DE60105034T2

DE60105034T2 - NUCLEOTIDE SEQUENCES CODING FOR THE LYSR2 GEN

Info

Publication number: DE60105034T2
Application number: DE60105034T
Authority: DE
Inventors: Bettina Möckel; Mike Farwick; Thomas Hermann; Caroline Kreutzer; Walter Pfefferle
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-08-10
Filing date: 2001-06-15
Publication date: 2005-08-11
Anticipated expiration: 2021-06-16
Also published as: DE60105034D1; DE10110346A1; KR20030024841A; KR100824551B1

Description

Gegenstand der Erfindung sind isolierte coryneforme Bakterien, bei denen die Expression von Nucleotidsequenzen, die das lysR2-Gen kodieren, beseitigt ist, sowie ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin und L-Valin durch Beseitigen des lysR2-Gens. Das LysR2-Gen kodiert das LysR2-Protein, das ein Transkriptionsregulator der LysR-Familie ist.object The invention relates to isolated coryneform bacteria in which the Expression of nucleotide sequences encoding the lysR2 gene is eliminated and a process for the fermentative production of L-lysine and L-valine by eliminating the lysR2 gene. The LysR2 gene encodes the LysR2 protein, which is a transcriptional regulator of the LysR family is.

Stand der TechnikState of the art

L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Valin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und vor allem in der Tierernährung Verwendung.L-amino acids, in particular L-lysine and L-valine, found in human medicine and in the pharmaceutical Industry, in the food industry and especially in animal nutrition use.

Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Aufgrund ihrer großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellungsverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch beispielsweise Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.It is known to be amino acids by fermentation of stems coryneform bacteria, in particular Corynebacterium glutamicum, getting produced. Because of their great importance is constantly at the Improvement of the manufacturing process worked. process improvements can fermentation measures, such as emotion and supply of oxygen, or the composition of the nutrient media, such as the sugar concentration during fermentation, or the work-up to the product form by, for example, ion exchange chromatography or the intrinsic performance characteristics of the microorganism concern yourself.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise werden Stämme erhalten, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die Aminosäuren produzieren.to Improve the performance characteristics of these microorganisms Methods of mutagenesis, selection and mutant selection applied. That's how tribes are made get resistant to antimetabolite or auxotrophic for regulatory are significant metabolites and produce the amino acids.

Seit einigen Jahren werden auch Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L- Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium angewendet.since Some years will also be methods of recombinant DNA technology for strain improvement of L-amino acid producing strains applied by Corynebacterium.

M. Vrljic et al. (Molecular Microbiology, Blackwell Scientific, Oxford, GB, Bd. 22, Nr. 5, 1. Dezember 1996 (1996-12-01), Seiten 815–826, XP 000675794 ISSN: 0950-382X beschreiben einen corynebakteriellen Stamm, dem lysG fehlt, ein Mitglied der LysR-Familie von Regulatoren. Es liegt allerdings keine bedeutende Sequenzhomologie zwischen LysG und LysR vor, und der dort gezeigte Effekt auf die Lysin-Produktion wurde eher mit der Unterbrechung des Exportproteins LysE als mit der Unterbrechung von LysG in Verbindung gebracht.M. Vrljic et al. (Molecular Microbiology, Blackwell Scientific, Oxford, GB, Vol. 22, No. 5, December 1, 1996 (1996-12-01), pages 815-826, XP 000675794 ISSN: 0950-382X describe a corynebacterial strain, lysG is missing, a member of the regulator's LysR family. It however, there is no significant sequence homology between LysG and LysR, and the effect on lysine production shown there became more likely with an interruption of the export protein LysE as with an interruption from LysG.

Aufgabe der ErfindungTask of invention

Die Erfinder hatten die Aufgabe, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Lysin und L-Valin bereitzustellen.The Inventors had the task of introducing new measures for improved fermentative fermentation Production of L-lysine and L-valine provide.

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

Gegenstand der Erfindung ist:
ein isoliertes coryneformes Bakterium, bei dem die Expression eines Polynucleotids, das ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz hat, die zu wenigstens 90% identisch mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 2 ist, beseitigt ist, wobei das Polypeptid die Funktion eines Transkriptionsregulators der lysR-Familie hat.The subject of the invention is:
an isolated coryneform bacterium in which expression of a polynucleotide encoding a polypeptide having an amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence in SEQ ID NO: 2 is eliminated, said polypeptide functioning as a transcriptional regulator of the lysR family has.

Vorzugsweise hat das genannte Polypeptid die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2.Preferably the said polypeptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

Vorzugsweise hat, das Polynucleotid

a) die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte Nucleotidsequenz oder
b) wenigstens eine Sequenz, die der Sequenz a) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder optional
c) funktionsneutrale Sinnmutationen in a), die die Aktivität des Proteins/Polypeptids nicht modifizieren.

Preferably, the polynucleotide

a) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO
b) at least one sequence corresponding to the sequence a) within the range of the degeneracy of the genetic code, or optionally
c) functionally neutral sense mutations in a) that do not modify the activity of the protein / polypeptide.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind:
ein Vektor, der das interne Fragment der in SEQ ID Nr. 3 dargelegten SEQ ID Nr. 1 umfasst, und coryneforme Bakterien, bei denen das lysR2-Gen insbesondere durch eine Insertion oder Deletion beseitigt ist.Further objects of the invention are:
a vector comprising the internal fragment of SEQ ID NO: 1 set forth in SEQ ID NO: 3, and coryneform bacteria in which the lysR2 gene is particularly eliminated by insertion or deletion.

Beschrieben werden Polynucleotide, die im Wesentlichen aus einer Polynucleotidsequenz bestehen, die erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank, die das vollständige Gen mit der Polynucleotidsequenz entsprechend SEQ ID Nr. 1 enthält, mit einer Sonde, die die Sequenz des genannten Polynucleotids gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein Fragment davon enthält, und Isolierung der genannten DNA-Sequenz.Described are polynucleotides consisting essentially of a polynucleotide sequence, obtainable by screening by hybridization of a corresponding gene bank containing the complete gene with the polynucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 1, with a probe containing the sequence of said polynucleotide according to SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof, and isolation the said DNA sequence.

Erfindungsgemäße Polynucleotidsequenzen sind als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um Nucleinsäuren oder Polynucleotide oder Gene, die das LysR2-Protein kodieren, in voller Länge zu isolieren oder um solche Nucleinsäuren oder Polynucleotide oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz des lysR2-Gens haben. Sie sind außerdem für den Einbau in so genannte „Arrays", „Mikro-Arrays" oder „DNA-Chips" geeignet, um die entsprechenden Polynucleotide nachzuweisen und zu bestimmen.Polynucleotide sequences of the invention are as hybridization probes for RNA, cDNA and DNA suitable for nucleic acids or polynucleotides or Genes that contain the LysR2 protein code, full length too or isolate such nucleic acids or polynucleotides or Isolate genes that are highly similar to the sequence of the lysR2 gene. They are also suitable for installation in so-called "arrays", "micro-arrays" or "DNA chips" to the detect and determine corresponding polynucleotides.

Polynucleotidsequenzen gemäß der Beschreibung sind ferner als Primer geeignet, mit deren Hilfe DNA von Genen, die das LysR2-Protein kodieren, mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt werden kann.polynucleotide sequences according to the description are also suitable as primers, with the help of which DNA of genes, which encode the LysR2 protein, with the polymerase chain reaction (PCR) can be produced.

Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonucleotide umfassen wenigstens 25, 26, 27, 28, 29 oder 30, vorzugsweise wenigstens 20, 21, 22, 23 oder 24, besonders bevorzugt wenigstens 15, 16, 17, 18 oder 19 aufeinander folgende Nucleotide. Oligonucleotide mit einer Länge von wenigstens 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40 oder wenigstens 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Nucleotiden sind ebenfalls geeignet. Oligonucleotide mit einer Länge von wenigstens 100, 150, 200, 250 oder 300 Nucleotiden sind bei Bedarf auch geeignet.Such at least one of oligonucleotides serving as probes or primers 25, 26, 27, 28, 29 or 30, preferably at least 20, 21, 22, 23 or 24, more preferably at least 15, 16, 17, 18 or 19 consecutive nucleotides. Oligonucleotides of length at least 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 or 40 or at least 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 or 50 nucleotides are also suitable. Oligonucleotides of at least 100, 150, 200, 250 or 300 nucleotides are also suitable if required.

„Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld herausgetrennt."Isolated" means from his natural Separated environment.

„Polynucleotid" bezieht sich im Allgemeinen auf Polyribonucleotide und Polydesoxyribonucleotide, wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA handeln kann."Polynucleotide" refers to Generally to polyribonucleotides and polydeoxyribonucleotides, which is unmodified RNA or DNA or modified RNA or DNA can act.

Unter „Polypeptiden" sind Peptide oder Proteine zu verstehen, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren umfassen.By "polypeptides" are peptides or To understand proteins that have two or more linked by peptide bonds amino acids include.

Die Polypeptide schließen ein Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 2 mit der biologischen Aktivität des LysR2-Proteins und auch solche ein, die zu wenigstens 90%, besonders bevorzugt zu wenigstens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% identisch mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 2 sind und die genannte Aktivität aufweisen.The Close polypeptides a polypeptide according to SEQ ID # 2 with the biological activity of the LysR2 protein and also those which are at least 90%, more preferably at least 91%, 93%, 95%, 97% or 99% identical to the polypeptide according to SEQ ID No. 2 and have the said activity.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L-Lysin und L-Valin, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits die genannten Aminosäuren produzieren und in denen die das lysR2-Gen kodierenden Nukleotidsequenzen beseitigt werden.The The invention further relates to a process for fermentative production of amino acids, selected from the group consisting of L-lysine and L-valine, using of coryneform bacteria, especially those already mentioned amino acids and in which the nucleotide sequences encoding the lysR2 gene be eliminated.

Der Begriff „Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Beseitigung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem beispielsweise ein schwacher Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet wird, das ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert oder das entsprechende Gen oder Allel oder Enzym (Protein) inaktiviert, und bei Bedarf diese Maßnahmen kombiniert werden.Of the Term "weakening" describes in this Related to the elimination of the intracellular activity of one or more enzymes (Proteins) in a microorganism, by the appropriate DNA, for example by a weak promoter or a gene or allele is used which is a corresponding enzyme with a low activity encodes or the corresponding gene or allele or enzyme (protein) inactivated, and if necessary, these measures are combined.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Lysin und L-Valin aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebacterium, handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Spezies Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.The Microorganisms which are the subject of the present invention can L-lysine and L-valine from glucose, sucrose, lactose, fructose, Maltose, molasses, starch, Cellulose or from glycerol and ethanol. It may be to representatives of coryneformer bacteria, in particular the genus Corynebacterium act. In the genus Corynebacterium, in particular, the species Corynebacterium glutamicum, which is known in the art for its ability to L-amino acids to produce.

Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Spezies Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
oder daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten oder Stämme, wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464
Corynebacterium glutamicum DM58-1
Corynebacterium glutamicum DG52-5
Corynebacterium glutamicum DSM 5715 und
Corynebacterium glutamicum DSM 12866
oder wie beispielsweise die L-Valin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum DSM 12455
Corynebacterium glutamicum FERM-P 9325
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 9324
Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 1763.Suitable strains of the genus Corynebacterium, in particular of the species Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), are especially the known wild-type strains
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium molassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 and
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
or L-amino acid producing mutants or strains produced therefrom, such as the L-lysine producing strains
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464
Corynebacterium glutamicum DM58-1
Corynebacterium glutamicum DG52-5
Corynebacterium glutamicum DSM 5715 and
Corynebacterium glutamicum DSM 12866
or such as the L-valine producing strains
Corynebacterium glutamicum DSM 12455
Corynebacterium glutamicum FERM-P 9325
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 9324
Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 1763.

Das lysR2-Gen von C. glutamicum, das LysR2-Protein kodiert, ist ein Transkriptionsregulator der LysR-Familie.The C. glutamicum lysR2 gene encoding LysR2 protein is a Transcriptional regulator of the LysR family.

Zum Isolieren des LysR2-Gens oder auch anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli) angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehr- und Handbüchern beschrieben. Als Beispiele sind das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990), oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) zu nennen. Eine sehr bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495–508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255–265, 1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160–2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563–1575) angelegt wurde. Börmann et al. (Molecular Microbiology 6 (3), 317–326 (1992) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und Collins, 1980, Gene 11, 291–298).To the Isolating the LysR2 gene or other genes of C. glutamicum will be first a gene bank of this microorganism in Escherichia coli (E. coli) created. The creation of gene banks is generally known in the teaching and manuals described. As examples are the textbook by Winnacker: Gene and Clones, an introduction into genetic engineering (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990), or the Handbook of Sambrook et al .: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). A well-known gene bank is the E. coli K-12 strain W3110, the by Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) in λ vectors was created. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996) describe a gene bank of C. glutamicum ATCC13032, the with the aid of the cosmid vector SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) E. coli K-12 strain NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) was created. Börmann et al. (Molecular Microbiology 6 (3), 317-326 (1992)) a library of C. glutamicum ATCC13032 using the cosmid pHC79 (Hohn and Collins, 1980, Gene 11, 291-298).

Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, 1979, Life Sciences, 25, 807–818) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259–268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E. coli-Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind, wie beispielsweise der Stamm DH5α (Jeffrey H. Miller: „A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992).to Production of a gene bank of C. glutamicum in E. coli can also Plasmids such as pBR322 (Bolivar, 1979, Life Sciences, 25, 807-818) or pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268). When Hosts are particularly suitable for those E. coli strains that are restriction and are recombination deficient, such as strain DH5α (Jeffrey H. Miller: "A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria ", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992).

Die mit Hilfe von Cosmiden oder anderen λ-Vektoren klonierten langen DNA-Fragmente können anschließend wiederum in gängige, für die DNA-Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert werden.The cloned with the help of cosmids or other λ vectors long DNA fragments can subsequently again in common, for the DNA sequencing suitable vectors are subcloned.

Methoden zur DNA-Sequenzierung werden unter anderem von Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA, 74: 5463–5467, 1977) beschrieben.methods for DNA sequencing, inter alia, by Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA, 74: 5463-5467, 1977).

Die resultierenden DNA-Sequenzen können dann mit bekannten Algorithmen oder Sequenzanalyse-Programmen wie z. B. dem von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217–232 (1986)), dem von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829–1836 (1988)) oder dem GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74–97 (1998)) untersucht werden.The resulting DNA sequences can then with known algorithms or sequence analysis programs like z. B. Staden's (Nucleic Acids Research 14, 217-232 (1986)), by Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) or the GCG program Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)) to be examined.

Auf diese Weise wurde die das lysR2-Gen kodierende DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die als SEQ ID Nr. 1 in der vorliegenden Anmeldung beschrieben wird. Weiterhin wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID Nr. 2 ist die sich ergebende Aminosäuresequenz des lysR-2-Genproduktes dargestellt. Es ist bekannt, dass wirtseigene Enzyme die N-terminale Aminosäure Methionin oder Formylmethionin des gebildeten Proteins abspalten können.On this way, the DNA sequence of C. encoding the lysR2 gene was obtained. glutamicum obtained as SEQ ID NO: 1 in the present application is described. Furthermore, from the present DNA sequence with the methods described above, the amino acid sequence of the corresponding Derived protein. In SEQ ID NO: 2 is the resulting amino acid sequence of the lysR-2 gene product. It is known that in-house Enzymes the N-terminal amino acid Cleave methionine or formyl methionine of the protein formed can.

Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID Nr. 1 durch die Degeneriertheit des genetischen Codes ergeben, sind ebenfalls bekannt. In gleicher Weise werden DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID Nr. 1 oder Teilen von SEQ ID Nr. 1 hybridisieren, beschrieben. In der Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche wie z. B. der Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als „Sinnmutationen" bekannt, die zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen, d. h. funktionsneutral sind. Ferner ist bekannt, dass Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können. Informationen hierzu findet die fachkundige Person unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751–757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene 77: 237–251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240–247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321–1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Es werden Aminosäuresequenzen beschrieben, die sich in entsprechender Weise aus SEQ ID Nr. 2 ergeben.coding DNA sequences resulting from SEQ ID NO. 1 by the degeneracy of the genetic code are also known. In the same Way become DNA sequences, which hybridize to SEQ ID NO: 1 or parts of SEQ ID NO: 1, described. In the professional world, conservative amino acid substitutions continue such as B. the exchange of glycine for alanine or aspartic acid against Glutamic acid in Proteins known as "sense mutations" that too no fundamental change the activity lead the protein, d. H. are functionally neutral. It is also known that changes at the N and / or C terminus a protein does not significantly affect its function or even stabilize. Information on this can be found by the expert person among others Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987)), in O'Regan et al. (Gene 77: 237-251 (1989)), in Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240-247 (1994)), in Hochuli et al. (Bio / Technology 6: 1321-1325 (1988)) and in known textbooks genetics and molecular biology. There will be amino acid sequences described in a corresponding manner from SEQ ID NO. 2.

Schließlich werden DNA-Sequenzen beschrieben, die durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich aus SEQ ID Nr. 1 ergeben. Solche Oligonucleotide haben typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nucleotiden.Finally DNA sequences described by the polymerase chain reaction (PCR) using primers that are from SEQ ID NO. Such oligonucleotides are typically a length of at least 15 nucleotides.

Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybrisierung findet die fachkundige Person unter anderem im Handbuch „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255–260 (1991)). Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) findet die fachkundige Person unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).instructions to identify DNA sequences by hybridization the expert person among other things in the manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization "by Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) and Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). Instructions for the amplification of DNA sequences using the polymerase chain reaction (PCR) finds the specialized person inter alia in the Gait Handbook: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) and Newton and Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994).

Bei der Arbeit an der vorliegenden Erfindung konnte festgestellt werden, dass coryneforme Bakterien nach der Beseitigung des lysR2-Gens in verbesserter Weise L-Lysin und L-Valin produzieren.at the work on the present invention could be stated that coryneform bacteria after removal of the lysR2 gene in improved way to produce L-lysine and L-valine.

Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression des lysR2-Gens oder die katalytischen Eigenschaften des Enzymproteins beseitigt werden. Bei Bedarf können beide Maßnahmen kombiniert werden.to Achieving a slowdown can either the expression of the lysR2 gene or the catalytic properties of the enzyme protein. If necessary, both measures be combined.

Die Beseitigung der Genexpression kann durch geeignete Kultivierung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startcodon und Terminatoren. Informationen hierzu findet die fachkundige Person z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), bei Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)), Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).The Elimination of gene expression can be achieved by appropriate cultivation or by genetic modification (Mutation) of the signal structures of gene expression. signal structures gene expression are, for example, repressor genes, activator genes, Operators, promoters, attenuators, ribosome binding sites, the start codon and terminators. Information can be found on the competent person z. In patent application WO 96/15246 Boyd and Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)) Voskuil and Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998)) Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), at Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)), Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999)) and in known textbooks of Genetics and molecular biology such. B. the textbook by Knippers ( "Molecular Genetics ", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995) or the von Winnacker ("Gene and Clones ", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990).

Mutationen, die zu einer Veränderung oder Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele sind die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611–8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760–1762 (1997)) und Möckel („Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994) zu nennen. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.mutations the change or lowering the catalytic properties of enzyme proteins to lead, are known in the art; as examples are the works Qiu and Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) and Möckel ("The Threonine dehydratase from Corynebacterium glutamicum: repeal of allosteric regulation and structure of the enzyme, "reports the research center Jülich, Jül-2906 ISSN09442952, Jülich, Germany, 1994). Summary presentations may be known textbooks genetics and molecular biology such. B. von Hagemann ("General Genetics ", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustauschs auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen oder Nichtsinnmutationen gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar (bp) in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen, in deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Codonen führen typischerweise zu einem vollständigen Verlust der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.Mutations include transitions, transversions, insertions and deletions. Depending on the effect of the amino acid exchange on the enzyme activity is spoken of missense mutations or non-mutations. Insertions or deletions of at least one base pair (bp) in a gene lead to frameshift mutations, as a consequence of which incorrect amino acids are incorporated or the translation is prematurely terminated. Deletions of several codons typically result in complete loss of enzyme activity. Instructions for generating such mutations are known in the art and may be familiar to known textbooks of genetics and molecular biology such as, for example, US Pat. B. the textbook by Knippers ("Molecular Genetics", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995), by Winnacker ("Gene and Clones", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990) or by Hagemann ("General Genetics", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung und des Gen-Ersatzes.A common The method of mutating genes of C. glutamicum is that of Schwarzer and Pühler (Bio / Technology 9, 84-87 (1991)) method of gene disruption and gene replacement.

Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784–791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69–73 (1994)), pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462–65 (1992)), pGEM-T (Progema corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biology Chemistry 269: 32678–84; US-Patent 5,487,993), pCR^®Blunt (Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534–541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510–4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der den zentralen Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756–759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067–1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 342–347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "Cross-over"-Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'-Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575–580 (1994)) zur Beseitigung des recA-Gens von C. glutamicum angewendet.In the method of gene disruption, a central part of the coding region of the gene of interest is cloned into a plasmid vector which can replicate in a host (typically E. coli) but not in C. glutamicum. Examples of vectors used are pSUP301 (Simon et al., Bio / Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob or pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB or pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Progema Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994), Journal of Biology Chemistry 269: 32678-84 ; US Patent 5,487,993), pCR ^® Blunt (Invitrogen, Groningen, The Netherlands; Bernard et al, Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993).) or pEM1 (shrink et al, 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) in question. The plasmid vector containing the central part of the coding region of the gene is then converted by conjugation or transformation into the desired strain of C. glutamicum. The method of conjugation is described by Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Methods for transformation are described by Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican and Shivnan (Bio / Technology 7, 1067-1070 (1989)) and Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 342-347 (1994)). After homologous recombination by means of a "cross-over" event, the coding region of the gene in question is interrupted by the vector sequence and two incomplete alleles are obtained, each of which lacks the 3 'or the 5' end. This method has been described, for example, by Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) for the elimination of the C. glutamicum recA gene.

In 1 ist beispielhaft der Plasmidvektor pCR2.1lysR2int dargestellt, mit dessen Hilfe das LysR2-Gen unterbrochen oder beseitigt werden kann.In 1 For example, the plasmid vector pCR2.1lysR2int is shown by means of which the LysR2 gene can be interrupted or eliminated.

Bei der Methode des Gen-Ersatzes wird eine Mutation wie z. B. eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro gebildet. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten „Cross-over"-Ereignisses, das eine Integration bewirkt, und eines geeigneten zweiten „Cross-over"-Ereignisses, das eine Exzision im Zielgen oder in der Zielsequenz bewirkt, wird der Einbau der Mutation oder des Allels erreicht. Diese Methode wurde beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915–927 (1998)) angewendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion zu beseitigen.at the method of gene replacement is a mutation such. A deletion, Insertion or base replacement in the gene of interest in vitro educated. The produced allele becomes turn into one for C. glutamicum non-replicative vector and this subsequently cloned Transformation or conjugation into the desired host of C. glutamicum. To Homologous recombination by means of a first "cross-over" event, which causes an integration, and a suitable second "cross-over" event, the causes an excision in the target gene or in the target sequence, the Incorporation of the mutation or allele achieved. This method was for example, by Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) applied to the pyc gene of C. glutamicum through a deletion to eliminate.

In das lysR2-Gen kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut werden.In The lysR2 gene may be deletion, insertion or so a base exchange be installed.

Darüber hinaus kann es für die Produktion von L-Lysin und L-Valin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des lysR2-Gens ein oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerose, des Pentosephosphatzyklus oder des Aminosäure-Exports zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren.Furthermore can it for the production of L-lysine and L-valine be beneficial, in addition to attenuation of the lysR2 gene, one or more enzymes of the respective biosynthetic pathway, glycolysis, anaplerosis, the pentose phosphate cycle or the Amino acid export to reinforce especially over-express.

Der Begriff „Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität von einem oder mehreren Enzymen (Proteinen) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem zum Beispiel die Kopiezahl des Gens oder der Gene erhöht, ein potenter Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet wird, das ein entsprechendes Enzym (Protein) mit hoher Aktivität kodiert, und bei Bedarf diese Maßnahmen kombiniert werden.Of the Term "reinforcement" describes in this Related the increase the intracellular activity of one or more enzymes (proteins) in a microorganism, which are encoded by the corresponding DNA, for example the copy number of the gene or genes increases, using a potent promoter or a gene or allele is used that is an appropriate enzyme (Protein) with high activity, and if necessary, these measures be combined.

So können beispielsweise für die Herstellung von L-Lysin gleichzeitig ein oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

• dem die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierenden Gen dapA (EP-B 0 197 335),
• dem Enolase kodierenden Gen eno (DE: 199 47 791.4),
• dem das zwf-Genprodukt kodierenden Gen zwf (JP-A-09224661),
• dem Pyruvatcarboxylase kodierenden Gen pyc (Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915–927 (1998)),
•) dem den Lysin-Export kodierenden Gen lysE (DE-A-195 48 222),
• dem eine Feedback-resistente Aspartatkinase kodierenden Gen lysC (EP-B-0387527; EP-A-0699759),
• dem das Zwa1-Protein kodierenden Gen zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115) verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

For example, for the production of L-lysine, one or more of the genes selected from the group consisting of

The dihydrodipicolinate synthase-encoding gene dapA (EP-B 0 197 335),
The enolase-encoding gene eno (DE: 199 47 791.4),
The gene zwf encoding the zwf gene product (JP-A-09224661),
The pyruvate carboxylase-encoding gene pyc (Peters-Wendisch et al., Microbiology 144, 915-927 (1998)),
•) the lysine export-encoding gene lysE (DE-A-195 48 222),
The feedback-resistant aspartate kinase-encoding gene lysC (EP-B-0387527, EP-A-0699759),
• the zwa1 protein coding gene zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115) amplified, in particular overexpressed.

So können beispielsweise für die Produktion von L-Valin gleichzeitig eines oder mehrere der Gene oder Allele, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

• gleichzeitig dem die Acetohydroxysäuresynthase kodierenden ilvBN-Gen (Keilhauer et al., (1993) Journal of Bacteriology 175: 5595–5603), oder
• gleichzeitig dem die Dihydroxysäuredehydratase kodierenden ilvD-Gen (Sahm und Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973–1979), oder
• gleichzeitig dem die Malat:Chinon-Oxidoreduktase kodierenden mqo-Gen (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395–403 (1998)) verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

For example, for the production of L-valine simultaneously one or more of the genes or alleles selected from the group consisting of

Simultaneously with the ilvBN gene encoding acetohydroxy acid synthase (Keilhauer et al., (1993) Journal of Bacteriology 175: 5595-5603), or
Simultaneously the dihydroxy acid dehydratase-encoding ilvD gene (Sahm and Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973-1979), or
• Simultaneously, the mqo gene encoding the malate: quinone oxidoreductase (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)) is amplified, in particular overexpressed.

Außerdem kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Beseitigung des lysR2-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

• dem Phosphoenolpyruvatcarboxykinase kodierenden Gen pck ( DE 199 50 409.1 , DSM 13047),
• dem Glucose-6-Phosphatisomerase kodierenden Gen pgi (US 09/396,478, DSM 12969),
• dem Pyruvatoxidase kodierenden Gen poxB (DE: 199 51 975.7, DSM 13114),
• dem das Zwa2-Protein kodierenden Gen zwa2 (DE: 199 59 327.2, DSM 13113), zu beseitigen.

In addition, for the production of L-lysine, it may be advantageous to simultaneously disassociate the lysR2 gene with one or more of the genes selected from the group consisting of

The phosphoenolpyruvate carboxykinase-encoding gene pck ( DE 199 50 409.1 , DSM 13047),
The gene pgi coding for glucose-6-phosphate isomerase (US 09 / 396,478, DSM 12969),
The pyruvate oxidase-encoding gene poxB (DE: 199 51 975.7, DSM 13114),
• to eliminate the Zwa2 protein encoding gene zwa2 (DE: 199 59 327.2, DSM 13113).

Schließlich kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Beseitigung des lysR2-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

• dem Homoserindehydrogenase kodierenden Gen hom (EP-A-0131171),
• dem Homoserinkinase kodierenden Gen thrB (Peoples, O. W., et al., Molecular Microbiology 2 (1988): 63–72), und
• dem Aspartatdecarboxylase kodierenden Gen panD (EP-A-1006192), zu beseitigen.

Finally, it may be advantageous for the production of L-lysine, in addition to the elimination of the lysR2 gene, simultaneously one or more of the genes selected from the group consisting of

Homoserine dehydrogenase-encoding gene hom (EP-A-0131171),
• the homoserine kinase-encoding gene thrB (Peoples, OW, et al., Molecular Microbiology 2 (1988): 63-72), and
• To eliminate the aspartate decarboxylase gene encoding gene panD (EP-A-1006192).

Die Beseitigung der Homoserindehydrogenase kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche wie beispielsweise durch den Austausch von L-Valin gegen L-Alanin, L-Glyin oder L-Leucin an Position 59 des Enzymproteins, durch den Austausch von L-Valin gegen L-Isoleucin, L-Valin oder L-Leucin an Position 104 des Enzymproteins und/oder durch den Austausch von L-Asparagin gegen L-Threonin oder L-Serin an Position 118 des Enzymproteins erreicht werden.The Elimination of homoserine dehydrogenase can also be achieved by amino acid changes such as by the replacement of L-valine by L-alanine, L-glycine or L-leucine at position 59 of the enzyme protein, through which Exchange of L-valine for L-isoleucine, L-valine or L-leucine Position 104 of the enzyme protein and / or by the exchange of L-asparagine against L-threonine or L-serine at position 118 of the enzyme protein be achieved.

Die Beseitigung der Homoserinkinase kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche wie beispielsweise durch den Austausch von L-Alanin gegen L-Valin, L-Glycin oder L-Leucin an Position 133 des Enzymproteins und/oder durch den Austausch von L-Prolin gegen L-Threonin, L-Isoleucin oder L-Serin an Position 138 des Enzymproteins erreicht werden.The Elimination of homoserine kinase can also be achieved by amino acid substitutions such as by the replacement of L-alanine by L-valine, L-glycine or L-leucine at position 133 of the enzyme protein and / or by replacing L-proline with L-threonine, L-isoleucine or L-serine can be reached at position 138 of the enzyme protein.

Die Beseitigung der Aspartatdecarboxylase kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche wie beispielsweise durch den Austausch von L-Alanin gegen L-Glycin, L-Valin oder L-Isoleucin an Position 36 des Enzymproteins erreicht werden.The Elimination of the aspartate decarboxylase can also be done by Amino acid exchanges like for example, by the exchange of L-alanine for L-glycine, L-valine or L-isoleucine reached at position 36 of the enzyme protein become.

Ferner kann es für die Produktion von L-Lysin und L-Valin vorteilhaft sein, neben der Beseitigung des lysR2-Gens unerwünschte Nebenreaktionen zu beseitigen (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).Further can it for the production of L-lysine and L-valine be beneficial, in addition to the Elimination of the lysR2 gene undesirable Eliminate side reactions (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms " in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im Batch-Verfahren (Batch-Kultur) oder im Fed-batch- (Zulaufverfahren) oder Repeated-Fed-Batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Valin, kultiviert werden. Eine Zusammenfassung bekannter Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) enthalten.The produced according to the invention Microorganisms are also the subject of the invention and can be continuous or discontinuously in a batch process (batch culture) or in the Fed-batch (feed) or repeated fed-batch (repetitive Feed process) for the purpose of producing L-amino acids, in particular L-lysine and L-valine, are cultured. A summary known Cultivation methods is in the textbook of Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Introduction in bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook of Storhas (bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)).

Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlenhydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerol und Ethanol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.The culture medium to be used must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media for various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology (Washington, DC, USA, 1981), which may include sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose , Maltose, molasses, starch and cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol and organic acids such as acetic acid. These substances can be used individually or as a mixture.

Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff sowie anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.When Nitrogen source can organic nitrogenous compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, Malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea as well inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, Ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used. The nitrogen sources can used singly or as a mixture.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorläufer zugesetzt werden. Die genannten Ausgangsstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes gegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugeführt werden.When Phosphorus source can Phosphoric acid, Potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts are used. The culture medium must continue to contain salts of metals, such as. For example, magnesium sulfate or ferric sulfate used for the growth is necessary. After all, essential growth substances can like amino acids and vitamins in addition used for the above-mentioned substances. The culture medium can also suitable precursors be added. The starting materials mentioned can be used to culture in the form of a given a unique approach or in an appropriate way during the Cultivation fed become.

Zur pH-Kontrolle der Kultur können basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika, zugegeben werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasgemische, wie z. B. Luft, in die Kultur eingebracht. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 20°C und 45° und vorzugsweise zwischen 25°C und 40°C. Die Kultur wird so lange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.to pH control of the culture can basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid be used in a suitable manner. To control foaming can Antifoams, such as. B. fatty acid polyglycol used become. To maintain the stability of plasmids, the Medium suitable selective substances such. B. antibiotics, be added. To maintain aerobic conditions, will be Oxygen or oxygen-containing gas mixtures, such as. B. air, in introduced the culture. The temperature of the culture is usually between 20 ° C and 45 ° and preferably between 25 ° C and 40 ° C. The culture is continued until a maximum of the desired Product has formed. This goal is usually within from 10 hours to 160 hours.

Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Diese Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann zum Beispiel wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167–1174) beschrieben durch Umkehrphasen-HPLC erfolgen.methods for the determination of L-amino acids are known from the prior art. This analysis can be for example as in Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) described by anion exchange chromatography with subsequent ninhydrin derivatization or, for example, as in Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) described by reverse phase HPLC.

Eine Reinkultur des folgenden Mikroorganismus wurde am 28. Juli 2000 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:

• Escherichia coli Stamm TOP10F/pCR2.1lysR2int als DSM 13617.

A pure culture of the following microorganism was deposited on July 28, 2000 with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany) under the Budapest Treaty:

Escherichia coli strain TOP10F / pCR2.1lysR2int as DSM 13617.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient der fermentativen Herstellung von L-Lysin und L-Valin.The inventive method is used for the fermentative production of L-lysine and L-valine.

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.The The present invention will be described below with reference to exemplary embodiments explained in more detail.

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalischen Phosphatasebehandlung wurden nach der Methode von Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) durchgeführt. Methoden zur Transformation von Escherichia coli sind ebenfalls in diesem Handbuch beschrieben.The Isolation of plasmid DNA from Escherichia coli and all techniques for restriction, Klenow and alkaline phosphatase treatment according to the method of Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). methods for the transformation of Escherichia coli are also in this Manual described.

Die Zusammensetzung gängiger Nährmedien wie LB- oder TY-Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook et al. entnommen werden.The Composition more common Culture Media Like LB or TY medium can also be found in the Sambrook manual et al. be removed.

1. Beispiel1st example

Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus C. glutamicum ATCC 13032Producing a genomic Cosmid Genbank from C. glutamicum ATCC 13032

Chromosomale DNA von C. glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168–179) beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code-Nr. 27-0913-02) teilweise gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit Shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code-Nr. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1 (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84: 2160–2164), bezogen von Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code-Nr. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code-Nr. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit Shrimp alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.Chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC 13032 was used as described in Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179) isolated and partially cleaved with the restriction enzyme Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product description Sau3AI, Code No. 27-0913-02). The DNA fragments were dephosphorylated with shrimp alkaline phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, product description SAP, Code No. 1758250). The DNA of the cosmid vector SuperCos1 (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84: 2160-2164), purchased from Stratagene (La Jolla, USA, Product Description SuperCos1 Cosmid Vector Kit, Code-No. 251301) was mixed with the rest XbaI restriction enzyme (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product description XbaI, Code No. 27-0948-02) and also dephosphorylated with shrimp alkaline phosphatase.

Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code-Nr. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code-Nr. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extract (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code-Nr. 200217) in Phagen verpackt.Subsequently was the cosmid DNA with the restriction enzyme BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product description BamHI, Code no. 27-0868-04). The Cosmid DNA treated in this way was treated with the ATCC13032 DNA mixed and the T4 DNA ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description T4 DNA Ligase, Code no. 27-0870-04). The ligation mixture was then washed with Help with the Gigapack II XL Packing Extract (Stratagene, La Jolla, USA, Product description Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217) packed in phages.

Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16: 1563–1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO₄ aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) +100 μg/ml Ampicillin ausplattiert wurden. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37° wurden rekombinante Einzelklone selektiert.To infect the E. coli strain NM554 (Raleigh et al 1988, Nucleic Acid Res. 16: 1563-1575), the cells were taken up in 10 mM MgSO ₄ and mixed with an aliquot of the phage suspension. Infection and titering of the cosmidbank were performed as described by Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), which cells were plated on LB agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) +100 μg / ml ampicillin. After overnight incubation at 37 °, recombinant single clones were selected.

2. Beispiel2nd example

Isolierung und Sequenzierung des lysR2-GensIsolation and sequencing of the lysR2 gene

Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Produkt-Nr. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Produkt-Nr. 27-0913-02) teilweise gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit Shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Produkt-Nr. 1758250) dephosphoryliert. Nach einer Trennung durch Gelelektrophorese wurden die Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Produkt-Nr. 20021, Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert.The Cosmid DNA of a single colony was analyzed using the Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) according to manufacturer's instructions isolated and with the restriction enzyme Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product description Sau3AI, product no. 27-0913-02) partially split. The DNA fragments were digested with shrimp alkaline phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Product Description SAP, product no. 1758250) dephosphorylated. After a breakup by gel electrophoresis the cosmid fragments were in size range from 1500 to 2000 bp with the QiaExII Gel Extraction Kit (product no. 20021, Qiagen, Hilden, Germany).

Die DNA des Sequenzierungsvektors pZero-1, bezogen von Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Produkt-Nr. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Produkt-Nr. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenzierungsvektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences, U. S. A., 87: 4645–4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343–7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 μg/ml Zeocin ausplattiert.The DNA of the sequencing vector pZero-1, obtained from Invitrogen (Groningen, Netherlands, Product Description Zero Background Cloning Kit, Product-No. K2500-01) was digested with the restriction enzyme BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Product no. 27-0868-04). The ligation of the cosmid fragments into the sequencing vector pZero-1 was as described by Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), using the DNA mixture with T4 ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany) overnight was incubated. This ligation mixture was then in the E. coli strain DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S. S.A., 87: 4645-4649) electroporated (Tauch et al., 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) and on LB agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) with 50 μg / ml Zeocin plated.

Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Produkt-Nr. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Didesoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the Nation Academies of Sciences, U. S. A., 74: 5463–5467) mit Modifikationen nach Zimmerman et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wurde der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Produkt-Nr. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die Trennung durch Gelelektrophorese und Analyse der Sequenzierungsreaktion erfolgte in einem „Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid"-Gel (29 : 1) (Produkt-Nr. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit dem „ABI Prism 377" Sequenzierungsgerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).The plasmid the recombinant clones were carried out with the Biorobot 9600 (product no. 900200, Qiagen, Hilden, Germany). The sequencing was done according to the dideoxy chain termination method of Sanger et al. (1977, Proceedings of the Nation Academies of Sciences, U.S.A., 74: 5463-5467) Modifications according to Zimmerman et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). It became the "RR dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Kit "from PE Applied Biosystems (product no. 403044, Weiterstadt, Germany). The separation through Gel electrophoresis and analysis of the sequencing reaction took place in a "rotiphoresis NF acrylamide / bisacrylamide "gel (29: 1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) with the "ABI Prism 377 "sequencing device from PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Germany).

Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschließend mit dem Staden-Progammpaket (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) Version 97-0 verarbeitet. Die Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützten Kodierungsbereichsanalysen wurden mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) angefertigt. Weitere Analysen wurden mit dem „BLAST search program" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389–3402) anhand der nichtredundanten Datenbank des „National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA) durchgeführt.The obtained raw sequence data were subsequently using the Staden program package (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) version 97-0. The single sequences of the pZero1 derivatives became one related Contig assembles. The computer-aided coding area analyzes were used with the program XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) prepared. Further analyzes were carried out with the "BLAST search program" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402) using the nonredundant Database of the "National Center for Biotechnology Information "(NCBI, Bethesda, MD, USA).

Die erhaltene Nucleotidsequenz ist in SEQ ID Nr. 1 dargestellt. Eine Analyse der Nucleotidsequenz ergab ein offenes Leseraster von 933 Basenpaaren, das als lysR2-Gen bezeichnet wurde. Das lysR2-Gen kodiert ein Polypeptid von 310 Aminosäuren.The The nucleotide sequence obtained is shown in SEQ ID NO: 1. A Analysis of the nucleotide sequence revealed an open reading frame of 933 Base pairs, referred to as the lysR2 gene. The lysR2 gene encodes a polypeptide of 310 amino acids.

3. Beispiel3rd example

Herstellung eines Integrationsvektors für die Integrationsmutagenese des lysR2-GensProduction of an integration vector for the Integration mutagenesis of the lysR2 gene

Aus dem Stamm ATCC 13032 wurde nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 2 für C. glutamicum bekannten Sequenz des lysR2-Gens wurden die folgenden Oligonucleotide für die Polymerase-Kettenreaktion ausgewählt (siehe SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 5):
lysR2intA:
5'CCA TCG TCG CAG AAT TCA AC 3'
lysR2intB:
5'GCT TCT TCG GCT AAT GCA TC 3'From strain ATCC 13032, the method of Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) isolated chromosomal DNA. Because of the sequence of the lysR2 gene known from Example 2 for C. glutamicum, the following oligonucleotides were selected for the polymerase chain reaction (see SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5):
lysR2intA:
5'CCA TCG TCG CAG AAT TCA AC 3 '
lysR2intB:
5'GCT TCT TCG GCT AAT GCA TC 3 '

Die dargestellten Primer wurden von MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und die PCR-Reaktion wurde nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase der Firma Boehringer durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wurde ein 439 bp großes internes Fragment des lysR2-Gens isoliert, das in der SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist.The primers described by MWG Biotech (Ebersberg, Germany) synthesized and the PCR reaction was carried out according to the standard PCR method by Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) with Pwo polymerase from Boehringer. With The polymerase chain reaction aid was a 439 bp internal Fragment of the lysR2 gene isolated as shown in SEQ ID NO: 3 is.

Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit dem TOPO TA Cloning Kit von Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalog Nummer K4500-01) in den Vektor pCR2.1-TOPO (Mead at al. (1991) Bio/Technology 9: 657–663) ligiert.The amplified DNA fragment was made with the TOPO TA cloning kit from Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Catalog Number K4500-01) into the vector pCR2.1-TOPO (Mead et al. (1991) Bio / Technology 9: 657-663) ligated.

Anschließend wurde der E. coli Stamm TOP10F mit dem Ligationsansatz (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Bd. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985) transformiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), der mit 25 mg/L Kanamycin angereichert worden war. Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit von Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschließender Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) überprüft. Das Plasmid wurde pCR2.1lysR2int genannt.Subsequently, E. coli strain TOP10F was transformed with the ligation mixture (Hanahan, In: DNA cloning, A practical approach, Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985). The selection of plasmid-carrying cells was made by plating out the transformation batch on LB agar (Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2 ^nd Ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989..) Connected to 25 mg / L Kanamycin had been enriched. Plasmid DNA was isolated from a transformant using the QIAprep Spin Miniprep Kit from Qiagen and checked by restriction with the restriction enzyme EcoRI followed by agarose gel electrophoresis (0.8%). The plasmid was named pCR2.1lysR2int.

4. Beispiel4th example

Integrationsmutagenese des lysR2-Gens in dem Lysinproduzenten DSM 5715 und in dem Valinproduzenten FERM BP-1763Integrationsmutagenese of the lysR2 gene in the lysine producer DSM 5715 and in the valine producer FERM BP-1763

Der im Beispiel 3 genannte Vektor pCR2.1lysR2int wurde nach der Elektroporationsmethode von Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343–347 (1994)) in Corynebacterium glutamicum DSM 5715 und Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763 elektroporiert. Bei dem Stamm DSM 5715 handelt es sich um einen AEC-resistenten Lysin-Produzenten (EP-B-435 132). Bei dem Stamm FERM BP-1763 handelt es sich um einen Valin-Produzenten, der Isoleucin und Methionin benötigt (US-A-5,188,948). Der Vektor pCR2.1lysR2int kann in DSM 5715 oder FERM BP-1763 nicht selbstständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er sich ins Chromosom von DSM 5715 oder FERM BP-1763 integriert hat. Die Selektion von Klonen mit ins Chromosom integriertem pCR2.1lysR2int erfolgte durch Ausplattieren des Elektroporationsansatzes auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), der mit 15 mg/L Kanamycin angereichert worden war.The vector pCR2.1lysR2int mentioned in Example 3 was purified by the electroporation method of Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)) in Corynebacterium glutamicum DSM 5715 and Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763. The strain DSM 5715 is an AEC-resistant lysine producer (EP-B-435 132). The strain FERM BP-1763 is a valine producer that requires isoleucine and methionine (US Pat. No. 5,188,948). The vector pCR2.1lysR2int can not self-replicate in DSM 5715 or FERM BP-1763 and only remains in the cell if it has integrated into the chromosome of DSM 5715 or FERM BP-1763. The selection of clones with integrated into the chromosome pCR2.1lysR2int made by plating out the electroporation batch on LB agar (Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2 ^nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.). which had been supplemented with 15 mg / L kanamycin.

Für den Nachweis der Integration wurde das lysR2int-Fragment nach der Methode "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) mit dem Dig-Hybridisierungskit der Firma Boehringer markiert. Chromosomale DNA eines potenziellen Integranten wurde nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) isoliert und jeweils mit den Restriktionsenzymen SalI, SacI und HindIII gespalten. Die entstehenden Fragmente wurden mit Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt und mit dem Dig-Hybridisierungskit der Firma Boehringer bei 68°C hybridisiert. Das in Beispiel 3 genannte Plasmid pCR2.1lysR2int war innerhalb des chromosomalen lysR2-Gens ins Chromosom von DSM 5715 und FERM BP-1763 inseriert worden. Die Stämme wurden als DSM5715::pCR2.1lysR2int und FERM BP-1763::pCR2.1lysR2int bezeichnet.For the proof the integration was the lysR2int fragment by the method "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization " Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) with the Dig hybridization kit marked Boehringer. Chromosomal DNA of a potential Integrants according to the method of Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) and in each case with the restriction enzymes SalI, SacI and HindIII cleaved. The resulting fragments were analyzed by agarose gel electrophoresis separated and with the Dig hybridization kit from Boehringer at 68 ° C hybridized. The plasmid pCR2.1lysR2int mentioned in Example 3 was within the chromosomal lysR2 gene in the chromosome of DSM 5715 and FERM BP-1763 have been advertised. The strains were named DSM5715 :: pCR2.1lysR2int and FERM BP-1763 :: pCR2.1lysR2int.

5. Beispiel5th example

Herstellung von L-Lysin und L-ValinProduction of L-lysine and L-valine

Die im Beispiel 4 erhaltenen C. glutamicum und B. lactofermentum Stämme DSM5715::pCR2.1lysR2int und FERM BP-1763::pCR2.1lysR2int wurden in einem zur Produktion von L-Lysin und L-Valin geeigneten Nährmedium kultiviert, und der L-Lysin- und L-Valin-Gehalt wurde im Kulturüberstand bestimmt.The C. glutamicum obtained in Example 4 and B. lactofermentum strains DSM5715 :: pCR2.1lysR2int and FERM BP-1763 :: pCR2.1lysR2int were in production for one cultured by L-lysine and L-valine suitable nutrient medium, and the L-lysine and L-valine content was determined in the culture supernatant.

Dazu wurden die Stämme zunächst auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Kanamycin (25 mg/L) 24 Stunden lang bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII verwendet. Medium CgIII NaCl 2,5 g/L Bacto-Pepton 10 g/L Bacto-Yeast-Extrakt 10 g/L Glucose (getrennt autoklaviert) 2% (w/v) Der pH-Wert wurde auf pH 7,4 eingestelltFor this purpose, the strains were first incubated on an agar plate with the appropriate antibiotic (brain-heart agar with kanamycin (25 mg / L) for 24 hours at 33 ° C. Starting from this agar plate culture, a preculture was inoculated (10 ml of medium in 100 ml Erlenmeyer flask) The complete medium CgIII was used as medium for the preculture. Medium CgIII NaCl 2.5 g / L Bacto-peptone 10 g / L Bacto-yeast extract 10 g / L Glucose (separately autoclaved) 2% (w / v) The pH was adjusted to pH 7.4

Diesem wurde Kanamycin (25 mg/L) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 24 Stunden lang bei 33°C bei 240 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so dass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD betrug. Für die Hauptkultur wurde das Medium MM verwendet. Medium MM CSL (Maisquellwasser) 5 g/L MOPS 20 g/L Glucose (getrennt autoklaviert) 50 g/L Salze: (NH₄)₂SO₄) 25 g/L KH₂PO₄ 0,1 g/L MgSO₄*7H₂O 1,0 g/L CaCl₂*2H₂O 10 mg/L FeSO₄*7H₂O 10 mg/L MnSO₄*H₂O 5,0 mg/L Biotin (sterilfiltriert) 0,3 mg/L Thiamin*HCl (sterilfiltriert) 0,2 mg/L CaCO₃ 25 g/L To this was added kanamycin (25 mg / L). The preculture was incubated for 24 hours at 33 ° C at 240 rpm on a shaker. From this preculture, a major culture was inoculated so that the initial OD (660 nm) of the major culture was 0.1 OD. The medium MM was used for the main culture. Medium MM CSL (corn steep liquor) 5 g / L PUG 20 g / L Glucose (separately autoclaved) 50 g / L salts: (NH ₄ ) ₂ SO ₄ ) 25g / L KH ₂ PO ₄ 0.1 g / L MgSO ₄ .7H ₂ O 1.0 g / L CaCl ₂ * 2H ₂ O 10 mg / L FeSO ₄ * 7H ₂ O 10 mg / L MnSO ₄ * H ₂ O 5.0 mg / L Biotin (sterile filtered) 0.3 mg / L Thiamine * HCl (sterile filtered) 0.2 mg / L CaCO ₃ 25g / L

CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das trocken autoklavierte CaCO₃ zugegeben. Für die Kultivierung von DSM 5715 wurde dem Medium zusätzlich 0,1 g/L Leucin zugesetzt. Für die Kultivierung von FERM BP-1763 wurden zusätzlich 0,1 g/L Isoleucin und 0,1 g/L Methionin zum Medium gegeben.CSL, MOPS and saline were adjusted to pH 7 with ammonia water and autoclaved. Subsequently, the sterile substrate and vitamin solutions and the dry autoclaved CaCO _{3 were} added. For the cultivation of DSM 5715, an additional 0.1 g / l leucine was added to the medium. For the cultivation of FERM BP-1763, an additional 0.1 g / L isoleucine and 0.1 g / L methionine were added to the medium.

Die Kultivierung erfolgte in einem 10-ml-Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 mg/L) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und 80% Luftfeuchtigkeit.The Cultivation was done in a 10 ml volume in a 100 ml Erlenmeyer flask with harassment. Kanamycin (25 mg / L) was added. The cultivation was at 33 ° C and 80% humidity.

Nach 72 Stunden wurde die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit einem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete L-Lysin- und L-Valin-Menge wurde mit einem Aminosäureanalysator von Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustausch-Chromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrinnachweis bestimmt.To For 72 hours, the OD was measured at a measuring wavelength of 660 nm with a Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich). The educated L-lysine and L-valine levels were measured with an amino acid analyzer by Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany) by ion exchange chromatography and post-column derivatization determined by ninhydrin detection.

In den Tabellen 1 und 2 sind die Ergebnisse des Versuchs dargestellt.In Tables 1 and 2 show the results of the experiment.

Tabelle 1

Table 1

Tabelle 2

Table 2

Kurze Beschreibung der FigurShort description of figure

1: Karte des Plasmids pCR2.1lysR2int 1 : Map of the plasmid pCR2.1lysR2int

Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben die folgende Bedeutung. KmR: Kanamycin-Resistenzgen EcoRI: Spaltstelle des Restriktionsenzyms EcoRI lysR2int: Internes Fragment des lysR2-Gens ColE1 ori: Replikationsstartpunkt des Plasmids ColE1 The abbreviations and designations used have the following meaning. Km R: Kanamycin resistance gene EcoRI: Cleavage site of the restriction enzyme EcoRI lysR2int: Internal fragment of the lysR2 gene ColE1 ori: Origin of replication of the plasmid ColE1

SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENCE LISTING

Claims

Isolated coryneform bacteria in which the Expression of a Polynucleotide Encoding a Polypeptide, The an amino acid sequence which is at least 90% identical to the amino acid sequence in SEQ ID NO: 2, wherein the polypeptide is the function a transcriptional regulator of the lysR family.

A bacterium according to claim 1, wherein said bacterium belongs to the species Corynebacterium glutamicum belongs.

A bacterium according to claim 1, wherein said polypeptide has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.

A bacterium according to claim 1, wherein said polynucleotide has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

Process for the preparation of L-lysine or L-valine, full: Fermenting the bacteria according to one the claims 1 to 4, which produce the mentioned amino acids.

Process for the preparation of L-lysine or L-valine, full fermenting said amino acid producing Bacteria, being the intracellular activity of the polypeptide shown in SEQ ID NO: 2 is eliminated.

Process for the preparation of L-lysine or L-valine, full fermenting said amino acid producing Bacteria, wherein the expression of the set forth in SEQ ID NO Polynucleotide (lysR2 gene) is eliminated.

The method of claim 6 or 7, comprising a) the fermentation of said bacteria b) concentrating the said amino acids in the medium or in the cells of the bacteria, and c) the Isolating said amino acids.

Method according to one or more of claims 5-8, wherein Bacteria are used in which other genes of the biosynthetic pathway the said amino acids additionally reinforced or overexpressed are.

Method according to one or more of claims 5-9, wherein Bacteria are used in which the metabolic pathways that the Formation of the named amino acids reduce, are eliminated.

The method of claim 9, wherein bacteria ferment in which one or more of the genes are simultaneously amplified or overexpressed will / will be selected are made up of the group a) the dihydrodipicolinate synthase coding gene dapA, b) the enolase-encoding gene eno, c) the gene encoding the zwf gene product zwf, d) the pyruvate carboxylase coding gene pyc, e) which encodes a protein for lysine export Gene lysis, f) encoding a feedback-resistant aspartate kinase Gene lysC, g) the zwa1 protein encoding gene zwa1.

The method of claim 10, wherein simultaneously a or multiple genes are eliminated, which are selected from the group consisting of: a) the phosphoenolpyruvate carboxykinase coding gene pck, b) the glucose-6-phosphate isomerase coding Gene pgi, c) the pyruvate oxidase-encoding gene poxB, d) the zwa2 protein encoding gene zwa2, e) the homoserine dehydrogenase coding gene hom, f) the homoserine kinase coding gene thrB and g) the aspartate decarboxylase-encoding gene panD.

Method according to one or more of claims 5-12, at the bacteria of the genus Corynebacterium be used.

The method of claim 13, wherein said Bacteria of the species Corynebacterium glutamicum are used.

Vector for integration mutagenesis, comprising the internal fragment of SEQ ID NO: 1 set forth in SEQ ID NO: 3.

Vector pCR2.11lysR2int carrying a) an internal fragment of the 439 bp lysR2 gene, b) its restriction map in 1 and c) which is deposited in the E. coli strain TOP10F / pCR2.1lysR2int under No. DSM 13617 in the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures.

Coryneform bacteria, transformed with an integration vector, a fragment of the polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 1 wearing.