 100 μM / l a slightly weakened until normal expression of the corresponding gene.
Der konstruierte E. coli-Expressionsvektor pXK99E wurde mittels Elektroporation (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343–347) in E. coli-DH5αmcr (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645–4649) transferiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), der mit 50 mg/l Kanamycin supplementiert worden war.Of the engineered E. coli expression vector pXK99E was electroporated (Tauch et al., 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-347) E. coli DH5αmcr (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649) transferred. The selection of the transformants was carried out on LB agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) supplemented with 50 mg / l kanamycin.
Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante nach den üblichen Methoden isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915–927), mit der Restriktionsendonuklease NcoI gespalten und das Plasmid durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese überprüft.Plasmid DNA was isolated from a transformant by the usual methods (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927) with the restriction endonuclease NcoI cleaved and the plasmid checked by subsequent agarose gel electrophoresis.
Das
so erhaltene Plasmidkonstrukt wurde als pXK99E (
3.3 Klonierung des tmk-Fragments in den E. coli-Expressionsvektor pXK99E3.3 Cloning of the tmk fragment into the E. coli expression vector pXK99E
Als Vektor wurde der in Beispiel 3.2 beschriebene E. coli-Expressionsvektor pXK99E verwendet. DNA dieses Plasmids wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und XbaI vollständig gespalten und anschließend mit Shrimpalkalischer-Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Produktnr. 1758250) dephosphoryliert.When The vector became the E. coli expression vector described in Example 3.2 used pXK99E. DNA of this plasmid was digested with the restriction enzymes KpnI and XbaI complete split and then with Shrimp Alkaline Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, product description SAP, product no. 1758250) dephosphorylated.
Das
in Beispiel 3.1 beschriebene, mittels PCR gewonnene und mit den
Restriktionsendonukleasen KpnI und XbaI gespaltene ca. 500 bp große tmk-Fragment
wurde mit dem vorbereiteten Vektor pXK99E gemischt. Der Ansatz wurde
mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung
T4-DNA-Ligase, Codenr. 27-0870-04) behandelt. Der Ligationsansatz
wurde in den E. coli-Stamm DH5αmcr
(Hanahan, in: DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. I, IRL-Press,
Oxford, Washington DC, USA) transformiert. Die Selektion von Plasmid
tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes
auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 mg/l Kanamycin.
Nach Inkubation über
Nacht bei 37ºC
wurden rekombinante Einzelklone selektioniert. Plasmid-DNA wurde
aus einer Transformante mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Produktnr.
27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben isoliert und
mit den Restriktionsenzymen KpnI und XbaI gespalten, um das Plasmid
durch anschließende
Agarosegel-Elektrophorese zu überprüfen. Das
erhaltene Plasmid wurde pXK99Etmk genannt. Es ist in
Beispiel 4Example 4
Integration des Vektors pXK99Etmk in das Genom des C. glutamicum-Stammes DSM 5715Integration of the vector pXK99Etmk into the genome of the C. glutamicum strain DSM 5715
Der in Beispiel 3 genannte Vektor pXK99Etmk wurde nach der Elekroporationsmethode von Tauch et al. (1989 FEMS Microbiology Letters 123: 343–347) in den Stamm C. glutamicum DSM 5715 elekroporiert. Der Vektor kann in DSM 5715 nicht selbstständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er in das Chromosom integriert ist. Die Selektion von Klonen mit integriertem pXK99Etmk erfolgte durch Ausplattieren des Elekroporationsansatzes auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, New York, 1989), der mit 15 mg/l Kanamycin und IPTG (1 mM/l) supplementiert worden war.Of the The vector pXK99Etmk mentioned in Example 3 was prepared by the method of electroporation by Tauch et al. (1989 FEMS Microbiology Letters 123: 343-347) in the strain C. glutamicum DSM 5715 is electroporated. The vector can not independent in DSM 5715 replicate and remains in the cell only when it enters the Chromosome is integrated. The selection of clones with integrated pXK99Etmk was performed by plating the Elekroporationsansatzes on LB agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor, New York, 1989), with 15 mg / l Kanamycin and IPTG (1 mM / L).
Für den Nachweis der Integration wurde das tmk-Fragment nach der Methode "The DIG System User's Guide for Filter Hybridization" von Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) mit dem Dig-Hybridisierungskit von Boehringer markiert. Chromosomale DNA einer potenziellen Integranten wurde nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) isoliert und jeweils mit den Restriktionsenzymen NcoI und KpnI gespalten. Die entstehenden Fragmente wurden mittels der Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt und mit dem Dig-Hybrisierungskit von Boehringer bei 68ºC hybridisiert. Das in Beispiel 3 genannte Plasmid pXK99Etmk wurde innerhalb des chromosomalen tmk-Gens in das Chromosom von DSM 5715 inseriert. Der Stamm wurde als DSM5715::pXK99Etmk bezeichnet.For the proof In the integration, the tmk fragment was modeled after the method "The DIG System User's Guide for Filter Hybridization "of Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) with the Dig hybridization kit marked by Boehringer. Chromosomal DNA of a potential integrants was determined by the method of Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) isolated and each cleaved with the restriction enzymes NcoI and KpnI. The resulting fragments were separated by agarose gel electrophoresis and with the Dig Hybrisierungskit from Boehringer at 68 ° C hybridized. The plasmid pXK99Etmk mentioned in Example 3 was within the chromosomal tmk gene into the chromosome of DSM 5715 inserted. The root was named DSM5715 :: pXK99Etmk.
Beispiel 5Example 5
Herstellung von LysinProduction of lysine
Der in Beispiel 4 erhaltene C. glutamicum-Stamm DSM5715::pXK99Etmk wurde in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt. Durch Zugabe von IPTG (10 μM/l) kommt es, durch den trc-Promotor reguliert, zu einer abgeschwächten Expression des tmk-Gens.Of the C. glutamicum strain DSM5715 :: pXK99Etmk obtained in Example 4 cultivated in a suitable for the production of lysine nutrient medium and the Lysine content in the culture supernatant certainly. Addition of IPTG (10 μM / L) occurs through the trc promoter regulated, to a weakened Expression of the tmk gene.
Der
Stamm wurde zunächst
auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar
mit Kana mycin (25 mg/l) und IPTG (10 μM/l) 24 Stunden lang bei 33ºC inkubiert.
Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft
(10 ml Medium im 100-ml-Erlenmeyerkolben).
Als Medium für
die Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII verwendet. Cg
III Medium
Der pH-Wert wurde auf pH 7.4 eingestellt.Of the pH was adjusted to pH 7.4.
Diesem
wurden Kanamycin (25 mg/l) und IPTG (10 μM/l) zugesetzt. Die Vorkultur
wurde 16 Stunden bei 33ºC
bei 240 Umdr./min auf einem Schüttler
inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft,
sodass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD betrug. Für die Hauptkultur
wurde das Medium MM verwendet. MM
Medium
CSL, MOPS und die Salzlösung werden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend werden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt sowie das trocken autoklavierte CaCO3 zugesetzt.CSL, MOPS and saline are adjusted to pH 7 with ammonia water and autoclaved. Subsequently, the sterile substrate and vitamin solutions are added and the dry autoclaved CaCO 3 is added.
Die Kultivierung erfolgt in einem 10-ml-Volumen in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Diesem wurden Kanamycin (25 mg/l) und IPTG (10 μM/l) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33ºC und 80% Luftfeuchtigkeit.The Cultivation is done in a 10 ml volume in a 100 ml Erlenmeyer flask with harassment. To this was added Kanamycin (25 mg / L) and IPTG (10 μM / L). The cultivation was carried out at 33 ° C and 80% humidity.
Nach 72 Stunden wurde die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete Lysinmenge wurde mit einem Aminosäureanalysator von Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt.To 72 hours, the OD at a measuring wavelength of 660 nm with the Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich). The educated Amount of lysine was analyzed with an amino acid analyzer from Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany) by ion exchange chromatography and post column derivatization determined by ninhydrin detection.
Die Ergebnisse des Versuchs gehen aus Tabelle 1 hervor.The Results of the experiment are shown in Table 1.
Tabelle 1 Table 1
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:Short description of Drawings:
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung.
- Kan:
- Kanamycin-Resistenzgen aph(3')-IIa aus Escherichia coli
- KpnI
- Spaltstelle des Restriktionsenzyms KpnI
- NcoI
- Spaltstelle des Restriktionsenzyms NcoI
- XbaI
- Spaltstelle des Restriktionsenzyms XbaI
- Ptrc
- trc-Promotor
- T1
- Terminationsregion T1
- T2
- Terminationsregion T2
- lacIq
- lacIq-Repressor des lac-Operons von Escherichia coli
- oriV
- Replikationsursprung ColE1 aus E. coli
- tmk
- klonierter Bereich des tmk-Gens
- Kan:
- Kanamycin resistance gene aph (3 ') - IIa from Escherichia coli
- KpnI
- Cleavage site of the restriction enzyme KpnI
- NcoI
- Cleavage site of the restriction enzyme NcoI
- XbaI
- Cleavage site of the restriction enzyme XbaI
- ptrc
- trc promoter
- T1
- Termination region T1
- T2
- Termination region T2
- lacI.sup.q
- lacIq repressor of the lac operon of Escherichia coli
- ori V
- Origin of replication ColE1 from E. coli
- tmk
- cloned region of the tmk gene
SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LISTING
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8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
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