DE60110604T2

DE60110604T2 - Dielektrisch-hergestellte mikropartikel

Info

Publication number: DE60110604T2
Application number: DE60110604T
Authority: DE
Inventors: R. Peter GASCOYNE; F. Frederick BECKER; Jody Vykoukal; Xiao-Bo Wang
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2000-06-14
Filing date: 2001-06-14
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2021-06-15
Also published as: EP1305628A2; WO2001096023A2; HK1056603A1; EP1305628B1; AU2001268500A1; DE60110604D1; ATE294960T1; CA2409400A1; WO2001096023A3; US20030015428A1; JP2004503758A

Description

GRUNDLAGEN DER ERFINDUNG
1. Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Gebiete der Chemie und Lebenswissenschaften. Ganz besonders betrifft sie Techniken für die Manipulation, Reinigung, Trennung und Indexierung von Ziel-Analyten unter Verwendung dielektrischhergestellter Mikropartikel (hier als DEMPs) bezeichnet.
2. Beschreibung der verwandten Technik
Verbesserte Verfahren zur Trennung und Identifizierung von Chemikalien, Zellen und Biomolekülen sind für viele Fortschritte in der Chemie und den Lebenswissenschaften fundamental gewesen. Ein Großteil der Entdeckungsprozesse basiert auf der Bestimmung von qualitativen und quantitativen Informationen über eine bestimmte Chemikalie, Zelle, Biomolekül oder ein anderes Analyt. Analyseverfahren wie Titration, Zentrifugation, Spektroskopie und Lichtmikroskopie verwenden Unterschiede in den inhärenten physikalischen Eigenschaften von Analyten, um eine Analyttrennung und/oder -detektion zu erreichen.
Verbesserungen in diesen Basisverfahren sind allgemein in zwei Kategorien eingeteilt: (i) das Auflösungsvermögen oder die Empfindlichkeit des Verfahrens ist verbessert worden, um geringe physikalische Unterschiede besser zu differenzieren oder (ii) eine Substanz oder Markierung mit bestimmten Eigenschaften, die ohne weiteres zu unterscheiden sind, ist an ein Analyt gekoppelt worden, um das Analyt detektierbar zu machen oder leichter indirekt aufzuslösen. Gradientenzentrifugation und Hochauflösungschromatographie sind Beispiele für Verfahren, die auf einer zunehmenden Empfindlichkeit eines gegeben Verfahrens basieren; Zellfärbung mit fluoreszierenden Antikörpern und Radiomarkierung von Biomolekülen sind Beispiele für verbesserte Verfahren, die auf der Kopplung von Markierungen an Analyte basieren, um die Auflösung eines Analyts zu fördern. Obwohl diese Verbesserungen viele Erfolge auf dem Gebiet zeigten, blieben Probleme bestehen. Insbesonders ermöglichen diese Verfahren noch kein Verfahren, bei dem Analyte auf einmal indexiert, detektiert und manipuliert werden können, noch erlauben sie die trennende Manipulation vieler verschiedener Analyttypen auf einmal.
Ein herkömmlicher Analysentyp, bei der Markierungen verwendet werden, ist als „Eintopf"- Reaktion bekannt. Eintopfreaktionen sind Reaktionen, wo die Reagenzien einfach zu einem Probenaliquot in einem einzigen Teströhrchen oder Becherglas zusammengegeben werden. Beliebige Moleküle des in der Probe vorhandenen Ziel-Analyts reagieren mit dem zugegebenen Indikator, um ein kolorimetrisches, fluoreszierendes oder chemilumineszierendes Produkt oder Komplex zu ergeben. Dieses Reaktionsprodukt oder -komplex wird dann detektiert und normalerweise quantifiziert. Das definierende Merkmal derartiger Verfahren ist, dass die detektierbare Spezies nur vorliegt, wenn das Ziel-Analyt tatsächlich in der Probe vorhanden ist.
Ein Beispiel einer zweckdienlichen Markierung für eine Eintopfanalyse ist ein molekulares Leuchtsignal. Molekulare Leuchtsignale verwenden ein Molekül, das ein eingebautes Fluorophor und einen Löscher hat. Das Fluorophor und der Löscher sind in unmittelbarer Nähe zusammen, bis zu dem Zeitpunkt, an dem das Molekül an ein Ziel bindet. Zu diesem Zeitpunkt werden sie hinreichend weit auseinandergezogen, so dass das Fluorophor fluoreszieren kann. Wenn der Löscher nicht länger löscht, kann das Ziel über die Fluoreszenz beobachtet werden.
Weitere Beispiele für Eintopfassays umfassen kolorimetrische pH-Detektion oder nicht-spezifisches Markieren von Nukleinsäuren unter Verwendung eines interkalierenden Farbstoffes wie Ethidiumbromid. Techniken wie Southern und Northern-Blotting mit Nukleinsäuren und ELISA und Western-Blotting mit Proteinen nutzen markierte Sonden, die binden und die Detektion von spezifischen biochemischen Analyten erleichtern. Diese Antikörper oder Nukleinsäuresonden sind radioaktiv, fluoreszierend oder enzymatisch aktiv, falls sie an ihr Ziel-Analyt gebunden haben.
Um allerdings mit den obigen Verfahren zweckdienliche Resultate zu erzielen, ist es erforderlich, zwischen dem ungebundenen Analyt, der freien Sonde und den Analyt-Sonde Komplexen zu unterscheiden. Dies wird erreicht durch Immobilisieren der Analyt-Sonde Komplexe an einem festen Träger, und dann Abwaschen der freien, ungebundenen Moleküle, und Zurücklassen nur der am festen Träger haftenden markierten Analyt-Sonde Komplexe. Unglücklicherweise kann dieser Prozess etwas kompliziert und zeitaufwändig sein.
Um wenigstens einige der Probleme zu lösen, die mit der herkömmlichen Identifizierung und Trennung von Analyten verbunden sind, sind bestimmte Mikropartikel verwendet worden. In den späten 70ern wurden Techniken entwickelt, die eine relativ einfache Herstellung von Mikropartikeln mit einer einheitliche Größe vom Submikron- bis zum 100-Mikronbereich ermöglichten. Später wurden auch Techniken zur Herstellung von Mikropartikeln mit magnetischen Eigenschaften entwickelt. Unter Verwendung dieser Techniken hergestellte Mikropartikel sind mit verschiedenen Sonden verbunden worden, die mit spezifischen Ziel-Analyten oder Klassen von Analyten wechselwirken oder an diese binden, um Mikropartikel-Analyt Komplexe zu bilden. Auf diese Weise können Mikropartikel hergestellt werden, die als Markierung dienen, die für Ziel-Analyte spezifisch sind.
Vorhandene Mikropartikel-Markierungen können grob in zwei Kategorien eingeteilt werden, nämlich die einen für den Analytnachweis und die anderen für die Analytmanipulation. In beiden Kategorien werden für ein spezifisches Analyt sensitive Markierungen zu einer Probe gegeben und unter Bedingungen inkubiert, die ein Binden des Ziel-Analyts, falls es in der Probe vorhanden ist, an die Mikropartikel-basierte Markierung erleichtern, um einen Mikropartikel-Analyt Komplex zu bilden.
In vorhandenen Analytdetektionsprotokollen sind bestimmte physikalische Eigenschaften der Mikropartikel wie Fluoreszenz, Undurchlässigkeit für Licht und andere Strahlen, oder Strahlenemission als Reporter eingesetzt worden, um auf das Vorhandensein des Mikropartikel-Analyt Komplex zu schließen. Zum Beispiel kann ein metallisches Mikropartikel oder Nanopartikel, das mit einem Zielprotein in einer Zelle über eine Antikörpersonde komplexiert, mittels Elektronenmikroskopie beobachtet und quantifiziert werden und darauf schließen lassen, dass das Zielprotein-Analyt an spezifischen Stellen in der Zeile ist und ein Beispiel für eine Markierung ist, die in Detektionsprotokollen verwendet wird.
In Detektionsprotokollen wird es nicht das Analyt direkt detektiert. Stattdessen wird auf das Vorhandensein des Analyts durch die Assoziation mit seinem Mikroparikelreporter geschlossen, eine Assoziation, die durch die Wechselwirkung zwischen der Sonde und dem Analyt vermittelt ist. Detektionsprotokolle können auch Zweischritt-Markierungsverfahren umfassen, in denen eine zweite Markierung verwendet wird, die das Vorhandensein des Mikropartikel-Analyt Komplexes anzeigt. In diesem Fall haftet das Analyt an einer ersten Sonde auf dem Mikropartikel und dann wird das Analyt anschließend mit einer zweiten spezifischen Markierung markiert, die dann als der Reporter verwendet wird, der das Vorhandensein des Analyts anzeigt, auf das geschlossen werden soll. Weil das Analyt zwischen dem Mikropartikel und einer zweiten Reportermarkierung effektiv eingequetscht endet, werden derartige Doppelmarkierungsprotokolle umgangsprachlich auch als „Sandwich-Assays" in der Wissenschaft bezeichnet.
In Manipulationsprotokollen werden Mikropartikel-basierte Markierungen als „Griffe" verwendet, um die physikalische Manipulation von Analyten zu unterstützen. In derartigen Protokollen werden bestimmte physikalische Eigenschaften des Mikropartikels wie Dichte, elektrische Ladung oder Größe genutzt, um den Mikropartikel-Analyt Komplex zu isolieren, zu trennen oder anderweitig zu manipulieren. In derartigen Verfahren wird das Analyt nicht direkt manipuliert. Stattdessen wird das Mikropartikel (d.h. der Griff) manipuliert und jedes an das Mikropartikel gebundene Analyt wird basierend auf dessen Assoziation mit dem Mikropartikel indirekt manipuliert. Manipulationsprotokolle basierend auf Mikropartikelmarkierungen erfordern unglücklicherweise zusätzliche Analyseschritte, um das Ziel-Analyt zu identifizieren.
Obwohl die obigen Mikropartikel-basierten Systeme wenigstens eine Einsatzfähigkeit auf diesem Gebiet gezeigt haben, stellen die zusätzlichen Schritte für die Identifizierung eines Ziels (abgesehen von Manipulation des Ziels) für den Wissenschaftler oder Ingenieur zusätzliche Zeit und Kosten dar. Selbst bei Verwendung von Mikropartikeln ist es außerdem manchmal der Fall, dass aus dem Nachweis der Mikropartikel selbst nicht immer auf das Vorhandensein des Ziel-Analyts geschlossen werden kann. Darüber hinaus erlauben herkömmliche Mikropartikel nicht die gleichzeitige getrennte Manipulation verschiedener Analyttypen. Einfach gesprochen, erlauben herkömmliche Mikropartikel nicht das Indexieren verschiedener Analyte und anschließende gleichzeitige Manipulation und/oder Identifizierung. Mit anderen Worten erlauben herkömmliche Techniken nicht die Bildung einer Bibliothek an verschiedenen Sonden, die jeweils an verschiedene Ziele binden und eine gleichzeitige Manipulation, Identifiziereung und Detektion der verschiedenen Spezies erlauben.
Mit Alkanthiolen beschichtetes Goldsol, die Gruppen auf dem Sol bereitstellen, die für die Verknüpfung von bindenden Resten wie Antikörper verfügbar sind, sind aus US-A-5 384 073 bekannt.
Bestimmte oben erwähnte Probleme, Schwächen oder Unzulänglichkeiten sind nicht erschöpfend genannt; weitere Probleme bestehen in der Technik. Allerdings zeigt die obige Diskussion, dass ein Bedarf an einer verbesserten Methodik bezüglich Manipulation, Trennung, Reinigung und Indexierung von Analyten besteht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die dielektrisch-hergestellten Mikropartikel der Erfindung sind durch die Merkmale in Anspruch 1 definiert.
Die dielektrisch-hergestellten Mikropartikel-Markierungen der Erfindung sind von Anspruch 4 oder Anspruch 5 definiert.
Ein Verfahren zum Nachweis eines Komplexes ist durch die Merkmale von Anspruch 6 definiert.
Ein Verfahren zur Manipulation eines Komplexes ist von Anspruch 9 definiert.
Ein Verfahren zur Identifizierung eines oder mehrerer Komplexe in einer Probe ist durch die Merkmale von Anspruch 16 definiert.
Die gemäß der vorliegenden Offenlegung hergestellten und verwendeten dielektrisch-hergestellten Mikroparikel-Markierungen können so konstruiert sein, dass sie die oben diskutierten Beschränkungen überwinden können, weil ein Indexieren des Analyts erreicht werden kann. Insbesondere erlaubt die vorliegende Offenlegung die gleichzeitige Identifizierung, Manipulation und Detektion einer Reihe verschiedener Ziel-Analyte durch die Verwendung einer Bibliothek von DEMPs mit verschiedenen unterscheidbaren dielektrischen Eigenschaften. Alternativ überwindet die vorliegende Offenlegung Beschränkungen in der Technik, weil sie ein Binden des Analyts erlaubt, das detektiert werden soll. Spezifische Mikropartikelmarkierungen mit dielektrischen Eigenschaften, die für ein Binden des Analyts sensitiv sind, können für eine Bestätigung der Bindung des Analyts durch Messung der Änderung des AC-elektrokinetischen Verhaltens der Markierung nach dem Binden verwendet sein.
Die Verwendungen für dielektrisch-hergestellte Mikropartikel gemäß den hier offengelegten Anwendungsformen sind vielfältig und umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Blutuntersuchung; Nachweis und Charakterisierung von Krankheiten, klinische Präparation reiner Zellpopulationen; Nachweis und Identifizierung von Pathogenen in der Lebensmittelverarbeitung, in öffentlichen Wasserversorgungssystemen, Landwirtschaft und Umwelt; Trennung von subzellulären Kompartimenten; Reinigung von Stammzellen für Knochenmarktransplantate und Entfernung oder Sammeln von erkrankten Zellen für Diagnose- und Forschungszwecke. Zusätzlich können hergestellte Mikropartikel für molekulare Analysen, einschließlich Isolierung, Trennung, Reinigung und Identifizierung verschiedener Materialien wie Proteine und Nukleinsäuren verwendet sein. Weitere hier offengelegte Techniken können zusammen mit heutigen Verfahren zur Trennung von Zellen wie Durchflusscytometrie angewandt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die folgenden Zeichnungen sind Teil der vorliegenden Beschreibung und sind zur weiteren Demonstration bestimmter Aspekte der vorliegenden Erfindung enthalten. Die Erfindung kann mit Bezug auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen zusammen mit der detaillierten Beschreibung der hier angeführten spezifischen Anwendungsformen besser verstanden werden.
1 zeigt ein dielektrisch hergestelltes Mikropartikel gemäß einer Anwendungsform der vorliegenden Offenlegung.
2A und 2B sind dielektrophoretische Kräftediagramme. Die Diagramme zeigen die Vektoren der dielektrischen Kraft, die ein sphärisches Partikel mit Radius 5 μm in einem rotierenden Feld erfährt, das mit Phasen-verschobenen Spannungssignalen von 1 Vrms, angelegt an Elektroden gebildet wird. In 2A, Re(f_CM) = 0,5 und Im(f_CM) = 0. In 2A lenkt die Kraft das Partikel gegen die Elektrode, die sich entlang der Kanten der Figuren befindet. In 2B, Re(f_CM) = 0 und Im(f_CM) = 0,5. Die Kräfte in 2B lenken das Partikel in circularer Translation um das Zentrum der Elektrodengeometrie.
3 zeigt einen Graph der Elektrorotationspektren. Insbesondere sind typische ROT-Spektren für Erythrocyten (Δ), T-Lymphocyten (O) und MDA231 Brustkrebszellen (☐) in isotonischer Sucrose mit einer Leitfähigkeit von 56 mS/m gezeigt. Kurven zeigen beste Übereinstimmungen mit einem einzelhülligen dielektrischen Modell, das unten diskutiert ist.
4 zeigt einen Graph des AC-elektrokinetischen Verhaltens verschiedener Mikropartikeltypen. Die cDEP (herkömmkiche Dielektrophorese) und twDEP (Wanderwellen-DEP) Reaktion für fünf unterschiedliche Mikropartikeltypen sind gezeigt. Jeder Mikropartikeltyp ist identisch, bis auf die Dicke der äußersten Hüllen, die zwischen etwa 1 bis 10 nm liegt. Jeder verschiedene Mikropartikeltyp kann an eine unterschiedliche Sonde gebunden sein und zum Markieren und dann zum Manipulieren oder Identifizieren verschiedener Analyte in einem Probengemisch verwendet sein.
5 ist ein schematisches Diagramm, das die Trennung von Analyten zeigt. Drei verschiedene Typen hergestellter Mikropartikel gemäß einer Anwendungsform der vorliegenden Offenlegung (als a, b und c bezeichnet) mit AC-elektrokinetischen Eigenschaften, die in 4 veranschaulicht sind, werden mit Antikörpern für CD3, CD4 und CD18 Zelloberflächenantige sensitiviert, um Markierungen für verschiedene Subpopulationen zu bilden. Diese Markierungen erleichtern DEP-FFF (DEP/Feld-Fluss-Fraktionierung) Trennung von CD3⁺, CD4⁺ und CD18⁺-Zellen, wie es in dem simulierten DEP-FFF Fraktogramm gezeigt ist.
6 ist ein schematisches Diagramm, das den Nachweis der Analyt-Bindung zeigt. Die dielektrischen Eigenschaften hergestellter Mikropartikel können durch die Analyt-Bindung gestört werden. Ein AC-elektrokinetisches Analyseverfahren wie DEP-FFF kann zum Nachweis dieser Änderung in Form von Elutionspeakverbreiterung oder Elutionspeakverschiebung angewandt werden.
7 ist ein Graph, der die Abhängigkeit der Partikelgeschwindigkeit von dielektrischen Eigenschaften zeigt.
8 ist eine schematische Darstellung von Partikel- und Mediumpolarisation.
9A–15B zeigen dielektrisch-hergestellte Mikropartikel, ihre Eigenschaften und Verhalten gemäß einer Anwendungsform der vorliegenden Offenlegung.
16 ist eine schematische Darstellung von Sandwich-(Doppelmarkierungs)-Assays, die zum Nachweis von Protein und mRNA in Untersuchungen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Offenlegung verwendet sein können.
17 zeigt ein dielektrisch-hergestelltes Mikropartikel gemäß einer Anwendungsform der vorliegenden Offenlegung, das einen Polystyrolkern, eine Goldhülle und eine selbst-assemblierte Alkanthiol-Einzelschicht umfasst.
18 zeigt ein dielektrisch-hergestelltes Mikropartikel gemäß einer Anwendungsform der vorliegenden Offenlegung, das einen Polystyrolkern, eine Goldhülle, eine selbst-assemblierten Alkanthiol-Einzelschicht und eine selbst-assemblierte Phospholipid-Einzelschicht umfasst.
19 zeigt ein dielektrisch-hergestelltes Mikropartikel gemäß einer Anwendungsform der vorliegenden Offenlegung, das einen Polystyrolkern, eine Goldhülle, eine selbst-assemblierte Alkanthiol-Einzelschicht und eine vernetzte selbst-assemblierte Phospholipid-Einzelschicht umfasst.
20 zeigt ein dielektrisch-hergestelltes Mikropartikel gemäß einer Anwendungsform der vorliegenden Offenlegung, das einen Polystyrolkern, eine Goldhülle, eine selbst-assemblierte Alkanthiol-Einzelschicht, eine selbst-assemblierte Phospholipid-Einzelschicht und eine Nukleinsäuresonde umfasst.
17 zeigt ein dielektrisch-hergestelltes Mikropartikel gemäß einer Anwendungsform der vorliegenden Offenlegung, das einen Polystyrolkern, eine Goldhülle, eine selbst-assemblierte Alkanthiol-Einzelschicht, eine selbst-assemblierte Phospholipid-Einzelschicht und eine Proteinsonde umfasst.
22 ist ein Graph, der die Übergangsfrequenz versus Leitfähigkeit zeigt.
BESCHREIBUNG DER VERANSCHAULICHENDEN ANWENDUNGSFORMEN
Diese Offenlegung beschreibt eine neue Technologie, in der Mikropartikel mit bestimmten zuvor festgelegten oder veränderten dielektrischen und/oder magnetischen Eigenschaften konstruiert und hergestellt werden, so dass ihr AC-elektrokinetisches (einschließlich herkömmlicher Dielektrophorese (cDEP), Wanderwellen-Dielektrophorese (twDEP), Wanderwellen-Dielektrophorese (gDEP) oder Elektrorotation (ROT)) und magnetophoretisches Verhalten wenigstens berechenbar oder steuerbar ist.
Diese hergestellten Mikropartikel können mit verschiedenen Sonden wie Antikörper, Nukleinsäuren oder chemischen Liganden mit in der Technik bekannten Verfahren sensitiviert und dementsprechend für die Markierung einer Reihe verschiedener Analyttypen, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, Zellen, subzellulärer Komponenten und Biomoleküle verwendet werden. Analyte, die mit derartig hergestellten Mikropartikel markiert sind, können dann unter Anwendung vorhandener AC-elektrokinetischer oder magnetophoretischer Verfahren (oder Kombinationen davon) manipuliert werden.
Da verschiedene Klassen an hergestellten Mikropartikel mit verschiedenen AC-elektrokinetischen und/oder magnetophoretischen Reaktionen konstruiert werden können, können mehrere verschiedene Analyte in einem Gemisch mit einer oder mehreren Sonden gleichzeitig markiert werden und dann einzeln (oder als eine Gruppe, die von jedem Typ verschiedener Sonden definiert wird) angesprochen, manipuliert und/oder identifiziert werden. Diese Fähigkeit kann als Indexieren bezeichnet werden und stellt einen signifikanten Fortschritt gegenüber der bestehenden Technologie dar. Außerdem können, da neue AC-elektrokinetische und magnetophoretische Analyseverfahren entwickelt sind, die hier diskutierten hergestellen Mikropartikel-Markierungen in diesen Verfahren verwendet werden, um Analyte anzusprechen, zu manipulieren und zu identifizieren.
Zusätzlich können bereits offengelegte AC-elektrokinetische Analyseverfahren wie elektrophoretische Feld-Fluss-Fraktionierung (DEP-FFF), Wanderwellen-DEP (twDEP) und Spiralelektrodenverfahren mit der hier diskutierten Verwendung der hergestellten Mikropartikel-Markierungen verbessert werden. Diese bereits offengelegten Verfahren nutzen typischerweise Unterschiede bei den inhärenten dielektrischen Eigenschaften von Analyten für eine Analytmanipulation und Analytidentifizierung. Sonden-sensibilisierte veränderte Mikropartikel stellen auf der anderen Seite Techniken zur Trennung von Analyten mit unbekannten oder nicht zu unterscheidenden dielektrischen Eigenschaften und zur Identifizierung von Analyten durch Messen von Änderungen des Verhaltens der veränderten Mikropartikel nach einer Analytbindung bereit. Veränderte dielektrische und magetische Mikropartikel-Markierungen stellen deshalb eine mögliche Technologie dar, die leistungsfähige neue Verfahren zur Trennung und Identifizierung von Analyten auf vielen verschiedenen Gebieten liefern kann.
Es können mehrere Typen hergestellter Mikropartikel für eine gleichzeitige Markierung und Besondung einer Probe für mehrere Ziel-Analyte verwendet werden. Weil jeder Mikropartikeltyp so hergestellt werden kann, dass er spezifische, unterscheidbare dielektrische und/oder magnetische Reaktionen zeigt, können verschiedene Ziel-Analyte im Gemisch unabhängig gleichzeitig oder hintereinander manipuliert werden.
Zusätzlich können die hergestellten Mikropartikel gemäß der Erfindung sensitiviert werden und daher mit einer in der Technik bekannten Methodik identifiziert werden.
Zusätzlich können hergestellte Mikropartikel mit AC-elektrokinetischen und/oder magnetophoretischen Verfahren unterschieden, sortiert und verarbeitet werden. Da die Unterscheidung von einigen auf Basis AC-elektrokinetischer Verfahren um Größenordnungen besser ist als mit bestehenden Isolierungsverfahren, mit Hilfe elektronischer Mittel kontrollierbar ist und anders als bestehende Verfahren mit integrierten und automatisierten Mikrosystemen für chemische und biologische Analyse anwendbar ist, können die veränderten Mikropartikel dieser Offenlegung für die Lösung vieler, wenn nicht gar aller, Unzulänglichkeiten verwendet werden, die oben bezüglich der bestehenden Technologie auf diesem Gebiet genannt sind.
Verschiedene veränderte Mikropartikeltypen, jeder mit einzigartigen intrinsischen dielektrischen Eigenschaften konstruiert, können basierend auf ihren dielektrischen Eigenschaften indexiert werden und als frequenzabhängige dielektrischen Griffe verwendet werden, um verschiedene Analyte gleichzeitig zu manipulieren. Ein Bibliothek von veränderten Mikropartikeln kann dann mit verschiedenen dielektrischen Eigenschaften entwickelt werden. Eine derartige Bibliothek kann zum Indexieren verwendet werden. Die Bibliothek kann ebenfalls zur Entwicklung von auf Kügelchen basierenden biochemischen Assays für meherere verschiedene Anwendungsarten wie für Microflumes verwendet werden.
In einer Anwendungsform können die Analyte unter Anwendung eines Sandwich-Protokolls detektiert werden. In einem derartigen System kann eine Änderung der Fluoreszenz der Kügelchen die Folge zweier getrennter Bindungsereignisse sein, die durch das Vorhandensein eines spezifischen Analyts vermittelt sind. Veränderte Mikropartikel können zuerst sensitiviert (oder verbunden) werden mit einer Einfangsonde, die eine hohe Bindungsaffinität für ein spezifisches Analyt besitzt. Diese sensitivierten veränderten Mikropartikel können dann mit einem Probentröpfchen inkubiert werden, was zur Bildung von verändertes Mikropartikel-Analyt Komplexen führt. Ein Tröpfchen, das eine Markierungssonde mit einer hohen Affinität für ein zweites Epitop oder Nukleinsäuresequenz auf dem Analyt enthält, kann dann zu der Reaktionsmischung gegeben werden, was zur Bildung von hergestellten Mikropartikel-Analyt-Fluorophor Komplexen führt. Diese Komplexe können zu einer Reaktionsoberfläche unter Verwendung der positiven Dielektrophorese gezogen und dort in situ gehalten werden, während das suspendierende Tröpfchen abgezogen wird. Ein anderes Reagenztröpfchen kann dann über die hergestellten Mikropartikel-Komplexe bewegt werden und die DEP-Kraft wird entfernt. Die hergestellten Mikropartikel können spontan freigesetzt werden in und thennokinetisch mit einem neuen Reagenz gemischt werden, was zu einem Pufferwechsel oder Waschvorgang führt. Diese Fähigkeit, Analyte in einer Mikrofluidvorrichtung ohne Verwendung einer Sonde reversibel zu immobilisieren, die permanent an der Oberfläche der Vorrichtung gebunden ist, stellt einen wesentlichen Fortschritt der Microflume-basierten chemischen Analyse dar.
In der Technik bekannte Probleme mit Kalibrierung, Probeneintrag und Kreuzkontaminierung können der Verwendung molekularer Erkennungs- und Messelementen zugeschrieben werden, die an hergestellte Mikropartikel befestigt werden, so dass ein neues Aliquot sensitivierter veränderter Mikropartikel für alle und jeden Assay verwendet werden kann. Durch anschließendes Verwerfen der Mikropartikel, durch einen „Leerlauf" zwischen jeder Probe und durch Reinigungsrunden können Kalibrierungsprobleme erkannt und Ausbleiben von Probeneintrag und Kreuzkontaminierung überprüft werden. Das Anbringen biologisch aktiver Komponenten auf hergestellte Mikropartikel bedeutet ebenfalls, dass ein einziges flüssiges Mittel auf einen großen Bereich von Problemen bei Probenpräparation und Molekularanalysen unter Verwendung verschiedener hergestellte Mikropartikel/Sonde Kombinationen angewandt werden kann. Da keine biologischen Komponenten an festen Oberflächen befestigt sein müssen, können diese zum Beispiel mit PTFE beschichtet sein, um Probleme mit biomolekularer Adhäsion und Probeneinträgen zu verringern. Es folgt, dass die Entscheidung, die veränderten Mikropartikel der vorliegenden Offenlegung zu verwenden, die vielfältige Anwendungsfähigkeit der Technologie verbessert, indem es möglich ist, dass ein einziges Mittel mehrfache Anwendungen besitzt.
Die Herstellung veränderter Mikropartikel gemäß der vorliegenden Offenlegung eröffnet die Möglichkeit, molekulare Analysen unter Verwendung eines Cocktails verschiedener veränderter Mikropartikel/Sonde Kombinatianen parallel durchzuführen. Assays unter Verwendung veränderter Kügelchen erfordern minimale Probenmengen. Zum Beispiel hat ein veränderter Mikropartikel mit einem Durchmesser von 5 μm die realativ große Oberfläche von ungefähr 78 μm² und nimmt demnach ein Volumen von nur 65 fL ein, etwa 1/15 einer typischen Tumorzelle. 100 Tumorzellen und 250 veränderte Mikropartikel, die aus 10 verschiedenen hergestellten Mikropartikeltypen zusammengesetzt sind, können in eine sphärische Region mit 50 μm Durchmesser mit Hilfe einer DEP-vermittelten Fokussierung gepackt werden. Dies enrspricht dem Äquivalent von fast 10⁹ Zellen/ml, in Kontakt mit 2 × 10⁹ hergestellten Mikropartikel/ml gehalten, die die molekularen Sonden tragen. Es ist gezeigt worden, dass die Zeit für die Hybridisierung der Ziel-RNAs mit cDNA-Sonden auf magnetischen Mikropartikeloberflächen gerade ein paar Minuten in konzentrierten Zelllysaten beträgt. Deshalb hat der hier beschriebene auf veränderten Mikropartikeln basierende Versuchsansatz unter Verwendung hoher Zell- und Mikropartikelkonzentrationen das Potenzial, schnelle Assays für Molekülmarkierungen in einem integrierten System zu ermöglichen.
Bei der Entwicklung der auf veränderten Mikropartikeln basierenden Indexierungstechnologie der vorliegenden Offenlegung kann ein verringertes Panel von etwa 10 molekularen Schlüsselmarkierungen aus einer Bibliothek von verfügbaren Markerierungen für Screeningzwecke für spezifische Teilmengen von verdächtigten Erkrankungsstadien ausgewählt sein. Durch Kombinieren von Probenpräparation und Molekularanalyse zu einem einzigen automatisierten Prozess erlaubt dieses System den Einsatz von Gen-Chig abgeleiteten molekularen epidemiologischen Daten und macht sie für eine große Population zugänglich.
Hergestellte Mikropartikel
Die Struktur eines hergestellten Mikropartikel gemäß einer Anwendungsform der vorliegenden Offenlegung ist in 1 gezeigt. Dort ist ein leitender Kern abgebildet, der von einer dünnen, schlecht leitenden, dielektrischen Hülle umgeben ist. Der leitende Kern kann aus sehr verschiedenen Materialien hergestellt sein. Außerdem kann der leitende Kern massiv oder hohl sein. Darüber hinaus kann der leitende Kern aus einer isolierenden inneren Region, die ganz oder zum Teil von einer leitenden äußeren Region umgeben ist gebildet sein.
Obwohl die Form des inneren Kerns etwas variieren kann, kann die Form in einer Anwendungsform sphärisch sein. In anderen Anwendungensformen kann die Form elliptisch oder eine beliebige andere geeignete Form sein.
Die dielektrische Hülle kann aus mehreren Materialen gebildet sein, die für die Erzeugung der dielektrischen Eigenschaften hinreichend sind, und spezifischer für Eigenschaften, die bei bestimmten Frequenzen für die dielektrophoretischen Reaktionen sorgen. Die dielektrische Hülle kann auf beliebige in der Technik bekannte Art und Weise an den inneren leitfähigen Kern gekoppelt sein.
Die Form der äußeren dielektrischen Hülle kann ebenso variieren, aber in einer Anwendungsform kann sie generell sphärisch sein oder generell der Form des inneren leitfähigen Kerns gleichen.
Die Größe, Zusammensetzung, Dicke und Form des leitfähigen Kerns und/oder der dielelektrischen Hülle kann so eingerichtet und optimiert sein, tun erwünschte dielektrische und/oder magnetische Eigenschaften zu erzielen. Insbesondere können die Größen, Dicken und Zusammensetzungen so eingestellt sein, dass ein veränderter Mikropartikel die korrekten dielektrischen Eigenschaften besitzt, um von einem bestimmten Bereich dielektrophoretischer Kräfte manipuliert zu werden.
In einer Anwendungsform können Polystyrol ummantelte Silber-Mikropartikel als veränderte Mikropartikel verwendet sein. Diese veränderten Mikropartikel unterliegen einem frequenzabhängigen Wechsel von einem nicht-leitenden Zustand in einen leitenden Zustand. Dies ist die Folge einer dielektrischen Verteilung bei der ein AC-Feld geeigneter Frequenz durch die nicht-leitende Polystyrol-Hülle hindurchdringt.
In einer anderen Anwendungsform kann ein Herstellungsverfahren unter Verwendung selbst-assemblierter Einzelschichten (SAMs) von Alkanthiol auf einer Gold- oder Silber-beschichteten, Hohlglas (oder Polystyrol oder andere Mikropartikel) Mikropartikel verwendet sein, um verbesserte biomimetische Partikel herzustellen. Das dielektrophoretisehe Verhalten dieser hergestelltem Mikropartikel kann unter Verwendung etablierter dielektrophoretischer und vielhülliger Modelle vorhergesagt werden, die in der Technik bekannt sind, und die Wirkungen der Änderungen der Eigenschaften von hergestellten Mikropartikel wie Partikeldurchmesser und isolierende Schichtdicke und Zusammensetzung können mit in der Technik bekannten Verfahren bestimmt werden.
Das hergestellte Mikropartikel von 1 kann zur Imitierung einer Säugerzelle gestaltet sein. Spezifisch kann es so hergestellt sein, dass sein AC-elektrokinetisches Verhalten das Verhalten einer Säugerzelle imitiert. Dieses Verhalten ist für Zellen ausgiebig charakterisiert worden und ist mit einer gut definierten und in der Technik bekannten relativ strengen Frequenzabhängkeit unterscheidbar. Proben dieser Mikropartikel sind durch Verkapselung leitender Kernpartikel aus Silber mit nicht-leitenden Hüllen verschiedener Dicken aus Polystyrol hergestellt worden. Die cDEP-Reaktion dieser Partikel ist untersucht worden und haben gezeigt, dass sie in Übereinstimmung mit den Vorhersagen der etablierten AC-elekttrokinnetischen Theorie variieren.
Klassen veränderter Mikropartikel, die sich von den in 1 dargestellten unterscheiden, können gemäß den in der Technik bekannten Herstellungsprinzipien konstruiert und hergestellt sein. Wiederum kann ein Spektrum unterschiedlicher dielektrischer Reaktionen innerhalb jeder strukturellen Klasse von Mikropartikeln durch Variieren der Zusammensetzungen, Dicken und/oder anderer Eigenschaften der Schichten, die die einzelnen Mikropartikel umfassen, erhalten werden. Auf diese Weise kann eine Bibliothek von veränderten Mikropartikel mit gut definierten, jetzt eindeutig unterscheidbaren dielektrischen und/oder magnetischen Eigenschafen hergestellt werden. Durch Konstruktion und Fabrikation verschiedener Mikropartikeltypen mit verschiedenen dielektrischen und/oder magnetischen Eigenschaften kann jeder Typ veränderter Mikropartikel unabhängig angesprochen, manipuliert und charakterisiert werden selbst wenn das Mikropartikel Teil eines Gemisches mehrerer Typen veränderter Mikropartikel ist.
Verbindende Elemente
Gemäß einer Anwendungsform können die oben diskutierten veränderten Mikropartikel an ein oder mehrere verbindende Elemente oder Sonden gekoppelt sein, um als veränderte Mikropartikel-Markierungen zu dienen. Die allgemeine Verwendung unterschiedlicher verbindender Elemente ist in der Technik bekannt. Allerdings erklären Abschnitte unten einige spezifische Anwendungsformen, die sich auf verschiedene verbindende Elemente beziehen, die zusammen mit den oben beschriebenen veränderten Mikropartikeln verwendet sein können. Der Fachmann, der die vorliegende Offenlegung nutzt, erkennt, dass allerdings weitere verbindende Elemente verwendet sein können.
Der Ausdruck „verbindendes Element" oder „Sonde", wie hier verwendet, bezieht sich auf jede Komponente, die eine Affinität für eine andere Komponente besitzt, die hier als „Ziel-Analyt" bezeichnet ist. Das Binden des verbindenden Elementes an das Ziel-Analyt bildet ein Affinitätspaar zwischen den beiden Komponenten.
Zum Beispiel umfassen derartige Affinitätspaare zum Beispiel Biotin mit Avidin/Streptavidin, Antigene oder Haptene mit Antikörpern, Schwermetall-Derivate mit Thiogruppen, verschiedene Polynukleotide wie Homopolynukleotide wie poly dG mit poly dC, poly dA mit poly dT und poly dA mit poly U. Beliebige Komponentenpaare mit einer starken Affininität zueinander können als das Affinitätspaar verwendet sein. Geeignete Affinitätspaare können auch unter Liganden und Konjugaten gefunden werden, die in immunologischen Verfahren Verwendung finden.
Die Wahl des verbindenden Elementes hängt offensichtlich von der Natur des Mikropartikels und des Ziel-Analyts ab. Wenn man zum Beispiel eine Nukleinsäurespezies (das Ziel-Analyt) auf einem Mikropartikel einzufangen wünscht, wird das gewählte verbindende Element normalerweise eine Nukleinsäure oder Nukleinsäure analoges Oligomer mit einer Sequenz sein, die zu derjenigen des Ziel-Analyts oder einem Teil davon komplementär ist.
Das verbindende Element kann zuerst an das Mikropartikel gebunden werden und kann dann eine Spezies mit einer Affinität für das Ziel-Analyt sein. Vorzugsweise ist die Affinität der Ziel-Analyts eine selektive Affinität, so dass die Bildung des Komplexes zwischen dem Mikropartikel und dem Ziel-Analyt selektiv ist und wenigstens ein Maß für die Identifizierung des Ziel-Analyts liefert. Vorzugsweise ist die Affinität hoch spezifisch und dementsprechend kann das an das Mikropartikel gebundene verbindende Element, das die selektive Affinität für das Ziel-Analyt bereitstellt, ein Antikörper oder ein Antikörperfragment mit Antikörperaktivität, ein Antigen, eine Nukleinsäuresonde oder eine Nukleinsäure analoge Sonde mit selektiver Affinität für komplementäre Nukleinsäuresequenzen oder ein Avidinähnliches Molekül wie Streptavidin sein.
Nukleinsäuren als verbindende Elemente
Auf Nukleinsäuren basierende verbindende Elemente können synthetische Oligonukleotide, einzelsträngige DNA, komplementäre DNA (cDNA) und RNA sein. Obwohl kürzere Oligonukleotide leichter herzustellen sind, sind zahlreiche weitere Faktoren an der Ausprägung der Hybridisierungsspezifität beteiligt. Sowohl Binduagsaffinität als auch Sequenzspezifität eines Oligonukleotids für sein komplementäres Ziel steigt mit zunehmender Länge an. Es ist zu erwägen, dass beispielhafte Oligonukleotide mit 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 24, 25, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 94, 95, 100 oder mehr Basenpaaren verwendet sein können, obwohl weitere in Betracht kommen können. Längere Polynukleotide, die für 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1500, 1922, 2000, 3000, 4000 Basen und mehr codieren, können genauso gut in Betracht kommen.
Antikörper als verbindende Elemente
Auf Antikörper basierende verbindende Elemente beziehen sich auf monoklonale oder polyklonale Antikörper, einzelkettige Antikörper oder rekombinant hergestellte Antikörper. Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Antikörper" mit Absicht weitestgehend auf jedes immunologisch bindende Agens wie IgG, IgM, IgA, IgD und IgE. Der Ausdruck „Antikörper", ist so verwendet, dass er sich auf jedes Antikörper-ähnliche Molekül bezieht, das eine Antigen bindende Region besitzt, und Antikörperfragmente wie Fab', Fab, F(ab')₂, single-Domain-Antikörper (DABs), Fv, scFv (einzelkettiges Fv) und ähnliches umfasst. Im Allgemeinen sind IgG und/oder IgM bevorzugt, da sie die am üblichsten Antikörper in der physiologischen Situation sind und da sie am leichtesten im Labor hergestellt werden können. Mittel für die Herstellung und Charakterisierung sind in der Technik gut bekannt (siehe z.B. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, hier durch Quellenangabe eingefügt).
Verfahren zur Erzeugung von polyklonalen Antikörpern sind in der Technik gut bekannt. Zusammengefasst: ein polyklonaler Antikörper wird durch Immunisieren eines Tieres mit einer Antigenzusammensetzung und Sammeln der Antisera von diesem immunisierten Tier produziert. Ein großes Spektrum von Tierarten kann zur Produktion von Antisera eingesetzt sein. Typischerweise ist das zur Produktion von Antisera eingesetzte Tier ein Kaninchen, eine Maus, eine Ratte, ein Hamster, ein Meerschweinchen oder eine Ziege. Aufgrund des relativ großen Blutvolumens von Kaninchen sind Kaninchen die bevorzugte Wahl für die Produktion polyklonaler Antikörper.
Wie in der Technik bekannt ist, kann eine gegebene Zusammensetzung in ihrer Immunogenität variieren. Es ist deshalb häufig erforderlich, das Immunsystem des Wirts zu boosten, wie es durch Kopplung eines Peptid- oder Polypeptidimmunogens an einen Träger erreicht werden kann. Beispielhafte und bevorzugte Träger sind Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) und bovines Serumalbumin (BSA). Andere Albumine wie Ovalbumin, Serumalbumin von Maus oder Kaninchen können ebenfalls als Träger verwendet sein. Mittel für die Konjugation eines Peptids an ein Trägerprotein sind in der Technik bekannt und umfassen Glutaraldehyd, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, Carbodiimid und bisbiazotiertes Benzidin.
Es ist ebenfalls in der Technik bekannt, dass die Immunogenität einer bestimmten, immunogenen Zusammensetzung durch die Verwendung von nicht-spezifschen Stimulatoren der Immunantwort, auch als Adjuvantien bezeichnet, verstärkt werden kann. Beispielhafte und bevorzugte Adjuvantien umfassen komplettes Freunds Adjuvans (ein nicht-spezifischer Stimulator der Immunantwort, der abgetötetes Mycobacterium tuberculosis enthält), inkomplettes Freunds Adjuvans und Aluminiumhydroxid-Adjuvans.
Die für die Produktion polyklonaler Antikörper verwendete Menge an immunogener Zusammensetzung variiert entsprechend der Natur des Immunogens wie auch des für die Immunisierung eingesetzten Tieres. Verschiedene Routen für die Verabreichung des Immunogens (subkutan, intramuskulär, intradermal, intravenös und intraperitoneal) können genutzt sein. Die Produktion polyklonaler Antikörper kann mit Hilfe von Blutproben des immunisierten Tieres zu verschiedenen Zeitpunkten nach Immunisierung kontrolliert werden. Eine zweite, Boosterinjektion kann ebenfalls gegeben werden Die Boosterinjektion und Titerbestimmung wird wiederholt, bis ein geeigneter Titer erhalten ist. Wenn ein erwünschtes Immunogenitätsniveau erreicht ist, wird das Blut des immunisierten Tieres gesammelt und das Serum isoliert und aufbewahrt und/oder in manchen Fällen kann das Tier zur Erzeugung monoklonaler Antikörper (mAk) eingesetzt werden. Zur Produktion von Kaninchen polyklonalen Antikörpern kann dem Tier über die Ohrvene oder alternativ über eine Herzpunktion Blut abgenommen werden. Das entnommene Blut kann koagulieren und wird dann zentrifugiert, um Serumkomponenten von den ganzen Zeilen und Blutgerinnseln zu trennen. Das Serum kann, so wie es ist, für verschiedene Anwendungen verwendet sein, oder die erwünschte Antikörperfraktion kann mit bekannten Verfahren gereinigt werden, wie Affinitätschromatographie unter Verwendung eines anderen, an eine feste Matrix gebundenen Antikörpers oder Peptids.
Monoklonale Antikörper (mAk) können ohne weiteres durch die Verwendung bekannter Verfahren hergestellt werden, wie diejenigen, die im U.S. Patent 4.196.265 beispielhaft dargestellt sind. Typischerweise umfasst diese Technik die Immunisierung eines geeigneten Tieres mit einer ausgewählten immunogenen Zusammemetzung, z.B: einem gereinigten oder partiell gereinigtem exprimierten Protein, Polypeptid oder Peptid. Die immunisierende Zusammensetzung wird so verabreicht, dass sie die Antikörper produzierenden Zellen wirksam stimuliert.
Die Verfahren zur Erzeugung monoklonaler Zellen (mAk) beginnen voll und ganz wie diejenigen für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern. Nagetiere wie Mäuse und Ratten sind die bevorzugten Tiere, allerdings ist ein Einsatz von Kaninchen-, Schaf- oder Froschzellen ebenfalls möglich. Der Einsatz von Ratten hat bestimmte Vorteile (Goding, 1986, Seiten 60–61), aber Mäuse sind bevorzugt, wobei die BALB/c Mäuse die bevorzugtesten sind, da diese routinemäßig eingesetzt werden und im Allgemeinen einen höheren Prozentsatz stabiler Fusionen ergeben.
Den Tieren wird das Antigen injiziert, wie es oben beschrieben ist. Das Antigen kann, falls erforderlich, an Trägermoleküle wie Keyhole Limpet Hämocyanin gekoppelt sein. Das Antigen kann typischerweise mit einem Adjuvans wie Freunds komplettem oder inkomplettem Adjuvans gemischt sein. Boosterinjektionen mit dem gleichen Antigen können in ungefähr zweiwöchigen Intervallen erfolgen.
Nach Immunisierung werden somatischen Zellen, die potenziell Antikörper produzieren können, besonders B-Lymphocyten (B-Zellen), für die Verwendung in dem mAk-Erzeugungsprotokoll ausgewählt. Diese Zellen können aus Biopsien von Milz, Tonsillen oder Lymphknoten oder aus Proben des peripheren Bluts gewonnen werden. Milzzellen und Zellen des peripheren Bluts sind bevorzugt, die ersteren weil sie eine reichhaltige Quelle Antikörper-produzierender Zellen sind, sich im Plasmablasten-Teilungsstadium befinden, und die letzteren, weil das periphere Blut leicht zu gewinnen ist. Häufig wird eine Reihe von Tieren immunisiert und die Milz des Tieres mit dem höchsten Antikörpertiter wird entnommen und die Milzlymphocyten durch Homogenisieren der Milz mit einer Spritze erhalten. Typischerweise enthält die Milz einer immunisierten Maus ungefähr 5 × 10⁷ bis 2 × 10⁸ Lymphocyten.
Die Antikörper-produzierenden B-Lymphocyten vom immunisierten Tier werden dann mit immortalen Myelomzellen fusioniert, die im Allgemeinen von derselben Spezies wie das immunisierte Tier stammen. Für die Verwendung in Hybridom-produzierenden Fusionsverfahren geeignete Myelomzelllinien produzieren vorzugsweise keine Antikörper, besitzen eine hohe Fusionseffizienz und Enzymdefekte, die sie unfähig machen, in bestimmten Selektivmedien zu wachsen, die das Wachstum nur der erwünschten fusionierten Zellen unterstützen (Hybridome).
Jede Myelomzelle einer Reihe von Myelomzellen kann verwendet sein, wie es dem Fachmann bekannt ist (Goding, 1986). Wo das immunisierte Tier eine Maus ist, kann man zum Beispiel P3-X63/Ag8, X63/Ag8.653, NS1/1.Ag4 1, Sg210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 und S194/5XX0 BuI verwenden; für Ratten kann man R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3; IR983F und 4B210 verwenden; und U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 und UC729-6 sind in Verbindung mit Humanzellfusionen zweckdienlich.
Eine bevorzugte murine Myelomzelle ist die NS-1 Myelomzeillinie (auch als P3-NS-1-Ag4-1 bezeichnet), die einfach von NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository durch Angabe der Verwahrungsnummer GM3573 zu erhalten ist. Eine andere Maus-Myelomzellinie, die verwendet werden kann, ist die 8-Azaguanin-resistente murine SP2/0 Nichtproduzenten-Myelomzelllinie.
Verfahren zur Erzeugung von Hybriden aus Antikörper-produzierenden Milz- oder Lymphknotenzellen mit Myelomzellen umfassen normalerweise Mischen somatischer Zellen mit Myelomzellen in einem Verhältnis von 2:1, obwohl das Verhältnis von etwa 20:1 bis beziehungsweise etwa 1:1 variieren kann, in Gegenwart eines Agens oder Agentien (chemische oder elektrische), die die Fusion von Zellmembranen fördern. Fusionsverfahren unter Verwendung von Sendai-Virus sind von Köhler und Milstein (1975; 1976); und auch welche unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) wie 37% (v/v) PEG sind von Gefter et al., (1977) beschrieben worden. Die Anwendung elektrisch induzierter Infusionsverfahren ist ebenfalls geeignet.
Fusionsprozeduren produzieren normalerweise lebende Hybride mit geringer Häufigkeit, etwa 1 × 10^–6 bis 1 × 10^–8. Allerdings stellt diese geringe Häufigkeit kein Problem dar, da die lebenden, fusionierten Hybride von den elterlichen, nichtfusionierten Zellen (besonders die nichtfusionierten Myelomzellen, die sich normalerweise endlos teilen) durch die Kultivierung in einem Selektionsmedium unterschieden werden. Das Selektivmedium ist im Allgemeinen ein Medium, das ein Agens enthält, das die de novo Synthese von Nukleotiden in den Gewebekulturmedien blockiert. Beispielhafte und bevorzugte Agentien sind Aminopterin, Methotrexat und Azaserin. Aminopterin und Methotrexat blockieren die de novo Synthese sowohl von Purinen als auch Pyrimidinen, wohingegen Azaserin nur die Purinsynthese blockiert. Wo Aminopterin oder Methotrexat verwendet wird, ist das Medium mit Hypoxanthin und Thymidin als Nukleotidquelle supplementiert (HAT-Medium). Wo Azaserin verwendet wird, ist das Medium mit Hypoxanthin suppiementiert.
Das bevorzugte Selektionsmedium ist HAT. Nur Zellen, die in der Lage sind, Nukleotid-Wiederverwertungswege einzuschalten, können in HAT-Medium überleben. Die Myelomzellen sind in Schlüsselenzymen des Wiederverwertungsweges, z.B. Hypoxanthinribosyltransferase (HPRT) defekt und können folglich nicht überleben. Die B-Zellen können diesen Weg einschalten, aber sie haben eine limitierte Lebensspanne in Kultur und sterben allgemein innerhalb zwei Wochen ab. Deshalb sind die einzigen Zellen, die in Selektivmedium überleben können, die aus Myelom- und B-Zellen gebildeten Hybride.
Diese Kultivierung stellt eine Population von Hybridomen bereit, von der spezifische Hybridome selektiert werden. Typischerweise erfolgt die Selektion von Hybridomen durch Kultivieren der Zellen mittels Einzelklon-Verdünnung in Mikrotiterplatten und anschließendes Testen der einzelnen Klonüberstände (nach etwa zwei oder drei Wochen) auf die erwünschte Reaktivität. Der Test sollte sensitiv, einfach und schnell sein wie Radioimmunassay, Enzymimmunassay, Cytotoxizitätsassay, Plaque-Assay, Dot-Immunbindungsassay und ähnliches.
Die selektierten Hybridome werden dann in einer Verdünnungsreihe verdünnt und in einzelne Antikörper-produzierende Zelllinien kloniert, die dann endlos vermehrt werden können, um mAk zu liefern. Die Zelllinien können für eine mAk-Produktion auf zwei grundlegende Weisen eingesetzt werden. Eine Probe des Hybridoms kann ein histokompatibles Tier des Typs, der für die Gewinnung der Soma- und Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion eingesetzt wurde, injiziert werden (oftmals in die Peritonealhöhle). Dieses Tier entwickelt Tumoren, die den spezifischen monoklonalen Antikörper sezernieren, der vom- fusionierten Zellhybrid produziert wird. Die Körperflüssigkeiten des Tieres wie Serum oder Aszitesflüssigkeit können dann gesammelt werden, um mAk in hoher Konzentration zu liefern. Die einzelnen Zelllinien könnten ebenfalls in vitro kultiviert werden, wo die mAk natürlicherweise in das Kulturmedium sezerniert werden, aus dem sie ohne weiteres in hohen Konzentrationen gewonnen werden können. Die mit beiden Möglichkeiten produzierten mAk können weiter aufgereinigt werden, falls erwünscht, unter Einsatz von Filtration, Zentrifugation und verschiedenen chromatographischen Verfahren wie HPLC oder Affinitätschromatographie.
Große Mengen der monoklonalen Antikörper können ebenfalls durch eine Vervielfachung der Hybridomzellen in vivo erhalten werden. Zellklone werden in Säuger injiziert, die mit elterlichen Zellen histokompatibel sind, z.B. syngene Mäusen, um das Wachstum von Antikörper-produzierenden Tumoren auszulösen. Gegebenenfalls werden die Tiere mit einem Kohlenwasserstoff, insbesonders Öle wie Pristan (Tetramethylpentadecan), vor der Injektion geprimt.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Offenlegung können Fragmente des monoklonalen Antikörpers von dem wie oben beschrieben produzierten monoklonalen Antikörper mit Hilfe von Verfahren erhalten werden, die Verdau mit Enzymen wie Pepsin oder Papain und/oder Spalten der Disulfidbindungen durch chemische Reduktion umfassen. Alternativ können monoklonale Antikörperfragmente, die von der vorliegenden Erfindung umfasst sind, unter Verwendung automatischer Peptid-Synthetisierer oder durch Expression vollständiger Gene oder Genfragmente in E. coli synthetisiert werden.
Weitere verbindende Elemente
Weitere verbindende Elemente umfassen Peptide, Antitumor-Agentien, Antibiotika und andere therapeutische Verbindungen. Wiederum wird von den verbindenden Elementen die Fähigkeit erfordert, mit einem gewissen Maß an Spezifität an ein Ziel-Analyt zu binden. Die Verwendung von Peptiden, Antitumor-Agentien, Antibiotika und anderen therapeutischen Verbindungen würde die Fähigkeit erlauben, derartige Ziel-Analyte wie Rezeptoren, Cofaktoren, Enzyme oder jedes andere Ziel, das in der Lage ist, an das verbindende Element zu binden, zu identifizieren oder zu reinigen.
Beispiele für verbindende Peptidelemente umfassen LH-RH Antagonisten (siehe U.S. Patente 4.086.219, 4.124.577, 4.253.997 und 4.317.815), Insulin, Somatostatin, Somatostatin-Derivate (siehe U.S. Pat., Nr. 4.087.390, 4.093.574, 4.100.117 und 4.253.998), Wachstumshormon, Prolactin, adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Melanocytenstimulierendes Hormon (MSH), Thyreotropin-releasing Hormon (TRH), ihre Salze und Derivate (siehe JP-A 50-121273 und JP-A 52-116465), Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon (LH), Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Vasopressin, Vasopressin-Derivate, Oxytocin, Calcitonin, Parathyroidhormon, Glucagon, Gastrin, Sekretin, Pankreozymin, Cholecystokinin, Angiotensin, human placental lactogen, human chorionic gonadotrophin (HCG), Enkephalin, Enkephalin-Derivate (siehe U.S. Patent 4.277.394 und EP-A 31.567); und Polypeptide, wie beispielsweise Endorphin, Kyotorphin, Interferon (α-Typ, [β-Typ, γ-Typ), Interleukin (I bis XI, Tuftsin, Thymopoietin, Thymosin, Thymosthymlin, thymic hormone factor (THF), Serum thymic factor (FTS) und Derivate davon (siehe U.S. Patent 4.299.438) Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Kolonie-stimulierender Faktor (CSF), Motilin, Dynorphin, Bombesin, Neurotensin, Caerulein, Bradykinin, Urokinase, Asparaginase, Kallikrein, Substanz P, Nervenwachstumsfaktor, Blutgerinnungsfaktor VIII und IX, Lysozymchlorid, Polymyxin B, Colistin, Gramicidin, Bacitracin, Proteinsynthese-stimulierendes Peptid (siehe G.B. Patent Nr. 8.232.082) gastric inhibitory polypeptide (GIP), vasoaktives instestinales Polypeptid (VIP), platelet-derived growth factor (PDGH), growth hormone-releasing factor (GRF, Somatoclinin), bone morphagenetic protein (BMP), epidermales Wachstumshormon (EGF) und ähnliche.
Beispiel für ein Antitumor-Agens umfassen Bleomycinhydrochlorid, Methotrexat, Actinomycin D, Mitomycin C, Vinblastinsulfat, Vincristinsulfat, Daunorubicinhydrochlorid, Adriamycin, Neocarzinostatin, Cytosinarabinosid, Fluoruacil, Tetrahydrofuranyl-5-fluoruracil, Picibanil, Lentinan, Levamisol, Bestatin, Azimexon, Glycyrrhizin, poly A: U, Poly ICLC und ähnliche.
Beispiele für ein Antibiotikum umfassen Gentamycin, Dibekacin, Kanendomycin, Lividomycin, Tobramycin, Amikacin, Fradiomycin, Sisomycin, Tetracyclin, Oxytetracyclin, Roliteracyclin, Docycyclin, Ampicillin, Piperacillin, Ticarcillin, Cefalotin, Cefaloridin, Cefotiam, Cefsulodin, Cefmenoxim, Cefmetazol, Cefazolin, Cefotaxim, Cefoperazon, Ceftizoxim, Moxolactam, Thienamycin, Sulfazecin, Azusleonam, Salze davon und ähnliche.
Beispiele für Therapeutika umfassen antipyretische, analgetische und antiinflammatorische Agentien wie Salicylsäure, Sulpyrin, Flufenaminsäure, Diclofenac, Indometacin, Morphin, Pethidin, Levorphanoltartrat, Oxymorphon und ähnliche; antitussive Expektorantien wie Ephedrin, Methylephedrin, Noscapin, Codein, Dihydrocodein, Alloclamid, Chlorphezianol, Picoperidamin, Cloperastin, Protokylol, Isoproterenol, Salbutamol, Terbutalin, Salze davon und ähnliche; Sedativa wie Chlorpromazin, Prochlorperazin, Trifluoperazin, Atropin, Scopolamin, Salze davon und ähnliche; Muskelrelaxantien wie Pridinol, Tubocurarin, Pancuronium und ähnliche; Antiepileptika wie Phenytoin, Ethosuximid, Acetazolamid, Chlordiazepoxid und ähnliche; antiulzerative Agentien wie Metoclopramid, Histidin und ähnliche; Antidepressiva wie Imipramin, Clomipramin, Onxiptilin, Phenelzin und ähnliche; Antiallergika wie Diphenhydraminchlorid, Chlorphenaminmalat, Tripelenaminhydrochlorid, Methdilazinhydrochlorid, Clemizolhydrochlorid, Diphenylpyralinhydochlorid, Methoxyphenaminhydrochlorid und ähnliche; Herzmittel wie Trans-pi-oxocamphor, Terephylol, Aminophyllin, Etilefrin und ähnliche; Antiarrhythmika wie Propranolol, Alprenolol, Bufetololoxyprenolol und ähnliche; Vasodilatantien wie Oxyfedrin, Diltiozem, Tolazolin, Hexobendin, Bamethan und ähnliche; blutdrucksenkende Diuretika wie Hexamethoniumbromid, Pentolinium, Mecamylamin, Ecarazin, Clonidin und ähnliche; Antidiabetika wie Glymidin, Glipizid, Phenformin, Buformin, Metformin und ähnliche; Antikoaglutantien wie Heparin, Zitronensäure und ähnliche; Hämostatika wie Thromboplastin, Thrombin, Menadion, Acetomenaphthon, ε-Aminocapronsäure, Tranexaminsäure, Carbazochromsulfonat, Adrenochrom, Monoaminoguanidin und ähnliche; Antituberkulotika wie Isoniazid, Ethambutol, para-Aminosalicylsäure und ähnliche; Hormonmittel wie Prednisolon, Dexamethason, Betametason, Hexoestrol, Methymazol und ähnliche; Narkose-Antagonisten wie Levallorphan, Nalorphin, Naloxon, Salze davon und ähnliche.
Befestigung verbindender Elemente an veränderte Mikropartikel
Die Art des Verfahrens, das für die Umwandlung des ursprünglichen hergestellten Mikropartikels in ein Erkennungselement durch Komplexieren dieses mit einem verbindenden Element angewandt ist, kann sehr stark entsprechend der Natur des verbindenden Elements variieren.
In manchen Fällen kann der Komplex ein Vernetzungsmittel umfassen, das das hergestellte Mikropartikel und das verbindende Element verbindet. Der Komplex kann außerdem eine an das verbindende Element oder Mikropartikel gebundene Markierung, gegebenenfalls über ein zweites verbindendes Element, umfassen, Der Komplex kann zahlreiche an das Partikel gebundene verbindende Elemente umfassen.
Antikörper und Antikörperfragmente mit Antikörpereigenschaften können für die Befestigung verwendet sein. Es gibt geeignete Techniken für das Beschichten der Mikropartikel-Oberflächen mit Antikörpern, die dem Fachmann bekannt sind. Antikörperbeschichtete Partikel sind in der Lage, entsprechende Antigene zu erkennen und zu binden, die auf Zellen von Mikroorganismen oder einem anderen Ziel-Analyt vorhanden sein können.
Verfahren zum Binden von Oligonukleinsäuresonden an Mikropartikel, wie die hier beschriebenen Mikropartikel, sind ebenfalls bekannt. Geeignete Techniken sind beispielsweise in der Patentanmeldung, Nr. WO93/04 199, beschrieben. Wo das verbindende Element eine Nukleinsäuresonde oder eine Nukleinsäure analoge Sonde ist, sind die resultierenden Mikropartikel natürlich für Erkennen und Binden komplementärer Nukleinsäuresequenzen geeignet.
Weitere Verfahren zum Befestigen verbindender Elemente an Mikropartikel umfassen die Verwendung funktionalisierter Vernetzungsmittel. Derartige Vernetzungsmittel sind dem Fachmann gut bekannt. Eine zweckdienliche Referenz, die den Anwendungsbereich von Vernetzungsmitteln beschreibt, die üblicherweise erhältlich sind sowie ihre Anwendungen und Beschränkungen können dem Pierce Chemical Katalog (Rockford, IL) entnommen werden.
Markierungen
Es kann die Verwendung einer zusätzlichen Markierung zur weiteren Steigerung der Nachweisbarkeit eines veränderten Mikropartikels wie auch zur Änderung seiner magnetischen und elektrokinetischen Charakteristika genutzt werden. Zum Beispiel können Fluorophore oder Chromophore tragende Antikörper an einen veränderten Mikropartikel gebunden werden, so dass der so gebildete Komplex außerdem von dem veränderten Ausgangsmikropartikel mit Hilfe magnetischer und/oder elektrokinetischer Mittel unterschieden werden kann ebenso wie auch Detektion mit Fluoreszenz oder Farbe.
Eine derartige Markierung kann an das Mikropartikel oder verbindende Element entweder vor, gleichzeitig mit oder nach der Bildung des Komplexes zwischen dem Ziel-Analyt und dem veränderten Mikropartikel gebunden werden. Die Markierung kann ein zweites von der Markierung getragenes verbindendes Element umfassen. Wiederum ist es bevorzugt, dass die Affinität des zweiten verbindenden Elements für das Ziel-Analyt selektiv ist, vorzugsweise hoch spezifisch ist und das zweite verbindende Element ebenfalls ein Antikörper, ein Antikörperfragment mit Antikörperaktivität, ein Antigen, eine Nukleinsäuresonde, eine Nukleinsäure analoge Sonde, Avidin oder ein Avidin-ähnliches Molekül sein kann. Die Verwendung einer Markierung dieser Art kann erwünscht sein, um die einfache Detektion des Komplexes zu unterstützen und/oder wo ein Komplex zwischen Mikropartikel und dem Ziel-Analyt selbst keine hinreichenden unterscheidenden magnetischen und elektrokinetischen Eigenschaften besitzt, folglich die magnetischen und elektrokinetischen Eigenschaften durch Einschluss der Markierung in den Komplex weiter verändert werden kann. Zu diesem Zweck kann die Markierung ein Fluorophor oder ein Chromophor oder ein Mikroorganismus, ein Metallpartikel, ein Polymerkügelchen oder ein magnetisches Partikel sein. Ein geeignetes Material ist kolloidales Gold, das leicht an Antikörper gebunden wird (als die zweite Spezies), um eine Markierung zu bilden. An kolloidales Gold gebundene Antikörper sind im Handel erhältlich und Verfahren zum Binden von Antikörper an kolloidales Gold sind zum Beispiel beschrieben in Geohegan et al. (1978). Andere Metallpartikel können allerdings eingesetzt sein, wie zum Beispiel Silberpartikel und Eisenpartikel.
Die Verwendung einer solchen oben beschriebenen Markierung kann geeignet sein, selbst wo ein Komplex zwischen dem Liganden und einem Partikel hinreichend unterschiedliche magnetische oder elektrokinetische Eigenschaften besitzt, um die Bildung eines derartigen zu beobachtenden Komplexes zu ermöglichen. Ein höheres Maß an Spezifität kann in manchen Fällen durch die Verwendung einer Markierung in einem derartigen Komplex erhalten werden. Zum Beispiel wenn man folglich wünscht, einen Antigen A exprimierenden Mikroorganismus von einem die Antigene A und B exprimierenden Mikroorganismus zu unterscheiden. Dies kann durch die Verwendung veränderter Mikropartikel, die als verbindendes Element einen Antikörper für A und eine Markierung besitzen, die als deren verbindendes Element einen Antikörper für B besitzt. Der Unterschied in den Charakteristika des markierten Komplexes (zwischen dem veränderten Mikropartikel, den Mikroorganismen und der Markierung) und dem nichtmarkierten Komplex (zwischen dem veränderten Mikropartikel und den Mikroorganismen) kann festgestellt werden und zur Unterscheidung der nur A exprimierenden Mikroorganismen von den A und B exprimierenden Mikroorganismen eingesetzt werden.
Markierungen sowohl für Zellen als auch kleinere Partikel können fluoreszierende Markierungen, z.B. FITC oder Rhodamin, Chromophoren, lumineszierende Markierungen oder Enzymmoleküle sein, die ein detektierbares Signal erzeugen können. Beispiele für letzteres beinhalten Luciferase und alkalische Phosphatase. Diese Markierungen können unter Verwendung dem Fachmann bekannter spektroskopischer Techniken detektiert werden.
Beispielhafte auf Mikropartikel basierende Markierungen und ihre Verwendungen
Die folgenden auf veränderten Mikropartikeln basierenden Markierungen sind angeführt, um weitere Verwendungen der vorliegenden Offenlegung darzustellen. Die folgenden Patentanmeldungen und Veröffentlichungen beschreiben verbindende Elemente, Vernetzungsmittel oder Verfahren zur Bindung oder Befestigung verbindender Elemente an Mikropartikel, Ziel-Analyte und weitere Methodologien, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.
Ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration einer Substanz in biologischen Flüssigkeiten (z.B. Medikamente, Hormone, Vitamine und Enzyme), wo magnetisch reagierende, permeable, feste, wasserunlösliche Mikropartikel eingesetzt sind, ist in U.S. Patent 4.115.534 offengelegt.
U.S. Patent 4.285.819 beschreibt Mikropartikel, die zur Entfernung von gelösten Ionen aus dem Abwasserstrom mittels Chelatbildung eingesetzt sind. U.S. Patent 3.933.997 beschreibt einen Festphasenradioimmunassay für Digoxin, wo anti-Digoxin Antikörper an magnetisch reagierende Partikel gekoppelt sind.
Kleine magnetische Partikel, die mit einer Antikörperschicht beschichtet sind, sind in U.S. Patent 3.970.518 verwendet, um eine große und sehr verteilte Oberfläche zum Aussortieren und Separieren ausgewählter Organismen und Zellen von Populationen davon bereitzustellen. U.S. Patent 4.018.886 legt kleine magnetische Partikel offen, die zur Bereitstellung einer großen und sehr verteilten Oberfläche zum Separieren eines ausgewählten Proteins aus einer Lösung verwendet ist, um dessen Nachweis zu ermöglichen. Die Partikel sind mit einem Protein beschichtet, das mit dem ausgewählten Protein selektiv wechselwirkt.
U.S. Patent 4.070.246 beschreibt Zusammensetzungen, die stabile, wasserunlösliche Beschichtungen auf Substraten umfassen, an denen biologisch aktive Proteine kovalent gekoppelt sein können, so dass das resultierende Produkt die biologischen Eigenschaften des Proteins und die mechanischen Eigenschaften des Substrats zum Beispiel die magnetischen Eigenschaften des Metallträgers besitzt.
Ein Diagnoseverfahren, das ein Gemisch aus normalerweise trennbaren Proteinbeschichteten Partikel einsetzt, ist in U.S. Patent 4.115.535 diskutiert. Mikropartikel aus Acrolein-Homopolymeren und Co-Polymer(en) mit hydrophilen Co-Monomeren wie Methacrylsäure und/oder Hydroxyethylmethacrylat sind in U.S. Patent 4.413.070 diskutiert. U.S. Patent 4.452.774 legt magnetische Eisen-Dextran Mikropartikel offen, die an Antikörper, Enzyme und andere biologische Molekülen kovalent gebunden sein können und zur Markierung und Trennung von Zellen und anderen biologischen Partikeln und Molekülen mit Hilfe eines Magnetfelds verwendet sind. Beschichtete magnetisierbare Mikropartikel, reversible Suspensionen davon und darauf beziehende Verfahren sind in U.S. Patent 4.454.234 offengelegt. Ein Verfahren zur Trennung kationischer von anionischen Kügelchen in gemischten Harzbetten, die ein ferromagnetisches Material in jedem der ionischen Kügelchen ausgeklügelt eingebaut haben, ist in U.S. Patent 4.523.996 beschrieben. Ein magnetisches Trennverfahren, das ein Kolloid aus magnetischen Partikeln nutzt, ist in U.S. Patent 4.526.681 diskutiert. U.K. Patentanmeldung GB, Nr. 2.152.664A, legt magnetische Assayreagenzien offen.
Von einem Elektronen-dichten Antikörper-Konjugat, das durch die kovalente Bindung eines Eisen-Dextran Partikels an ein Antikörpermolekül hergestellt wird, berichten Dutton et al. (1979). Ithakissios et al. (1977) beschreibt die Verwendung von Protein-haltigen magnetischen Mikropartikeln in Radioassays. Die Trennung von Zellen, die mit immunspezifischen Eisen-Dextran Mikropartikeln markiert sind, unter Verwendung von Hochfeldmagnet-Chromatographie ist von Milday et al. (1984) offengelegt. Molday et al. (1982) beschreiben ein immunspezifisches ferromagnetisches Eisen-Dextran-Reagenz für die Markierung und magnetische Trennung von Zellen. Eine Anwendung magnetischer Mikropartikel bei Markierung und Trennung von Zellen ist ebenfalls von Molday et al. (1977) offengelegt. Ein Festphasenfluorimmunassay von Humanalbumin und biologischen Flüssigkeiten ist von Margessi et al. (1978) diskutiert. Nye et al. (1976) legt ein Festphasenradioimmunassay mit magnetischen Partikeln offen. Magnetische Flüssigkeiten sind von Rosenweig (1983) beschrieben. Magnetische Proteinassays, Mikropartikel und ihre Verwendung in einem Verfahren zur Zelltrennung sind von Widder et al. (1979) offengelegt.
U.S. Patent 5.279.936 ist ein Verfahren, das auf der Trennung einer Komponente von Interesse von anderen Komponenten eines Gemisches durch die Bindung der Komponente von Interesse an magnetische Partikel beruht. In der Anwendungsform der Erfindung, die ein Verfahren zur Trennung von Zellen von einem weitere Komponenten enthaltenden Gemisch ist, umfasst das Verfahren ein Überschichten eines ersten flüssigen Mediums, das Zellen und andere Komponenten enthält, mit einem zweiten Medium, das eine andere Dichte und/oder eine andere Viskosität als das erste flüssige Medium besitzt. Die Zellen werden an paramagnetische Partikel gebunden. Das überschichtete erste flüssige Medium und das zweite flüssige Medium werden einem Magnetfeldgradienten ausgesetzt, damit die Zellpartikel in das zweite Medium wandern. Das Ziel der Isolierung der Zellen in dem zweiten flüssigen Medium ist dann, mit Hilfe einer weiteren Anwendungsform, die Trennung der Zellen von dem zweiten flüssigen Medium.
U.S. Patent 4.935.147 ist ein Verfahren, das spezifisch auf die Anwendung einer magnetischen Trennung in dem Assay von organischen und biochemischen Analyten abzielt, insbesondere solcher Analyte von Interesse bei der Analyse von Körperflüssigkeiten. Das Verfahren dieser Erfindung liefert eine Möglichkeit zur Trennung nicht-magnetischer Partikel von einem Medium aufgrund der chemisch kontrollierten nicht-spezifischen reversiblen Bindung derartiger Partikel an magnetischen Partikel. Aufgrund der geringen Größe der magnetischen Partikel sorgt es ebenfalls für ein sehr schnelles Binden einer abzutrennenden Substanz. Durch anschließendes Aggregieren der Partikel wird eine viel schnellere und vollständigere magnetische Trennung bereitgestellt als dies mit älteren Verfahren erreicht wird.
Weitere gegenwärtige Techniken auf dem Gebiet der Zelltrennung verwenden Matrixmaterialien zum Beispiel Materialien aus Hohlfasern, flach-schichtigen Membranen oder Füllkörperschüttungskügelchen oder Partikel mit physikalisch adsorbierten oder kovalent gebundenen Chemikalien zur selektiven Zelltrennung. Diese Vorrichtungen sind so gestaltet, dass sie einen kontinuierlichen Einstrom und Rückfluss von Gesamtblut oder Blutkomponenten erlauben. Da diese Vorrichtungen mit normalen Blutflussraten unter Bedingungen arbeiten, bei denen die Konzentration der erwünschten Zellen sehr gering sein kann im Vergleich mit anderen Zelltypen, ist der Trennprozess häufig nicht effizient. Darüber hinaus ist es mit diesen Systemen schwierig, die ausgewählten Zellen lebend zu sammeln.
Die Entwicklung paramagnetischer Kügelchen bot die Aussicht auf eine magnetische Trennung von Ziel-Zellen. Verschiedene Verfahren zur Herstellung magnetischer und paramagnetischer Partikel sind in den folgenden U.S. Patenten offengelegt:
U.S. Patent 4.672.040; U.S. Patent 5.091.206; U.S. Patent 4.177.253; U.S. Patent 4.454.234; U.S. Patent 4.582.622; U.S. Patent 4.452.773; U.S. Patent 5.076.950; U.S. Patent 4.554.088; und U.S. Patent 4.695.392.
Verschiedene Verfahren wurden zur Verwendung magnetischer Partikel für Assays erfunden, Siehe zum Beispiel U.S. Patente: U.S. Patent 4.272.510; U.S. Patent 4.777.145; U.S. Patent 5.158.871; U.S. Patent 4.628.037; U.S. Patent 4.751.053; U.S. Patent 4.988.618; U.S. Patent 5.183.638; U.S. Patent 4.018.886; und U.S. Patent 4.141.678.
Versuche wurden gemacht, um magnetische Partikel zur Trennung biologischer Komponenten, einschließlich Zellen, zu nutzen. Nachfolgend eine Auflistung von U.S. Patenten, die den Anmeldern bekannt sind und von denen vermutet wird, dass sie magnetische Separatoren und Verfahren betreffen: U.S. Patent 4.855.045; U.S. Patent 4.664.796; U.S. Patent 4.190.524; U.S. Patent 4.738.773; U.S. Patent 4.491.969; U.S. Patent 5.053.344; U.S. Patent 5.200.084; U.S. Patent 4.375.407; U.S. Patent 5.076.914; U.S. Patent 4.595.494; U.S. Patent 4.290.528; U.S. Patent 4.921.597; U.S. Patent 5.108.933; U.S. Patent 4.219.411; U.S. Patent 3.970.518; und U.S. Patent 4.230.685.
Zahlreiche Techniken sind jüngst unter Verwendung Mikropartikel-basierten Verfahren entwickelt worden, um die Nachfragen nach schnellen und genauen Nachweisen von Agentien wie Viren, Bakterien und Pilze, und Nachweisen von normalen und anormalen Genen zu befriedigen. Derartige Techniken, die allgemein die Amplifizierung und Detektion (und nachfolgende Messung) von genauen Mengen von Ziel-Nukleinsäuren (entweder DNA oder RNA) in einer Testprobe umfassen, umfassen unter anderem die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Saiki et al., 1985; 1988; PCR Technology, Henry A. Erlich, ed. Stockton Press, 1989; Patterson et al., 1993), Ligase-Kettenreaktion (LCR) (Barany, 1991), Strangverdrängungsamplifizierung (SDA) (Walker et al., 1992), Qβ Replikaseamplifizierung (QβRA) (Wu et al., 1992; Lomeli et al., 1989) und selbsterhaltende Replikation (3SR) (Guatelli et al., 1990).
Weitere Anwendungen für derartige Techniken umfassen Nachweis und Charakterisierung von genetischen Störungen einzelner Gene in Individuen und in Populationen (siehe z.B. Landergren et al., 1988, der eine Ligationstechnik zum Nachweis einzelner Gendefekte, einschließlich Punktmutationen, offenlegt). Derartige Techniken sollten in der Lage sein, eindeutig einzelne Nukleotidunterschiede (Punktmutationen) zu unterscheiden, die zu einer Erkrankung (z.B. Sichelzellanämie) ebenso wie auch deletierte oder duplizierte genetische Sequenzen (z.B. Thalassämie) führen können.
Griffe
Falls verschiedene Typen veränderter Mikropartikel mit verschiedenen Sonden verbunden sind, die gegen spezifische Analyte gerichtet sind, können verschiedene Ziel-Analyte gleichzeitig markiert, sogar unabhängig in einem Analytgemisch manipuliert sein. Nach Binden an sein Ziel-Analyt wirkt ein sensitivierter hergestellter Mikropartikel-Markierung (ein hergestellter Mikropartikel, der an eine oder mehrere verbindende Elemente oder weitere Markierungen gekoppelt ist) als ein Griff, der beispielsweise zum Herausziehen des Analytes aus dem Zelllysat, Serum oder einer anderen biologischen Probe verwendet sein kann. Zahlreiche markierte Analyte können gleichzeitig in schaltbarer, frequenzabhängiger Weise manipuliert werden.
Zusätzlich zu der Funktion als Griff können Sonden-sensitivierte veränderte Mikropartikel ebenfalls zum Nachweis und in einer Anwendungsform zum gleichzeitigen oder fast gleichzeitigen Nachweis von Analyten eingesetzt sein. Durch Nutzung dieser Offenlegung kann ein veränderter Mikropartikel so konstruiert sein, dass die dielektrischen Eigenschaften und folglich das elektrophoretische Verhalten sehr sensitiv auf die Analytbindung sind. Das Vorhandensein eines Ziel-Analytes in einer Probe kann durch Beobachtung dieser Änderung des AC-elektrokinetischen Verhaltens detektiert werden.
Anbetracht des oben erwähnten, ist es dem Fachmann offensichtlich, dass die hergestellten Mikropartikel der vorliegenden Offenlegung, die für eine AC-elektrokinetische Manipulation von Zellen und Biomolekülen verwendet sein können, eine mögliche Technologie für die Entwicklung von verbesserten Trenn- und Nachweisverfahren für integrierte und automatisierte Mikrosysteme bereitstellen können, wo herkömmliche Verfahren wie Zentrifugation oder Immundetektion schwierig oder schlecht einzusetzen sind. Vorrichtungen, die diese verbesserten Verfahren nutzen, können in verschiedenen Diagnose- und Forschungsanwendungen zweckdienlich sein, wie es bereits diskutiert ist.
In einer Anwendungsform kann die Isolierung, Identifizierung, etc. von verdächtigen Zellen aus gemischten Zellsuspensionen und die Manipulation von Gemischen von dielektrisch indexierten veränderten Mikropartikeln, sämtliches in einer integrierten Vorrichtung, durchgeführt sein. Die Durchführung dieser Schritte hängt letzten Endes von den Möglichkeiten ab, das Material bezogen auf die Lösung zu bewegen, in der es suspendiert ist, ein Problem, für das die Dielektrophorese geradezu geschaffen ist. Obwohl die Prinzipien der Dielektrophorese in der Technik bekannt sind, werden diese Prinzipien für die hier diskutierten veränderten Mikropartikel in den Abschnitten unten erläutert und angewandt.
AC-elektrokinetische Phänomene
AC-elektrokinetische Phänomene sind eine Reihe verwandter Effekte, in denen Wechselstromfelder Kräfte auf Partikel induzieren. Diese Kräfte hängen von den elektrischen Charakteristika der Partikel und ihrer Umgebung ab. Das am besten bekannte elektrokinetische Phänomen ist die herkömmliche Dielektrophorese (cDEP). Der Ausdruck Dielektrophorese (DEP) wurde zuerst von Pohl gebraucht, um die Bewegung polarisierbarer Partikel gegen das Minimum des dielektrischen Potenzials in einen nicht gleichförmigen elektrischen Feld zu beschreiben (Pohl, 1978; Sauer, 1985; Kaler und Jones, 1990; Holzel et al., 1991; Gascoyne et al., 1993). Dieses Phänomen wird in Zellfusions- und Elektroporationsvorrichtungen genutzt (Abidor et al., 1994; Wu et al., 1994), um Zellen in einen engen Kontakt durch Perlenketten-Bildung zu bringen. Jüngst sind weitere elektrokinetische Phänomene, einschließlich Elektrorotation (ROT, Partikelrotation, die aus dem Drehmoment resultiert, das auf das Partikel von einem rotierenden elektrischen Feld ausgeübt wird) (Arnold und Zimmermann, 1982 und 1988; Fuhr et al., 1990; Hu et al., 1990; Gimsa et al., 1991, Holzel und Lamprecht, 1992; Huang et al., 1992; Sukhorukov et al., 1993; Wang et al., 1994c) und Wanderwelle-Dielektrophorese (twDEP, Lateralbewegung eines Partikels, die durch ein elektrisches Feld verursacht ist, das den Raum durchläuft) (Masuda et al., 1988; Hagedorn et al., 1992; Huang et al., 1993; Gascoyne et al., 1994a) auf ihre Anwendungsfähigkeit in der nichtinvasiven Charakterisierung und Manipulation von Zellen und Biomolekülen erforscht worden.
AC-elektrokinetische Phänomene resultieren aus der Wechselwirkung zwischen einem elektrischen Feld und Polarisationen, die in einem Partikel von dem Feld induziert wird. Der Effekt ist detailliert von mehreren Arbeitsgruppen untersucht worden und seine Theorie ist ziemlich gut etabliert (Pething, 1979; Jones, 1995). Es ist wichtig anzumerken, dass zwar die Dielektrophorese und die bekanntere Elektrophorese beide elektrokinetische Phänomene beschreiben, sie sich durch einige grundlegende Unterschiede unterscheiden. Bei der Dielektrophorese wird Partikelbewegung von der Größe, Polarität und Phase der Ladungen bestimmt, die in einem Partikel von einem angelegten Feld induziert werden. Es ist nicht erforderlich, dass das Partikel eine eigene Nettoladung trägt, um die Dielektrophorese zu erfahren. Die Elektrophorese erfordert allerdings, dass das Partikel eine eigene Nettoladung trägt. Die Wechselwirkung zwischen dieser eigenen Ladung und einem elektrischen Feld ist Ursache der Partikelbewegung. Außerdem werden in der Elektrophorese typischerweise homogene Gleichstromfelder eingesetzt. Die Dielektrophorese erfordert die Verwendung inhomogener elektrischer Felder, die entweder Gleich- oder Wechselstromfelder sein können. Die AC-elektrokinetischen Phänomene cDEP, gDEP und ROT sind als recht bedeutungslos für die Trennung und Analyse in der Chemie und Lebenswissenschaften angesehen worden, trotz der Tatsache, dass sie, aufgrund ihrer außergewöhnlichen Natur, weit mehr anwendbar sind als die üblich angewandten elektrophoretischen Verfahren. Betrachten wir die folgenden Vorteile von AC-elektrokinetischen Verfahren:

(1) Die Größe und das Vorzeichen der in einem Partikel induzierten Ladungen sind sehr stark von den dielektrischen Eigenschaften des Partikels abhängig. Partikel mit einem großen Spektrum dielektrischer Eigenschaften können durch Änderung der Dicke und Zusammensetzung der Beschichtung wie auch der Zusammensetzung des Partikelkerns hergestellt sein.
(2) Die Größe und das Vorzeichen der in einem Partikel induzierten Ladungen sind nicht fest, hängen aber entscheidend von der Frequenz des angelegten Feldes und den Eigenschaften des Mediums ab, in dem das Partikel suspendiert ist. Aus diesem Grund können die veränderten Mikropartikel in einer frequenzabhängigen Weise angesprochen werden.
(3) AC-elektrokinetische Phänomene stellen nicht nur eine einzige Art linearer Bewegung dar, sondern verschiedene kinetische Effekte in zwei Dimensionen, die nicht nur zur Manipulation der Partikel sondern auch zur Charakterisierung ihrer dielektrischen Eigenschaften eingesetzt sein können.
(4) Wie in (1) und (2) diskutiert, ist die AC-elektrokinetische Reaktion eines Partikels für die dielektrischen Eigenschaften hoch sensitiv. Veränderte Mikropartikel können gebildet werden, so dass ihre dielektrischen Eigenschaften auf die Bindung eines Analyts sehr sensitiv sind. Derartig veränderte Mikropartikel stellen ein Mittel zur Unterscheidung nicht gebundener Mikropartikel von Analyt-Mikropartikel Komplexen bereit. Dieser Typ veränderter Mikropartikel kann für eine qualitative und in manchen Fällen auch quantitatve Identifizierung eines Analyts verwendet sein.
(5) Die starken Abhängigkeiten von Zellbewegungen in beide Dimensionen von der Feldkonfiguration, der Feldfrequenz und dem Suspensionsmedium versprechen eine Anwendbarkeit der Partikeltrenntechnologien, die auf eine Reihe verschiedener Anwendungen abzielen.

Alle diese Phänomene können einzeln oder gleichzeitig angewandt sein, um die dielektrischen Eigenschaften der Partikel mit Hilfe geeigneter angelegter Feldkonfigurationen voll und ganz zu nutzen.
Allgemeine dielektrophoretische Theorie
Die dielektrische Kraft, die auf ein Partikel aufgrund eines elektrischen Feldvektors E →(t) wirkt, kann ganz allgemein bezogen auf den effektiven Vektor des Dipolmoments m →(t), der das Feld in einem Partikel induziert (Huang et al., 1992 und 1993; Gascoyne et al., 1994b; Wang et al., 1994a), beschrieben werden als F →(t) = (m →(t)∇)E →(t) (1)
Im Frequenzbereich ist das induzierte Partikeldipolmoment gegeben durch m →(ω) = 4πεmr3fCME →(ω) (2)wo ω die Winkelfrequenz des angelegten Felds, r der Partikelradius und f_CM der Clausius-Mossotti Faktor ist, der definiert ist als
Hier sind ε * / ρ und ε * / m die komplexen Permittivitäten des Partikels beziehungsweise seines Suspensionsmediums. Bis vor kurzem wurden die Ausdrücke, die verschiedene elektrokinetische Phänomene, einschließlich cDEP und twDEP, beschreiben (Huang et al., 1993), durch Substitution geeigneter räumlicher Ausdrücke für E abgeleitet, was zu Spezialfällen des Ausdrucks der Kraft führte. Allerdings durch die Nutzung der Tatsache, dass die partiellen Ableitungen des Felds nach Raum und Zeit den Swartz-Beziehungen gehorchen (Geliert et al., 1977), damit das Feld kontinuierlich bleibt, ist vor kurzem abgeleitet worden (Wang et al., 1994a und 1994b), dass die über die Zeit gemittelte dielektrophoretische Kraft dargestellt werden kann als ⟨F →(t)⟩ = 2πε=r3(Re(fCM)∇E(rms)2 + Im(fCM)(E2x0 ∇φx + E2y0 ∇φy + E2z0 ∇φz)) (4),wo E(rms) der rms-Wert der elektrischen Feldstärke ist. E_i0 und φ_i (i = x, y, z) die Größe beziehungsweise die Phase der Feldkomponenten in den Hauptachsenrichtungen sind. Anders als frühere Analysen kann dieser Ausdruck zur Untersuchung der von einer beliebigen Form eines angelegten Felds ausgehenden Kräfte verwendet sein. Er enthält zwei Terme, die zum ersten Mal die Erkenntnis erlauben, dass es zwei unabhängige Kräfte gibt, die zu der gDEP-Bewegung beitragen

(i) der linke Term bezieht sich auf die reale (phasengleiche) Komponente (Re(f_CM)) des induzierten Dipolmoments in dem Partikel und auf die räumliche Ungleichförmigkeit, VE(rms)², der Feldgröße. Diese Kraft richtet das Partikel gegen starke oder schwache Feldbereiche, abhäng davon, ob Re(f_CM) positiv oder negativ ist (2a). Dies ist der herkömmliche DEP-Term (Huang et al., 1992; Jones und Kallio, 1979).
(ii) der rechte Term bezieht sich auf die imaginäre (phasenverschobene) Komponente des induzierten Dipolmoments und auf die räumliche Ungleichförmigkeit des Feldes (∇φ_x, ∇φ_y, ∇φ_z) der Feldphase. Abhängig von der Polarität von Im(f_CM) lenkt diese Kraft das Partikel gegen Bereiche, wo die Phasen der Feldkomponente größer (Im(f_CM) > 0) oder kleiner (Im(f_CM) < 0) sind (2b). Unter den zwingenden Bedingungen für ein elektrisches Wanderfeld wird Gleichung 4 auf den Ausdruck der twDEP Kraft reduziert (Huang et al., 1993).

Gleichung 4 zeigt, dass die von einem Partikel erfahrene Kraft in einem ACelektrischen Feld nicht nur von der Inhomogenität der Feldgröße herrührt, wie von Pohl (1978) vermutet, sondern auch von der Ungleichförmigkeit der Feldphase. Die Erfinder haben die Partikelbewegung, die sowohl von Größen- als auch Phasenungleichförmigkeiten ausgelöst ist, allgemeine Dielektrophorese genannt. Da alle Feld-induzierten Zellbewegungen mit den Termen der Gleichung 4 zu verstehen sind, können komplizierte Feldkonfigurationen mit sowohl Phasen- als auch Größenungleichförmigkeiten mit Hilfe der in der Technik bekannten Methodologie untersucht werden.
Charakterisierung veränderter Mikropartikel mit ROT
Die dielektrischen Eigenschaften von Partikeln, einschließlich veränderter Mikropartikel, können mittels Elektrorotation nachgewiesen werden. Bei der Elektrorotation werden die Partikel einem rotierenden elektrischen Feld ausgesetzt und zur Rotation um eine im Wesentlichen stabile Achse induziert. Dieses Verfahren ist gegenüber anderen Charakterisierungsverfahren geeignet, da es relativ einfach ist, eine gute Reproduzierbarkeit bietet und ein Mittel zur Charakterisierung einzelner Partikel bereitstellt. Während die dielektrischen Eigenschaften des Partikels nichtinvasiv mit Hilfe eines beliebigen elektrokinetischen Phänomens untersucht werden können, bietet ROT den signifikanten Vorteil, dass es eine Partikelrotation um eine Achse induziert, die für die meisten Zwecke als feststehend im Raum erachtet werden kann. Folglich bleibt das Partikel in einer konstanten Position konstanter Feldstärke. Das ROT Drehmoment, Γ(t) hängt (Arnold und Zimmermann, 1982 und 1988; Fuhr, 1985) nicht von der Inhomogenität des elektrischen Feldes sondern von dem Vektorprodukt ab Γ →(t) = –m →(t) × E →(t) (5)und in dem Frequenzbereich kann die Größe dieses Drehmoments (Arnold und Zimmermann, 1982 und 1988; Fuhr, 1985) geschrieben werden Γ(ω) = –4πεmr3Im(fCM)E2 (6)
Typische ROT-Spektren, die für drei verschiedene Partikel oder in diesem Fall Zelltypen abgeleitet sind, sind in 3 gezeigt. Gleichung 6 zeigt, dass Im(f_CM) die Form eines jeden Spektrums für jeden Partikeltyp widerspiegelt. Durch Anwenden eines geeigneten dielektrischen Modells ist es möglich, die dielektrischen Eigenschaften von veränderten Mikropartikel direkt von ihren ROT-Spektren abzuleiten. Die explizite dielektrische Modellierung von Partikeleigenschaften wird am häufigsten unter Verwendung dielektrischer Schalenmodelle unternommen (Huang et al., 1992; Fuhr, 1985; Irimajri et al., 1979) und die Erfinder (Huang et al., 1992; Wang et al., 1994c; Gascoyne et al., 1994b) und andere (Holzel und Lamprecht, 1992) haben ihren Beitrag zu dieser Theorie geleistet, die erlaubt, dielektrische Daten für Partikel aus ROT-Daten abzuleiten.
Die Erfinder haben ebenfalls die Genauigkeit untersucht, mit der dielektrische Parameter aus ROT-Analysen abgeleitet sein können (Gascoyne et al., 1994b). Dies erlaubt uns, nicht nur die wesentlichen dielektrischen und strukturellen Aspekte von Mikropartikeln zu verstehen, sondern ebenfalls zusammen mit Gleichung 4, das elektrokinetische Verhalten der Mikropartikel unter allen Suspensionsbedingungen für alle Konfigurationen des elektrischen Feldes vorauszusagen. Analoge magnetische Rotationsexperimente können ebenfalls durchgeführt werden, um die magnetischen Eigenschaften der Mikropartikel zu charakterisieren.
Dielektrische Modellierung veränderter Mikropartikel
Die Struktur eines hergestellten Mikropartikels, wie das in 1 gezeigte und im begleitenden Text erklärte Mikropartikel, kann hinsichtlich der dielektrischen Eigenschaften einem sphärischen leitenden Inneren (selbst wenn dieses Innere dann wieder einen dielektrischen Kern umfasst, der von einer leitenden Hülle umgeben ist), der von einer dünnen, schlecht leitenden Hülle umgeben ist, angenähert sein. Die Komplex-Permittivität ε * / ρ eines solchen Partikels ist gegeben durch (Irimajari et al., 1979; Huang et al., 1992)
wo ε * / Inneres und ε * / Hülle die komplexen Permittivitäten Leitfähigkeit und Permittivitäten des Partikelinneren und der isolierenden Hülle sind, r der Partikelradius ist und d die Dicke der isolierenden Schicht ist. Die cDEP und twDEP AC-elektrokinetische Reaktion eines veränderten Mikropartikels kann in Übereinstimmung mit der in der Technik bekannten Methodologie unter Anwendung der Gleichungen 4 und 7 gebildet werden.
4 veranschaulicht die cDEP und twDEP Reaktion veränderter Mikropartikel, deren Hülldicken zwischen etwa 1 und 10 nm variieren. Es geht aus 4 klar hervor, dass veränderte Mikropartikel unterschiedlicher Zusammensetzung im Wesentlichen verschiedene Reaktionen auf AC-elektrische Felder verschiedener Frequenzen zeigen. Die Frequenzreaktion eines einzigen Mikropartikeltyps wird als dielektrischer Fingerabdruck bezeichnet und erlaubt die Unterscheidung zwischen Mikropartikeln mit verschiedenen Strukturen.
Veränderte Mikropartikel mit komplexeren dielektrischen Fingerabdrücken können durch Auftragen mehrerer Materialschichten kontrollierter Dicke über ein Kernmaterial oder unter Verwendung eines Kernmaterials, das dispergierend ist, hergestellt sein. Die AC-elektrokinetische Reaktion dieser komplexeren veränderten Mikropartikel kann durch die Verwendung eines in der Technik bekannten vielhülligen dielektrischen Modells vorausgesagt werden, wie dasjenige, das von Jones (1995) beschrieben ist und hier durch Quellenangabe eingefügt ist. Zusätzlich können andere nicht konzentrische Strukturen hergestellt werden und mit einem Äquivalent mit sphärischen Hüllen modelliert werden.
Eine Bibliothek veränderter Mikropartikel mit verschiedenen dielektrischen Fingerabdrücken können ohne weiteres durch Herstellung veränderter Mikropartikel mit verschiedenen physikalischen Zusammensetzungen und Strukturen assembliert werden. Mikropartikel mit einzigartigen dielektrischen Fingerabdrücken können individuell ansprechbar sein und können als frequenzabhängige Griffe für die Manipulation mehrerer verschiedener Analyte in einem Probengemisch verwendet werden.
Magnetophorese
Ein Partikel mit Volumen ν und magnetischer Permeabilität μ * / ρ, der in ein homogenes Magnetfeld verbracht ist, erfährt eine magnetophoretische Kraft FMAP = 2πμsR3kcm(μ*s , μ*ρ , ωH)∇H(x, y, z)2 (8)wo μ_s die magnetische Permeabilität des Suspensionsmediums ist, R der Partikelradius ist, k_cm(μ * / s, μ * / ρ, ω_H) der Magnetische Clausius-Mossotti-Faktor ist, der die magnetische Polarisierbarkeit des Partikels bezogen auf sein Suspensionsmedium beschreibt, und ∇H(x, y, z)² der Gradient des Quadrats der magnetischen Feldstärke ist. Hier ist ω_H die Frequenz des angelegten Magnetfeldes und besitzt einen Wert von 0 für ein statisches Feld. Analog zur dielektrischen Gleichung (Gl. 2) sind μ * / s und μ * / ρ die komplexen Permeabilitäten des Suspensionsmediums beziehungsweise des Partikels. Im Falle eines statischen Magnetfelds reduzieren diese sich auf die Parameter der realen, statischen Permeabilität μ_s beziehungsweise μ_ρ.
Es ist zu beachten, dass die Gleichung 8 das magnetische Analog zu Gleichung 2 ist. Alternativ, falls das Partikel eine permanente Volumenmagnetisierung m hat, dann ist die magnetophorische Kraft FMAP = μsR3m∇H(x, y, z)2 (9)
Es ist für ein Partikel möglich, beide Komponenten, die permanente als auch die induzierbare magnetische Polarisierung, zu besitzen. In diesem Fall kann eine Kombination der Gleichungen 8 und 9 angewandt werden. Zum Beispiel kann ein Partikel eine hohe Permeabilität haben und zum selben Zeitpunkt magnetische Remanenz zeigen. Für eine formale Diskussion der Magnetophorese sei der Leser auf Jones (1995) verwiesen.
Die Anwendung der Magnetophorese zum Sammeln magnetisch suszeptibler Mikropartikel ist in der Technik bekannt. Produkte z.B. von Dynatech, Inc. (Lake Success, NY) und Miltenyi Biotec (Aubern, CA) werden routinemäßig für auf Magnetophorese basierende Trenntechniken, die auch als Immunomagnetische Separation (IMS) und magnetisch aktiviertes Zellsortieren (MACS) bekannt sind, verwendet.
Obwohl magnetische Mikropartikel ohne weiteres von vielen Quellen verfügbar sind, ist die gleichzeitige Nutzung magnetischer und dielektrischer Mikropartikeleigenschaften für eine verbesserte Trennungen ein neuartiger Versuchsansatz. Die Vorrichtung, die zum Unterscheiden, Manipulieren und/Isolieren veränderter Mikropartikel verwendet ist, enthält sowohl AC-elektrokinetische als auch magnetophoretische Elemente. Zum Beispiel kann eine AC-elektrokinetische Manipulation veränderter Mikropartikel cDEP, twDEP, gDEP und ROT umfassen, unter Verwendung einer Elektrodenanordnung, mit der AC-Signale geschaltet werden. Magnetophoretische Manipulation veränderter Mikropartikel kann unter Verwendung eines starken Magneten durchgeführt werden, der mit einem Mittel zur Bereitstellung lokaler Magnetfeld-Inhomogenität in Nähe der Elektrodenanordnung ausgestattet ist. In einer solchen Vorrichtung erfahren veränderte Mikropartikel sowohl ACelektrokinetische als auch magnetophoretische manipulierende Kräfte; sowohl die dielektrischen als auch die magnetischen Eigenschaften der Mikropartikel können dadurch gleichzeitig genutzt werden, um eine verbesserte Unterscheidungs- und Manipulationsfähigkeiten bereitzustellen.
Die Sensivität von DEP-FFF auf Änderungen der dielektrischen Eigenschaften der Partikel
Die Erfinder haben sowohl theoretisch als auch experimentell gezeigt (Wang et al., 1998), dass für eine parallele Elektrodengeometrie die dielektrophoretische Levitationskraft für ein in einem flüssigen Medium suspendiertes dielektrisches Partikel mit der Höhe über der Elektrode exponentiell abfällt. Falls das Partikel eine solche Dichte hat, dass es dazu neigt, gegen die Elektrodenebene zu sedimentieren, erfolgt eine stabile dielektrophoretische Levitation bei einer Gleichgewichtshöhe, die gegeben ist durch
Hier ist U die elektrische Spannung, die an der Elektrodenanordnung angelegt ist. A ist ein geometrischer Term, ρ ist der Anteil des angelegten Felds, das durch die Elektrodenpolarisation nicht abgeschirmt ist, ε_m ist die dielektrische Permittivität des Suspensionsmediums, (ρ_c – ρ_m)g ist der Sedimentationsterm und die dielektrische Polarisierung, die an der Partikel-Medium Grenzfläche erfolgt, ist mit dem realen Teil des sogenannten Claussius-Mossotti-Faktors Re(f_CM) beschrieben.
Bei DEP-FFF erfolgt die Levitation in einer Flüssigkeit, die in einer schmalen Kammer gemäß dem hydrodynamischen Fließprofil fließt. Folglich hängt die Geschwindigkeit des Partikels von der Levitationshöhe h_eq in dem Flüssigkeitsstrom ab und Partikel mit verschiedenen h_eq-Werten können folglich aus dem Ausgangsgemisch getrennt werden, da sie mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten entlang der Länge der Kammer fließen, in der die Levitation erfolgt.
Um die Abhängigkeit der Partkelgeschwindigkeit von kleinen Änderungen der dielektrischen Eigenschaften des Partikels in einem DEP-FFF-Experiment einzuschätzen, ist es hilfreich, sie zuerst als eine Funktion der Gleichgewichtshöhe vor den dielektrischen Änderungen zu formulieren. Differenzieren wir die Gleichung (1) nach den dielektrischen Eigenschaften, so erhalten wir
Falls das hydrodynamische Fließprofil in der Trennkammer parabolisch ist, dann hängt die Partikelgeschwindigkeit von der Levitationshöhe ab gemäß
wo H die Kammerdicke und (ν) die mittlere Fließgeschwindigkeit ist.
Folglich können wir die zunehmenden Änderungen der Geschwindigkeit, die den zunehmenden Änderungen der Höhe entsprechen, formulieren als
Wir können außerdem von Gleichung (3)6(ν) ersetzen, um zu erhalten
und dann zunehmende Änderungen der dielektrischen Partikeleigenschaften mit den entsprechenden Änderungen der Partikelgeschwindigkeit unter Verwendung Gleichung (2) in Beziehung setzen als
wo wiederum
Durchsicht der Gleichung (6) zeigt, dass die Empfindlichkeit der Partikelgeschwindigkeit auf zunehmende Änderungen der Höhe am größten ist, wenn h_eq und Re(f_CM) beide klein sind. Die extreme Empfindlichkeit des DEP-FFF Phänomens leitet sich von der Tatsache ab, dass diese beiden Bedingungen dazu neigen, gegenseitig zu bedingen. Die Erfinder erkennen zum Beispiel aus Gleichung (1), dass es eine Schwellenbedingung für eine überhaupt zu erfolgende Levitation gibt,
Dies bedingt, dass die dielektrische Kraft die Sedimentationskraft an der Elektrodenebene für die Levitation übersteigen muss. Zweifellos für beliebige allgemeine Bedingungen, in denen
die angelegte Spannung U gewählt sein kann, um sicherzustellen, dass die Levitation tatsächlich erfolgt, aber dass sie dennoch klein ist. Wir stellen also fest, dass kleinere Größen von Re(f_CM) ebenfalls kleinere Levitationshöhen sicherstellen. Natürlich gibt es eine Grenze in des Praxis, wie groß U sein kann und deshalb wie klein Re(f_CM) in einer realen Anwendung sein kann.
Da h_eq und Re(f_CM) den Nenner von Gleichung (6) bestimmen, kann deshalb die Empfindlichkeit der DEP-FFF zunehmenden Geschwindigkeit auf Änderungen der dielektrischen Partikeleigenschaften sehr groß sein, falls die geeigneten Bedingungen gewählt werden. In der Praxis können so kleine Änderungen von Re(f_CM) wie –0,0001 detektierbar sein – eine wahrhaft erstaunliche Empfindlichkeit.
Um dieses zu veranschaulichen, beobachten wir, dass in Experimenten, die mit menschlichen HL-60 Leukämiezellen mit einer Elektrodenanordnung mit Elektrodenbreiten und Zwischenräumen von 20 Mikron durchgeführt wurden, die folgenden Parameter erhalten wurden
A = –2,77 × 10¹⁴m^–3, d = 80 × 10^–6 m, ρ = 1, ρ_c = 1089 kg·m^–3,
ρ_m = 1033 kg·m^–3, ε_m = 78 ε_m und H = 200 × 10^–6 m.
Aus Gleichung (1) wird die Levitationshöhe berechnet als heq = 6·37 × 10–6ln(–522Re(fCM)),und der Parameter der Geschwindigkeitsempfindlichkeit ist
7 zeigt für diese experimentell verifizierten Parameter die Abhängigkeit der Empfindlichkeit der Partikelgeschwindigkeit, ausgedrückt als % Änderung der Partikelgeschwindigkeit, von kleinen Änderungen von Re(f_CM) für Ausgangswerte von –0,01, –0,02, – 0,04, –0,08, –0,16 und –0,32. Wir bemerken, dass eine Zunahme der Größe von Re(f_CM) von 0,025, das in der Figur gezeigte Maximum, noch als extrem klein betrachtet wird.
7 zeigt, dass falls Re(f_CM) der Kombination Partikel/Medium klein ist, dann ist die Empfindlichkeit der DEP-FFF Geschwindigkeit auf Änderungen der dielektrischen Eigenschaften in der Tat sehr groß. Zum Beispiel schafft für den Ausgangswert Re(f_CM) = –0,01 eine Änderung in Re(f_CM) von –0,005 eine 120% Zunahme der Partikelgeschwindigkeit (Magenta-Kurve). Wir können zuverlässig so kleine Änderungen wie 2% in der Partikelgeschwindigkeit messen, daher ist die Empfindlichkeit hinreichend, eine Änderung von Re(f_CM) von nur –0,0001 nachzuweisen. Andererseits, falls der Ausgangswert für Re(f_CM) –0,32 ist, so ist der Nachweis von Änderungen der Partikelgeschwindigkeit nur für Zunahmen von Re(f_CM) größer als etwa –0,03 zuverlässig. Für die höchste Empfindlichkeitsstufe in einem DEP-FFF Detektionsassay sollten dielektrische Partikel und Suspensionsmedium so gewählt sein, dass Re(f_CM) → 0. Wir werden nun deshalb die Bedingungen betrachten, unter denen dies erreicht werden kann.
Der Clausius-Mossotti-Faktor f_CM
Betrachten wir ein Partikel in einem dielektrischen Medium, an das ein elektrisches Feld angelegt worden ist. Das dielektrische Suspensionsmedium und das Partikel polarisieren als Reaktion auf das elektrische Feld. Fall die dielektrischen Eigenschaften sich von denjenigen des Suspensionsmediums unterscheiden, dann werden allerdings das Partikel und Medium einen unterschiedlichen Polarisationsgrad zeigen und die Grenzfläche zwischen den beiden wird einer lokalen Polarisation unterliegen, um sicherzustellen, dass die dielektrische Verdrängung D über die Grenzfläche kontinuierlich ist. In 8 hat das ovale Partikel eine geringe dielektrische Permittivität und polarisiert nicht nennenswert. Andererseits polarisiert das tragende Suspensionsmedium, das eine hohe dielektrische Permittivität besitzt, und es erfolgt eine Grenzflächenpolarisierung an der Partikel/Medium-Grenzfläche, um die Kontinuität der dielektrischen Verdrängung zu erhalten. Dies stellt ziemlich genau den Fall einer Luftblase in einer wässrigen Suspension dar. Es stellt ebenfalls eine vereinfachte Betrachtung eines Polymerkügelchens dar, das in Wasser in einem DEP-FFF Experiment suspendiert ist (siehe später wegen der sehr gewichtigen Widersprüche). Die Kombination aller dielektrischer Polarisationen bestimmt die dielektrophoretische Reaktion des Partikels, falls das angelegte Feld inhomogen ist. Der Claussius-Massotti-Faktor f_CM drückt die Gesamtpolarisierbarkeit des Partikels im Suspensionsmedium aus und folglich beinhaltet f_CM die Polarisationsterme für sowohl das Partikel als auch das Medium. Ein zentrales Problem der AC-Elektrokinetiken ist die Bestimmung von f_CM für eine bestimmte Kombination von Partikel und Medium, so dass die dielektrophoretischen Kräfte nachgebildet werden können.
Für ein sphärisches Partikel ist der Claussius-Massotti-Faktor gegeben durch
wo ε_ρ die effektive Permittivität des Partikels ist und ε_m diejenige des Mediums ist. In der Figur ist das gezeigte Partikel nicht polarisierbar, so dass ε_ρ << ε_m. In diesem Fall ist f_CM –0,5, so dass ebenfalls Re(f_CM) ≈ –0,5 ist. In einem dielektrophoretischen Experiment entspricht dies den Bedingungen für die maximale negative Dielektrophorese. Substitution von Re(f_CM) mit diesem Wert in Gleichung (1) und (6) zeigt, dass eine riesige Änderung der dielektrischen Eigenschaften des Partikels ε_ρ erforderlich wäre, um eine wesentliche Änderung in der Partikelgeschwindigkeit unter diesen Bedingungen zu schaffen, und man schließt daraus, dass DEP-FFF nicht sehr empfindlich für eine Detektion der Änderungen der dielektrischen Eigenschaften des Partikels wäre. Andererseits sahen wir bereits, dass die DEP-FFF Empfindlichkeit ansteigt, wenn Re(f_CM) → 0. Dies impliziert, dass
Eine Optimierung von DEP-FFF zum Nachweis kleiner Reaktion bei den dielektrischen Eigenschaften von Partikeln an Ziel-Agentien läuft folglich darauf hinaus, die Bedingungen zu erkunden, unter denen3 die Partikel und ihr Suspensionsmedium fast die gleichen effektiven relativen Permittivitäten haben.
Der Claussius-Mossotti-Faktor für veränderte Mikropartikel
Es ist zu beachten, dass ε_ρ die effektive Permittivität des Partikels ist. Im Falle einer Luftblase könnte ε_ρ als eine Konstante, die gleich der Permittivität des Volumens ist, modelliert sein. Allerdings in Abhängigkeit der Struktur und Zusammensetzung des in Frage kommenden Partikeltyps kann der Ausdruck für ε_ρ und sein entsprechendes dielektrisches Modell ziemlich komplex sein. Zum Beispiel ein einfaches Modell für ein verändertes Mikropartikel, wie dasjenige in 3 gezeigte, entsteht ε_ρ aus einem System konzentrischer Hüllen, das aus einem leitenden Inneren besteht, mit einer Permittivität ε_c und einer Leitfähigkeit σ_c, umgeben von einer sehr dünnen isolierenden Schicht mit einer Permittivität ε_s und einer Leitfähigkeit σ_s.
Die entsprechende effektive Permittivität des sogenannten Hüllensystems ist sehr frequenzabhängig, das eine sehr effektive Charakterisierung, Unterscheidung und Sortierung von Mikropartikeln verschiedenen Typs mit Hilfe AC-elektrokinetischer Verfahren erlaubt. Darüber hinaus können ohne weiteres geeignete Permittivität ε_m, Leitfähigkeit σ_m des Suspensionsmediums und angelegte Frequenzbedingungen ausgewählt werden, so dass die effektive Permittivität eines veränderten Mikropartikeltyps der Permittivität des Suspensionsmediums sehr nahe kommt. Auf diese Weise eignen sich die Mikropartikel für eine hohe Unterscheidung mit DEP-FFF.
Für veränderte Mikropartikel, die Säugerzellen nachbilden, ist die Leitfähigkeit σ_s der Hülle extrem gering und ihr Einfluss kann im Vergleich mit kapazitiven Effekten von ε_s vernachlässigt werden. Im Gegensatz dazu ist für den Frequenzbereich von 10 kHz bis < 1 Mhz, wo die kapazitiven Effekte bedeutend sind, der Einfluss der Leitfähigkeit σ_m des Suspensionsmediums viel größer als derjenige der Permittivität ε_m. Unter diesen Bedingungen kann der reale Teil des Claussius-Mossotti-Faktors für veränderte Mikropartikel, die Säugerzellen nachbilden, angenähert sein
Wo C die spezifische Membrankapazität des Mikropartikels in F/m² ist, r der Radius des Mikropartikels ist und f die Frequenz des angelegten Felds ist. Wir stellen fest, dass in diesem Fall die DEP Übergangsbedingung erfolgt, wo Re/f_CM) → 0 ist, wenn
Die grundlegende Bedingung, die erfüllt sein muss, um eine Unterscheidung der beiden verschiedenen Mikropartikeltypen mittels DEP-FFF zu ermöglichen, ist, dass sie in verschiedenen Höhen schweben. Wenn die obere Näherung für den realen Teil des Claussius-Mossotti-Faktors richtig ist, kann diese Bedingung unter Verwendung von Gleichung (1) ausgedrückt sein als
wo die Indizes 1 beziehungsweise 2 sich auf die beiden zu trennenden Mikropartikel beziehen. Es folgt, dass
was auf drei Weisen erfüllt sein kann, nämlich (1 und 2) falls einer der beiden DEP-Übergangsfrequenz-Terme, die in den Klammern zum Quadrat definiert sind, näherungsweise null ist, während der andere nicht null ist, eine Bedingung, die immer erfüllt werden kann, wenn r1C1 ≠ r2C2 oder (3) falls die Frequenz weit unter der Übergangsfrequenz ist, falls (ρρ1 – ρm) ≠ ρρ2 – ρm)
In diesem dritten Fall kombinieren Mikropartikelgröße, -dichte und Hüllkapazität als Faktoren, um die Trennbarkeit der Mikropartikel zu bestimmen.
Beispiele
Die folgenden Beispiele sind enthalten, um die spezifischen Anwendungsformen der vorliegenden Offenlegung zu demonstrieren. Der Fachmann sollte wissen, dass die in den Beispielen offengelegten Techniken, die aus den vom Erfinder entdeckten repräsentativen Techniken folgen, sehr gut bei der praktischen Umsetzung der Erfindung funktionieren und folglich als spezifische Formen für ihre praktische Umsetzung zu betrachten sind.
Beispiel 1
Konstruktionserwägungen für veränderte Mikropartikel
Die Forschungen in den Lebenswissenschaften erfordern typischerweise Analysen von Partikeln, die einen Größenbereich von 100 nm bis 10 μm im Durchmesser besitzen. Die Hauptkräfte, die auf Partikel in diesem Größenbereich wirken, sind Sedimentationskräfte und Zufallskräfte aufgrund der Brownschen Molekularbewegung. Für ein Partikel mit einem Radius von 1 μm und einer Dichte von 1,05 g/cm³, der in wässrigem Medium (ρ = 1,00 g/cm³) bei 25°C suspendiert ist, besitzen die Sedimentations- und Brownschen Kräfte jeweils eine Größe von annähernd 2 × 10^–15 N.
Um die herkömmlichen Dielektrophorese als eine manipulierende Kraft wirksam zu verwenden, muss die cDEP-Kraft größer sein als andere Kräfte, die auf das Partikel wirken, und in einer Anwendungsform etwa eine Größenordnung größer als die anderen Kräfte, die auf das Partikel wirken. Gemäß Gleichung 4, wenn Re(f_CM) = 0,5, dann sollte ∇E(rms)² annähernd 9 × 10¹² V²/m³ sein, um eine cDEP-Kraft zu ergeben, die 10 mal größer ist als die Sedimentations- oder Brownschen Kräfte (Pething und Markx, 1997).
Mit Hilfe von Mikroelektroden und in der Technik bekannten Verfahren ist es möglich, Felder dieser Größe mit einer angelegten Spannung von etwa 10 V oder weniger zu erzeugen. Die Sedimentationskräfte und die herkömmlichen dielektrophoretischen Kräfte sind beide proportional zu r³, während die Zufallskräfte der Brownschen Molekularbewegung proportional zu r^–1 sind. Für Partikel größer als 1 μm sind die Sedimentations- und cDEP-Kräfte die dominierenden Kräfte, die auf Partikel wirken, und die herkömmliche Dielektrophorese kann verwendet werden, um Partikel mit etwa 10 μm im Durchmesser oder größer zu manipulieren. Für kleinere Partikel dominieren die Brownschen Molekularkräfte über die Sedimentationskräfte. Mit Hilfe von Elektroden mit Submikron-Geometrien kann man cDEP-Kräfte erzeugen, die in der Lage sind, Viren und andere Partikel, die etwa 100 nm im Durchmesser oder kleiner sind, zu manipulieren (Mauer et al., 1996).
Mit der Nutzung dieser Offenlegung können veränderte Mikropartikel konstruiert werden mit Eigenschaften, die sie für AC-elektrokinetische und magnetophoretische Manipulation zugänglich machen. Wie zuvor für den spezifischen Fall der cDEP-Manipulation von Partikeln diskutiert, muss die Größe der cDEP-Kraft hinreichend sein, um den Einfluss der anderen auf die Partikel in dem System wirkenden Kräfte zu überwinden. Dies ist trifft für jede AC-elektrokinetische oder magnetophoretische Manipulation zu. Die Kräfte, die auf Partikel wirken, sind im allgemeinen Sedimentationskräfte und durch die Brownsche Molekularbewegung induzierte Zufallskräfte. Da die Größe dieser Kräfte von den Partikeleigenschaften abhängt, können die veränderten Mikropartikel so konstruiert sein, dass die Wirkung der elektrokinetischen AC-Kraft durch eine geeignete Änderung des Einflusses der konkurrierenden Kräfte maximiert ist.
Sedimentationskräfte können verändert sein, zum Beispiel, durch Herstellen veränderter Mikropartikel mit einer wirksamen Dichte zwischen 1,0 und 2,0 g/cm³. Eine geringe (< 1,5 × 10^–12 N) Sedimentationskraft wird dann auf 10 μm Partikel dieser Dichte wirken, wenn sie in einem wässrigen Medium suspendiert sind. Für die meisten Anwendungen ist dieses Merkmal bevorzugt, da mikrohergestellte elektrokinetische AC-Vorrichtungen typischerweise mit Mikroelektroden auf der Unterseite der Vorrichtung konstruiert sind. Die elektrische Feldstärke und dadurch die AC-elektrokinetische Kraft ist am ausgeprägtesten in Nähe der Elektrodenfläche.
Ein negativer Auftrieb kann verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Mikropartikel auf die Elektrodenfläche fallen, wo sie durch positive cDEP gehalten oder durch negative cDEP levitiert werden können. Die Brownschen Kräfte können durch Konstruktion von Mikropartikeln mit einem Durchmesser von etwa 10–20 μm vermindert werden. Der Einfluss der Brownschen Kräfte auf Partikel dieser Größe ist vernachlässigbar, im Vergleich zu der Größe der DEP-Kräfte, die typischerweise für die Manipulation der veränderten Mikropartikel verwendet werden. Analoge Argumente sind auf die Konstruktion der magnetischen Mikropartikeleigenschaften und das magnetische Feld anwendbar.
Ein Versuchsansatz, um eine endgültige wirksame Dichte in einem spezifizierten Bereich zu erreichen, kann folgendermaßen lauten: maßgeschneidert veränderte Mikropartikel können mittels einer dünnschichtigen Anlagerung von leitfähigen, isolierenden und/oder magnetisch suszeptiblen Materialien auf sphärischen Substraten geringer Dichte (< 1,3 g/cm³) hergestellt werden. Aus dem Maxwell-Gesetz für Elektromagnetismus ist bekannt, dass eine leitfähige sphärische Hülle nicht von einer festen leitenden Sphäre als Reaktion auf ein äußeres angelegtes elektrisches Feld zu unterscheiden ist. Die leitfähige Schicht kann ein dünner Film aus Metall, wie Gold, Silber, Platin oder Kupfer mit einer Dicke von etwa 10–-100 nm sein.
Diese Schicht kann auf das Substrat mittels physikalischer Bedampfung (PVD) oder stromlosen Beschichtens (Elshabini und Brown, 1998 gemäß den in der Technik bekannten Prinzipien) aufgetragen werden, um den leitfähigen Kern zu bilden. Das isolierende Material kann ein dünner Film aus Metalloxid wie Al₂O₃ oder polymeres Material wie Polystyrol oder PTFE sein. Derartige Materialien können zum Beispiel durch PVD oder Mikroverkapselungstechniken (Lim, 1984) aufgetragen werden.
Da die Dichten der leitfähigen und isolierenden Schichten im Bereich von 8,9–21,4 g/cm³ und 1,1–2,2 g/cm³ liegen können, muss das entsprechende Substrat eine geringe Dichte besitzen, um einen fertigen Mikropartikel in dem gewünschten Dichte-Bereich zu erhalten. Polystyrol- und Hohlglas-Mikropartikel von etwa 10–1000 μm im Durchmesser sind kommerziell mit einer Dichte von annähernd 1,0 g/cm³ von verschiedenen Firmen, einschließlich Dynal, Inc. (Lake Success, NY, Miltenyl Biotec (Auburn, CA), Cortex Biochem, Inc (San Leandro, CA) und BioSource International (Camarillo, CA), erhältlich.
Ähnliche Erwägungen beziehen sich auf die Konstruktion der magnetischen Eigenschaften der Mikropartikel, so dass eine geeignete Mikropartikeldichte erreicht werden kann. Geeignete magnetische Materialien für den Mikropartikel-Kern oder die Schichtbildung umfassen Ferrite, seltene Erden, die Keramiken und Glasmaterialien enthalten, ebenso wie auch Eisen, Kobalt, Titan und andere Materialien, die Atome oder Moleküle mit nichtkompensierten Elektronen-Spin enthalten.
Charakteristika, die die dielektrischen Eigenschaften von Mikropartikeln bestimmen, umfassen ihre Größe, Oberflächenladung, Dichte, Zusammensetzung und elektrische Leitfähikeit. Mit der Nutzung dieser Offenlegung und der in der Technik bekannten Technologie können alle diese Parameter modifiziert werden, um einen gewünschten dielektrischen Fingerprint zu erhalten. Insbesondere können veränderte Mikropartikel hergestellt werden, um eine definierte Oberfläche und interne dielektrische, magnetische und Dichte-Eigenschaften einzubauen, innere und Oberflächenschichten und interne Kompartimente und/oder Kerne einzubauen, wobei jedes Element davon dielektrisch, leitfähig, magnetisch oder nicht-magnetisch sein kann. Die dielektrischen und elektrischen Eigenschaften der Mikropartikeloberfläche und jeder Hülle, Schicht, Kompartiment und Kern kann unterschiedlich sein. Die dielektrischen und magnetischen Gesamteigenschaften eines Mikropartikels werden durch die synergistischen dielektrischen und elektrischen Beiträge jedes seiner Komponententeile und durch das Vorhandensein von magnetisch suszeptiblen Materialien im Partikel bestimmt. Durch Kombinieren von strukturellen Elementen, die die geeigneten dielektrischen und elektrischen Eigenschaften besitzen, können unterschiedliche Typen an Mikropartikeln, die unterschiedliche und unterscheidbare dielektrische Eigenschaften besitzen, synthetisiert werden.
Die Physik der Dielektrizität und des Magnetismus macht es möglich, Mikropartikel auf mehrere Weisen herzustellen, die im wesentlichen ähnliche dielektrische und/oder magnetische Eigenschaften besitzen. Im Sinne dieser Erfindung werden alle Mikropartikel, die ähnliche dielektrische und magnetische Eigenschaften in einem definierten Frequenzbereich von Interesse besitzen, als identische Mikropartikel betrachtet, selbst wenn ihre zugrunde liegenden physikalischen Zusammensetzungen unterschiedlich sind.
Beispiele für Mikropartikelstrukturen umfassen einfache Sphären aus Latex, Metall, Glas, Halbleitern, Kunststoffen oder magnetischen Materialien, mit oder ohne kontrollierte Oberflächeneigenschaften oder Beschichtungen. Komplexere Strukturen umfassen Mikropartikel, die ein oder mehrere der folgenden Merkmale besitzen: (i) eine elektrische nicht-leitfähige Membran-ähnliche Beschichtung mit einem elektrisch leitfähigeren Inneren; (ii) eine Schicht oder ein Kern, der ein dielektrisches Material enthält, das eine dielektische Dispersion innerhalb eines Frequenzbereichs von Interesse besitzt; (iii) eine hoch leitfähige Oberflächenschicht oder ein Kern; (iv) eine Oberfläche mit einer Nettoladung, die zu den Eigenschaften der Mikropartikel durch Interaktion mit dem dielektrischen Medium beiträgt; (v) eine oder mehr Schichten oder ein Kern, der/die eine magnetische Suszeptibilität besitzen. Die vorliegende Offenlegung betrifft jeden Mikropartikeltyp, dessen dielektrische und magnetische Gesamteigenschaften spezifisch gewählt sind, so dass die Mikropartikel zur Isolierung, Identifizierung, Charakterisierung oder für eine andere Manipulation von Ziel-Analyten mit AC-elektrokinetischen oder kombinierten AC-elektrokinetischen und magnetischen Verfahren verwendet werden können.
Beispiel 2
Experimentelle Untersuchungen
Silber beschichtete Hohlglassphären wurden von Potters Industries (Valley Forge, PA) und nach Maß mit unterschiedlichen Dicken an Polystyrol von Theis Technologie (St. Louis, MO) unter Verwendung eines Mikroverkapselungsprotokolls ohne Tensid verkapselt. Die resultierende Mikropartikelstruktur war der in 1 gezeigten ähnlich. Nach Anlegen eines inhomogenen elektrischen Feldes von einer zinnenartigen parallelgeschalteten Elektrodenanordnung wurde die Mikropartikel-Manipulation durch Einchalten der Feldfrequenz und Spannung erreicht. Die dielektrische Antwort variierte in Übereinstimmung mit den Voraussagen von Gleichung 4 und 7. Die Ergebnisse bestätigen die hier dargestellten Analysen und zeigen, dass sowohl die dielektrischen Eigenschaften als auch die Leitfähigkeitseigenschaften der Polystyrolbeschichtung das Verhalten der Mikropartikel, wie erwartet, definieren. Experimente unter Verwendung dielektrischer Ferrit-Mikropartikel von Dynal Inc. (Lake Success, NY bestätigten ebenfalls, dass magnetische und DEP-Kräfte gleichzeitig für Mikropartikel-Manipulationen verwendet werden können.
Beispiel 3
Anwendungen der Technologie veränderter Mikropartikel
Der Nutzen der auf Mikropartikel basierenden Technologien für die Identifizierung und Isolierung von Ziel-Zellen ist universell. In jüngster Zeit hat die Verwendung von Mikropartikeln in der Molekularbiologie eine weite Verbreitung erlangt und verspricht ein Neubewertung von Verfahren, die in der Lebenswissenschaft Verwendung finden, wo immer das Zielen oder Erkennen einer Zelle oder eines Moleküls erforderlich ist. Noch sind gegenwärtige Versuchsansätze eindimensional und bieten eine geringe Flexibilität. Zum Beispiel ist ein paralleles Besonden mehrerer Ziele nicht möglich, Ziele können nur an eine Sammelstelle gezogen werden, so dass eine negative Auswahl (die Präferenz in einigen Sortieranwendungen) schwierig, wenn gar unmöglich ist, und ein Sortieren ist im Wesentlichen digital (Ziele können nicht gemäß der Bindungseffizienz unterschieden werden, sondern nur danach, ob sie an eine beliebige Anzahl von Mikropartikeln im Bereich von eins bis zehntausend binden oder nicht). Die hier beschriebenen Verfahren überwinden diese Beschränkungen und bieten die Möglichkeit zur gleichzeitigen Trennung mehrerer Ziele aus einer Mischung, zur Verwendung von sowohl positiver als auch negativer Auswahl, um die Reinheit der isolierten Fraktionen stark zu erhöhen und zu ermöglichen, die Ziele gemäß ihrer Bindungseffizienz zu unterscheiden (folglich können die Zellen eher gemäß der Anzahl an Antiköperbindungsstellen auf ihren Oberflächen sortiert werden als nur danach, ob sie irgendwelche Bindungsstellen besitzen oder nicht).
Unmittelbare Anwendungen für die veränderte Mikropartikel-Technologie umfassen:

1) Sortierung von Zellen gemäß der Konzentration von Oberflächenmarkierungen, einschließlich der CD-Antigene, Wachstumsfaktor-Rezeptoren und/oder Membranassoziierter Proteine oder Protein-Reste;
2) Isolierung von Blutzellsubpopulationen von hoher Reinheit;
3) Entfernung von Tumorzellen und/oder von T-Zellen aus Stammzellernten;
4) Isolierung und Identifizierung von Pathogenen aus Blut, Urin und anderen Patientenproben;
5) Isolierung und Identifizierung von Pathogenen bei öffentlichen Wasserversorgern und Betriebsanlagen von Nahrungsmittelherstellern und Nahrungsmittelverarbeitern;
6) Isolierung von subzellulären Kompartimenten, wie beispielsweise Vesikel und Organellen;
7) Isolierung und Identifizierung von Nukleinsäuren, Proteinen und anderen Biomolekülen aus biologischen Proben einschließlich solcher mit extrem kleinen Volumen;

Beispiel 4
Veränderte Mikropartikel-Technologie zur Analyttrennung und Identifizierung basierend auf Differenzierungscluster oder CD, Antigenen, die auf der Oberfläche von Zellen gefunden werden
Drei unterschiedliche Mikropartikeltypen sind so verändert, dass sie jeweils ein unterschiedliches cDEP-Verhalten, wie in 4 mit a, b und c markiert besitzen. Durch Verbinden einer Sonde für CD mit veränderten Mikropartikeln mit cDEP-Verhalten, mit a markiert, einer Sonde für CD4 an Mikropartikel mit cDEP-Verhalten, mit b markiert, und einer Sonde für CD18 an Mikropartikel mit cDEP-Verhalten, mit c markiert, können drei unterschiedliche veränderte Mikropartikel-Markierungen hergestellt werden. Eine Mischung aus diesen drei unterschiedlichen Markierungen kann dann verwendet werden, um eine Blutprobe, die viele unterschiedliche Zellsubpopulationen enthält, in einem einzigen Markierungsschritt simultan zu markieren.
Unter Anwendung eines AC-elektrokinetisch-basierten Trennverfahrens wie DEP-FFF können die drei unterschiedlichen Mikropartikeltypen und folglich CD3⁺, CD4⁺ und CD18⁺ Zellen in einem einzigen DEP-FFF Trennungsschritt (5) getrennt werden. Unter Anwendung dieses Verfahrens ist die Analyse von Zellsubpopulationen, die von anderen Subpopulationen mit Hilfe ihrer Größe, Dichte oder Oberflächen-spezifischen kapazitiven Merkmalen allein nicht zu unterscheiden sind, möglich geworden.
Bei einer DEP-FFF Trennung fraktionieren die unterschiedlichen Mikropartikeltypen in gut definierte Banden, wobei jede als ein einziger, gut definierter Elutionspeak (5) erscheint. Bei freien, ungebundenen Mikropartikel-Markierungen ist die Peakform relativ eng und scharf. Die dielektrischen Eigenschaften der Mikropartikel durch die Analytbindung gestört werden, ist allerdings die Peakform von Analyt-Markierung Komplexen breiter und/oder zeigt eine Verschiebung der Elutionszeit (6). Der Umfang dieser Störung kann von der Natur des Analyts und dem Umfang der Analytbindung abhängig sein. Es sollte bemerkt werden, dass derartige Elutionspeakänderungen als Grundlage für quantitative Verfahren für ein Analytnachweis verwendet werden können.
Beispiel 5
Veränderte Mikropartikel
Mikropartikel können mit Hilfe von selbst-assemblierter Einzelschichten (SAMs) aus Alkanthiolat auf mit Silber oder Gold metallisierten Hohlglaskernen hergestellt werden. Alkanthiole CH₃(CH₂)_nSH adsorbieren chemisch spontan auf Goldoberflächen, um Alkanthiolate zu bilden: X(CH₂)_nSH + Au⁰ → X(CH₂)_nS^–Au¹ + 1/2H₂. Die Alkanthiolate organisieren sich selbst in einem dichtgepackten, robusten einzelschichtigen Film. Derartige Filme sind umfassend charakterisiert worden und ihre isolierenden Eigenschaften nachgewiesen. Die Dicke eines Alkanthiol SAM-Films ist abhängig von der Anzahl n der Methylengruppen in der Alkyl-Kette. Die dielektrischen Eigenschaften veränderter Mikroparikel, die mit Alkanketten unterschiedlicher Länge hergestellt sind, können untersucht werden. Experimente können mit zweischichtigen Hybridmembranen durchgeführt werden, die durch Fusion von Lipidvesikeln mit selbst-assemblierten Alkanthiolat-Einzelschichten gebildet wurden. Die Wirkungen der Änderung der Alkanthiolkopfgruppe X können bestimmt werden. Zusätzlich können weitere Moleküle wie thiolierte DNA an die metallisierte Mikropartikeloberfläche adsorbiert werden. Schließlich können Protokolle für eine Verknüpfung von Protein- und Oligonukleotid-Einfangsonden an die alkanthiolierten Kopfgruppen entwickelt werden.
Beispiel 6
Nachweis von chemischen biologischen Kampfstoffen
Die hier diskutierten veränderten Mikropartikel können in einem extrem weiten Spektrum von Assays eingesetzt werden, die sich von dem Nachweis an CBW-Agentien bis zum Nachweis von medizinischen, chemischen, landwirtschaftlichen und Umweltanalyten erstrecken. Ein Mikropartikel-basierter Sandwich-Assay kann entwickelt werden, um spezifische Protein-Simulantien wie Cholera-Toxin β-Untereinheit (CTB) und Staphylokokken Enterotoxin B(SEB) nachzuweisen. Zusätzlich kann ein Mikropartikelbasierter Sandwich-Assay für den Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), ein früher Indikator eines herausgeforderten Wirtsimmunsystems, entwickelt werden. Monoklonale Antikörper, die gegen diese Proteine gerichtet sind, sind verfügbar und können für die Konstruktion von Einfang- und Markierungssonden verwendet werden. Auf veränderte Mikropartikel beruhende Sandwich-Assays können entwickelt werden, um spezifische Nukleinsäuresequenzen nachzuweisen, die sich von bakteriellen Simulantien ableiten, wie Bacillus subtilis und Escherichia coli Serotyp O157:H7. Oligonukleotidsonden, die zu in diesen Organismen gefundenen mRNA-Sequenzen komplementär sind, sind ohne weiteres zu erhalten. Der Einsatz der Dielektrophorese zur Fokussierung der Analyt-Mikropartikel Komplexe in einem dichtgepackten sphärischen Bereich kann die örtliche Analytkonzentration um mehrere Größenordnungen erhöhen, was die Notwendigkeit einer Nukleinsäure-Amplifikation überflüssig macht und die Empfindlichkeit des Assays erhöht. Bestehende Eintopf-Assays können für die PFP-Plattform angepasst werden sein. Gute Kandidaten für eine Anpassung umfassen den Bicinchoninsäure-(BCA)-Protein-Assay von Pierce und den LIVE/DEAD Lebensfähigkeit/Cytotoxizitätsassay von Molecular Probes.
Beispiel 7
Indexierung
9–15 zeigen veränderte Mikropartikel mit unterschiedlichen dielektrischen Eigenschaften. Ebenfalls sind die Reaktion versus Frequenz Beziehungen für diese Partikel gezeigt.
In einer Anwendung können diese Partikel als eine Indexierungsbibliothek verwendet sein. Insbesondere kann jeder unterschiedliche Mikropartikel hergestellt werden, um an ein unterschiedliches Analyt zu binden und dann gleichzeitig manipuliert, identifiziert, gemessen und gemäß der unterschiedlichen Antwortmerkmalen der in 9B, 10B, 11B 12B, 13B, 14B & 15B gezeigten Bibliothek nachgewiesen werden.
Beispiel 8
Sandwich-Assay
16 ist eine schematische Darstellung von Sandwich-(Doppelmarkierungs)-Assays, die zum Nachweis von Protein und mRNA in Untersuchungen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Offenlegung verwendet sein können. Wie dargestellt, können die veränderten Mikropartikel von 16 verbindende Elemente umfassen, die für eine Wechselwirkung mit Proteinen und/oder mRNA entwickelt sind. Markierungen wie Fluorophore oder biolumineszierende Markierungen können als zweite Sonde dienen.
Mit der Nutzung vorliegenden Offenlegung weiß der Fachmann zu schätzen, dass die veränderten Mikropartikel von 16 gemeinsam mit den daran befestigten Ziel- Analyten (und Markierungen) mit Hilfe von dielektrischen Kräften manipuliert werden können. Insbesondere können die Komplexe von 16 sortiert, getrennt, eingefangen, sortiert allgemein bearbeitet werden mit Hilfe der Dielektrophorese. Diese Bearbeitung kann auf einer Reaktionsoberfläche stattfinden wie die Oberfläche, die in der anhängigen United States Anmeldung, Nr. 09/249.955, eingereicht am 12 Februar 1999, und mit Titel, „Method And Apparatus for Programmable Fluidic Processing" offengelegt ist, die hier durch Quellenangabe eingefügt ist, und/oder die Feld-Fluss-Fraktionierungsvorichtung, die in United States Patent Nr. 5.993.630 offengelegt ist, das ebenfalls durch Quellenangabe eingefügt ist. Ein spezifisches Beispiel für eine Bearbeitung, die auf einer Reaktionsoberfläche erfolgen kann, ist die Verwendung der Dielektrophorese, um (a) Komplexe, wie die in 16 gezeigt sind, aus einer Lösung zu ziehen und (b) diese Komplexe auf der Reaktionsoberfläche zu bearbeiten.
Die Bildung der Komplexe von 16 kann mittels Aufzeichnung der Unterschiede in den dielektrischen Eigenschaften vor und nach der Bildung des Komplexes nachgewiesen werden. Dieser Unterschied kann mit Hilfe eines in der Technik bekannten Sensors oder Impedanzsensors oder einer in der Technik bekannten beliebigen anderen Methode zur Messung dielektrischer, elektrischer oder physikalischer Eigenschaften gemessen werden. Die Plasmonresonanz ist ein Beispiel für eine derartige Methodik.
Gemäß einer Anwendungsform der vorliegenden Offenlegung können verschiedene veränderte Mikropartikel hergestellt werden, so dass jedes Mikropartikel unterschiedliche dielektrische Eigenschaften besitzt. Zum Beispiel kann jedes veränderte Mikropartikel mit einer unterschiedlicher Dicke und/oder Zusammensetzung seiner isolierenden Schichten) hergestellt werden. Zusammen kann diese Mikropartikelgruppe eine Bibliothek bilden.
Für jedes unterschiedliche Mikropartikel der Bibliothek kann ein unterschiedliches verbindendes Element verwendet sein. Die Mikropartikel können dann einer Probe beigemischt werden, die ein oder mehr Ziel-Analyte enthält, um einen oder mehrere Komplexe zu bilden. Die dielektrischen Eigenschaften jedes Mikropartikels können von den dielektrischen Eigenschaften seines entsprechenden Komplexes mit Hilfe geeigneter Impedanzsensoren unterschieden werden. Diese Unterscheidung der dielektrischen Eigenschaften ermöglicht den Nachweis von Komplexen, falls sich einer gebildet hat. Außerdem können die dielektrischen Eigenschaften eines jeden Mikropartikels von denen eines anderen unterschieden werden. Diese Unterscheidung erlaubt die Identität der nachzuweisenden Mikropartikel zu bestimmen.
Beispiel 9
Veränderte Mikroparikel mit einer oder mehreren selbst-assemblierten Einzelschichten
17–21 zeigen mehrschichtige veränderte Mikropartikel gemäß den Anwendungsformen der vorliegenden Offenlegung.
17 zeigt ein einzelschichtiges verändertes Mikropartikel. Es umfasst einen mit einer leitfähigen Goldhülle beschichteten Polystyrolkern. Ein Isolator wie eine selbstassemblierte Einzelschicht (eine selbst-assemblierte Alkanthiol-Einzelschicht ist dargestellt) kann die leitfähige Goldhülle bedecken. Zum Beispiel kann man durch Variieren der Größe und/oder Zusammensetzung der isolierenden Schicht und/oder der leitenden Schicht die dielektrischen Eigenschaften der hergestellten Mikropartikel verändern.
In 18 wird ein zweischichtiges verändertes Mikropartikel gezeigt. Es umfasst die folgenden Schichten: einen Poylstyrolkern, eine Goldhülle, eine selbst-assemblierte Alkanthiol-Einzelschicht und eine selbst-assemblierte Phospholipid-Einzelschicht.
In 19 ist die selbst-assemblierte Phospholipid-Einzelschicht vernetzt. Beim Oxidieren vernetzen die ungesättigten Lipide und Bilden polymere Strukturen. Da sie vernetzt ist, ist die Phospholipid-Schicht, die einen hydrophilen „Kopf" und einen hydrophoben „Schwanz" besitzt, in organischen Lösemitteln stabiler.
20 und 21 zeigen zweischichtige veränderte Mikropartikel einschließlich verbindender Elemente. In 20 ist das verbindende Element eine Nukleinsäuresonde. In 21 ist es eine Proteinsonde. In jeder dieser Figuren ist das verbindende Element an den leitfähigen Goldkern gebunden. Es ist allerdings zu verstehen, dass die verbindenden Elemente an die äußere oder innere Isolierungsschicht gebunden sein können.
Mit der Nutzung dieser Offenlegung ist es offensichtlich, dass die Mikropartikel von 17–21 mehrere oder wenige Schichten umfassen können. Zum Beispiel können unter der Goldhülle (die nicht fest zu sein braucht) und der gezeigten SAM-Schichten) eine oder mehrere zusätzliche SAMs oder andere Schichten zugefügt sein. Eine oder mehrere Schichten können vernetzt sein und eine oder mehrere Markierungen können an die verbindenden Elemente angefügt sein.
Außerdem kann man verstehen, dass die leitfähige Goldhülle von 17–21 durch beliebige geeignete Leiter, einschließlich leitfähiger Polymere oder ähnlicher, ersetzt sein kann. Zusätzlich kann der Polystyrol-Kern durch ein beliebiges anderes geeignetes Material ersetzt sein.
Beispiel 10
Überlegungen zur Herstellung
Die hier offengelegten Alkanthiolate organisieren sich selbst zuverlässig zu robusten, dichtgepackten einzelschichtigen Filmen reproduzierbarer Dicke. Zusätzlich können biomimetische doppelschichtige Hybridmembranen (HBMs) durch Fusion von Phospholipid-Vesikeln mit veränderten Mikropartikelkernen, die bereits mit Alkanthiolat-Einzelschichten beschichtet worden sind, gebildet werden. Die Dicke der isolierenden Schicht, die den Kern eines veränderten dielektrischen Mikropartikel umgibt, ist sowohl von der Anzahl an Methylengruppen in der Alkylkette des Alkanthiol SAM-Films als auch von der Anzahl an Methylengruppen in dem Lipid-Schwanz des Phospholipids abhängig, das für die Bildung der doppelschichtigen Hybridmembran verwendet wurde.
Deshalb kann man eine Bibliothek von Partikeln mit isolierenden Schichten unterschiedlicher Dicke und unterschiedlichen dielektrischen Eigenschaften durch einfache Veränderung der Länge der Kohlenwasserstoffkette in den Alkanthiolaten und Phospholipid-Schichten der hier dargestellten Mikropartikel herstellen.
Gold beschichtete Polystyrol-Mikropartikel, die im Durchmesser 9,6 μm mit einer konstanten Dichte von 2,2 g/cm³ (Variationskoeffizient < 5%) einheitlich sind, können von Dynal Biotech bezogen werden. Die Erfinder haben vier unterschiedliche Typen an veränderten dielektrischen Mikropartikeln durch Bildung selbst-assemblierter Einzelschichten aus Alkanthiolat und Phospholipid auf den Gold beschichteten Polystyrolkernpartikeln konstruiert. Veränderte Mikropartikel mit einer relativ dünnen isolierenden Schicht sind durch Beschichten des Kernpartikels mit einer einzigen Alkanthiolat-Schicht hergestellt worden aus:

(i) Nonylmercaptan [CH₃(CH₂)₈-SH], um eine isolierende C₉ Schicht zu ergeben, oder
(ii) Octadecylmercaptan [CH₃(CH₂)₁₇-SH], um eine isolierende C₁₈ Schicht zu ergeben.

Veränderte Mikropartikel mit dickeren isolierenden Schichten sind durch Bildung einer zweiten isolierenden Einzelschicht aus DMPC [1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3- phosphocholin]-phospholipid über der Alkanthiolat-Schicht folgendermaßen hergestellt worden:

(iii) Nonylmercaptan plus DMPC, um eine C₂₃ isolierende Schicht zu ergeben, oder
(iv) Octadecylmercaptan plus DMPC, um eine C₃₂ isolierende Schicht zu ergeben.

Jede Probe veränderter dielektrischer Mikropartikel wurde durch ein erstes Waschen der Gold-beschichteten Kern-Mikropartikel in 10 ml absolutem Ethanol in einem Glasröhrchen, um die Goldoberfläche der Mikropartikel zu reinigen, hergestellt. Nach mehreren Minuten Mischen wurden die Mikropartikel mittels Zentrifugation mit Hilfe einer Tischzentrifuge sedimentiert, das Ethanol wurde abdekantiert und die gewaschenen Mikropartikel wurden mit 10 ml 1 mM Nonyl- oder Octadecylmercaptanlösung in absolutem Ethanol vereint. Diese Suspension wurde vorsichtig mindestens 12 Stunden gemischt, um die Bildung einer gut organisierten, hochintegrierten, selbst-assemblierten Einzelschicht (SAM) sicherzustellen.
Der Adsorptionsprozess für mäßige (1mM) Alkanthiol-Konzentrationen ist durch die schnelle Iniationsphase gekennzeichnet, während der die Alkanthiol-Schichtdicke auf 80–90% ihres Maximums innerhalb weniger Minuten wächst. Dieser Initialphase folgt eine langsamere Periode, die mehrere Stunden dauert, während der die Alkanthiolat-Schicht ihre endgültige Stärke erreicht. Es ist im Fachgebiet berichtet worden, dass Alkanthiolat-Einzelschichten auf Gold an der Luft oder im Kontakt mit flüssigem Wasser oder Ethanol bei Raumtemperatur unbegrenzt stabil zu sein scheinen. Die Alkanthiolat-beschichteten Mikropartikel wurden mittels Zentrifugation wiedergewonnen, zweimal in absolutem Ethanol und zweimal in dreifach-destilliertem Wasser gewaschen und bei 4°C in 1 ml dreifachdestilliertem Wasser aufbewahrt.
Die Phospholipid-Schicht wurde über der Alkanthiol-Schicht durch Vereinen der Alkanthiolat-beschichteten Mikropartikel mit wässrigen Suspensionen von kleinen unilamellaren DMPC-Vesikeln gebildet. Die DMPC-Vesikel wurden Einfüllen von 1 ml einer 20 mg/ml DMPC in Chloroform-Lipidlösung in einen Kolben mit runden Boden und Verdampfen des Lösemittels in mehreren Stunden mit Hilfe eines Vakuumrotationsverdampfers hergestellt. Das getrocknete Lipid wurde in 50 ml Isopropanol resuspendiert und in 10 ml dreifach-destilliertem Wasser während der Verwirbelung injiziert, um eine Suspension großer multilamellarer Vesikel zu bilden. Die Lösung mit den großen Vesikeln wurde in einem Ultraschallbad mehrere Minuten beschallt, um die großen Vesikel in kleinere 20–100 nm unilamellare Vesikel zu zerreißen. Diese 10 ml Suspension kleiner Vesikel wurde mit 10 mg Alkanthiolat-beschichteten Kügelchen vereint und vorsichtig 30 Minuten bei Raumtemperatur gemischt. Die Alkanthiolat-beschichteten Mikropartikel wurden mittels Zentrifugation wiedergewonnen, zweimal in dreifach-destilliertem Wasser gewaschen und in dreifach-destilliertem Wasser aufbewahrt.
Beispiel 11
Testen der veränderten Mikropartikel
Die Analyse des dielektrischen einzelhülligen Modells sagt eine eindeutige Beziehung zwischen der Dicke der äußeren isolierenden Hülle und den dielektrischen Eigenschaften eines veränderten dielektrischen Mikropartikels voraus. Für veränderte Mikropartikel einer geeigneten Zusammensetzung aus dünnen-isolierenden-Schicht-über-einleitfähiges-Inneres wird vorausgesagt, dass sie eine starke negative Dielektrophorese bei Frequenzen zwischen 10²–10⁴ Hz erfahren. In diesem Frequenzbereich wäre das elektrische Feld nicht in der Lage, die äußere isolierende Hülle zu durchdringen–aus dielektrischer Sicht besäße das Mikropartikel eine hohe AC-Impedanz und würde relativ unpolarisierbar erscheinen. Bei Frequenzen im Bereich von 10⁷–10⁹ Hz wird vorausgesagt, dass die veränderten Mikropartikel eine starke positive Dielektrophorese zeigen. In diesem Frequenzbereich würde das elektrische Feld die dünne äußere isolierende Hülle über eine kapazitive Kopplung durchdringen und die Kerneigenschaften würden dominieren–dielektrisch gesehen, der Mikropartikel besäße eine geringe AC-Impedanz und würde hoch polarisierbar erscheinen.
In dem 10⁵–10⁶ Hz Übergangsbereich wird vorausgesagt, dass eine steigende Frequenz mit einer Veränderung der dielektrischen Kraft korreliert, die auf das veränderte Mikropartikel von abnehmend negativ bis ansteigend positiv wirkt. Bei der Übergangsfrequenz, f_c, ist die dielektrophoretischen Nettokraft, die auf das Mikropartikel wirkt, null–bei Frequenzen unter f_c erfahren die Partikel eine negative Dielektrophorese und bei Frequenzen über f_c, erfahren die Partikel eine positive Dielektrophorese. Eine zunehmende Dicke der isolierenden äußeren Hülle korreliert mit einem Anstieg in der Übergangsfrequenz. Diese Beziehung zwischen der Dicke der isolierenden Hülle und der Übergangsfrequenz ist durch folgende Beziehung gegeben:
und
wo C_mem die spezifische Membrankapazität (d.h. auf die Hüllfläche normalisiert) ist, σ_s die Leitfähigkeit des Suspensionsmedium ist, R der Radius des veränderten Mikropartikels ist, f_c die Übergangsfrequenz ist, ε₀ die Permittivität des freien Raums ist, ε_mem die Prmittivität der isolierenden Schicht und d die Dicke der isolierenden Schicht ist. Eine Kombination dieser Gleichungen ergibt die folgende Beziehung:
Gemäß der oberen Gleichung ergibt die inverse Steigung einer Kurve von f_c gegen ☐_s die annähernd spezifische Membrankapazität für einen gegebenen veränderten Mikropartikeltyp. Des weiteren sollte die Steigung einer derartigen Kurve mit zunehmender Membrandicke zunehmen.
Untersuchungen der dielektrophoretischen Übergangsfrequenz wurden von den Erfindern durchgeführt, um festzustellen, ob die vier Typen veränderter dielektrischer Mikropartikel (Außenhülle selbst-assemblierte isolierende Einzelschicht aus C₉ oder C₁₈ Alkanthiol oder C₉ oder C₁₈ Alkanthiol + C₁₄ Phospholipid) die vorhergesagte Korrelation zwischen der Dicke der isolierenden Hülle und der Übergangsfrequenz zeigen. Für die dielektrophoretischen Untersuchungen wurden die veränderten dielektrischen Mikropartikel in einem DEP-Puffer, der 8,5% (w/v) Sucrose, 0,3% (w/v) Dextrose enthielt, suspendiert. Die elektrische Leitfähigkeit des Puffers wurde mit 300 mM EDTA (mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt) eingestellt. Aliquote der Suspension veränderter Kügelchen wurden in einem offenen Reservoir über parallele Elektroden (50 μm Spur–50 μm Lücke) der Gold-auf-Glass Konstruktion platziert und wurde mit 1–10 Volt Peak-zu-Peak bei Frequenzen zwischen 1 kHz und 100 kHz mit Energie versorgt, um inhomogene elektrische Felder für die dielektrophoretische Manipulation zu erzeugen. Die dielektrophoretische Manipulation wurde durch Schalten der Feldfrequenz erreicht und die dielektrophoretische Übergangsfrequenz wurde bestimmt.
Wie in 22 gezeigt, zeigen die veränderten Mikropartikel eine eindeutige Abhängigkeit von der Dicke der isolierenden Außenhülle, die durch die Wahl eines Alkanthiols und Phospholipids mit geeigneter Länge der Kohlenstoffkette vermittelt wird. Des weiteren ist der y-Abschnitt nahezu null, was darauf hinweist, dass die Leitfähigkeit der isolierenden Schicht gering ist und die selbst-assemblierten Einzelschichten eine robuste, einheitliche isolierende Schicht bereitstellen.
Lipophile Moleküle wie das porenbildene Protein Mellitin kann in die isolierende Schicht eingebaut sein. Zusätzlich kann man Sonden wie thiolierte Nukleinsäuren und Proteine auf die Goldoberfläche des veränderten Mikropartikel-Kerns adsorbieren und Oligonukleotid- und Proteineinfangsonden können mit den Alkanthiolat- und Phospholipid-Molekülen verbunden werden.
REFERENZEN

Abidor, Li, Sowers, "Membrane electrofusion yeilds in membrane fractions obtained with a colloid-osmotic hemolysis and electrohemolysis procedure," Bioelectrochem. Bioenerget. 34, 31–37, 1994.
Arnold, Zimmermann, "Electro-rotation: developments of a technique for dielectric measurements on individual cells and particles," J. Electrost 21 151–-191, 1988.
Arnold, Zimmermann, "Rotation of an isolated cell in a rotating eledric field," Naturwissenschaften 69 297–300, 1982.
Barany, Proc. Natl. Acad Sci. USA 88: 189, 1991.
Dutton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 3392–3396, 1979.
Elshabini, Barlow, in Thin Film Technology Handbook, McGraw-Hill, New York, Ch 1, 1998.
Fuhr, "Über die rotation dielektrischer körper in rotierenden feldern," PhD Dissertation Humboldt-Universität, Berlin Chap. 3, pp24–53, 1385.
Fuhr, Rosch, Müller, Dressler, Goring, "Dielectric spectroscopy of chloroplasts isolated from higher plants – characterization of the double-membrane system," Plant Cell Physiol. 31, 975–985, 1990.
Gascoyne, Huang, Hughes, Wang, Pethig, Becker, "Manipulations of biological cells using travelling-wave dielectrophoresis," Proc. 16th LEEE: Eng. Med. Biol. Soc. 792–-973, 1994a.
Gascoyne, Pethig, Burt, Becker, "Membrane changes accompanying the induced differentiation of friend murine erythroleukemia cells studied by dielectrophoresis," Biochim. Biophys. Acta 1149, 119–126, 1993.
Gascscoyne, Wang, Becker, "Numerical analysis of the influence of experimental conditions on the accuracy of dielectric parameters derived from electrorotation measurements," Bioelectrochem. Bioenerg. 36, 115–125, 1994b.
Gefter et al., Somatic Cell Genet, 3: 231–236, 1977.
Gellert, Küstner, Hettwich, Kästner, in The VNR Concise Encyclopedia of Mathematics (Van Nostrand Reinhold, New York) pp 420–424, 1977.
Geohegan et al., Immunol. Comm 7: 1, 1978.
Gimsa, Marszalek, Loewe, Tsong, "Dielectrophoresis and electrorotation of neurospora slime and murine myeloma cells." Biophys. J. 60, 749–760, 1991.
Coding, 1986, In Monocional Antibodies: Principles and Practice, 2d ed., Orlando, Fla., Academic Press, 1986, pp. 60–61, 656, and 71–74.
Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874–1878, 1990.
Hagedorn, Fuhr, Müller, Gimsa, "Travelling wave dielectrophoresis of microparticles," Elektrophoresis 13: 49–54, 1992.
Hölzel, Lamprecht, "Dielectric properties of yeast cells as determined by electrorotation," Biochim. Biophys. Acta 1104, 195–200, 1992.
Hölzel, Lamprecht, Mischel, "Characterisation of cells by dielectrophoretic techniques," in Physical Charactertization of Biological Cells, eds. Schütt, W., Klinkmann, H., Lamprecht, I. & Wilson, T. (Verlag Gesundheit Gmh, Berin), 1991.
Hu, Arnold, Zimmermann, "Alterations in the electrical properties of T and B lymphocyte membranes induced by mitogenic stimulation. Activation monitored by electro-rotation of single cells," Biochim. Biophys. Acta 1021, 151–200, 1990.
Huang, Hölzel, Pethig, Wang, "Differences in the AC electrodynamics of viable and non-viable yeast cells determined through combined dieletrophoresis and elektrorotation studies," Phys. Med. Biol. 37, 1499–1571, 1992.
Huang, Wang, Tame, Pethig "Electrokinetic behaviour of colloidal particles in travelling electric fields: studies using yeast cells," J. Phys. D: Appl. Phys. 26: 1528–1535, 1993
Irimajiri, Hanai, Inouye "A dielectric theory for "multi-stratified shell" model with its application to a lymphoma cell," J. Theor. Biol. 78 251–269, 1979.
Ithakissios et al., Clin. Chem., 23, 2072–2079, 1977.
Jones, Electromechanics of Particles, Cambridge University Press, Cambridge, 1995.
Jones, Kallio, "Dielectrophoretic levitation of spheres and shells," J. Electrostat. 6 207–224, 1979.
Kaler and Jones, "Dielectrophoretic spectra of single cells determined by feedback-controlled levitation," Biophys. J. 57: 173–182. 1990.
Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 6: 511–519, 1976.
Kohler and Milstein, Nature, 256: 495–497, 1975.
Landergren et al., Science 241: 1077, 1988.
Lim, in Biomedical Applications of Microencapsulation, CRC Press, Boca Raton, 1984.
Lomeli et al., Clin. Chem. 35: 1826, 1989.
Margessi et al., Clin. Chim. Acta., 89, 455–460, 1978.
Masud, Washizu, Kawabata, "Movement of blood-cells in liquids by nonuniform traveling fields," IEEE Trans. Ind. Appl. 24: 217–223, 1988.
Meuse, C. W., Fu, J., Conner, J. T, Plant, A. L. (1998.) Construction of hybrid bilayers in air. Biophys. J. 74. 1388.)
Meuse, C. W., Niaura, G., Lewis, M. L., Plant, A. L. (1998) Assessing the molecular structure of supported hybrid bilayer membranes with vibrational spectroscopies. Langmuir 14, 1604.,
Milday et al., FEBS, 170, 232–238, 1984.
Molday et al., J. Immunol. Meth., 52, 353–367, 1982.
Molday et al., Nature, 268, 437, 1977.
Müller, Gerardino, Schnelle, Shirley, Bordoni, De Gasperis, Leoni, Fuhr, J Phys 29: Appl Phys 29: 340, 1996.
Nye of al., Clin. Chim. Acta., 63, 387–396, 1976.
Oldenburg et al., "Nanoengineering of optical resonances," Chemical Physics Letters 288 (1988) pp. 243–247 (May 1998).
Patterson et al., Science 260: 976, 1993.
Pethig, Dielectric and Electronic Properties of Biological Materials, J. Wiley & Sons, New York, 1979.
Pethig, Markx, Trends in Biotech 15: 426, 1997.
Plant, A. L. Self assembled phospholipid/alkanethiol biomimetic bilayers on gold. (1993) Langmuir 9: 2764-2767. [Online abstract]
Plant, A. L., Guegetchkeri, M., Yap, W. (1994) Supported phospholipid/alkanethiol biomimetic membranes: Insulating properties. Biophys, J. 67: 1126–1133. [Online abstract]
Plant, A. L, Gueguetchkeri, M. (1994) Planar phospholipid bilayer membranes formed form self-assembled alkanethiol monomers. Proceedings of the 13th Southern Biomedical Engineering Conference.
Plant, A. L., Brigham-Burke, M., O'Shannessy (1995) Phospholipid/alkanethiol bilayers for cell surface receptor studies by surface plasmon resonance. Anal. Biochem. 226: 342–348. [Online abstract]
Pohl in Dielectrophoresis, Cambridge Universiy Press, Cambridge, 1978.
Rao, N. M., Plant, A. L., Hui, S. W:, Silin, V., Wight, S. (1997) Characterization of biomimetic surfaces formed from cell membranes. Biophys. J. 73: 3066–3077. [Online abstract]
Rosenweig, Scien. Amer., 252, 10, 136–194 (1983).
Saiki of al., Science 230: 1350, 1985.
Saiki et al., Science 239: 487, 1988.
Sauer, "Interaction-forces between microscopic particles in an external electromagnetic field," in Interactions Between Electromagneric Fields and Calls ed A Chiabrera of al (New York: Plenum) pp 181.202, 1985.
Sukhorukov, Arnold, Zimmermann, "Hypotonically induced changes in the plasma membrane of cultured mammalian cells," J. Membr. Biol. 132, 27–40, 1893.
United States Patent No. 5,993,630.
United States Patent Application No. 09/249,955.
Walker et al., Nucl. Acids Res. 20: 1691, 1992.
Wang, Huang, Becker, Gascoyne, "A Unified theory of dielectrophoresis and travelling wave dielectrophoresis," J. Phys. D: Appl. Phys. 27, 1571–1574, 1994a.
Wang, Huang, Burt, Markx, Pethig, "Selective dielectrophoretic confinement of bioparticles in potential energy wells," J. Phys. D: Appl. Phys. 26, 1278–1285, 1993.
Wang, Huang, Gascoyne, Becker, Hölzei, Pethig, "Changes in Friend murine erythroleukaemia cell membranes during induced differentiation determined by electrorotation," Biochim. Biophys. Acta 1193, 330–344, 1994c.
Wang, Hughes, Huang, Becker, Gascoyne, "Non-uniform spatial distributions of both the magnitude and phase of AC electric fields determine dielectrophoretic forces," Biochim. Biophys. Acta. 1243: 185–194, 1994b.
Wang, Vykoukal, Becker, Gascoyne "Separation of polystyrene microbeads using DEP/G-FFF," Biophysics Journal 74: 2689, 1998.
Widder of al., Clin. Immunol. and Immunopath., 14, 395–400, 1979.
Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11769, 1992.
Wu, Sjodin, Sowers, "Distinct mechanical relaxation components in pairs of erythrocyte ghosts undergoing fusion," Biophys. J. 66, 114–119, 1994.

Claims

Dielektrisch hergestellter Mikropartikel, umfassend einen leitfähigen Kern und eine isolierende, selbst-assemblierte Einzelschicht, die den leitfähigen Kern ummantelt, wobei die Einzelschicht eine Dicke besitzt, die ausreicht, um den Mikropartikel durch Dielektrophorese manövrierfähig zu machen.
Dielektrisch hergestellter Mikropartikel gemäß Anspruch 1, wobei der leitfähige Kern einen Isolator umfasst, der mit einer leitenden Hülle ummantelt ist.
Dielektrisch hergestellter Mikropartikel gemäß Anspruch 1, wobei der leitfähige Kern Gold, Silber, Platin oder Kupfer umfasst.
Dielektrisch hergestellte Mikropartikel-Markierung zur Bindung an einen Analyten, wobei die Mikropartikel-Markierung einen dielektrisch hergestellten Mikropartikel umfasst, der einen leitfähigen Kern, eine isolierende Schicht, die den leitfähigen Kern ummantelt, wobei die isolierende Schicht eine Dicke besitzt, die ausreichend ist, um die Mikropartikel-Markierung durch Dielektrophorese manövrierbar zu machen, und ein verbindendes Element umfasst, das an den dielektrisch hergestellten Mikropartikel gekoppelt ist.
Dielektrisch hergestellte, durch Dielektrophorese manövrierfähige Mikropartikel-Markierung, umfassend einen isolierenden Kern, der mit einer leitenden Hülle ummantelt ist, eine erste selbst-assemblierte Einzelschicht, welche die leitende Hülle ummantelt und eine zweite selbst-assemblierte Einzelschicht, welche die erste selbst-assemblierte Einzelschicht ummantelt.
Verfahren zum Nachweis eines Komplexes innerhalb einer Probe, wobei das Verfahren das Mischen der Probe mit einem dielektrisch hergestellten Mikropartikel umfasst, der eine erste dielektrische Eigenschaft besitzt und einen leitfähigen Kern, eine isolierende, selbst-assemblierte Schicht, die eine Dicke besitzt, die ausreicht, um den Mikropartikel durch Dielektrophorese manövrierfähig zu machen, und ein verbindendes Element umfasst; wobei das Verfahren weiterhin die Assoziierung des dielektrisch hergestellten Mikropartikels mit einem Ziel-Analyten umfasst, so dass der Komplex ausgebildet wird, wobei der Komplex eine zweite dielektrische Eigenschaft besitzt; und wobei das Verfahren weiterhin den Nachweis des Komplexes mittels der Unterscheidung zwischen der ersten und zweiten dielektrischen Eigenschaft umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die Probe Blut, Urin, Speichel, amniotische Flüssigkeit, eine Biopsie, eine Zellsuspension, ein Zelllysat, eine Chromatographiefraktion oder konditionierte Medien umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die Probe Wasser, Nahrungsmittel, Nahrungsmittelverarbeitungsprodukte, Nahrungsverteilungsprodukte, Mineralien oder Erz umfasst.
Verfahren zur Manipulation eines Komplexes in einer Probe, wobei das Verfahren das Mischen der Probe mit einem dielektrisch hergestellten Mikropartikel umfasst, der einen leitfähigen Kern, eine isolierende, selbst-assemblierte Schicht, die den leitfähigen Kern ummantelt und eine Dicke besitzt, die ausreicht, um den Mikropartikel durch Dielektrophorese manövrierfähig zu machen, und ein verbindendes Element umfasst; wobei das Verfahren weiterhin wobei das Verfahren weiterhin die Assoziierung des dielektrisch hergestellten Mikropartikels mit dem Ziel-Analyten umfasst, so dass der Komplex ausgebildet wird; und wobei das Verfahren weiterhin die Manipulation des Komplexes mittels Dielektrophorese umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Probe Blut, Urin, Speichel, amniotische Flüssigkeit, eine Biopsie, eine Zellsuspension, ein Zelllysat, eine Chromatographiefraktion oder konditionierte Medien umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Probe Wasser, Nahrungsmittel, Nahrungsmittelverarbeitungsprodukte, Nahrungsverteilungsprodukte, Mineralien oder Erz umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Manipulation Sortierung umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Manipulation Auftrennung umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Manipulation Aufreinigung der Probe umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Manipulation Einfangen umfasst.
Verfahren zur Identifizierung wenigstens eines Komplexes innerhalb einer Probe, wobei das Verfahren das Mischen der Probe mit einer Vielzahl von dielektrisch hergestellten Mikropartikeln umfasst, wobei jeder Mikropartikel eine unterschiedliche dielektrische Eigenschaft besitzt, welche die Vielzahl von dielektrisch hergestellten Mikropartikeln mit wenigstens einem Ziel-Analyten assoziiert, so dass wenigstens ein Komplex ausgebildet wird; und wobei das Verfahren weiterhin die Identifizierung des wenigstens einen Komplexes mittels Unterscheidung der unterschiedlichen dielektrischen Eigenschaften umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei jeder aus der Vielzahl von dielektrisch hergestellten Mikropartikeln einen leitfähigen Kern und eine isolierende Schicht umfasst.
Dielektrisch hergestellter Mikropartikel gemäß Anspruch 1 oder dielektrisch hergestellte Mikropartikel-Markierung gemäß Anspruch 5, wobei die selbst-assemblierte Einzelschicht eine selbst-assemblierte Alkanthiol-Einzelschicht umfasst.
Dielektrisch hergestellter Mikropartikel gemäß Anspruch 1 oder dielektrisch hergestellte Mikropartikel-Markierung gemäß Anspruch 5, wobei die selbst-assemblierte Einzelschicht bzw. die zweite selbst-assemblierte Einzelschicht eine selbst-assemblierte Phospholipid-Einzelschicht umfasst.
Dielektrisch hergestellte Mikropartikel-Markierung gemäß Anspruch 19, wobei der isolierende Kern Polystyrol umfasst.
Dielektrisch hergestellter Mikropartikel gemäß Anspruch 1 oder dielektrisch hergestellte Mikropartikel-Markierung gemäß Anspruch 5, weiterhin umfassend ein verbindendes Element, das an den Mikropartikel bzw. die Markierung gekoppelt ist.
Dielektrisch hergestellte Mikropartikel-Markierung gemäß Anspruch 21, weiterhin umfassend eine Markierung, die an das verbindende Element gekoppelt ist.
Mikropartikel-Markierung gemäß Anspruch 22, wobei die Markierung eine fluoreszierende Markierung, ein Chromophor, eine lumineszierende Markierung oder ein Enzym umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 6, 9 oder 17, wobei die isolierende Schicht wenigstens eine selbst-assemblierte einzelschichtige Schicht umfasst.
Dielektrisch hergestellter Mikropartikel gemäß Anspruch 21, dielektrisch hergestellte Mikropartikel-Markierung gemäß Anspruch 4 oder 5 und Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 9, wobei das verbindende Element einen Antikörper, einen Einzelkettenantikörper, ein Peptid, ein Hormon, eine Nukleinsäuresequenz, einen therapeutischen Wirkstoff, ein Antibiotikum oder eine chemisch reaktive Verbindung umfasst.