DE60026284T2

DE60026284T2 - Nukleinsäurefragmente zur identifizierung von dechlorierenden bakterien

Info

Publication number: DE60026284T2
Application number: DE60026284T
Authority: DE
Inventors: R. Edwin Hockessin HENDRICKSON; C. Richard Wilmington EBERSOLE
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1999-04-15
Filing date: 2000-04-13
Publication date: 2006-10-12
Anticipated expiration: 2020-04-14
Also published as: DE60026284D1; WO2000063443A2; WO2000063443A3; EP1224323B1; MXPA01010425A; CA2384332A1; EP1224323A2; ATE318933T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Gegenstand der Erfindung ist das Gebiet der Molekularbiologie und Mikrobiologie. Es wurden spezifischer 16S-rRNA-Regionen aus Dehalococcoides ethenogenes identifiziert und isoliert, die die Identifikation von dechlorierenden Bakterienstämmen ermöglichen. Sonden und Primer, die den einzigartigen Regionen entsprechen, wurden zur Ermöglichung der schnellen Identifikation der Dechlorierer konstruiert.
HINTERGRUND
Die Grundwasserverschmutzung durch halogenierte und insbesondere chlorierte Lösungsmittel stellt ein weltweites Problem dar, das hauptsächlich mit Industrieanlagen, in denen diese Lösungsmittel durch falsche Handhabung oder unsachgemäße Entsorgung mit dem Boden in Kontakt gebracht werden, assoziiert ist. Die häufigsten und problematischsten Verbindungen stellen die chlorierten Ethylene (Ethene), wie zum Beispiel Tetra-, Tri- oder Dichlorethylen, dar. Kohlenstofftetrachlorid, Chloroform und Methylenchlorid gelten auch als sich überall ausbreitende Schmutzstoffe. Die zu Bedenken Anlass gebenden Gründe sind grundlegend dreifacher Art. Erstens, die meisten dieser Lösungsmittel sind in Wasser wenig löslich und neigen dazu, an den Bodenpartikeln zu kleben. Dies führt zu festhaftenden unterirdischen Lösungsmittelfahnen, die mithilfe der standardmäßigen „Pump-and-Treat"-Technologie nicht ohne weiteres entfernt werden können (Biswas, N., et. al., Water Environ. Res. 64,170,10,1 (1992); Hutter, G. M., et. al., Water Environ. Res. 64, 69, (1992)). Zweitens, die Toxikologie vieler chlorierter Lösungsmittel deutet darauf hin, dass diese Verbindungen karzinogen und für spezifische Organe, wie zum Beispiel die Leber und Nieren, schädigend sein können (Price, P. S., Memo of the U.S. Environmental Protection Agency, Office of Water, Washington, D.C. (1985); Vogel, T. M., Environ. Sci. Technol., 21, 722, (1987)). Schließlich, unter in vielen grundwasserführenden Schichten und unterirdischen Milieus gefundenen Bedingungen werden chlorierte Ethylene und Methane nur sehr langsam biologisch abgebaut. Diese Faktoren führen zu dem Ergebnis, dass chlorierte Lösungsmittel langlebige, potenziell gefährliche Grundwasserschmutzstoffe darstellen.
Derzeit stehen zwei Ansätze zur in situ-Entfernung von Organohalogen-Schmutzstoffen zur Verfügung. Der erste Ansatz besteht aus dem standardmäßigen „Pump-and-Treat"-Verfahren, im Rahmen dessen das Grundwasser zum physikalischen Stripping des Kontaminanten aus dem Wasser an die Oberfläche gepumpt wird. Für chlorierte Lösungsmittel stellt dies mehr ein Containment-Verfahren als eine Sanierungstechnologie dar, obwohl dieses Verfahren bei ausreichender Zeit (in der Regel Jahrzente bis Jahrhunderte) die meisten Schmutzstoffe einfangen könnte. Der andere Ansatz ist biologischer Art und macht sich Mikroorganismen zur enzymatischen Umwandlung der halogenierten organischen Stoffe zunutze. Der biologische Ansatz kann für eine bestimmte Stelle indigene Mikroorganismen nutzen, wobei der Sanierungsvorgang primär darin besteht, Zugaben an der kontaminierten Stelle vorzunehmen, die das Wachstum des gewünschten Mikroorganismus fördern. Als Alternative können nicht indigene Mikroorganismen an einer kontaminierten Stelle mit den für das Wachstum erforderlichen notwendigen Meliorationen eingeführt werden.
Es sind eine Anzahl an Organismen zur Dechlorierung persistenter chlorierter Schmutzstoffe bekannt. So wurde zum Beispiel gezeigt, dass Dehalobacter restrictus und Dehalospirillium multivorans chlorierte Ethene teilweise dechlorieren (Kochian et. al., Plant Mol. Biol. 46:237 (1995); Delhaize et al., Plant Physiol. 107:315 (1995)). Außerdem lehrt WO 9849106 die Verwendung eines hydrogenotrophen Bakteriums (Dehalococcoides ethenogenes) in einer Vorrichtung für die Dekontaminierung von chlorierte Verbindungen enthaltendem Abwasser. Ebenso wurde gezeigt, dass Dehalococcoides ethenogenes die vollständige Dechlorierung von Tetrachlorethen und Trichlorethen zu Ethen bewirkt [Freedman et al, Appl. Environ. Microbiol. 55:2144 (1989)] und Maymó-Gatell et al. (Science, 176:1568 (1997)) haben einen D. ethenogenes-Stamm isoliert, der zur respiratorisch-reduktiven Dechlorierung von Tetrachlorethen direkt zu Ethen mit Wasserstoff als Elektronendonator fähig ist. Die Analyse der 16S-rRNA des Organismus von Maymó-Gatell wies ein einzigartiges Profil auf, das zur Identifikation von Organismen mit ähnlichen Reduktionsfähigkeiten verwendet werden könnte.
Der erste Schritt bei der Nutzung der Dechlorierungseigenschaften der vorstehend identifizierten Organismen ist schnell und stellt eine genaue Identifkation bereit. Ein Identifikationsverfahren beinhaltet die Verwendung von DNA-Sonden (siehe zum Beispiel in WO 89/06704, US-Patent Nr. 4,851,330 und US-Patent Nr. 5,574,145). Viele solcher Sonden leiten sich von der Beobachtung her (siehe Woese, Scientific American 244 (6) 1981 zum Überblick), dass Teile der 16S- und 23S-ribosomalen RNA-Sequenzen (rRNA-Sequenzen) in verschiedenen Spezies variieren. Diese Information wurde initial für phylogenetische Analysen verwendet, sie wurde in jüngerer Zeit jedoch auch für auf DNA-Sonden basierende Verfahren zur Identifikation von Organismen eingesetzt. Der Nutzen eines solchen Verfahrens basiert auf der Konservierung der Nukleinsäuresequenz in den rRNA-Sequenzen.
Jede der Zellen aller Lebensformen, außer Viren, enthalten Ribosomen und folglich ribosomale RNA. Ein Ribosom enthält drei separate einsträngige RNA-Moleküle, nämlich ein großes Molekül, ein Molekül mittlerer Größe und ein kleines Molekül. Die Größe der zwei größeren rRNA-Moleküle variiert in verschiedenen Organismen. Ribosomale RNA stellt ein direktes Genprodukt dar und wird durch das rRNA-Gen kodiert. Diese DNA-Sequenz wird als eine Matrize zum Synthetisieren von rRNA-Molekülen verwendet. Für jede der ribosomalen RNA-Untereinheiten existiert ein separates Gen. Multiple rRNA-Gene kommen in den meisten Organismen vor, wobei viele höhere Organismen sowohl nukleare als auch mitochondrale rRNA-Gene enthalten. Zahlreiche Ribosomen sind in allen Zellen aller Lebensformen anwesend. In einer typischen Zelle bestehen ca. 85–90 % der Gesamt-RNA aus rRNA. Ein Bakterium, wie zum Beispiel E. coli enthält ca. 10⁴ Ribosomen pro Zelle. Ein großer Teil der Sequenzen in rRNA ist über die breiten evolutionären Grenzen hinweg hoch konserviert, bestimmte Regionen sind jedoch hoch variabel und können zur Vornahme feiner Unterschiede zwischen den Spezies, Subspezies und Stämmen verwendet werden (US-Patent Nr. 5567587). 16S-rDNA wurde zum Nachweis und zur Isolation dechlorierender Bakterien verwendet. Pulliam et al. (Applied and Environmental Microbiology, 64, 3359, (1998)) haben zum Beispiel auf der Basis von 16S-rDNA eine dechlorierende Bakterienpopulation charakterisiert; Friedrich et al. (Applied and Environmental Microbiology, 65,283, (1999)) haben eine Anzahl an Trichlorbenzen-Degradierern unter Verwendung einer kleinen Untereinheit von rRNA-Genen isoliert; und Horvais A., ( FR 2733754 ) hat 16S-RNA-Fragmente aus Clavibacter michiganensis (einem Dechlorierer) isoliert.
Das Problem, dem man begegnen muss, besteht deshalb in der Identifikation einer einzigartigen 16S-rDNA-Sequenz in einem Bakterium, das zur Dechlorierung persistent chlorierter Verbindungen zur Identifikation und der letztendlichen Verbesserung dieses Bakteriums zur Sanierung einer kontaminierten Stelle fähig ist. Die Anmelder haben das angegebene Problem durch Bereitstellung eines Sets von Nukleinsäuresequenzen, die für verschiedene Stämme von Dehalococcoides ethenogenes einzigartig sind, gelöst
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer isolieren 16S-rDNA-Sequenz, die auf einen dechlorierenden Bakterienstamm hindeutet, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:30; und (b) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das vollkommen komplementär zu (a) ist.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Bereitstellung eines isolierten Bakterienstamms, umfassend jedwede eine der erfindungsgemäßen Sequenzen wie in SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:30 dargelegt ist, worin der Stamm die Fähigkeit zum Dechlorieren chlorierter Verbindungen aufweist.
Gegenstand der Erfindung ist weiter die Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifikation eines dechlorierenden Bakterienstamms, umfassend: (i) Extrahieren genomischer DNA aus einer Zelle, die vermutlich zum Dechlorieren chlorierter Verbindungen fähig ist; (ii) Sondieren der extrahierten genomischen DNA mit einer Sonde, die sich von jedweder einen der Sequenzen von SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:30 unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen herleitet, worin die Identifikation eines hybridisierbaren Nukleinsäurefragments die Anwesenheit eines Bakteriums bestätigt, das zum Dechlorieren chlorierter Verbindungen fähig ist.
Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Verfahren zur Identifikation eines dechlorierenden Bakterienstamms, umfassend: (i) Extrahieren genomischer DNA aus einer Zelle, die vermutlich zum Dechlorieren chlorierter Verbindungen fähig ist; und (ii) Amplifizieren der extrahierten genomischen DNA mit einem Oligonukleotid-Primer, der einem Anteil von jedweder einen der erfindungsgemäßen Sequenzen wie in SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:30 dargelegt ist, dergestalt entspricht, dass Amplifikationsprodukte gebildet werden, worin die Anwesenheit von Amplifikationsprodukten das Vorliegen eines dechlorierenden Bakterienstamms bestätigt.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Bereitstellung eines Verfahrens zum Dechlorieren chlorierter Verbindungen, umfassend das Kontaktieren einer chlorierten Verbindung mit einem isolierten Bakterienstamm, umfassend jedwedes eine der DNA-Fragmente, wie in SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:30 dargelegt ist, unter Bedingungen, die zum Auftreten von Dechlorierung geeignet sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN UND DES SEQUENZPROTOKOLLS
1 stellt ein Alignment des 16S-rDNA-Sequenzprofils von Dehalococcoides ethenogenes DHE-195, wie in Maymó-Gatell et al., Science, 176:1568 (1997) offenbart, im Vergleich zu Profilen dar, generiert für Organismen, die aus einer Anzahl von Abwasser-Behandlungsanlagen isoliert wurden.
2 stellt einen Vergleich der erfindungsgemäßen dechlorierenden 16S-rDNA-Profile mit einem 16S-rDNA-Profil von E. coli dar.
3 stellt eine grafische Darstellung dar, die die Fähigkeit eines Bodenmikrokosmos oder einer -kultur veranschaulicht, entwickelt aus bestimmten Böden, die von einer mit Chlorethen kontaminierten Stelle zum Dechlorieren von Trichlorethylen oder Perchlorethylen entnommen wurden.
4 stellt eine Abbildung von einem Elektrophoresegel dar, das zum Nachweis von PCR-Produkten in einem Test von mit Chlorethenen kontaminierten Böden unter Verwendung von zwei Sets der hierin beschriebenen Primern verwendet wurde.
Die Sequenzbeschreibungen enthalten den Einbuchstabencode für die Nukleotidsequenzzeichen und die Dreibuchstabencodes für Aminosäuren, wie sie in Übereinstimmung mit den in Nucleic Acids Research 15:3021–3030 (1985) und im Biochemical Journal 219 (Nr. 2):345–373 (1984) beschriebenen IUPAC-IYUB-Standards definiert wurden.
SEQ ID NO:1 stellt eine einzigartige Region des 16S-rDNA-Profils von Dehalococcoides ethenogenes, die mit der dechlorierenden Aktivität im Zusammenhang steht, dar.
SEQ ID NO:2 stellt das 16S-rDNA-Profil von Dehalococcoides ethenogenes DHE-PL, isoliert aus dem Boden in der Umgebung einer Industrieanlage dar.
SEQ ID NO:3 stellt das 16S-rDNA-Profil von Dehalococcoides ethenogenes DHE-STF, isoliert aus dem Boden in der Umgebung einer Industrieanlage dar.
SEQ ID NO:4 stellt das 16S-rDNA-Profil von Dehalococcoides ethenogenes DHE-DAB, isoliert aus dem Boden in der Umgebung einer Industrieanlage dar.
SEQ ID NO:5 stellt das 16S-rDNA-Profil von Dehalococcoides ethenogenes DHE-PIN, isoliert aus dem Boden in der Umgebung einer Industrieanlage dar.
SEQ ID NO:6 stellt das 16S-rDNA-Profil von Dehalococcoides ethenogenes DHE-DLL, isoliert aus dem Boden in der Umgebung einer Industrieanlage dar.
SEQ ID NO:7 stellt das 16S-rDNA-Profil von Dehalococcoides ethenogenes DHE-195, wie in Maymó-Gatell et al. (Science, 176:1568 (1997)), Genbank AF004928, berichtet, dar.
SEQ ID NO:8 stellt die sich von DHE-PL, DHE-STF, DHE-DAB, DHE-PIN und DHE-DLL an den Basen E180–E226 herleitende Konsensus-Sequenz dar.
SEQ ID NO:9–29 stellen die sich vom 16S-rDNA-Profil herleitende Primer dar, die bei der Identifikation dechlorierender Bakterien nützlich sind.
SEQ ID NO:30 stellt die sich von DHE-PL, DHE-STF, DHE-DAB, DHE-PIN und DHE-DLL an den Basen E1001–E1047 herleitende Konsensus-Sequenz dar.
SEQ ID NO:31 stellt die Basen-Sequenz in der Region des Konsensus-l6S-rDNA-Profils, von der sich die diagnostische Sequenz herleitet, dar.
SEQ ID NO:32 stellt die Basen-Sequenz in der Region des DHE-195-16S-rDNA-Profils, von der sich die diagnostische Sequenz herleitet, dar.
SEQ ID NO:33 stellt die 16S-rDNA-Referenzsequenz von E. coli dar.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einzigartiger 16S-rDNA-Sequenz-Profile, die sich von Dehalococcoides ethenogenes (DHE) herleiten. D. ethenogenes ist für seine Fähigkeit bekannt, persistente chlorierte Schmutzstoffe abzubauen. Die erfindungsgemäßen Sequenz-Profile können zur Identifikation und Subtypisierung von Bakterien mit ähnlichen Stoffwechselwegen verwendet werden. Eine Sequenz (ATTTTCTAGCGAGACTGCCCCGCG, SEQ ID NO:1), die an der Base E1146 beginnt, wurde in allen DHE identifiziert, die aus kontaminierten Böden isoliert wurden und ist stark mit der Fähigkeit dieser Organismen, chlorierte organische Verbindungen abbauen zu können, verknüpft. Ebenso kann eine Strecke von Nukleinsäuren, die im Bereich zwischen E180 und E226 liegt, entsprechend der SEQ ID NO:8, zur Identifikation von Dechlorierern ebenso wie für die genetische Subtypisierung von Spezies verwendet werden.
In dieser Offenbarung werden eine Reihe von Begriffen und Abkürzungen verwendet. Die folgenden Definitionen sind bereitgestellt.
Der Begriff „Dehalococcoides ethenogenes" wird als „DHE" abgekürzt.
Der Begriff „DHE-195" verweist auf die Stämme von Dehalococcoides ethenogenes, die von Maymó-Gatell et al. (Science, 176:1568 (1997)) isoliert und charakterisiert wurden.
Die Begriffe „DHE-PL, DHE-STF, DHE-DAB, DHE-DLL und DHE-PIN" verweisen auf Stämme von Dehalococcoides sp., die das erfindungsgemäße dechlorierende 16S-rDNA-Profil enthalten.
Unter dem Begriff „dechlorierende Bakterien" versteht man jedwede Bakterienspezies oder jedweden -stamm, die/der die Fähigkeit zur Entfernung von mindestens einem Chloratom aus einer chlorierten organischen Verbindung aufweist. Dechlorierende Bakterien können gegebenenfalls die Fähigkeit zum Wachsen auf chlorierten organischen Stoffen als alleinige Kohlenstoffquelle aufweisen, oder sie könnten den Abbau unter Verwendung einer anderen Energiequelle bevorzugen.
Unter dem Begriff „chlorierte Verbindungen" versteht man jedwede geradkettige oder einen Ring enthaltende organische Verbindung, die mindestens ein Chloratom enthält.
Trichlorethylen wird als „TCE" abgekürzt.
Perchlorethylen wird als „PCE" abgekürzt.
Unter dem Begriff „16S-rDNA" versteht man die DNA, die für in Bakterienzellen gefundene ribosomale RNA kodiert.
Unter dem Begriff „16S-rDNA-Profil" versteht man die spezifische DNA-Sequenz des rDNA-Gens in jedwedem bestimmten Organismus. Für die erfindungsgemäßen Zwecke sind die 16SrDNA-Profile für DHE-195, DHE-PL, DHE-STF, DHE-DAB, DHE-DLL und DHE-PIN in den 1 und 2 erläutert.
Unter dem Begriff „Signatur-Sequenz oder Signatur-Sequenzbereich" versteht man die kurzen Sequenzen im 16S-Gen oder rRNA-Molekül, die für eine bestimmte Gruppe oder Gruppen von Organismen einzigartig sind. Diese Sequenzen können zum Definieren von Domänen, Gruppen, Subdivisionsgattungen oder Spezies eines Organismus verwendet werden.
Der wie hierin verwendete Begriff „Konsensus-Sequenz", worunter man das Alignment eines gegebenen Sets von Sequenzen versteht, wird als die Sequenz des Sets von Basen definiert, worin eine designierte Base eine darstellt, die an jeder Position in der 16S-Sequenz am häufigsten vorkommt.
Der wie hierin verwendete Begriff „Referenz-Sequenz", worunter man das Alignment eines gegebenen Sets von Sequenzen versteht, wird als die bestimmte 16S-Sequenz definiert, mit der die Basen an jeder Position eines Alignments von 16S-Sequenzen verglichen werden. Die hierin verwendete Referenz-Sequenz stellte eine 16S-rDNA-Sequenz von E. coli dar. In der Referenz-Sequenz identifizierte Basen, die mit entsprechenden Basen in einem 16S-rDNA-Profil korrelieren, wird eine „E-Nummer" zugeteilt. Folglich entspricht die mit E-28 bezeichnete Base an der Referenz-Sequenz der Base 1 des 16S-rDNA-Profils von DHE-195, und E-107 entspricht der Base 66 von DHE-195. Die vollständige Korrelation ist in Tabelle 2 ersichtlich.
Unter dem Begriff „dechlorierendes 16S-rDNA-Profil" versteht man ein 16S-rDNA-Profil, enthaltend die diagnostische Sequenz, wie in SEQ ID NO:1 dargelegt ist.
Unter dem Begriff „diagnostische Sequenz" versteht man die Sequenz ATTTTCTAGCGAGACTGCCCCGCG (SEQ ID NO:1), die auf eine dechlorierende Aktivität hindeutet.
Unter den Buchstaben „A", „G", „T", „C", wenn auf sie im Rahmen von Nukleinsäuren verwiesen wird, versteht man die Purinbasen Adenin (C₅H₅N₅), Guanin (C₅H₅N₅O) und die Pyrimidinbasen Thymin (C₅H₆N₂O₂) bzw. Cytosin (C₄H₅N₃O).
In dieser Offenbarung werden eine Reihe von Begriffen und Abkürzungen verwendet. Die folgenden Definitionen sind bereitgestellt.
Unter „Gen" versteht man ein Nukleinsäurefragment, das ein spezifisches Protein exprimiert, einschließlich Regulationssequenzen, die der Kodierungssequenz vorangehen (5' nicht kodierende Sequenzen) und folgen (3' nicht kodierende Sequenzen).
Unter dem Begriff „Nukleinsäurefragment" versteht man ein RNA- oder DNA-Polymer, das ein- oder doppelsträngig ist, das optional synthetische, nichtnatürliche oder veränderte Nukleotidbasen enthält. Ein Nukleinsäurefragment in der Form eines DNA-Polymers kann aus einem oder mehr Segmenten) von cDNA, genomischer DNA oder synthetischer DNA bestehen.
Unter dem Begriff „Oligonukleotid" versteht man Primer, Sonden, nachzuweisende Oligomerfragmente, markierte Sonden zum Replikationsblocking, Oligomerkontrollen, und soll für Polydesoxyribonukleotide (enthaltend 2-Desoxy-D-ribose) für Polyribonukleotide (enthaltend D-Ribose) und für jedwedes Polynukleotid, bei dem es sich um ein N-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase (Nukleotid) oder modifizierte Purin- oder Pyrimidinbase handelt, generisch sein. Auch eingeschlossen in die Definition „Oligonukleotid" sind Nukleinsäureanaloga (z. B. Peptid-Nukleinsäuren) und diejenigen, die strukturell modifiziert wurden (z. B. Phosphorthioat-Verknüpfungen). Es besteht kein beabsichtigter Unterschied zwischen der Länge einer „Nukleinsäure", eines „Polynukkeotids" oder eines „Oligonukleotids".
Unter dem Begriff „Primer" versteht man ein Oligonukleotid (synthetisch oder natürlich vorkommend), das dazu fähig ist, als ein Initiierungspunkt für die Nukleinsäuresynthese oder -replikation entlang einem komplementären Strang zu wirken, wenn es unter Bedingungen platziert wird, bei denen die Synthese eines komplementären Strangs durch eine Polymerase katalysiert wird.
Unter dem Begriff „Sonde" versteht man ein Oligonukleotid (synthetisch oder natürlich vorkommend), das signifikant komplementär zu einem „Fragment" ist und durch Hybridisierung mit mindestens einem Strang des Fragments eine Duplex-Struktur bildet.
Der Begriff „komplementär" wird zur Beschreibung des Verhältnisses zwischen Nukleotidbasen, die aneinander hybridisierbar sind, verwendet. So ist zum Beispiel in Bezug auf DNA Adenosin komplementär zu Thymin und Cytosin ist komplementär zu Guanin.
Ein Nukleinsäuremolekül ist mit einem anderen Nukleinsäuremolekül, wie zum Beispiel einer cDNA, genomischen DNA oder RNA, „hybridisierbar", wenn eine einsträngige Form des Nukleinsäuremoleküls mit dem anderen Nukleinsäuremolekül unter den geeigneten Bedingungen von Temperatur und der Ionenstärke der Lösung, annealen kann. Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind gut bekannt und in Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), insbesondere in Kapitel 11 und Tabelle 11.1 dann erläutert. Die Bedingungen von Temperatur und Ionenstärke bestimmen die „Stringenz" der Hybridisierung. Für vorläufiges Screening auf homologe Nukleinsäuren können Hybridisierungsbedingungen von niedriger Stringenz, die einer Tm von 55 °C entsprechen, wie z. B. 5 × SSC, 0,1 % SDS, 0,25 % Milch und kein Formamid; oder 30 % Formamid, 5 × SSC, 0,5 % SDS, verwendet werden. Hybridisierungsbedingungen von mittelgradiger Stringenz entsprechen einem höheren Tm, wie z. B. 40 % Formamid, mit 5 × oder 6 × SSC.
Die Hybridisierung macht erforderlich, dass die beiden Nukleinsäuren komplementäre Sequenzen enthalten, obwohl abhängig von der Stringenz der Hybridisierung Mismatches zwischen den Basen möglich sind. Die geeignete Stringenz zum Hybridisieren von Nukleinsäuren hängt von der Länge der Nukleinsäuren und dem Grad der Komplementierung ab, von Variablen, die im Stand der Technik weithin bekannt sind. Je größer der Grad der Ähnlichkeit oder Homologie zwischen zwei Nukleotidsequenzen ist, um so größer ist der Wert von Tm für Hybriden von Nukleinsäuren, die diese Sequenzen aufweisen. Die relative Stabilität (entspricht der höheren Tm) der Nukleinsäure-Hybridisierungen nimmt in der folgenden Reihenfolge ab: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Für Hybriden mit einer Länge von mehr als 100 Nukleotiden wurden Gleichungen zur Berechnung der Tm abgeleitet (siehe Sambrook et al., vorstehend, 9,50–9,51). Für Hybridisierungen mit kürzeren Nukleinsäuren, d. h. Oligonukleotiden, wird die Position von Mismatsches wichtiger, und die Länge des Oligonukleotids bestimmt seine Spezifität (siehe Sambrook et al., vorstehend 11,7–11,8). In einer Ausführungsform beträgt die Länge für eine hybridisierbare Nukleinsäure mindestens ca. 10 Nukleotide. Eine Mindestlänge für eine hybridisierbare Nukleinsäure beträgt bevorzugt mindestens ca. 15 aneinandergrenzende Nukleotide; bevorzugter mindestens ca. 20 aneinandergrenzende Nukleotide; und am bevorzugtesten beträgt die Länge mindestens 30 benachbarte Nukleotide. Wenn sich folglich eine „Sonde" oder ein „Primer" von einem „Anteil" eines Nukleinsäurefragments „herleitet" oder ihm entspricht, wird die Sonde oder der Primer oder der Anteil bevorzugt mindestens 15 benachbarte Nukleotide betragen; bevorzugter mindestens ca. 20 benachbarte Nukleotide; und am bevorzugtesten beträgt die Länge mindestens 30 benachbarte Nukleotide des Fragments, von dem er/sie sich herleitet. Der Fachmann wird ferner erkennen, dass die Temperatur und die Salzkonzentration der Waschlösung gemäß den Faktoren, wie zum Beispiel der Länge der Sonde, gegebenenfalls angeglichen werden können.
Unter dem Begriff „Amplifikationsprodukt" versteht man Anteile von Nukleinsäurefragmenten, die während einer Primer gerichteten Amplifikationsreaktion produziert werden. Typische Verfahren der Primer-gerichteten Amplifikation schließen die Polymerasekettenreaktion (PCR), die Ligasekettenreaktion (LCR) oder Strangverdrängungsamplifikation (SDA) ein. Wenn die PCR-Methodik ausgewählt wird, würde die Replikationszusammensetzung, zum Beispiel Nukleotidtriphosphate, zwei Primer mit entsprechenden Sequenzen, DNA- oder RNA-Polymerase und Proteine einschließen. Diese Reagenzien und Einzelheiten, die Verfahren für ihre Verwendung bei der Amplifikation von Nukleinsäuren beschreiben, sind in US-Patent Nr. 4,683,202 (1987, Mullis, et al.) und US-Patent Nr. 4,683,195 (1986, Mullis, et al.) enthalten. Wenn die LCR-Methodik ausgewählt wird, dann würden die Nukleinsäurereplikations-Zusammensetzungen zum Beispiel eine thermostabile Ligase, wie z. B. die Ligase von T. aquaticus, zwei Sets von benachbarten Oligonukleotiden, worin ein Mitglied von jedem Set zu jedem der Target-Stränge komplementär ist, Tris-HCl-Puffer, KCl, EDTA, NAD, Dithiothreitol und Lachsspermien-DNA umfassen. Siehe zum Beispiel Tabor et al., Proc. Acad Sci. U.S.A., 82,1074–1078 (1985)).
Unter dem Begriff „Sequenzanalysen-Software" versteht man jedweden Computer-Algorithmus oder jedwedes Software-Programm, das für die Analyse der Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen nützlich ist. „Sequenzanalysen-Software" kann gewerblich erhältlich sein oder unabhängig entwickelt werden. Eine typische Sequenzanalysen-Software schließt das GCG-Paket von Programmen (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wise), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403–410 (1990) und DNASTAR (DNASTAR, Inc., 1228 S. Park St Madison, WI 53715 USA) ein, ist aber nicht darauf beschränkt. Im Rahmen dieser Anmeldung wird man zur Kenntnis nehmen, wenn die Sequenzanalysen-Software zur Analyse verwendet wird, dass die Ergebnisse der Analyse auf den „Default-Werten" des erwähnten Programms basieren, sofern nicht anderweitig spezifiziert wird. Wie hierin verwendet, versteht man unter „Default-Werten" jedweden Set von Werten oder Parametern, der ursprünglich mit der Software geladen wurde, wenn sie zuerst initialisiert wird.
Die hier verwendeten standardmäßigen rekombinanten DNA- und molekularen Klonierungsverfahren sind im Stand der Technik weithin bekannt und werden von Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) (hierin nachstehend „Maniatis"); und von Silhavy, T. J., Bennan, M. L. und Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Press Spring Harbor, NY (1984); und von Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, veröffentlicht von der Greene Publishing Assoc. und Wiley-Interscience (1987), beschrieben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die einzigartigen 16S-rDNA-Sequenzen, die aus Bakterien, die Dehalococcoides ethenogenes sehr ähnlich, wenn nicht gar verwandt mit ihnen sind, isoliert wurden, die mit der Fähigkeit dieses Bakteriums einhergehen, chlorierte organische Verbindungen zu dechlorieren. Die Sequenzen wurden aus Bakterien isoliert, die in Bodenproben von verschiedenen Industrieanlagen gefunden wurden, von denen gezeigt wurde, dass sie Bakterien mit der Fähigkeit enthalten, chlorierte Verbindungen zu dechlorieren. Die Sequenzen sind nützlich für die Identifikation neuer dechlorierender Bakterien, ebenso wie für die Subtypisierung von Stämmen von Dehalococcoides ethenogenes.
Dechlorierende Bakterien wurden aus der grundwasserführenden Schicht des Bodens isoliert, der mittels im Stand der Technik weithin bekannter Mittel im Umkreis von Industrieanlagen gewonnen wurde. Die Proben wurden unter anaeroben Bedingungen aufrechterhalten und in einem zum Wachstum der anaeroben Bodenbakterien geeigneten Medium kultiviert. Solche Kulturverfahren und -medien sind im Stand der Technik allgemein und weithin bekannt und sind im Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips, Hrsg.), American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994)) oder von Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Zweite Auflage, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989) beschrieben.
Um die kultivierten Bodenproben für dechlorierende Bakterien anzureichern, wurden die Proben mit einer geringen Konzentration einer chlorierten organischen Verbindung in Kontakt gebracht. Eine Anzahl chlorierter Verbindungen sind für diesen Zweck geeignet, einschließlich, aber nicht begrenzt darauf, Kohlenstofftetrachlorid, Tetrachlorethen, Chloroform, Dichlormethan, Trichlorethen, Dichlorethylen, Vinylchlorid und Chloraromate, unter denen chlorierte Ethene bevorzugt sind, und TCE und PCE sind bevorzugt. Die Inkubation lief für eine Dauer von ca. sechs Monaten ab, und die Kulturen wurden periodisch auf das Verschwinden der chlorierten organischen Verbindung und das Auftreten von Abbauprodukten analysiert. Die Kulturen, die eine Fähigkeit zum Abbau chlorierter organischer Stoffe erkennen ließen, wurden zur weiteren Analyse ausgewählt.
Bakterien von dechlorierenden Kulturen wurden anhand von Standardverfahren entfernt und die chromosomale Gesamt-DNA wurde aus den Mikroorganismen mittels eines Homogenisierungsverfahrens mithilfe einer Kugelmühle entfernt. Ein Fragment des 16S-rRNA-Gens wurde aus dem genomischen DNA-Extrakt durch PCR unter Verwendung von 16S-rDNA-Primern, die für dechlorierende Mikroben spezifisch sind, amplifiziert. Das 16S-rDNA-PCR-Produkt wurde zur Bestätigung seiner Identität kloniert und sequenziert (M. I. More et al. 1994. Appl. Environ. Microbiol., 60,1572–1580). Jede gewonnene Roh-16S-Sequenz wurde zu einem Contig assembliert, und eine Konsensus-Sequenz wurde unter Verwendung eines Seqman II in DNAstar (DNAstar, Inc., Madison, WI) manuell konstruiert. Für jede Testsequenz wurde eine Ähnlichkeitssuche gemäß Pearson und Lipman unter Verwendung des FASTA-Programms in GCG (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group, Madison, WI) durchgeführt. Der mit der Testsequenz hinsichtlich der Ähnlichkeit ähnlichste Organismus in der 16S-rRNA-Sequenz wurde als das genaueste Match zur Identifikation verwendet. Die 16S-DNA-Gensequenzen, die als dem dechlorierenden Bakterium, Dehalococcoides ethenogenes DHE-195 (GenBank Zugriff-Nr. AF004928), ähnlich identifiziert wurden, wurden mit den ausgewählten 16S-rRNA-Sequenzen, die aus dem Ribosomal Database Project (Michigan State University) extrahiert wurden, die eine Repräsentation der bedeutenden Mikroorganismus-Domänen, Bakterien und Archeae im Universal Phylogenetic Tree of Life [universellen phylogenetischen Baum] darstellten, aligned. Die Sequenzen wurden unter Verwendung von MegAlign in DNAstar unter Verwendung der Default-Software-Parameter aligned. Die aus diesem Alignment wahrscheinlichen Regionen für Signatur-Sequenzen wurden kartiert. Danach wurden die Sequenzen aus jeder Region gegen die ribosomale Datenbank (RDB) auf einzigartige Sequenzen getestet, bei denen es sich um Signatur-Sequenzen handeln könnte, und die als PCR-Primer oder Detektionssonden verwendet werden könnten.
In dem durch den Vergleich der isolierten Dechlorierer definierten 16S-rDNA-Profil (siehe 1 und 2) ließen drei Signatur-Regionen eine erhebliche Variation von den bekannten Sequenzen erkennen. Diese Regionen wurden als Erweiterung von E1146 bis E1156 (SEQ ID NO:1), von E180 bis E227 (SEQ ID NO:8) und von E1001 bis E1047 (SEQ ID NO:30) definiert. Alle die erfindungsgemäßen dechlorierenden Isolate enthielten die Sequenz, wie sie in SEQ ID NO:1 dargelegt ist, die von der im Stand der Technik bekannten Sequenz auffallend abwesend ist (Maymó-Gatell et al. (Science, 176:1568 (1997)).
Obwohl eine Region ähnlich der durch SEQ ID NO:8 definierten in der in der Literatur erwähnten Sequenz gefunden wird, liegen an den Positionen E184, E190, E197, E200, E207, E216 und E221 signifikante Variationen vor, wie in der Formel I nachstehend ersichtlich ist.
Formel I.
Im erfindungsgemäßen Rahmen haben die Anmelder entdeckt, dass in der durch SEQ ID NO:8 und Formel I vorstehend definierten Signatur-Region, das R an Position E184 A/G darstellen kann, das Y an Position E190 C/T darstellen kann, das W an Position E198 A/T darstellen kann, und die Y an Position E201, E208, E217 und E222 T/C darstellen können.
Die durch SEQ ID NO:30 definierte Region wird auf ähnliche Weise auch in der Literatur gefunden, enthält aber signifikante Variationen an den Positionen E1003, E1012, E1020, E1039 und E1040, wie nachstehend in der Formel II ersichtlich ist.
Formel II.
Wie bereits mit SEQ ID NO:8 haben die Anmelder entdeckt, dass in der durch SEQ ID NO:30 und Formel II vorstehend definierten Signatur-Region das W an Position E 1003 A/T darstellen kann, an Position E1012 das M A/C darstellen kann, an Position E1020 das R A/G darstellen kann, an Position E 1039 das R A/G darstellen kann und an Position E 1040 das M A/C darstellen kann.
Gleichermaßen, wenn das gesamte 16S-rDNA-Profil untersucht wird, ist zu sehen, dass über das gesamte Profil durchweg signifikante Einzelbasen-Unterschiede vorliegen (1 und 2). Diese Unterschiede sind in Tabellenform in Tabelle 2 veranschaulicht. Demzufolge ist eine 16S-rDNA-Profil-Sequenz mit den folgenden Basensubstitutionen, unabhängig oder zusammen genommen, diagnostisch für die dechlorierenden Bakterien: E107 = G, Base E184 = G, Base E190 = C, E198 = T, E201 = T, E208 = C, E217 = T, E222 = C, E264 = C, E267 = C, E291 = T, E333 = C, E420 = C, E444 = T, E631 = A, E829 = A, E933 = T, E934 = T, E980 = C, E1003 = T, E1012 = T, E1020 = G, E1039 = A, E1040 = C, E1087 = T und E1114 = C.
Assay-Verfahren
Die erfindungsgemäßen Sequenzen können in vielen verschiedenen Formaten zum Nachweis dechlorierender Bakterien verwendet werden. Die beiden zweckmäßigsten Formate verlassen sich auf Verfahren der Nukleinsäure-Hybridisierung oder auf Primer-gerichtete Amplifikationsverfahren, wie zum Beispiel PCR.
Nukleinsäure-Hybridisierungsverfahren
Die grundlegenden Komponenten eines Nukleinsäure-Hybridisierungstests schließen eine Sonde, ein Probe, die vermutlich ein dechlorierendes Bakterium enthält, und ein spezifisches Hybridisierungsverfahren ein. Wie vorstehend angemerkt ist, handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Sonden um eine einsträngige Nukleinsäuresequenz, die zu den nachzuweisenden Nukleinsäuresequenzen komplementär ist. Die Sonden sind an die nachzuweisende Nukleinsäuresequenz „hybridisierbar". Die Sondenlänge kann von 5 Basen bis zu Zehntausenden von Basen variieren und wird von dem auszuführenden spezifischen Test abhängen. Nur ein Teil des Sondenmoleküls braucht mit der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz komplementär zu sein. Außerdem braucht die Komplementarität zwischen der Sonde und der Targetsequenz nicht perfekt zu sein. Eine Hybridisierung tritt zwischen imperfekt komplementären Molekülen mit dem Ergebnis auf, dass eine bestimmte Fraktion der Basen in der hybridisierten Region nicht mit der richtigen komplementären Base gepaart ist. Eine Sonde kann sich aus entweder RNA oder DNA zusammensetzen. Die Form der Nukleinsäuresonde kann ein markiertes einsträngiges Molekül von eben einer Polarität oder ein markiertes einsträngiges Molekül, bei dem beide Polaritäten anwesend sind, darstellen. Die Form der Sonde ebenso wie ihre Länge, wird durch den Typ des durchzuführenden Hybridisierungstests bestimmt.
Die Probe kann gegebenenfalls den Organismus von Interesse enthalten. Die Probe kann viele verschiedene Formen, einschließlich flüssig, wie zum Beispiel Wasser oder fest, wie zum Beispiel Staub oder Erde, annehmen. Die Nukleinsäure in der Probe muss zum Kontakt mit der Sonde verfügbar gemacht werden, bevor jedwede Hybridisierung der Sonde und des Targetmoleküls auftreten kann. Folglich muss die RNA des Organismus frei von der Zelle sein und unter die richtigen Bedingungen gebracht werden, bevor eine Hybridisierung auftreten kann. Verfahren zur Hybridisierung in einer Lösung machen die Reinigung der RNA erforderlich, damit man in der Lage ist, eine Hybridisierung der Proben-rRNA mit der Sonde zu erreichen. Dies hat bedeutet, dass zur Verwendung des Verfahrens in Lösung zum Nachweis von Targetsequenzen in einer Probe die Nukleinsäuren der Probe zur Elimination von Protein, Lipiden und anderen Zellkomponenten zuerst gereinigt werden und dann mit der Sonde unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht werden müssen. Das Verfahren zur Reinigung der Nukleinsäure in der Probe ist im Stand der Technik allgemein und weithin bekannt (Maniatis, vorstehend).
Auf ähnliche Weise sind die Hybridisierungsverfahren gut definiert. Die Sonde und Probe müssen in der Regel unter Bedingungen gemischt werden, die eine Hybridisierung der Nukleinsäure zulassen. Dies beinhaltet das Kontaktieren der Sonde und Probe in Anwesenheit eines anorganischen oder organischen Salzes unter den richtigen Konzentrations- und Temperaturbedingungen. Die Sonde und die Nukleinsäuren in der Probe müssen für eine Zeit, die lange genug ist, in Kontakt gebracht werden, damit jedwede Hybridisierung zwischen der Sonde und der Nukleinsäure der Probe auftreten kann. Die Konzentration der Sonde oder des Targets im Gemisch bestimmen die Zeit, die bis zum Auftreten der Hybridisierung notwendig ist. Je höher die Sonden- oder Targetkonzentration ist, um so kürzer ist die benötigte Inkubationszeit zum Hybridisieren.
In einer Ausführungsform können die Hybridisierungsassays direkt an Bakterienlysaten durchgeführt werden, ohne dass die Nukleinsäuren extrahiert werden müssen. Hierdurch werden mehrere Schritte aus dem Proben-Handhabungsvorgang eliminiert, und der Assay kann beschleunigt werden. Zur Durchführung dieser Assays an Rohzelllysaten wird den wie vorstehend beschriebenen präparierten Zelllysaten in der Regel ein Chaotrop zugefügt. Das Chaotrop stabilisiert Nukleinsäuren durch Inhibition der Nuklease-Aktivität. Das Chaotrop erlaubt ferner die empfindliche und stringente Hybridisierung kurzer Oligonukleotidsonden an RNA bei Raumtemperatur [Van Ness und Chen (1991) Nucl. Acids Res. 19:5143–5151). Geeignete Chaotrope schließen folgende ein: Guanidiniumchlorid, Guanidiniumthiocyanat, Natriumthiocyanat, Lithiumtetrachloracetat, Natriumperchlorat, Rubidiumtetrachloracetat, Kaliumiodid und Cäsiumtrifluoracetat unter anderen. Das Chaotrop liegt in der Regel in einer Endkonzentration von ca. 3 M vor. Gegebenenfalls kann man dem Hybridisierungsgemisch Formamid, in der Regel 30–50 Vol-%, zufügen.
Als Alternative kann man das rRNA vor der Sondenhybridisierung reinigen. Einem Fachmann sind viele verschiedene Verfahren (z. B. die Phenol-Chloroform-Extraktion, IsoQuick-Extraktion (MicroProbe Corp., Bothell, WA) und andere) bekannt. Die Reinigung vor der Hybridisierung ist für standardmäßige Filter-Hybridisierungsassays besonders nützlich. Die Reinigung erleichtert ferner Maßnahmen zur Steigerung der Empfindlichkeit des Assays durch Inkorporation von RNA-Amplifikationsverfahren in vitro, wie zum Beispiel die selbst unterhaltene Sequenzreplikation (siehe zum Beispiel Fahy et al. (1991) in PCR Methods and Applications, Cold Spring Harbor Laboratory Press, S. 25–33) oder reverse Transkriptase-PCR (Kawasaki (1990) in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, M. A. Innis et al., Hrsg., S. 21–27). Man kann amplifizierte rRNA unter Verwendung von RNA-Amplifikationsverfahren in vitro wie in Fahy et al., vorstehend; Kawasaki, vorstehend, beschrieben, erhalten Das verwendete exakte Verfahren ist nicht ausschlaggebend, vorausgesetzt, dass es nicht signifikante DNA-Mengen amplifiziert, die dazu neigen würden, die Ergebnisse zu verschleiern.
Sobald die prä-rRNA aus den Zellen freigesetzt ist, kann sie durch jedwede unter vielen verschiedenen Verfahren nachgewiesen werden. Das Verfahren des rRNA-Nachweises ist für die Erfindung nicht ausschlaggebend. Die nützlichsten Ausführungsformen weisen jedoch zumindest einige Merkmale wie Geschwindigkeit, Zweckmäßigkeit, Empfindlichkeit und Spezifität auf. Die direkte DNA-Sondenanalyse ist, wie auch ein RNA-Amplifikationsverfahren in vitro, wie zum Beispiel 3SR, das markierte Primer einsetzt, geeignet.
Verschiedene Hybridisierungslösungen können eingesetzt werden. In der Regel umfassen diese von ca. 20 bis 60 Vol-%, bevorzugt 30 % eines polaren organischen Lösungsmittels. Eine übliche Hybridisierungslösung setzt ca. 30–50 Vol-% Formamid, ca. 0,15 bis 1 M Natriumchlorid, ca. 0,05 bis 0,1 M Puffer, wie zum Beispiel Natriumcitrat, Tris-HCl, PIPES oder HEPES (pH-Bereich ca. 6–9), ca. 0,05 bis 0,2 % Detergens, wie zum Beispiel Natriumdodecylsulfat oder zwischen 0,5–20 mM EDTA, Ficoll (Pharmacia Inc.) (ca. 300–500 Kilodalton), Polyvinylpyrrolidon (ca. 250–500 kDa) und Serumalbumin ein. Auch eingeschlossen in die typische Hybridisierungslösung sind unmarkierte Träger-Nukleinsäuren von ca. 0,1 bis 5 mg/ml, fragmentierte Nukleinsäure-DNA, z. B. Kalbthymus- oder Lachsspermien-DNA oder Hefe-RNA und optional von ca. 0,5 bis 2 % (w/v) Glycin. Andere Additive können auch eingeschlossen werden, wie zum Beispiel Volumenausschlussmittel, die viele verschiedene polare wasserlösliche oder quellbare Mittel, wie zum Beispiel Polyethylenglykol, anionische Polymere, wie zum Beispiel Polyacrylat oder Polymethylacrylat und anionische Saccharid-Polymere, wie zum Beispiel Dextransulfat, einschließen.
Die Nukleinsäure-Hybridisierung ist an viele verschiedene Assay-Formate anpassbar. Eines der geeignetsten stellt das Sandwich-Assay-Format dar. Der Sandwich-Assay ist unter nicht denaturierenden Bedingungen besonders anpassbar. Eine primäre Komponente eines Assays vom Sandwich-Typ stellt einen festen Träger dar. Der feste Träger weist adsorbiert daran oder kovalent gekoppelt an ihn eine immobilisierte Nukleinsäuresonde, die nicht markiert ist und zu einem Anteil der rRNA-Sequenz komplementär ist, auf. Bevorzugt sind die Sonden, die an Regionen der rRNA hybridisieren, die minimale sekundäre und tertiäre Interaktionen aufweisen. Der Vorteil solcher Sonden besteht darin, dass die Hybridisierung ohne den zusätzlichen Schritt der Hitzedenaturierung der Proben-Nukleinsäure durchgeführt werden kann. Die Hybridisierung kann zum Beispiel bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Der Sandwich-Assay kann in einem Assay-Kit enthalten sein. Dieses Kit würde eine erste Komponente zum Gewinnen der Proben aus dem Boden, wie zum Beispiel Fläschchen zum Containment und Puffer zur Dispersion und Lyse der Probe darstellen. Eine zweite Komponente würde ein Medium, entweder in trockener oder flüssiger Form, zur Hybridisierung der Target- und Sonden-Polynukleotide ebenso wie zur Entfernung unerwünschter und Nichtduplex-Formen durch Waschen einschließen. Eine dritte Komponente schließt einen festen Träger (Dipstick) ein, auf dem fixiert oder an den konjugiert sich (eine) unmarkierte Nukleinsäuresonde(n) befindet/befinden, die komplementär zu einem Teil der Präkursor-rRNA der zu testenden Bakterien-Spezies ist sind. Im Fall der multiplen Target-Analyse wird mehr als eine Capture-Sonde, die jeweils spezifisch für ihre eigene rRNA ist, auf verschiedene diskrete Regionen des Dipsticks appliziert. Eine vierte Komponente würde eine markierte Sonde enthalten, die zu einer zweiten und anderen Region des gleichen rRNA-Strangs, an die die immobilisierte, nicht markierte Nukleinsäuresonde der dritten Komponente hybridisiert ist, komplementär ist.
In einer anderen Ausführungsform kann die erfindungsgemäße 16S-rDNA-Sequenz als eine 3' blockierte Detektionssonde in entweder einem homogenen oder heterogenen Assay-Format verwendet werden. Eine zum Beispiel aus den erfindungsgemäßen Sequenzen generierte Sonde kann zum Beispiel 3' blockiert oder nicht partizipatorisch sein, und wird durch eine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion nicht erweitert oder an ihr teilnehmen. Die Sonde inkorporiert zusätzlich eine Markierung, die als ein reaktiver Ligand dienen kann, der als ein Anheftungspunkt für die Immobilisierung der Sonden-/Analyt-Hybriden oder als ein Reporter zum Hervorrufen eines nachweisbaren Signals dienen kann. Demgemäß wird genomische oder cDNA, die aus dem Testorganismus isoliert wird, durch standardmäßige Primer-gerichtete Amplifikationsprotokolle in Anwesenheit eines Überschusses der an 3' blockierten 16S-rDNA-Detektionssonde zur Herstellung der Amplifikationsprodukte amplifiziert. Da die Sonde an 3' blockiert ist, nimmt sie nicht an der Amplifikation des Targets teil oder greift in sie ein. Nach dem endgültigen Amplifikationszyklus, annealt die Detektionssonde an den relevanten Anteil der amplifizierten DNA und der annealte Komplex wird dann auf einem Träger durch den reakiven Liganden captured.
PCR-Assayverfahren
In einer anderen Ausführungsform können die vorliegenden Sequenzen als Primer oder zur Generierung von Primern verwendet werden, die in der Primer-gerichteten Nukleinsäure-Amplifikation zum Nachweis des Vorliegens von dechlorierenden Bakterien verwendet werden können. Eine Reihe vieler verschiedener Primer-gerichteter Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren, einschließlich der Thermocycling-Verfahren, wie zum Beispiel der Polymerasekettenreaktion (PCR) und der Ligasekettenreaktion (LCR) ebenso wie der isothermischen Verfahren und der Strangverdrängungsamplifikation (SDA), sind im Stand der Technik bekannt. Das bevorzugte Verfahren stellt die PCR dar. Bei den Amplifikationsverfahren des PCR-Typs weisen die Primer in der Regel unterschiedliche Sequenzen auf und sind nicht komplementär zueinander. In Abhängigkeit von den gewünschten Testbedingungen sollten die Sequenzen der Primer zur Bereitstellung von sowohl effizienter als auch getreuer Replikation der Target-Nukleinsäure konzipiert sein. Verfahren des PCR-Primer-Designs sind im Stand der Technik allgemein und weithin bekannt. (Thein und Wallace, „The use of oligonucleotide as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders", in Human Genetic Diseases: A Practical Approach, K. E. Davis, Hrsg., (1986) S. 33–50 IRL Press, Hemdon, Virginia); Rychlik, W. (1993) In White, B. A. (Hrsg.), Methods in Molecular Biology, Vol. 15, Seiten 31–39, PCR Protocols: Current Methods and Applications. Humania Press, Inc., Totowa, NJ.) Wenn ein Nukleinsäure-Target exponentiell amplifiziert werden soll, dann werden zwei Primer verwendet, die jeweils Regionen aufweisen, die zu nur einem der Stränge im Target komplementär sind. Nach der Hitzedenaturierung binden die einsträngigen Target-Fragmente an die entsprechenden Primer, die im Überschuss vorhanden sind. Beide Primer enthalten asymmetrische Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen, die sich am 5'-Ende der Target-Bindungssequenzen befinden. Jeder Primer-Target-Komplex zykliert durch Nicking- und Polymerisations-/Verdrängungsschritte in Anwesenheit eines Restriktionsenzyms, einer DNA-Polymerase und den drei dNTP und einem dNTP[aS], wie vorstehend besprochen wird. Eine eingehende Besprechung der SDA-Methodik wird von Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89,392, (1992), gegeben.
Als Alternative kann eine asymmetrische Amplifikation zur Generierung des Strangs verwendet werden, der komplementär zur Detektionssonde ist. Asymmetrische PCR-Bedingungen zur Herstellung einer einsträngigen DNA würde ähnliche Bedingungen für die wie beschriebene PCR einschließen, die Primer-Konzentrationen werden jedoch mit 50 pmol des überschüssigen Primers und 1 pmol des limitierenden Primers verändert. Es wird in Betracht gezogen, dass dieses Verfahren die Empfindlichkeit des Verfahrens erhöhen würde. Diese Verbesserung der Empfindlichkeit würde durch Erhöhung der Zahl der verfügbaren Einzelstränge zur Bindung mit der Detektionssonde auftreten.
Im erfindungsgemäßen Rahmen werden Primer für die konservierten Regionen des 16S-rDNA-Profils konzipiert, die mit Dechlorierung assoziiert sind. Die signifikantesten dieser Regionen stellen die in SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:30 dargelegten Sequenzen dar.
Im Anschluss an die Amplifikation und vor dem Sequenzieren kann die amplifizierte Nukleotidsequenz an einen geeigneten Vektor, gefolgt von der Transformation eines geeigneten Wirtsorganismus mit diesem Vektor, ligiert werden. Man gewährleistet dadurch eine ohne weiteres verfügbare Versorgung mit der amplifizierten Sequenz. Als Alternative kann nach der Amplifikation die amplifizierte Sequenz oder ein Anteil davon zum Gebrauch als eine Nukleotidsonde chemisch synthetisiert werden. In einer von beiden der Situationen wird die DNA-Sequenz der variablen Region unter Verwendung von Verfahren, wie zum Beispiel dem Didesoxy-Verfahren, etabliert (Sauger, F. et al. Proc. Natl Acad. Sci (1977) 74, 5463–5467). Die erhaltene Sequenz wird zur Steuerung der Wahl der Sonde für den Organismus verwendet, und die geeignetste(n) Sequenzen) wird/werden ausgewählt.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung ist weiter in den folgenden Beispielen definiert. Man sollte zur Kenntnis nehmen, dass diese Beispiele, obwohl sie die bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen andeuten, nur auf dem Weg der Veranschaulichung gegeben sind. Aus der vorstehenden Besprechung und diesen Beispielen kann ein Fachmann die wesentlichen erfindungsgemäßen Merkmale ermitteln und kann verschiedene erfindungsgemäße Änderungen und Modifikationen zur Anpassung an ihre verschiedenen Verwendungszwecke und Bedingungen vornehmen.
ALLGEMEINE VERFAHREN
Die in den Beispielen verwendeten standardmäßigen rekombinanten DNA- und Molekularverfahren sind im Stand der Technik weithin bekannt. Zur Verwendung in den folgenden Beispielen geeignete Verfahren, können in Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) (hierin nachstehend „Maniatis") gefunden werden.
Für die Erhaltung und das Wachstum von Bakterienkulturen geeignete Materialien und Verfahren sind im Stand der Technik weithin bekannt. Zur Verwendung in den folgenden Beispielen geeignete Verfahren können, wie im Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg und G. Briggs Phillips, Hrsg.), American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994)) oder von Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Zweite Auflage, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989) dargelegt ist, gefunden werden. Alle für das Wachstum und die Erhaltung von Bakterienzellen verwendeten Reagenzien, Restriktionsenzyme und Materialien wurden, sofern nicht anderweitig angegeben wird, von Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MT), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) oder der Sigma Chemical Company (St Louis, MO) bezogen.
Manipulationen genetischer Sequenzen wurden unter Verwendung der von der Genetics Computer Group Inc. (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA) erhältlichen Programm-Pakete oder dem „Online"-Sonden-Match-Programm vom Ribosomal Database Project II (Michigan State University, East Lansing, MI) erlangt. Wo immer in den folgenden Beispielen jedwede Sequenzanalysen-Software verwendet wurde, wurden – sofern nicht anderweitig angegeben wird – Default-Werte verwendet.
Die Bedeutung der Abkürzungen verhält sich wie folgt: „h" bedeutet Stunde(n), „min" bedeutet Minute(n), „sec" bedeutet Sekunde(n), „d" bedeutet Tag(e), „ml" bedeutet Milliliter, „1" bedeutet Liter.
BEISPIEL 1
Isolation und Charakterisierung von dechlorierenden Bodenorganismen
Kernproben von der grundwasserführenden Schicht wurden mit dem Probennahmekerngerät mit einem Schlitzlöffel in Tiefen von 10 bis 80 ft, in Abhängigkeit von der Tiefe der zu testenden entsprechenden grundwasserführenden Schicht gewonnen. Die entnommenen Kernproben wurden in sterile Edelstahlzylinder oder in sterile Glasflaschen platziert. Die Kernproben wurden sofort bei Umgebungstemperaturen und unter aeroben Bedingungen an das Laboratorium versandt. Nach dem Eingang wurden die Proben in einer anaeroben Glovebag (Kammer) gelagert (Coy Laboratory Products Inc., Ann Arbor, MT), deren Atmosphäre 10 % H₂, 5 % CO₂ und 85 % N₂ betrug.
Der Labor-Mikrokosmos wurde in 250 ml fassenden Wheaton-Flaschen (Wheaton Co., Millville, NJ) in der anaeroben Kammer hergestellt. Duplizierte Mikrokosmen wurden für die folgenden Bedingungen hergestellt: „Abgetötete" Kontrolle (an zwei konsekutiven Tagen für die Dauer von 1 h autoklavierter Lebendboden), Lebendboden und Lebendboden + 0,05 % Hefeextrakt. Jeder Mikrokosmos enthält 20 % Boden und 80 % BTZ-3-Medium (NH₄Cl, 4,3 g/l; KH₂PO₄, 50 g/l; MgCl-6H₂O, 20 g/l; CaCl₂-2H₂O, 1 g/l; HEPES, 50 mM/l; Mineral-Lösung, 10 ml/l; Resazurin 0,2 %, 5 ml/l). Der Mikrokosmos wurde bis oben dergestalt gefüllt, dass wenig oder kein Headspace vorhanden war und dann mit Teflon^TM kaschierten Disks verschlossen und mit Aluminiumsiegeln durch Crimping versiegelt (Wheaton Co., Millville, NJ). Die Zugabe von Resazurin ermöglichte die Sichtbarmachung der anaeroben Bedingungen bei niedrigem Potenzial durch einen Farbumschlag von rosa nach farblos. Jeder Mikrokosmos wurde mit 5 ppm einer in Wasser gesättigten PCE- oder TCE-Lösung gespickt. Die Mikrokosmen wurden auf ihren Seiten in der anaeroben Kammer, im Dunklen, bei ambienter Raumtemperatur (22°C) bis zu 180 Tagen inkubiert.
Die Proben wurden am nächsten Tag als Zeit null (to) und zweimal wöchentlich auf die Dechlorierung von PCE oder TCE und die Bildung von cisDCE, Vinylchlorid oder Methan analysiert. Alle Proben wurden unter Verwendung einer Spritze mit einer aufgesetzten Kanüle (23 Gauge), die zum Durchstechen der Teflon^TM-Septa verwendet wurde, um eine flüssige Probe (5 ml) zu gewinnen, die in ein 10 ml fassendes Headspace-Fläschchen injiziert wurde, in der anaeroben Kammer entnommen. Die Proben wurden unter Verwendung eines HP-Headspace-Probengebers 7694, HP5890, Serie II GC (FID Detektor, HP 5 Kapillarsäule Nr. 19091J-215), HP3365 Chemstation Version A.03.34, getestet.
In 3 ist die Konzentration (Teile je eine Million Teile; ppm) von Chlorethen im Mikrokosmos-Medium als eine Funktion der Zeit (Tage) aufgetragen und veranschaulicht die Dechlorierung von Chlorethenen. Die Dechlorierung von PCE zu TCE konnte mithilfe der GC/FID nachgewiesen werden. Innerhalb von zwei Tagen wurde aus der Dechlorierung von TCE die Bildung von cisDCE nachgewiesen. Diese Ergebnisse wurden im Mikrokosmos gefunden, der mit 0,05 % Hefeextrakt plus Minimalsalzmedium (BTZ-3-Medium) melioriert wurde. Diese Ergebnisse können auch in Mikrokosmen gefunden werden, die ausschließlich mit dem Minimalsalzmedium melioriert wurden. Der Unterschied bestand darin, dass die Dechlorierung geringgradig verzögert ist. Es dauert vier Tage, bevor cisDCE nachgewiesen wird. Der Abbau von cisDCE würde über die nächsten zwei Wochen auftreten. Vinylchlorid und Ethen konnte nur in Spurenmengen nachgewiesen werden. Die „abgetötete" Kontrolle zeigte keinen Abbau von PCE oder TCE während der Dauer des Experiments. Zellwachstum wurde durch die Zunahme der Trübung des Mikrokosmos-Mediums und anhand der mikroskopischen Analyse gezeigt.
BEISPIEL 2
Generierung von PCR-Primern und -Sonden für die Amplifikation und den Nachweis der profilierten 16S-rRNA von Dehalococcoides ethenogenes
Der Nachweis und die Sequenzierung der Dehalococcoides ethenogenes-ähnlichen Organismen, die den Set der PCR-Primer verwendeten, sind in Tabelle 1 ersichtlich. Die PCR-Primer wurden unter Verwendung der Signatur-Sequenzregionen konzipiert. Zur Bestimmung der Stelle dieser Signatur-Sequenz wurde die Sequenz von Dehalococcoides ethenogenes (GenBank Nr. AF004928)[SEQ ID NO:7] unter Verwendung von MEGALIGN (DNAstar, Madison, WI) oder PILEUP (Genetics Computer Group, Madison, WI) mit 16S-rRNA-Sequenzen von 100 Organismen, die die wichtigsten Domänen, Familien und Gattungen in den bedeutenden Königreichen der Bakterien und Archaea darstellen, aligned. Die konservierten, variablen und hoch variablen Regionen konnten durch Eingrenzung der Konsensus-Sequenzen delineiert werden. Primer-Kandidatensequenzen wurden manuell aus den variablen und hoch variablen Regionen gewählt und ihre Einzigartigkeit wurde durch Bestimmung ihres Potenzials als Sonden für Sequenzen aus einer ribosomalen Sequenz-Datenbank unter Verwendung des „Online"-Sonden-Match-Programms aus dem Ribosomal Database Project II (htrp://www.cme.rnsu.edu/RDP/htmUindex.html)RDPII, Michigan State University, East Lansing, MI) bestimmt. Diese Analyse gab einen Überblick über Matches zwischen einer Sonde und ihrer potenziellen Target-Sequenz als ein Protokoll und als einen phylogenetischen Überblick aus. Die Programm-Ergebnisse zeigten die Sequenzen, die mit der Abfrage-Sequenz (wenn solche Sequenzen vorliegen) übereinstimmen und zeigten auch Sequenzen, die Mismatches, Deletionen und Insertionen aufwiesen, wobei die Anzahl und Positionen der Aberrationen angegeben wurden.
Die Sequenzen, die einzigartig waren und in diesem Test als Signatur-Sequenzen durchgingen, wurden dann als entweder ein Forward- oder Reverse-Primer konzipiert, der gewöhnlich von ihrer Position in der Sequenz abhängig war. Die einzigartigste Sequenz der Signatur-Sequenz (Spezifität) wurde in das 3'-Ende in einer der beiden Primer-Typen konzipiert. Die ausgewählten Primer sind in Tabelle 1 ersichtlich.
Die Primer wurden unter Verwendung von der standardmäßigen β-Cyanethylphosphoramidit-Kopplungschemie auf Controlled Pore Glass-Trägern (CPG-Träger) an einem automatisierten DNA-Oligonukleotid-Synthesizer (Applied Biosystems Model 392, Perkin-Elmer, Foster City, CA) synthetisiert.

Die Primer wurden, nachdem sie unter Verwendung der PCR synthetisiert waren, an Proben, die von Mikrokosmen gewonnen wurden, von denen bekannt ist, dass sie Dehalococcoides ethenogenes-ähnliche Organismen aufweisen, getestet. Die PCR-Produkte wurden anhand der Agarose-Elektrophorese nach Größenklassen getrennt und dann kloniert und sequenziert, um zu verifizieren, dass es sich bei den amplifizierten Sequenzen um Dehalococcoides ethenogenes-ähnliche 16S-rRNA-Sequenzen handelte. TABELLE 1 PRIMER FÜR DEHALOCOCCOIDES ETHENOGENES

FP DHE 32	5'AAG TCGAACGGTCTTAAGCA3' SEQ ID NO:9
RP DHE422	5' CGTCATTATTCTTCCCTGTG 3' SEQ ID NO:10
FP DHE 958	5'GGGAAACGACCTGTTAAGTCA 3' SEQ ID NO:11
RP DHE 1212	5'GGATTAGCTCCAGTTCACACTG 3' SEQ ID NO:12
RP DHE 1076	5'AAATTTAACTAGCAACAAGG 3' SEQ ID NO:13
FP DHE 795	5'GGAGTATCGACCCTCTCTG 3' SEQ ID NO:14
FP DHE 774	5'GGGAGTATCGACCCTCTC 3' SEQ ID NO:15
FP DHE 946	5'AGTGAACCGAAAGGGAAA 3' SEQ ID NO:16
FP DHE 385	S'GGGTTGTAAACCTCTTTTCAC 3' SEQ ID NO:17
RP DHE 806	5'GTTAGCTTCGGCACAGAGAG 3' SEQ ID NO:18
RP DHE 692	5'TCAGTGACAACCTAGAAAAC 3' SEQ ID NO:19
FP DHE1	5'GATGAACGCTAGCGGCG 3' SEQ ID NO:20
FP DHE 30	5'GTGCCTTATGCATGCAAG 3' SEQ ID NO:21
FP DHE 1187	5'AATAGGTTGCAACAGTGTGAA 3' SEQ ID NO:22
FP DHE 1175	5'AATGGACAGAACAATAGGTTGC 3' SEQ ID NO:23
RP DHE 1381	5'GGCACATCGACTTCAAGTGTT 3' SEQ ID NO:24
RP DHE 1381	5'GGCACATCGACTTCAAGTGTT 3' SEQ ID NO:25
FP DHE 558	5'TAACCGGGACG(AT)GTCATTCA 3'SEQ ID NO:26
FP DHE 593	5'GAGTACAGCAGGAGAAAAC 3' SEQ ID NO:27
RP DHE 1394	5'CCTCCTTGCGGTTGGCACATC 3' SEQ ID NO:28
RP DHE 1090	5'GGCAGTCTCGCTAGAAAAT 3' SEQ ID NO:29

BEISPIEL 3
Verwendung der Dehalococcoides ethenogenes-ähnlichen spezifischen Primer zum Nachweis dieser Organismen im Mikrokosmos
Nukleinsäuren wurden aus den Mikrokosmos-Kulturen mit einem Homogenisierungsverfahren mithilfe einer Kugelmühle, FastDNA Spin Kit for Soil (Bio 101, Vista, CA), das zur Isolation genomischer DNA aus allen Zelltypen konzipiert wurde, extrahiert. Ca. 10 ml der Mikrokosmos-Kultur wurden pelletiert und in 500 μl des Kulturmediums resuspendiert. Das resuspendierte Pellet wurde einem 2,2 ml fassenden konischen Röhrchen mit Schraubverschluss, das 1,5 g Glas- und Zirkoniumoxid-/Siliziumdioxid-Perlen in drei verschiedenen Größen (106 Mikron, 710–1180 Mikron) enthielt, zugefügt. Den Probenröhrchen wurden 978 μl Natriumphosphat-Puffer und 122 μl MT-Puffer zugefügt. Die Röhrchen wurden 30 Sekunden bei einer Geschwindigkeit von 5,5 an einem Fast Prep-Kugelmühlen-Homogenisator homogenisiert. Ein klarer Überstand wurde durch Zentrifugieren der Proben bei 14 000 × g für eine Dauer von 30 Sekunden erhalten.
Der Überstand wurde an ein reines Mikrozentrifugenröhrchen überführt, und es wurden 250 μl PPS-Reagenz zugefügt und gemischt. Das sich ergebende Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei 14 000 × g für die Dauer von 5 Minuten pelletiert. Der Überstand wurde an ein neues Mikrozentrigenröhrchen überführt, und es wurde 1 ml Bindungsmatrix zugefügt. Die Proben wurden 2 Minuten auf einen Rotator gegeben und dann 3 Minuten auf einem Arbeitstisch abgestellt, um das Absetzen der Siliziumdioxidmatrix herbeizuführen. Es wurden zwischen 500–700 μl des Überstandes entfernt und verworfen. Der restliche Überstand wurde zum Resuspendieren der Siliziumdioxidmatrix verwendet und an ein Spinfilter überführt. Das Spinfilter wurde 1 Minute bei 14 000 × g zentrifugiert und der Durchlauf dekantiert. Die Siliziumdioxidmatrix wurde mit 500 μl SEWS-M-Puffer gewaschen und 1 Minute bei 16 000 × g zentrifugiert. Der Durchlauf wurde verworfen und jedweder restliche Puffer in der Matrix wurde mithilfe einer 2-minütigen Zentrifugation bei 14 000 × g entfernt. Das Spinfilter wurde in ein Auffangröhrchen platziert und 5 Minuten in einem biologischen Abzug luftgetrocknet. Die genomische DNA wurde durch Zufügen von 60 μl sterilem, deionisiertem Wasser, Zusammenmischen der Matrix und des Wassers mit einer Pipettenspitze und 1-minütigem Zentrifugieren bei 14 000 × g eluiert.
Das 16S-rRNA-Gen fit Dehalococcoides ethenogenes wurde mittels der PCR-Amplifikation und der Gelelektrophorese nachgewiesen. Die 16S-Sequenzen wurden unter Verwendung von für Dehalococcoides ethenogenes spezifischen 16S-rDNA-Primern (in Tabelle 1 gezeigt) amplifiziert. Alle PCR-Amplifikationen wurden unter Verwendung des GeneAmp PCR-Kits with Taq-DNA-Polymerase (PE Applied Biosystems, Branchburg, NJ) in einem Perkin Elmer 9600 Thermocycler durchgeführt. Die Amplifikationsreaktionen enthielten 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCh, jeweils 10 μM Desoxynukleosidtriphosphat, jeweils 20 pmol Primer, 2,5 E Taq-Polymerase und 1 μl der genomischen Extraktion, verdünnt 1:10 in einem Endreaktionsvolumen von 50 μl. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 2 Minuten Denaturierung bei 95 °C, gefolgt von 30 Zyklen von 30 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 55 °C, 30 Sekunden bei 72 °C. 8 μl des PCR-Produkts wurde auf einem 2%igen Agarosegel (SeaKem GTG, FMC BioProducts, Rockland, ME), gefärbt mit Ethidiumbromid, sichtbar gemacht .
Ein Protokoll zum Direktnachweis, das 1 μl der Mikrokosmos-Kultur verwendete, wurde dem zuvor beschriebenen PCR direkt zugefügt.
Nachdem die Dehalococcoides ethenogenes-ähnlichen Sequenzen im aus kontaminiertem Boden entwickelten Mikrokosmos nachgewiesen waren, wurde FP DHE 1 (SEQ ID NO:20), RP DHE 1330 (SEQ ID NO:12) zur Amplifikation eines Fragments von 1212 by (oder 1221 bp), das (unter Verwendung des PCR dA/T-Cloning Systems, Invitrogen, Inc., CA) kloniert und (unter Verwendung von Modell 377 des DNA-Sequencer-Kits und -Systems, Applied Biosystems, Perkin-Elmer, Foster City, CA) sequenziert wurde, verwendet. Die Sequenz wurde unter Verwendung des Seqman II-Programms (DNAstar, Inc., Madison, WI) assembliert. Die gebildete 16S-rDNA-Sequenz Contig wurde mit 16S-rDNA-Sequenzen verglichen, die von Mikrokosmen erhalten wurden, die aus kontaminierten Böden von anderen Stellen gewonnen wurden, und der Vergleich ist in 4 ersichtlich.
4 zeigt ein Gel von Amplifikationsprodukten, die von der PCR-Amplifikation verschiedener Dehalococcoides ethenogenes generiert wurden, die aus einer Anzahl von mit entweder PCE oder TCE kontaminierten Industrieanlagen isoliert wurden. Alle Amplifilcationen wurden unter Verwendung von Primern SEQ ID NO: 17, gepaart mit 19 und SEQ ID NO: 18, gepaart mit 20 durchgeführt. Lanes 1 und 12 tragen die Molekulargewichtsmarker. Lanes 2 und 3 stellen die PCR-Produkte dar, die aus den Organismen generiert wurden, die aus dem Boden, enthaltend PCE, isoliert wurden. Lanes 4, 5, 6, 7, 8 und 9 stellen die PCR-Produkt aus Organismen dar, die aus dem Boden, enthaltend TCE, isoliert wurden. Lanes 10 und 11 enthalten negative PCR-Kontrollen. Wie anhand der Daten von allen Proben ersichtlich ist, waren alle Proben durch die verwendeten Primer nachweisbar.
Die aneinandergrenzenden Sequenzen von jeder Stelle waren einzigartig, wobei sie 96 bis 99 Ähnlichkeit miteinander aufwiesen. Die Unterschiede in der Sequenz sind in Tabelle 2 angemerkt. Ein bedeutender Unterschied besteht in der Konsensus-Sequenz, die von allen Stämmen (CS) erhalten wurde, die an kontaminierten Stellen nachgewiesen wurden und die Referenz-Sequenz durch die veröffentlichte Sequenz von Stamm DHE-195 (Tabelle 2) dargestellt wurde. An den DHE-(CS)-Positionen 1088–1096 (E. coli-Koordinaten E1146–E1156) liegt eine Deletion von neun Basen vor. Die Sequenz in den CS-Stämmen liest sich wie folgt: ATTTTCTAGCGAGACTG (SEQ ID NO:31); im DHE-195-Stamm wird sie wie folgt gelesen:
ATTTTCTAGCGAGACTAGCGAGACTG (SEQ ID NO:32) (die doppelt unterstrichene Sequenz stellt die Sequenz dar, die in den CS-Stamm-Sequenzen deletiert ist. Unterschiede in den Sequenzen wurden an sechs anderen Basenpositionen, wie nachstehend in Tabelle 2 ersichtlich ist, gefunden.
TABELLE 2

Legende: DHE Nr. = Konsensus-Zahl; Zahl (+) = letzte Basen-Koordinate vor einer Basen-Deletion; im Fettdruck (rot) sind die Basen indikativ für Basen-Sequenzen, die sich von DHE 195 unterscheiden; (*), Basen im Fettdruck und Blöcke von Zellen (Base und Koordinate) impliziert eine Sequenz von allen Isolaten von 16S-Sequenzen, die sich von DHE 195 unterscheiden.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte 16S-rDNA-Sequenz, die auf einen dechlorierenden Bakterienstamm hindeutet, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 30; und (b) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das vollkommen komplementär zu (a) ist.
Isolierter Bakterienstamm, umfassend jedwede eine der Sequenzen nach Anspruch 1, worin der Stamm die Fähigkeit zum Dechlorieren chlorierter Verbindungen aufweist.
Verfahren zur Identifikation eines dechlorierenden Bakterienstamms, umfassend: (i) Extrahieren genomischer DNA aus einer Zelle, die vermutlich zum Dechlorieren chlorierter Verbindungen fähig ist; (ii) Sondieren der extrahierten genomischen DNA mit einer Sonde, die sich von jedweder einen der Sequenzen nach Anspruch 1 unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen herleitet, worin die Identifikation eines hybridisierbaren Nukleinsäurefragments die Anwesenheit eines Bakteriums bestätigt, das zum Dechlorieren chlorierter Verbindungen fähig ist.
Verfahren zur Identifikation eines dechlorierenden Bakterienstamms, umfassend: (i) Extrahieren genomischer DNA aus einer Zelle, die vermutlich zum Dechlorieren chlorierter Verbindungen fähig ist; und (ii) Amplifizieren der extrahierten genomischen DNA mit mindestens einem Oligonukleotid-Primer, der einem Anteil von jedweder einen der Sequenzen nach Anspruch 1 dergestalt entspricht, dass Amplifikationsprodukte gebildet werden; worin die Anwesenheit von Amplifikationsprodukten die Anwesenheit eines Bakteriums bestätigt, das zum Dechlorieren chlorierter Verbindungen fähig ist.
Verfahren zum Dechlorieren chlorierter Verbindungen, umfassend das Kontaktieren einer chlorierten Verbindung mit dem isolierten Bakterienstamm nach Anspruch 2 unter Bedingungen, unter denen die Dechlorierung auftreten kann.
Verfahren nach Anspruch 5, worin die dechlorierende Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Kohlenstofftetrachlorid, Tetrachlorethen, Chloroform, Dichlormethan, Trichlorethen, Dichlorethylen, Vinylchlorid und Chloraromaten.