DE60110821T2

DE60110821T2 - Gerät und verfahren zur messung von biologischen strukturen

Info

Publication number: DE60110821T2
Application number: DE60110821T
Authority: DE
Inventors: Christopher Clarkston HILLIER; David Cambuslang BUNTON; Paul Coats; Peter Smith
Original assignee: COURT OF GLASGOW CALEDONIAN UN; Glasgow Caledonian University
Current assignee: Biopta Ltd
Priority date: 2000-10-07
Filing date: 2001-10-05
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2021-10-06
Also published as: EP1322218B1; ES2240525T3; AU2001293971B2; US20040039266A1; EP1322218A1; DE60110821D1; WO2002030276A8; CA2424954A1; GB0024641D0; AU9397101A; JP4159352B2; JP2004510528A; ATE295114T1; WO2002030276A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung und auf ein Verfahren für die Messung von Dimensionen biologischer Strukturen. Insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, bezieht sich die Erfindung auf die Messung von Veränderungen im Zeitablauf der physischen Dimensionen biologischer Strukturen.
Die Messung der Größe biologischer Strukturen, wie zum Beispiel von Arterien oder Muskeln, findet zahlreiche Anwendungsbereiche im Labor. Insbesondere ist es oftmals wünschenswert, die Kontraktion oder Relaxation von Blutgefäßen und dergleichen als Reaktion auf Hormone, Agonisten oder potentielle Arzneimittel zu erforschen.
Typischerweise werden solche Erforschungen unter Anwendung eines Myographen, das heißt, eines Gerätes zur Messung von Muskeleigenschaften, durchgeführt. Die Drahtmyographie involviert das Anbringen des zu untersuchenden Gefäßes an einem Paar Stahldrähte, die an Stützen gesichert sind. Das Anbringen des Gefäßes ist eine schwere, zeitintensive Technik, die ein beträchtliches Maß an Übung erfordert und, überwiegend wegen der Schwierigkeit beim Ausrichten der Drähte mit dem Lumen des Gefäßes, oftmals zu einer Beschädigung des Gefäßes führt. Eine Stütze ist an einem Mikrometer befestigt, wodurch der Gefäßumfang kontrolliert werden kann, während die andere Stütze an einem Kraftaufnehmer befestigt ist, um die Entwicklung der Spannung zu messen. Die gesamte Anordnung wird in einer Kammer mit einer physiologischen Salzlösung gehalten, zu der verschiedene Testsubstanzen hinzugegeben werden können, um die Gefäßreaktion auszuwerten. Die Qualität der mittels eines Drahtmyographen erhaltenen Informationen ist jedoch begrenzt, da das Gefäß nicht auf eine Weise gestreckt ist, die der Situation in vivo entspricht.
Eine alternative Technik ist die Druckmyographie, bei der Gefäße an beiden Enden kanüliert werden und unter Druck untersucht werden.
Die Druckmyographie erzeugt eine Situation, die eher der Situation in vivo entspricht; das Anbringen der Gefäße auf Kanülen ist jedoch eine schwierige, zeitintensive Prozedur.
Der Durchmesser und die Länge der zu untersuchenden Gefäße können auch visuell ermittelt werden, entweder unter dem Mikroskop durch einen erfahrenen Experimentatoren oder automatisch mittels eines Rechnergerätes, das Bildanalysesoftware verwendet. Eine solche Software muss jedoch technisch relativ ausgereift sein, um die Dimensionen des zu untersuchenden Gefäßes genau abzubilden und zu analysieren, und eine solche Bildanalyse ist schwer auf den inneren Durchmesser der Gefäße anzuwenden.
Die Perfusionsmyographie erfordert eine umfangreiche, teure Ausrüstung, doch die Anzahl der durchführbaren Experimente ist äußerst niedrig.
Daher ist die Anwendung von Aufnehmern und Bildaufbereitungstechnologien aufgrund von drei grundlegenden Nachteilen nicht für die Durchführung einer großen Anzahl von Experimenten förderlich. Erstens muss das Gewebe auf der Messvorrichtung „angebracht" werden. Dies involviert erfahrene Techniker oder Wissenschaftler und kann kostbare Zeit in Anspruch nehmen. Zweitens bedeutet eine mangelnde Automatisierung dieser Systeme, dass sie während des gesamten Assays von einem erfahrenen Techniker beaufsichtigt und gesteuert werden müssen. Drittens sind die Systeme sehr teuer. Diese grundlegenden Probleme stellen „Zugangsschranken" dar, die den Gebrauch solcher Systeme limitieren.
Das Dokument US-A-5 846 188 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Feststellen von Veränderungen physischer Dimensionen biologischer Strukturen, wobei die Vorrichtung mindestens eine Lichtquelle, einen Lichtdetektor, Mittel zum Lokalisieren einer biologischen Struktur zwischen der Quelle und dem Detektor und Datenverarbeitungsmittel zum Aufzeichnen und Analysieren von festgestelltem Licht, das von der biologischen Struktur durchgelassen wurde, beinhaltet, um Veränderungen der Eigenschaften des durchgelassenen Lichtes festzustellen und zu analysieren, um Veränderungen der physischen Dimensionen der biologischen Struktur zu ermitteln.
Es gehört zu den Zielen der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, diese und andere Nachteile bekannter Myographietechniken und -systeme zu umgehen oder zu verringern.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren gemäß Anspruch 1 bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung macht sich das unterschiedliche Ausmaß der Absorption von Licht durch biologische Strukturen mit verschiedenen Durchmessern und Dicken zu Nutze. Ferner ermöglicht die vorliegende Erfindung das Feststellen von Veränderungen des Innendurchmessers einer Röhrenstruktur, da dies die Dicke und somit die Absorption der Struktur beeinflussen wird.
Vorzugsweise wird das Verfahren verwendet, um eine biologische Röhrenstruktur zu messen, zum Beispiel ein Blutgefäß oder dergleichen.
Vorzugsweise beinhaltet das Feststellen von durchgelassenem Licht den Schritt des Feststellens der Intensität von durchgelassenem Licht über im Wesentlichen den gesamten Durchmesser der biologischen Struktur. Es hat sich herausgestellt, dass eine solche relativ simple Messtechnik tatsächlich ausreichend Informationen bereitstellt, um eine Veränderung der Dimensionen der Struktur anhand einer Veränderung der Absorption der Struktur zu ermitteln. Es ist daher nicht erforderlich, ein detailliertes optisches Bild und auch nicht Bilder von vielen verschiedenen Punkten über die gesamte Struktur zu erhalten, im Gegensatz zu bekannten Myographietechniken. Dies bietet Vorteile hinsichtlich des Erfassens und Verarbeitens von Informationen.
Vorzugsweise beinhaltet das Verfahren ferner den Schritt des Wiederholens der Schritte des Ausleuchtens, Feststellens und Vergleichens mit Licht einer zweiten Wellenlänge. Dies kann so oft wie gewünscht mit weiteren Wellenlängen ausgeführt werden. Die Anwendung zusätzlicher Lichtwellenlängen kann aufgrund des abweichenden Transmissionsgrades solcher Strukturen bei verschiedenen Wellenlängen zusätzliche Informationen hinsichtlich der biologischen Struktur bereitstellen. Vorzugsweise sind die Wellenlängen so ausgewählt, dass die biologische Struktur bei einer der Wellenlängen im Wesentlichen opak ist, während die biologische Struktur bei einer anderen der Wellenlängen semi-transparent ist. Dem Fachmann wird es schnell offensichtlich werden, dass es mit Grundkenntnissen über das zu untersuchende Gewebe möglich sein wird, Wellenlängen so auszuwählen, dass einige hochabsorbierend sind, während andere einen Kontrast zwischen Wegen hoher und geringer optischer Dichte bereitstellen. Die Schritte des Ausleuchtens, Feststellens und Vergleichens mit zweiten oder nachfolgenden Wellenlängen können im Anschluss an die bei der ersten Wellenlänge durchgeführten Schritte ausgeführt werden; alternativ können die Schritte gleichzeitig ausgeführt werden. Eine getrennte Ausführung der Schritte stellt sicher, dass die Informationen von jeder Wellenlänge getrennt gehalten werden; wenn die Schritte gleichzeitig ausgeführt werden, wird bevorzugt, dass das Verfahren ferner den Schritt des Unterscheidens der gemessenen Intensitäten jeder verwendeten Lichtwellenlänge umfasst. Zum Beispiel können getrennte Detektoren verwendet werden oder die festgestellte kombinierte Intensität kann einer nachträglichen Verarbeitung unterzogen wird, um die Komponenten der verschiedenen Wellenlängen zu trennen.
Vorzugsweise entspricht die Referenzlichtintensität der Intensität des Lichtes, die gemessen wird, wenn keine biologische Probe ausgeleuchtet wird, d. h. einer blinden Referenzmessung. Auf diese Weise können jegliche Merkmale des zur Durchführung der Messungen verwendeten Systems, die die verwendeten Lichtwellenlängen beeinflussen, berücksichtigt werden. Alternativ kann die Referenzlichtintensität der gemessenen Intensität des Lichtes entsprechen, das von der biologischen Probe in einem anderen physischen Zustand durchgelassen wurde. Auf diese Weise können Messungen der Veränderung des Transmissionsgrades einer biologischen Struktur im Zeitablauf erhalten werden. Natürlich kann eine Kombination der beiden Referenzintensitäten verwendet werden, um sowohl eine absolute als auch eine relative Messung des durchgelassenen Lichtes bereitzustellen.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Messen von Veränderungen der physischen Dimensionen einer biologischen Struktur im Zeitablauf bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte beinhaltet:
Ausleuchten einer biologischen Struktur zu einem ersten und zweiten Zeitpunkt mit Licht einer ersten Wellenlänge;
Feststellen der Intensität des Lichtes, das von der biologischen Struktur zu dem ersten und zweiten Zeitpunkt durchgelassen wird; und
Vergleichen der Intensität des durchgelassenen Lichtes zu dem ersten Zeitpunkt mit der Intensität des durchgelassenen Lichtes zu dem zweiten Zeitpunkt, um eine Veränderung der Intensität des durchgelassenen Lichtes zu ermitteln, wobei die Intensitätsveränderung ein Hinweis auf eine Veränderung der physischen Dimensionen der biologischen Struktur ist.
Das Verfahren kann ferner den Schritt des Modifizierens der örtlichen Umgebung der biologischen Struktur zwischen dem ersten und dem zweiten Zeitpunkt beinhalten. Zum Beispiel kann dies das Hinzugeben oder Entfernen von Agonisten, Hormonen, potentiellen Arzneimitteln, Testproben und dergleichen zu/aus dem Umfeld der biologischen Struktur oder die direkte physische Stimulation der Struktur umfassen. Das Verfahren kann auch den Schritt des Transfizierens der biologischen Struktur mit exogener Nukleinsäure umfassen; dies kann für die Ermittlung der Auswirkungen eines Gens oder einer ähnlichen Nukleinsäurestruktur oder der potentiellen Stabilität eines Transfektionsvektors oder der biologischen Struktur für die Transfektion nützlich sein. Alternativ oder zusätzlich können Peptid- oder Proteinstrukturen zu der biologischen Struktur hinzugegeben werden, um die Auswirkungen solcher Peptide oder Proteine direkt zu ermitteln, ohne dass die Expression eines transfizierten Gens erforderlich ist.
Formulierungen für die Anwendung in den Verfahren der Erfindung werden mit Bezug auf die Beispiele der Erfindung detailliert beschrieben. Die Erfindung stellt ebenfalls eine Anwendung dieser Gleichungen bei der Messung von physischen Veränderungen röhrenförmiger biologischer Strukturen bereit.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung gemäß Anspruch 15 bereitgestellt.
Die Lichtquelle kann Licht in einer einzelnen Wellenlänge oder in einer Vielzahl von Wellenlängen erzeugen. Alternativ können eine Reihe verschiedener Lichtquellen bereitgestellt werden.
Der Lichtdetektor kann zum Beispiel ein CCD-Bauteil, einen Fotowiderstand, eine Fotodiode oder dergleichen beinhalten. Der Detektor kann Licht in nur einer einzelnen Wellenlänge oder in einer Vielzahl von Wellenlängen feststellen. Wenn der Detektor eine Vielzahl von Lichtwellenlängen feststellen kann, beinhaltet die Vorrichtung ferner Mittel zum Trennen des festgestellten Lichtes mehrerer Wellenlängen: dies kann Post-Feststellungsmittel, wie zum Beispiel Datenverarbeitungsmittel, beinhalten, oder kann Prä-Feststellungsmittel, wie zum Beispiel Mittel zum Erzeugen von jeweils nur Licht einer einzelnen Wellenlänge oder Filtermittel, die es nur Licht einer einzelnen Wellenlänge ermöglichen, den Detektor zu erreichen, beinhalten.
Die Vorrichtung kann ferner Mittel zum Ausrichten von erzeugtem und festgestelltem Licht beinhalten. Vorzugsweise beinhaltet dies ausgerichtete Lichtleitfasern, von denen mindestens eine erzeugtes Licht und mindestens eine festgestelltes Licht trägt. Die Fasern sind an einem Ende mit einer Lichtquelle oder einem Lichtdetektor verbunden, wie anwendbar, und die anderen Enden der Fasern sind entgegengesetzt ausgerichtet, sodass Licht, das aus der Quellenfaser austritt, in die Feststellungsfaser eintreten kann. Die Vorrichtung kann ferner einen aus Kunststoff oder ähnlichem hergestellten Halter für die Lichtleitfasern beinhalten, der so angeordnet ist, dass er die Lichtleitfasern in entgegengesetzt ausgerichteter Relation hält. Der Halter kann günstigerweise eine gegabelte Röhre beinhalten, wobei die Spitzen jeder seiner Gabeln ausgerichtet sind; bei Anwendung kann eine Lichtleitfaser in jede Gabel des Halters eingesetzt werden, wobei die freiliegenden Enden der Fasern an die Enden der Gabeln angrenzen. Auf diese Weise wird eine korrekte Ausrichtung der Fasern sichergestellt.
Die Mittel zum Lokalisieren einer biologischen Struktur können einen Drahthalter, eine Kanüle oder dergleichen beinhalten.
Vorzugsweise beinhalten die Lokalisierungsmittel eine aus Kunststoff hergestellte Röhre mit einer Außenumfangsrille; bei Anwendung kann eine biologische Röhrenstruktur über der aus Kunststoff hergestellten Röhre lokalisiert werden und daran mittels einer um die Rille gebundenen Befestigung gesichert werden. Günstigerweise ist die Röhre aus Polypropylen.
Vorzugsweise beinhaltet die Vorrichtung ferner Mittel, um die biologische Struktur Fluiden und dergleichen auszusetzen. Vorzugsweise beinhaltet dies eine Kammer mit einem Fluideingang und einem Fluidausgang, in der die biologische Struktur lokalisiert ist. Die Vorrichtung kann ferner einen oder mehrere Fluidbehälter zum Speichern von Zirkulationsfluid beinhalten. Günstigerweise beinhaltet die Kammer eine Fluidpumpe zum Zirkulieren von Fluid innerhalb der Kammer oder in die Kammer hinein und aus ihr heraus. Günstigerweise kann die Pumpe außerdem so angeordnet sein, dass sie die Kammer auf einem im Wesentlichen physiologischen Fluiddruck hält. Die Vorrichtung kann darüber hinaus Mittel zum Einführen von Substanzen in die biologische Struktur beinhalten; zum Beispiel kann eine Spritze verwendet werden, um eine Testsubstanz in die zirkulierende Flüssigkeit einzuführen. Vorzugsweise ist eine Vielzahl an Kammern bereitgestellt, die das gleichzeitige Untersuchen einer Vielzahl von Proben biologischer Struktur ermöglichen.
Vorzugsweise beinhalten die Datenverarbeitungsmittel einen Computer.
Nach der Dissektion ist isoliertes Gewebe schwer zu handhaben, da es von schlaffer Beschaffenheit ist.
Dies gilt insbesondere für die genaue Positionierung des Gewebes im Hinblick auf die Lokalisierungsmittel, die einen Drahthalter, eine Kanüle oder dergleichen beinhalten können. Um diesen Nachteil zu umgehen, wird ein Verfahren zum Immobilisieren und Positionieren des Gewebes bereitgestellt, das eine Ausrichtung mit dem Lokalisierungsgerät sicherstellt, wobei das Verfahren beinhaltet, dass das Gewebe auf eine Schicht platziert wird, die ein oder mehrere, aus dem Folgenden ausgewähltes) Proteine) beinhaltet: Kollagen, Elastin, Gelatine, Fibronektin, Fibrinogen und Vitronektin.
Das Verfahren kann ferner den Schritt des vorherigen Platzierens der Proteinschicht auf eine Polypropylen- oder Polyethylenfläche beinhalten. Vorzugsweise beinhaltet die aus Kunststoff hergestellte Fläche den inneren Aspekt einer Hälfte eines konischen Trichters, sodass eine konkave Fläche sichergestellt wird, auf die das Gewebe zu platzieren ist. Zwei solche Trichter werden dann entgegengesetzt auf eine starre Wanne platziert, wobei die Öffnungen der Trichter zueinander gerichtet sind. Ein Trichter ist als ein Teil der Wanne fixiert, der zweite Trichter ist auf der Wanne platziert, vorzugsweise auf einer Schiene befestigt, die die Bewegung hin zu oder weg von dem ersten Trichter in der horizontalen Ebene ermöglicht.
Ferner wird die genaue Positionierung des Gewebes im Hinblick auf das gewählte Lokalisierungsgerät sichergestellt, indem ein Ende des Gewebes an einem Punkt, der dem Außendurchmesser des Gewebes gleicht, in dem Hals des fixierten konischen Trichters platziert wird. Der zweite Trichter wird dann entlang der horizontalen Ebene bewegt, bis das Ende des Gewebes in dem Hals des konischen Trichters wieder über dem Punkt in dem Trichter liegt, der dem Außendurchmesser des Gewebes gleicht. Dann wird das Gewebe auf der Proteinschicht des bewegbaren zweiten Trichters platziert.
Das Lokalisierungsgerät kann zuerst durch den engen Abschnitt des Trichters und dann durch das immobilisierte Gewebe geführt werden.
Die Mittel zum Lokalisieren der biologischen Struktur in der Vorrichtung der Erfindung können eine Schicht von Protein zum Immobilisieren der Struktur umfassen.
Typischerweise kann das Protein Kollagen, Elastin, Gelatine, Fibronektin, Fibrinogen, Vitronektin oder eine beliebige Kombination davon sein oder davon abgeleitet sein.
Die Erfindung stellt außerdem die Anwendung von mindestens einem aus Kollagen, Elastin, Gelatine, Fibronektin, Fibrinogen und Vitronektin gewähltem Protein bereit, um biologisches Gewebe in der Testvorrichtung zu stützen.
Die Vorrichtung kann ferner temperaturregulierende Mittel zum Regulieren der Temperatur einer biologischen Probe beinhalten.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nun lediglich beispielhaft und unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, in denen:
1 ein schematisches Schaubild einer Implementierung des Verfahrens des Messens biologischer Strukturen gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung zeigt;
2 ein theoretisches Beispiel der Intensität von durch eine theoretische biologische Struktur durchgelassenem Licht zweier unterschiedlicher Wellenlängen zeigt;
3 ein schematisches Schaubild einer Vorrichtung zum Messen biologischer Strukturen gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt;
4 einen Glasfaserhalter, wie er mit einer Vorrichtung zum Messen biologischer Strukturen gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, zeigt;
5 Mittel zum Anbringen einer biologischen Struktur, wie mit einer Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, zeigt;
6 eine Vorrichtung für die Messung biologischer Strukturen gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt;
7 einen Graphen der prozentualen Veränderung des Lumendurchmessers eines Blutgefäßes als Reaktion auf unterschiedliche Konzentrationen eines Agonisten, wie mit der Vorrichtung aus 6 ermittelt, zeigt;
8 die Geometrie eines unter Spannung liegenden Gefäßes in einem Myographen zeigt, wie weiter unten detaillierter mit Bezug auf Experiment 2 beschrieben wird;
9 ein schematisches Schaubild der Versuchsvorrichtung für die Absorptionsspektroskopie unter Anwendung des Mulvany-Myographen, wie weiter unten in Experiment 2 beschrieben, ist;
10 Transmissionsspektren zeigt, die unter Anwendung des adaptierten Mulvany-Myographen für normale (N1, N2: BD = 135,4 mmHg, Mediadicke = 25,32 μm) und hypertensive (H1, H2: BD = 231 mmHg, Mediadicke = 46,7 μm) Gefaße unter einer durch eine lineare Streckung über 250 μm (N1, H1) und 300 μm (N2, H2) erzeugten Spannung erhalten wurden. Die Spektren werden von gepaarten Exemplaren erhalten;
11 das angepasste durchschnittliche normalisierte Transmissionsspektrum eines Kontrollgefäßes unter einer linearen Streckung von 350 μm zeigt. Datenpunkte sind durch Kreise dargestellt und die durchgehende Linie ist durch Folgendes gegeben:
12 eine Tabelle ist, die Blutdrucke (Tailcuff) und morphologische Eigenschaften von Mesenterialarterien (Mittel ± SEM) zeigt;
13 eine Matrix von Korrelationskoeffizienten ist. Die Daten stammen aus allen Gruppen (4-wöchig, 8-wöchig abgeklemmt und Kontrolle.) Anzahl der insgesamt analysierten Spektren = 659 (*p < 0,001, normotensiv vs. hypertensiv); und
14 Lokalisierungsmittel zum Positionieren von Gewebe zum Testen in der Vorrichtung der Erfindung darstellt.
Unter Bezugnahme auf 1 als erstes zeigt diese eine schematische Anordnung zum Messen biologischer Strukturen gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Eine biologische Röhrenstruktur 12, wie zum Beispiel ein Blutgefäß, wird in einer Einfassung 14 aufgehängt, sodass das Blutgefäß 12 von einer Lichtquelle 16 ausgeleuchtet werden kann. Eine Öffnung 18 ermöglicht es nur einem Teil des Lichtes, durchgelassen zu werden. Die Lichtquelle 16 ist eine Kombination mehrerer Spektralkomponenten; jede Spektralkomponente erzeugt ein Intensitätsprofil 20 des durch das Blutgefäß 12 durchgelassenen Lichtes, dessen Eigenschaften eine Funktion der Blutgefäßgeometrie und optischer Charakteristiken ist. Eine Fokussierlinse 22 und ein Detektor 24 werden verwendet, um für jede Spektralkomponente eine Einzelpunkt-Intensitätsmessung des durchgelassenen Lichtes zu erhalten. Diese Einzelmessung ist im Wesentlichen das integrierte Intensitätsprofil für die Spektralkomponente.
Eine Messreihe besteht aus Extinktionswerten (integrierten Intensitätsprofilen) der durch das Gewebe durchgelassenen Intensität für jede unterschiediche Spektralkomponente, diese sind mit ε_i gekennzeichnet. Eine Referenzmessreihe ε_0i wird ohne Vorhandensein des Gewebes aufgestellt.
Die Spektralkomponenten werden so gewählt, dass das Gewebe bei einer (oder mehreren) der Komponenten im Wesentlichen opak ist, während das Gewebe bei einer (oder mehreren) anderen semi-transparent ist. Der Übergang zwischen diesen Bedingungen ist jedoch ziemlich eng, da die Lichtabsorption mit der optischen Dichte (im Wesentlichen) exponentiell ansteigt. Mit Grundkenntnissen über das zu untersuchende Gewebe wird es daher stets möglich sein, Spektralkomponenten auszuwählen, die hochabsorbierend sind, und andere, die einen Kontrast zwischen Wegen hoher und niedriger optischer Dichte bereitstellen. Dieses Charakteristikum wird im Standardperfusionsmyographen verwendet, um bei der Bildaufbereitung einen Kontrast zwischen dem Gefäßlumen und der Gefäßwand bereitzustellen.
2 zeigt eine Serie theoretischer repräsentativer Intensitätsmessungen für ein Blutgefäßmodell mit zwei Spektralkomponenten, i und j. Für jede Spektralkomponente wird eine Referenzmessung ε_0i, ε_0j, bezeichnet durch die Referenzziffern 26, 28, und ein Paar Extinktionsmessungen ε_i(t₁), ε_i(t₂) (Referenzziffern 30, 32), die nacheinander aufgestellt wurden, gezeigt. Es ist zu sehen, dass sich die Eigenschaften des Gefäßes vom Zeitpunkt t₁ zum Zeitpunkt t₂ modifizieren (zum Beispiel wird dem System ein Hormon hinzugegeben, wodurch sich das Gefäß zusammenzieht) und dass das Gefäß für die Spektralkomponente j im Wesentlichen opak ist, sodass aus dieser Komponente alleine keine Informationen bezüglich des Gefäßlumens abgeleitet werden können. Da alle diese Messungen von einer fixierten Öffnung stammen, kann ein einfaches Modell der Relation zwischen Extinktionswert und dem Profil folgendermaßen formuliert werden: ε0i = MIi εi(t) = (M – V(t))Ii + (V(t) – L(t))IiαVi + L(t)IiαLi wobei davon ausgegangen wird, dass das Ausleuchtungsmuster mit der Intensität pro Einheit Länge I_i uniform ist und M ein Maß der Öffnungsgröße ist. Die variierbaren Gefäß- und Lumengrößen sind jeweils durch (V(t), L(t)) dargestellt und die Lichtabsorptionskoeffizienten in dem Gefäß und dem Lumen sind durch (α_Vi, α_Li) dargestellt. Es bietet sich an, den normalisierten Extinktionskoeffizienten folgendermaßen zu bilden, wobei die normalisierten Werte durch ein Dach über der Variablen gekennzeichnet sind:
Zwei Instanzen dieser Gleichung (d. h. für zwei Spektralkomponenten) können nach Gefäß- und Lumengröße aufgelöst werden, unter der Voraussetzung, dass die optischen Charakteristiken des Gewebes bekannt sind (oder kalibriert werden können). Eine weitere Vereinfachung kann erreicht werden, wenn die Gefäßwand für bestimmte ausgewählte Spektralkomponenten, wie zum Beispiel der Spektralkomponente j, im Wesentlichen opak ist, in welchem Fall sich der normalisierte Extinktionskoeffizient folgendermaßen reduziert: ε ^j(t) = 1 – V ^(t)und folglich kann die Lumengröße folgendermaßen berechnet werden:
Durch eine sorgfältige Wahl der Spektralkomponenten von einem Fachmann kann die folgende Bedingung zutreffen: αVi >> αLi
Und folglich:
Viele weitere Modelle der Gewebegeometrie und dazugehörigen Extinktionsprofile sind vorstellbar. Das hier Betrachtete wird nur beispielhaft gezeigt. Es soll veranschaulichen, wie das Gefäßlumen zu den gemessenen normalisierten Extinktionskoeffizienten von mindestens zwei kontrastierenden Spektralkomponenten in Relation steht. Obwohl die hier abgeleitete Relation linear ist, kann sie grundsätzlich auch nichtlinear sein. In einem Echtsystem kann diese Relation durch Kalibierung im Hinblick auf Gewebephantome (das heißt Material, das konstruiert ist, um die geometrischen und optischen Charakteristiken einer echten Gewebeprobe zu imitieren, zum Beispiel ein aus optischem Harz mit eingelagertem Sand konstruierter Zylinder), die die Geometrie- und Streuungscharakteristiken einer Reihe von Gefäßen imitieren, erkundet werden. Solche Phantome sind einfach zu konstruieren.
Nun wird Bezug auf 3 genommen, die in groben Zügen eine Vorrichtung 40 zum Messen biologischer Strukturen wie zum Beispiel eines Blutgefäßes 42 zeigt. Die Vorrichtung 40 umfasst eine Kammer 44, in der das Blutgefäß 42 angebracht und mit geeigneten Medien versorgt wird, um den Zustand des Gefäßes 42 aufrechtzuerhalten. Eine Lichtquelle 46 erzeugt eine Reihe an Spektralkomponenten 48, wobei die Komponenten 48 durch eine Linse 50 geführt werden, die die unterschiedlichen Komponenten kollimiert und in ein einzelnes Lichtfeld 52 ausrichtet. Das Lichtfeld 52 wird dann mittels einer Glasfaseranordnung 54 so gerichtet, dass es einen geeigneten Bereich der Kammer 44 und des Gefäßes 42 ausleuchtet. Licht, das von dem Gefäß 42 durchgelassen 56 wird, wird mittels einer weiteren Lichtleitfaseranordnung 58 empfangen und auf einen geeigneten Lichtdetektor 60 gerichtet, der ein integriertes Intensitätsprofil des durchgelassenen Lichtes bereitstellt. Die Intensitätsdaten werden an einen Datenprozessor 62, wie zum Beispiel einen Personal-Computer, weitergeleitet, der auch so eingerichtet sein kann, dass er Daten von den anderen Komponenten der Vorrichtung 40 empfangen und Daten an diese weiterleiten kann und die Operationen der Vorrichtung steuern kann. Der PC 62 ist ebenfalls mit einem Ausgabegerät 64, wie zum Beispiel einem Monitor oder Drucker, verbunden, um eine Aufzeichnung der Versuchsdaten zu erzeugen.
Im Folgenden werden verschiedene Komponenten der Vorrichtung 40 detaillierter beschrieben. 4 zeigt einen Lichtleitfaserhalter 70, der mit der Vorrichtung 40 verwendet werden kann, um die geeignete Richtung des ausleuchtenden und des durchgelassenen Lichtes (mittels Lichtleitfaseranordnungen 54 und 58 in 3) sicherzustellen. Der Halter 70 beinhaltet einen röhrenförmig geformten Kunststoff 72, der die Form einer umgedrehten Tasse mit einem Gabelungspunkt 74 bildet, was zu zwei Kanalabschnitten 76, 78 führt, deren freie Enden sich gegenüberliegen. Der Halter 70 ist auf einer kreisförmigen Drehanbringung 80 angebracht, so dass der Halter leicht in die und aus der Position bewegt werden kann. Während der Anwendung werden zwei Lichtleitfasern, von denen eine als Sender und eine als Empfänger dient, von der Drehanbringung 80 aus in die Röhre 72 eingesetzt. Die Sender-Faser wird entlang der Röhre in den linken Kanalabschnitt 76 geführt, während die empfangende Faser in den rechten Kanalabschnitt 78 geführt wird. Die Enden der Faser werden angepasst, so dass sie bündig mit den Enden der Kanalabschnitte 76, 78 abschließen, um sicherzustellen, dass aus der durchlassenden Faser austretendes Licht von der empfangenden Faser festgestellt werden kann. Die anderen Enden der Fasern sind mit den geeigneten Sender- oder Detektorteilen der Vorrichtung verbunden. Während der Anwendung wird der Halter 70 so platziert, dass sich auf jeder Seite einer zu messenden biologischen Struktur einer der Kanalabschnitte 76, 78 befindet.
Wenn die biologische Struktur eine Röhrenstruktur ist, kann sie mittels einer wie in 5 gezeigten Gewebeanbringung zwischen den Abschnitten des Halters gestützt werden. Die Gewebeanbringung 82 beinhaltet eine Polypropylenröhre 84 mit parallelen Wänden und einem externen Durchmesser, der etwa ein Zehntel der Länge beträgt, und einen Innendurchmesser, der circa vier Fünftel des Außendurchmessers beträgt. In einem Abstand von einem Ende, der im Allgemeinen dem Außendurchmesser der Röhre gleicht, ist eine 20 mm breite Rille 86 vorhanden. Zum Herstellen der Gewebeanbringung 82 wird ein herkömmlicher Polypropylenrohrstrang (Camlab, Cambridge, UK) in geeignete Längen geschnitten und auf einer Mikrodrehmaschine angebracht. Ein Mikromanipulator, der eine erwärmte chirurgische Nadel (28 Gauge) aufweist, wird langsam der sich drehenden Kunststoffröhre angenähert und schneidet eine 20 mm breite periphere Rille in den Rohrstrang. Um ein Gefäß auf der Anbringung 82 anzubringen, wird ein Teilabschnitt des zu untersuchenden Gefäßes auf die Anbringung gezogen, bis der Rand des Gefäßes über die Rille 86 geht. Ein kleines Kunststoffband wird an das Gefäß angelegt und sachte über die Rille festgezogen, um das Gefäß an der Anbringung 82 zu sichern.
6 stellt eine weitere Vorrichtung 90 zum Messen biologischer Strukturen gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar. Die Vorrichtung 90 umfasst vier Kammern 92, in denen eine Versuchsprobe lokalisiert werden kann, von denen jede mit einem Lichtleitfaserhalter 70 wie beschrieben bereitgestellt wird.
Die Vorrichtung umfasst ein Oszilloskop 94, um die Intensität des durchgelassenen Lichtes zu überwachen, und ist mit einem Personal-Computer 96 mit Monitor 98 verbunden, um die Versuchsdaten zu analysieren und anzuzeigen. Die Vorrichtung 90 weist ebenfalls mehrere Fluidbehälter 100 zum Lagern und Abgeben von Medien oder anderen Substanzen für die Anwendung in Versuchsprozeduren sowie eine Mehrkanalkassettenpumpe (aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht gezeigt) zum Fluidpumpen auf. Um die Vorrichtung 90 für Versuchsprozeduren vorzubereiten werden Gewebeanbringungen wie beschrieben in jeder Kammer 92 an jedes von zwei Edelstahlrohren angebracht. Ein Teilabschnitt isolierten Blutgefäßes (Längenspanne 8–16 mm; Durchmesserspanne 100–1000 μm) wird auf die proximate Kanule gezogen, bis 2 mm an Gefäß die Gewebeanbringung umgibt. Das Gefäß wird mittels einem Kunststoffband wie beschrieben gesichert.
Vor der Untersuchung des Gewebes wird der Lichtleitfaserhalter 70 über dem Gewebe herumgedreht und so positioniert, dass die Endflächen der Lichtleitfasern entgegengesetzt sind und das emittierte Licht direkt senkrecht zu der Längsachse des Gewebes ist (wie durch den strickpunktierten Umriss 79 in 4 gezeigt).
Die Fluidbehälter 100, die über ein Rohrstrangsystem mit Perfusionsschleifen verbunden sind und durch Magnetventile kontrolliert werden, werden vor Beginn des Versuchsprotokolls mit den geeigneten Lösungen gefüllt. Üblicherweise enthalten die Behälter eine Spüllösung und Arzneimittel. Das Füllen des Behälters wird vor jeder Untersuchung manuell über das Einfülllochbewerkstelligt.
14 ermöglicht das genaue Positionieren von Gewebe im Hinblick auf die Lokalisierungsmittel.
Nach der Dissektion ist isoliertes Gewebe möglicherweise schwer zu handhaben, da es von schlaffer Beschaffenheit ist. Dies gilt insbesondere für die genaue Positionierung des Gewebes im Hinblick auf die Lokalisierungsmittel, die einen Drahthalter, eine Kanüle oder dergleichen beinhalten können. Um diesen Nachteil zu umgehen und wie in 14 gezeigt ist, kann das Immobilisieren und Positionieren des Gewebes hilfreich für die Ausrichtung auf das Lokalisierungsgerät sein. Indem die Gewebestruktur unter Anwendung einer Pinzette vorsichtig auf einer Schicht platziert wird, die ein oder mehrere aus dem Folgenden ausgewähltes) Proteine) beinhaltet: Kollagen, Elastin, Gelatine, Fibronektin, Fibrinogen und Vitronektin, kann das Gewebe in der Position gehalten werden.
Die Proteinschicht kann auf eine Polypropylen- oder Polyethylenfläche platziert werden. Vorzugsweise beinhaltet die aus Kunststoff hergestellte Fläche den inneren Aspekt einer Hälfte eines konischen Trichters, sodass eine konkave Fläche sichergestellt wird, auf die das Gewebe zu platzieren ist. Wie in 14 zu sehen ist, werden zwei solche Trichter dann entgegengesetzt auf einer starren Wanne platziert, wobei die Öffnungen der Trichter zueinander gerichtet sind. Ein Trichter (A) ist als ein Teil der Wanne fixiert, der zweite Trichter (B) ist auf der Wanne platziert, vorzugsweise an einer Schiene befestigt, die die Bewegung hin zu und weg von dem ersten Trichter in der horizontalen Ebene ermöglicht.
Ferner wird die genaue Positionierung des Gewebes im Hinblick auf das gewählte Lokalisierungsgerät sichergestellt, indem ein Ende des Gewebes an einem Punkt, der dem Außendurchmesser des Gewebes gleicht, vorsichtig in dem Hals des fixierten konischen Trichters (A) platziert wird. Der zweite Trichter (B) wird entlang der horizontalen Ebene bewegt, bis das Ende des Gewebes in dem Hals des konischen Trichters wieder über dem Punkt in dem Trichter liegt, der dem Außendurchmesser des Gewebes gleicht. Dann wird das Gewebe vorsichtig auf der Proteinschicht des bewegbaren zweiten Trichters (B) platziert.
Das Lokalisierungsgerät kann zuerst durch den engen Abschnitt des Trichters und dann durch das immobilisierte Gewebe geführt werden.
Verschiedene Versuchsbeispiele werden nun beschrieben. Die Versuche wurden alle mit einem modifizierten Druckmypgraphen (P110, Danish MyoTech, Aarhus, Dänemark) mit vier Kammern in jedem Modul und Multi-Behälter-Kapazitäten ausgeführt. Eine Mehrkanalkassettenpumpe vom Typ 205U/CA (Watson-Marlow, Camlab, Cambridge, UK) wurde ebenfalls verwendet.
Für den Betrieb und die Vorbereitung des Myographen und der Pumpe wurde die Bedienungsanleitung des Lieferanten verwendet, mit Modifizierungen für die Implementierung des vorliegenden Messprotokolls, wo angebracht.
Beispiele
Beispiel 1. Absorptionsspektroskopie der agonisteninduzierten Vasokonstriktion und Vasodilation von Mesenterialarterien in Ratten
Mesenterialarterien der 3. Ordnung normotensiver männlicher Wistarratten wurden in zwei Perfusionskammern in normaler physiologischer Salzlösung (PSS) bei 37°C arrangiert und mit 95% O₂/5% CO₂ begast. Die Gefäße wurden unter einen Druck von 60 mmHg gesetzt und konnten 30 Minuten lang äquilibrieren. Anschließend diente ein Gefäß als Kontrolle und das andere Gefäß erhielt steigende Konzentrationen des Thromboxan-A2-Mimetikums, U46619. Transmissionsspektren wurden in Intervallen von einer Sekunde aufgezeichnet und gemäß der oben beschriebenen Verfahren analysiert.
Die U46619-induzierte Vasokonstriktion wurde anhand von Verschiebungen in den Transmissionsspektren aufgrund von Veränderungen des Lumendurchmessers festgestellt. Das oben beschriebene optische Extinktionsmodell wurde verwendet, um den Lumendurchmesser genau und kontinuierlich zu messen. Diese Daten können dann als Graph der Konzentration (des Agonisten) gegenüber der Reaktion (% Veränderung des Lumendurchmessers) ausgedrückt werden (7).
Experiment 2. Absorptionsspektroskopie von Rattenarterien
Mesenteriale Widerstandsarterien der dritten Ordnung wurden von adulten weiblichen normotensiven Wistarraten und hypertensiven Goldblattratten (eine Niere – ein Clip) 8 Wochen nach Einleiten der Hypertension gewonnen. Zwanzig arterielle Proben (10 normotensive; 10 hypertensive) von 16 Tieren (6 achtwöchige normotensive, 5 achtwöchige hypertensive, 3 vierwöchige normotensive und 2 vierwöchige hypertensive) wurden untersucht. Vor der Anbringung in dem Myographen wurden sezierte arterielle Segmente in einer kalten Salzlösung gelagert.
Ringpräparationen wurden auf zwei Edelstahldrähten (40 μm im Durchmesser) in physiologischer Salzlösung angebracht, begast in 95% O₂/5% CO₂ und bei 37°C auf einem pH-Wert von 7,4 gehalten. Die Drähte wurden auf den Anbringungsköpfen des Myographen gesichert, um den Innendurchmesser der Gefäße direkt über einen automatisierten, an einem Anbringungskopf befestigten Lineartisch kontrollieren zu können. Unter Anwendung von Lichtmikroskopie und einem kalibrierten Fadenokular wurden morphologische Messungen der Mediadicke (w), des Drahtdurchmessers (d) und der Drahttrennung (s) durchgeführt, wobei die Gefäße unter Bedingungen der minimalen Spannung standen (8). Der Durchschnitt von drei Werten, die in gleichem Abstand entlang jedes Gefäßes gemessen wurden, wurde verwendet. Ausgehend von einem kreisförmigen Querschnitt unter physiologischen Bedingungen wurden der effektive Innenumfang (C), der Lumendurchmesser (L) und der Querschnittsbereich der Gefäßwand (A) unter Anwendung der folgenden Gleichungen berechnet: C = d(2 + P) + 2s L = C, P A = Pw(L + w)
Spektroskopiemessungen wurden durch ein einfaches, über eine über dem Gefäß endende Sonde in den Mulvany-Myographen integriertes lichtleitfasergekoppeltes Spektrometer gewonnen. Licht aus einer Wolframhalogenquelle (150 W) wurde über eine Lichtleitfaser und eine Kollimationslinse zu dem Myographen geleitet (9). Die Glasfasersonde (Durchmesser der Spitze: 1 mm, Kerndurchmesser der Glasfaser: 50 μm) wurde mittels einer an horizontalen (Auflosung 0,01 mm) und vertikalen (Auflosung 0,05 mm) Lineartischen eingespannten Sondenanordnung über dem Gefäß positioniert, um eine genaue Ausrichtung des Transmissionssystems zu ermöglichen. Ein an die Sonde gekoppeltes Dioden-Array-Spektrometer zeichnete in Intervallen von 2–3 Sekunden auf, während der Lumendurchmesser in 50-μm-Schritten von 100 μm auf 350 μm gestreckt wurde. Von zwei Sondenpositionen wurden Transmissionsspektren erhalten: eines wurde mit einem feststehenden Sondenkopf und das andere mit einem für jede horizontale Streckung von 50 μm um 20 μm bewegten Sondenkopf erfasst. In der darauffolgenden Analyse wurde insgesamt 659 Spektren verwendet. Es wurde ein Standardnormalisationverfahren verwendet, um die Rohspektren in Transmissionsspektren umzuwandeln, definiert als das Verhältnis zwischen hintergrundsubtrahiertem arteriellem Rohspektrum und Weißlichtspektrum. Die Analyse von Transmissionsspektren In der Annahme, dass die beobachteten Merkmale, die normale und hypertensive Gefäße voneinander unterscheiden, eine zugrundeliegende kompositionelle Veränderung der Gefäßwand widerspiegeln, hätte eine quantitative Analyse der Spektren prinzipiell mittels einer multivariaten Analyse der Konstituenten ausgeführt werden können. Da jedoch zu diesem Zeitpunkt das Vorhandensein und die Beschaffenheit solcher kompositioneller Veränderungen noch nicht etabliert worden ist, wurde eine empirischer Ansatz bevorzugt, um das Ausmaß und die Signifikanz der wichtigsten Spektralmerkmale zu etablieren. In Anbetracht der Gesamtform der zu untersuchenden Transmissionsspektren (T) war eine kompakte Representation unter Anwendung der logistischen Funktion möglich:
Ein Quasi-Newton-Algorithmus wurde verwendet, um diese nichtlineare Funktion an die beobachteten Spektren anzupassen. Ausreichend genaue Datenanpassungen wurden erhalten (RMS-Fehler = 3%), wenn nur zwei Termini dieser Gleichung verwendet wurden, die für die hier aufgeführte Analyse angewendet wurden.
Ergebnisse
Die mittleren, durch Mikroskopie gemessenen Dimensionen der arteriellen Exemplare sind in 12 aufgeführt.
Das Vorkommen vaskulären Wachstums war in beiden hypertensiven Altersgruppen ersichtlich. Die 4-wöchigen hypertensiven Tiere zeigten einen merklichen Anstieg von 98% im Querschnittsbereich der Media (65% im Verhältnis Media:Lumen) verglichen mit ihren gepaarten normotensiven Kontrollen. Die Gefäße der 8-wöchigen hypertensiven Gruppe zeigten auch einen Anstieg dieser Parameter (20% im Querschnittsbereich der Media; 20% im Verhältnis Media:Lumen). Die Daten der 4-wöchigen Gruppe wurden verzerrt, da ein Tier einen ungewöhnlich hohen Druck (231 mmHg) und ein merkliches strukturelles Wachstum entwickelte. Da es das Ziel dieser Untersuchung war, die Nützlichkeit der Spektroskopie zu bestätigen, und nicht, Aspekte dieses speziellen Hypertensionsmodells zu erforschen, erwiesen sich diese Daten in der Folge als äußerst nützlich. Aus den Gefäßen 4-wöchiger Tiere abgeleitete Transmissionsspektren (Auflösung = 1 nm) zeigen eine deutliche Trennung zwischen normotensiven und hypertensiven Gefäßen, da Veränderungen der Gefäßwanddicke in vertikalen Verschiebungen der Spektren reflektiert werden (10). Der beobachtete Unterschied zwischen den 8-wöchigen Gruppen war aufgrund der dickeren Wände, die von der 4-wöchigen Gruppe gezeigt wurden, nicht so merklich. Ein unterschiedlicher Anstieg des arteriellen Lumens (N1 bis N2 und H1 bis H2) beeinflusste die beobachteten Absorptionsspektren in der vertikalen Ebene, was die Korrelation zwischen Wanddicke und Absorptionsspektren bestätigte. Feinere Merkmale der Unterscheidung von hypertensiven und normotensiven Gefäßen wurden beobachtet, einschließlich einer hohen Absorptionseigenschaft im Blau-Grün-Bereich des Spektrums (400 nm–550 nm, 10). Angesichts der Konsistenz dieser Beobachtungen eignet sich eine zukünftige detaillierte quantitative Bestimmung für die Nachprüfung der Quelle dieser Daten.
Ein typisches Transmissionsspektrum und dessen empirisches Modell sind in 11 gezeigt, wobei die folgenden Modellparameter gelten: a₁ = 0,39; a₂ = 0,098; b₁ = 0,057 nm^–1; b₂ = 0,179 nm^–1; λ₁ = 412 nm; λ₂ = 753 nm. Jeder dieser Parameter weist im Hinblick auf die Datenanpassungsprozedur eine unterschiedliche Empfindlichkeit auf, und daher wurde die Präzision der Parameterschätzwerte individuell ausgewertet. Diese Auswertung wurde an anderer Stelle ausgeführt und die Schlussfolgerung aus der Analyse bringt die folgenden ungünstigsten Schätzfehler bei der Ermittlung der Modellparameter hervor: a₁ (±0,02); a₂ (±0,03); b₁ (±0,006); b₂ (±1,5); λ₁ (±4); λ₂ (±44). Diese Fehler sind wesentlich größer als die der meisten der untersuchten Spektren und sind angegeben, um eine konservative Interpretation der Ergebnisse zu ermöglichen. Es sollte außerdem betont werden, dass diese Fehler aus den begrenzten bereitgestellten Datensätzen abgeleitet sind und nur als Richtwerte bei der Betrachtung absoluter Fehler verwendet werden sollten.
Der Vergleich spektraler und morphologischer Ergebnisse
Beide hypertensiven Altersgruppen zeigten Mediawachstumsneigungen. Die linearen Korrelationskoeffizienten, die aus einem Vergleich zwischen den Transmissionsspektralmerkmalen (a₁, a₂, b₁, b₂, λ₁, λ₂) und den Parametern, die gewöhnlich in der Untersuchung und klinischen Definition von Hypertension verwendet werden (Verhältnis Media:Lumen (R), Querschnittsbereiche (A) der Media und Blutdruck (BD)), gewonnen wurden, sind in 13 detailliert beschrieben. Es besteht eine Reihe statistisch signifikanter Korrelationen zwischen den durch die Spektroskopie gewonnenen Merkmalen und den herkömmlich zur Definition von Hypertension verwendeten, wobei die von größerer Signifikanz und näherem Herankommen an die Linearität in der 4-wöchigen Gruppe vorzufinden sind. Es ist zu erwarten, dass das Verhältnis Media:Lumen Veränderungen der Gefäßgröße widerspiegelt, die mit anatomischer Variabilität und Mediawachstum assoziiert sind, und dies sollte wiederum in einer Neuskalierung der Transmissionsspektren widergespiegelt werden. Diese Auswirkungen werden in der Tat durch die signifikante Korrelation zwischen R und den Skalierungsfaktoren für die 4-wöchige Gruppe impliziert. In der 8-wöchigen Gruppe, mit einem weniger merklichem Unterschied in der Struktur, ist die Anzahl der Korrelationen reduziert, signifikante Veränderungen können jedoch immer noch in zwei Skalierungsfaktoren festgestellt werden. Tatsächlich sind die signifikantesten Korrelationen zwischen b₁, λ₁ und BD, R vorzufinden. Da BD und R selbst in dieser (Korrelationskoeffizient = 0,98 für die 4-wöchige Gruppe) und vielen anderen Untersuchungen stark korreliert sind, ist ihre Relation zu den beobachteten Spektralmerkmalen das wichtigste Ergebnis dieser vorliegenden Untersuchung. Da diese Spektralmerkmale zu der logistischen Funktion (obige Gleichung), die die durchschnittliche Spektralform im Bereich 350–550 nm modelliert, in Beziehung stehen, ist ein Zusammenhang zwischen dem Vorkommen von Hypertension und der Existenz unterschiedlicher Absorption im Blau-Grün-Bereich des Spektrums erwiesen.
Die folgenden Beispiele beziehen sich auf theoretische Messungen, die unter Anwendung der Vorrichtung und des Verfahrens der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden könnten.
Beispiel 1. Absorptionsspektroskopie proximaler und distaler humaner subkutaner Arterien von Patienten mit kritischer Gliedmaßenischämie
Humane subkutane Arterien von Patienten mit kritischer Gliedmaßenischämie werden in der Perfusionseinheit arrangiert und mit normaler PSS perfundiert. Gefäße, die sich proximal zu der Stelle der Gliedmaßenischämie befinden, werden mit Gefäßen, die sich distal zu der Stelle der Gliedmaßenischämie befinden, verglichen. Die Absorptionsspektren beider Gefäßarten werden verwendet, um Unterschiede des Verhältnisses Media:Lumen, des Querschnittsbereichs der Gefäßwand und der Wanddicke zu untersuchen.
Die Ergebnisse zeigen, ob Ischämiearterien (I) merklich unterschiedliche Absorptionsspektren im Vergleich zu proximalen Nicht-Ischämiegefäßen (N) aufweisen, die Unterschiede ihrer Wanddicke, ihres Verhältnisses Media:Lumen und ihres Lumendurchmessers widerspiegeln.
Die Vorrichtung kann auch für Transfektionsversuche verwendet werden. Während dieses Vorgangs wird das Blutgefäß einem beliebigen von dem Erforscher gewählten Arzneimittel oder Vektor ausgesetzt. Wenn es sich um einen Vektor zum Transfizieren genetischen Materials handelt, wird das Material in das vaskuläre Gewebe transportiert, wenn die Druck- und Fließeinstellungen entsprechend gewählt sind. Sobald es dort angelangt ist, beginnen die Zellen des Blutgefäßes, das spezifische, von dem genetischen Material kodierte Protein zu produzieren. Diese Proteine gelangen zur Zellmembran und quartieren sich dort ein. Die für diesen Vorgang benötigte Zeit hängt von dem angeregten Vektor und bestimmten System ab. Im Anschluss an einen geeigneten Transfektionszeitraum (der durch den Erforscher ermittelt wird und zu Beginn des Tests programmiert wird) wird der Perfusionsbehälter in einen Behälter geändert, der einen Agonisten der Wahl enthält, der als geeignet dafür ausgewählt worden ist, das während der Transfektion induzierte Protein zu stimulieren. Beim Kontakt mit den Proteinen in dem Gewebe induziert der Agonist in dem Gewebe eine funktionelle Reaktion (in der Regel Vasokonstriktion oder Vasodilation, möglicherweise Veränderungen der Wandstruktur). Jegliche solche Veränderung spiegelt sich in einer Modifizierung der optischen Eigenschaften des vaskulären Gewebes wider.
Beispiel 2. Transiente Transfektion vom NOS-Synthase-Gen in NOS-Knockout-Mäusen unter Anwendung des Reagens LipofectAMINE und funktionelle Feststellung der Transfektion durch Absorptionsspektroskopie
Maus-Mesenterialarterien der 1. Ordnung werden herausseziert und in Optimem I, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, gehalten. In geeignete Plasmide eingefügte cDNAs (für NOS) werden gemäß Herstellerangaben mit LipofectAMINE gemischt. Zwei Arterien werden in getrennten Perfusionskammern arrangiert; das erste Gewebe (A) dient als Kontrolle (erhält LipofectAMINE und Plasmide ohne cDNA-Einfügung), das zweite Gewebe (B) erhält LipofectAMINE mit Plasmiden, die die NOS-cDNA-Einfügung enthalten. Die Arterien werden 8 Stunden lang den geeigneten Transfektionslösungen ausgesetzt.
Die Ermittlung der NOS-cDNA-Transfektionseffzienz
Nach 8 Stunden schaltet die Einheit automatisch um und perfundiert die Gefäße mit normaler PSS. Die Analyse des Lumendurchmessers mittels der Absorptionsspektroskopie setzt ein und stellt kontinuierliche Informationen hinsichtlich des kontraktilen Zustandes der Arterie bereit.
Die funktionelle Feststellung der NOS-Aktivität wird mittels eines Zweiphasenprotokolls erreicht. Als erstes werden in beiden Gefäßen Konzentrations-Wirkungs-Kurven bezüglich ACh durchgeführt. Während der Konzentrations-Wirkungs-Kurve werden Veränderungen des Zustandes der Blutgefäße durch Absorptionsspektroskopie kontinuierlich beobachtet. ACh aktiviert selektiv die exprimierte NOS-Synthase und verursacht eine Freisetzung des Vasodilators Stickstoffmonoxid (NO). Daher wird das Vorkommen von NOS durch die Vasodilation des Blutgefäßes als Reaktion auf ACh bewiesen. Das Kontrollgefäß sollte geringe Vasodilation durch ACh aufzeigen, da NOS-cDNA in diesem Gewebe nicht transfiziert wurde.
Beide Gefäße werden dann dreißig Minuten lang mit normaler PSS perfundiert. Um sicherzustellen, dass die ACh-induzierte Vasodilation durch die NOS-Aktivierung entsteht und nicht durch andere nichtidentifizierte Faktoren, wird die zweite Phase des Protokolls eingeleitet. Die Konzentrations-Wirkungs-Kurve für ACh wird in Anwesenheit des selektiven NOS-Inhibitors L-NAME wiederholt. Wenn ACh in der ersten Phase des Protokolls eine Vasodilation über die NOS-Aktivierung erzeugte, sollte L-NAME weitere Reaktionen auf ACh beseitigen.
Beispiel 5. Die Transfektion vom Gastrointestinaltrakt von ORL-1-Knockout-Mäusen mit ORL-cDNA unter Anwendung von Adenovirusvektoren
Zwei 3 cm große Segmente des Gastrointestinaltraktes von Mäusen werden in Perfusionskammern arrangiert und mit normaler PSS perfundiert. cDNAs für den ORL-1-Rezeptor werden in ein adenovirales Transferplasmid mit dem Zytomegalieviruspromotor ligiert. Der Virus wird in Optimem I verdünnt und dann bis zu zwei Stunden lang durch ein Segment des Gastrointestinaltraktes perfundiert, das andere Segment dient als Kontrolle und erhält das Virus ohne die ORL-1-cDNA.
Nach dem Transfektionszeitraum wird die funktionelle Feststellung des exprimierten ORL-1-Rezeptoren durch die spektroskopische Feststellung von Kontraktionen während der Perfusion des selektiven ORL-1-Agonisten Nociceptin erreicht. Das Kontrollgewebe sollte keine Reaktion zeigen. Um sicherzustellen, dass die Einwirkungen von Nociceptin durch den ORL-1-Rezeptor geschehen, wird die Zugabe von Nociceptin in Anwesenheit eines selektiven ORL-1-Antagonisten, wie zum Beispiel Naloxon, wiederholt. Dieser Antagonist blockiert Reaktionen, in die der ORL-1-Rezeptor involviert ist, und daher sollte Nociceptin keine Wirkung zeigen.

Claims

Ein In-vitro-Verfahren zum Feststellen einer Veränderung der physischen Dimensionen einer biologischen Struktur, wobei das Verfahren die folgenden Schritte beinhaltet: Ausleuchten einer biologischen Struktur mit Licht einer ersten Wellenlänge und Licht mindestens einer weiteren Wellenlänge, Feststellen der Intensität des Lichtes jeder Wellenlänge, das von der biologischen Struktur durchgelassen wurde, in mindestens einem ersten und zweiten physischem Zustand und Vergleichen der Intensität des durchgelassenen Lichtes jeder Wellenlänge mit einer Referenzlichtintensität der gleichen Wellenlänge, um eine Veränderung der Absorption der biologischen Struktur zu ermitteln, wobei die Veränderung der Absorption einer Veränderung physischer Dimensionen entspricht, wobei das Verfahren den Schritt des Unterscheidens der gemessenen Intensitäten jeder verwendeten Lichtwellenlänge umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt des Feststellens von durchgelassenem Licht den Schritt des Feststellens der Intensität von durchgelassenem Licht über im Wesentlichen den gesamten Durchmesser der biologischen Struktur beinhaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei Wellenlängen so ausgewählt werden, dass die biologische Struktur bei einer der Wellenlängen im Wesentlichen opak ist, während die biologische Struktur bei einer anderen der Wellenlängen semi-transparent ist.
Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Schritte des Ausleuchtens, Feststellens und Vergleichens bei zweiten oder nachfolgenden Wellenlängen im Anschluss an die bei der ersten Wellenlänge durchgeführten Schritte ausgeführt werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Schritte des Ausleuchtens, Feststellens und Vergleichens bei zweiten oder nachfolgenden Wellenlängen gleichzeitig mit der ersten Wellenlänge ausgeführt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei getrennte Detektoren verwendet werden.
Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die festgestellte kombinierte Intensität einer nachträglichen Verarbeitung unterzogen wird, um die Komponenten der verschiedenen Wellenlängen zu trennen.
Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Referenzlichtintensität der Intensität des Lichtes entspricht, die gemessen wird, wenn keine biologische Probe ausgeleuchtet wird.
Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Referenzlichtintensität der gemessenen Intensität des Lichtes entspricht, das von der biologischen Probe in einem anderen physischen Zustand durchgelassen wurde.
Verfahren gemäß einer der vorherigen Ansprüche, wobei die Veränderungen der physischen Dimensionen einer biologischen Struktur im Zeitablauf gemessen werden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte beinhaltet: Ausleuchten einer biologischen Struktur zu einem ersten und zweiten Zeitpunkt mit Licht einer ersten Wellenlänge, Feststellen der Intensität des von der biologischen Struktur zu einem ersten und zweiten Zeitpunkt durchgelassenen Lichtes und Vergleichen der Intensität des durchgelassenen Lichtes zu dem ersten Zeitpunkt mit der Intensität des durchgelassenen Lichtes zu dem zweiten Zeitpunkt, um eine Veränderung der Intensität des durchgelassenen Lichtes zu ermitteln, wobei die Intensitätsveränderung ein Hinweis auf eine Veränderung der physischen Dimensionen der biologischen Struktur ist.
Verfahren gemäß Anspruch 10, das ferner den Schritt des Modifizierens der örtlichen Umgebung der biologischen Struktur zwischen dem ersten und dem zweiten Zeitpunkt beinhaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei der Schritt des Modifizierens der örtlichen Umgebung das Hinzugeben oder Entfernen von Agonisten, Hormonen, potentiellen Arzneimitteln und/oder Testproben zu/aus dem Umfeld der biologischen Struktur, und/oder direkte physische Stimulation der Struktur und/oder Transfizieren der biologischen Struktur mit exogener Nukleinsäure umfasst.
Anwendung eines Verfahrens gemäß Anspruch 12, um die Auswirkungen eines Gens oder einer ähnlichen Nukleinsäurestruktur oder die potentielle Stabilität eines Transfektionsvektors oder der biologischen Struktur für die Transfektion zu ermitteln.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei Peptid- oder Proteinstrukturen zu der biologischen Struktur hinzugegeben werden, um die Auswirkungen solcher Peptide oder Proteine direkt zu ermitteln, ohne dass die Expression eines transfizierten Gens erforderlich ist.
Eine Vorrichtung zum Feststellen von Veränderungen physischer Dimensionen biologischer Strukturen, wobei die Vorrichtung mindestens eine Lichtquelle (46) zum Erzeugen von Licht einer Vielzahl von Wellenlängen, einen Lichtdetektor (60), der in der Lage ist, die Intensität des von den biologischen Strukturen auf jeder der Wellenlängen durchgelassenen Lichtes festzustellen, Mittel zum Trennen des festgestellten Lichtes einer jeden Wellenlänge, Mittel (40) zum Lokalisieren einer biologischen Struktur zwischen der Quelle und dem Detektor und Datenverarbeitungsmittel (62) zum Aufzeichnen und Analysieren von festgestelltem Licht, das von der biologischen Struktur durchgelassen wurde, beinhaltet, um Veränderungen der Eigenschaften des durchgelassenen Lichtes festzustellen und zu analysieren, um Veränderungen der physischen Dimensionen der biologischen Struktur zu ermitteln.
Vorrichtung gemäß Anspruch 15, wobei die mindestens eine Lichtquelle eine Vielzahl von Lichtquellen, von denen jede Licht in einer einzelnen Wellenlänge erzeugt, beinhaltet.
Vorrichtung gemäß Anspruch 15, wobei die mindestens eine Lichtquelle mindestens eine Lichtquelle, die Licht in einer Vielzahl von Wellenlängen erzeugt, beinhaltet.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei der Lichtdetektor ein CCD-Bauteil, einen Fotowiderstand oder eine Fotodiode beinhaltet.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei die Mittel zum Trennen des festgestellen Lichtes mehrerer Wellenlängen aus Post-Feststellungsmitteln oder Prä-Feststellungsmitteln gewählte Mittel oder Filtermittel, die es nur Licht einer einzigen Wellenlänge ermöglichen, den Detektor zu erreichen, beinhalten.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19, die ferner Mittel zum Ausrichten von erzeugtem und festgestelltem Licht beinhaltet.
Vorrichtung gemäß Anspruch 20, wobei die Mittel zum Ausrichten ausgerichtete Lichtleitfasern beinhalten, von denen mindestens eine erzeugtes Licht und mindestens eine festgestelltes Licht trägt.
Vorrichtung gemäß Anspruch 21, wobei die Fasern an einem Ende mit einer Lichtquelle oder einem Lichtdetektor verbunden sind und die anderen Enden der Fasern entgegengesetzt ausgerichtet sind, sodass Licht, das aus der Quellenfaser austritt, in die Feststellungsfaser eintreten kann.
Vorrichtung gemäß Anspruch 22, die ferner einen aus Kunststoff oder ähnlichem hergestellten Halter für die Lichtleitfasern beinhaltet, der so angeordnet ist, dass er die Lichtleitfasern in entgegengesetzt ausgerichteter Beziehung hält.
Vorrichtung gemäß Anspruch 23, wobei der Halter eine gegabelte Röhre beinhaltet, wobei die Spitzen jeder seiner Gabeln ausgerichtet sind und wobei bei Anwendung eine Lichtleitfaser in jede Gabel des Halters einsetzbar ist, wobei die freiliegenden Enden der Fasern an die Enden der Gabeln angrenzen, um eine korrekte Ausrichtung der Lichtleitfasern sicherzustellen.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 24, wobei die Mittel zum Lokalisieren einer biologischen Struktur einen Drahthalter, eine Kanüle oder eine aus Kunststoff hergestellte Röhre mit einer äußeren Umfangsrille beinhalten; wobei bei Anwendung eine biologische Röhrenstruktur über der aus Kunststoff hergestellten Röhre lokalisiert und daran mittels einer um die Rille gebundenen Befestigung gesichert werden kann.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 25, die ferner Mittel beinhaltet, um die biologische Struktur Fluiden und dergleichen auszusetzen.
Vorrichtung gemäß Anspruch 26, wobei das Mittel mindestens eine Kammer mit einem Fluideingang und einem Fluidausgang, in der die biologische Struktur lokalisiert ist, beinhaltet.
Vorrichtung gemäß Anspruch 27, die einen oder mehrere Fluidbehälter zum Speichern von Zirkulationsfluid beinhaltet.
Vorrichtung gemäß Anspruch 27 oder Anspruch 28, wobei die Kammer eine Fluidpumpe zum Zirkulieren von Fluid innerhalb der Kammer oder in die Kammer hinein und aus ihr heraus beinhaltet.
Vorrichtung gemäß Anspruch 29, wobei die Pumpe so angeordnet ist, dass sie die Kammer auf einem im Wesentlichen physiologischen Fluiddruck hält.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 30, die ferner Mittel zum Einführen von Substanzen in die biologische Struktur beinhaltet.
Vorrichtung gemäß Anspruch 27, in der eine Vielzahl an Kammern bereitgestellt ist, die das gleichzeitige Untersuchen einer Vielzahl von Proben biologischer Struktur ermöglichen.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 32, wobei das Datenverarbeitungsmittel einen Computer beinhaltet,
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 33, die temperaturregulierende Mittel zum Regulieren der Temperatur einer biologischen Probe beinhaltet.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 34, wobei das Mittel zum Lokalisieren der biologischen Struktur eine Proteinschicht, welche die Struktur immobilisieren kann, beinhaltet oder umfasst.
Vorrichtung gemäß Anspruch 35, wobei das Protein eines oder mehrere aus der aus Kollagen, Elastin, Gelatine, Fibronektin, Fibrinogen und Vitronektin bestehenden Gruppe ist oder davon abgeleitet ist.
Anwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zum Feststellen von Veränderungen des inneren Umfangs einer Röhrenstruktur.
Anwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zum Messen einer biologischen Röhrenstruktur wie die aus der Blutgefäße, lymphatische Gefäße, Luftwege, Darmkanäle, Harnleiter, Harnröhren, Hodenkanälchen, Samenleiter und dergleichen umfassenden Gruppe gewählten.