DE4442473A1 - Immunosensor - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen Sensor auf der Grundlage eines akustischen Plattenmoden-Sensors, der zum spezifischen Nach­ weis von Teilchen und Molekülen, insbesondere zur direkten Messung von Immunoreaktionen geeignet ist.

Der schnelle Nachweis geringster Substanzmengen aus einem Gemisch chemisch und physikalisch sehr ähnlicher Stoffe hat, besonders in den Bereichen medizinische Diagnostik, Umwelt- und Lebensmittelanalytik und der biotechnischen Prozeßkon­ trolle, große Bedeutung. Von besonderem Interesse sind Ana­ lyseverfahren, die nur kleine Probenvolumina erfordern, eine direkte Überwachung der stattfindenden Vorgänge ermöglichen und preisgünstig zu realisieren sind.

Im Bereich der Immunosensorik stellen trägergebundene mono­ klonale Antikörper durch die ihnen eigenen hohen Bindungs­ konstanten (10⁶-10¹² Liter/Mol) und außerordentlich hohen Selektivität bezüglich des Antigens ein geeignetes Konzept dar, das Antigen unter Fremdmolekülen separat zu erkennen.

Die Antigen-Antikörper-Bindung wird in der Regel indirekt über weitere radioaktiv-, enzym- oder fluoreszenzmarkierte Antikörper nachgewiesen. Hierbei handelt es sich jedoch um zeitaufwendige Mehrschrittverfahren, die für on-line Prozeß­ kontrollen nicht einsetzbar sind, vgl. J.H. Peters und H. Baumgarten, "Monoklonale Antikörper. Herstellung und Charak­ terisierung", Springer-Verlag, 2. Aufl. 1990.

Eine direkte Unterscheidung von freiem Antikörper und Anti­ gen-Antikörper-Komplex ohne Trennung durch aufeinanderfol­ gende Inkubations- und Waschschritte kann mit Hilfe der Ultraschalltechnik erfolgen. Im Vergleich zu kompetitiven bzw. Sandwich-Tests sind in der Ultraschalltechnik keine markierten Antigene bzw. Sekundärantikörper erforderlich. Immunreaktionen an der Oberfläche eines Sensorkristalles führen zu Änderungen in dessen Schwingungsverhalten. Anti­ gen-Antikörper-Reaktionen wurden bereits mit Hilfe von Schwingquarzen nachgewiesen, vgl. J. Ngeh-Ngwainbi, P.-H. Foley, Shia S. Kuan, G.G. Guilbault, J. Am. Chem. Soc. 108, 5111 (1986) sowie Joy E. Roederer und G. J. Bastiaans, Anal. Chem. 55, 2333 (1983). Der Nachweis von Antigen-Antikörper- Reaktionen mit APM wurde ebenfalls schon beschrieben, vgl. J.C. Andle, J.F. Vetelino, R. Lec, D.J. McAllister, Proc. IEEE Ultrason Symp., 1989, S. 579 und J.C. Andle, J.T. Weaver, D.J. McAllister, F. Josse, J.F. Vetelino, Sensors and Actuators B, 13, 437 (1993). Jedoch wurde stets mit der Fundamentalfrequenz gearbeitet und nur ein schlechtes Signal-Rauschverhältnis erzielt. Die Empfindlichkeitsgrenzen von Radioimmunotests und ähnlichen Verfahren konnten jedoch bisher nicht erreicht werden.

Als für einen Biosensor in Frage kommende akustische Bauele­ mente können Schwingquarze, Oberflächenwellenbauelemente (SAW) und akustische Plattenmodensensoren (APM) angeführt werden. Ihre Fraktionsweise beruht auf dem piezoelektrischen Effekt des dem Sensor zugrundeliegenden Substrates. Beim SAW sowie beim APM besteht dieses Substrat in der Regel aus einem plattenförmigen Körper, auf dem als elektroakustische Wandler ineinandergreifende Fingerstrukturen (interdigital transducers (IDT)) ausgebildet sind. Auf dem plattenförmigen piezoelektrischen Substratkristall sind mindestens zwei IDT vorhanden. Ein IDT dient als Sender für die akustischen Wel­ len während ein weiterer über das gleiche elektroakustische Wirkprinzip im umgekehrten Sinne als Empfänger dient. SAW und APM unterscheiden sich jedoch grundsätzlich in der An­ ordnung der IDT. So ist ein SAW derart ausgebildet, daß sich die akustischen Wellen an der Oberfläche zwischen Sende-IDT und Empfangs-IDT fortpflanzen. Hingegen wird beim APM die akustische Welle durch das Substrat in einem bestimmten Win­ kel (in Abhängigkeit vom gewählten Substrat sowie von der Geometrie des IDT) zur entgegengesetzten Plattenoberfläche abgestrahlt, von dort zwischen den beiden Oberflächen des plattenförmigen Kristalls mehrfach reflektiert und von dem zweiten IDT schließlich wieder aufgenommen. Im Falle dünner Kristallplatten bilden sich längs der Kristalldicke stehende Wellen aus und die akustische Welle breitet sich parallel zur Kristalloberfläche aus. Besteht daher die Aufgabe darin, die Adsorption eines Stoffes zu messen, so muß im Falle des SAW diese empfindliche Stelle 11 zwischen sendendem 13 und empfangenden 12 IDT angeordnet sein, wohingegen dies beim APM auf der Rückseite der Platte 15′ erfolgen kann, vgl. Fig. 1, 12′ und 13′. Es wird damit beim APM eine unmittel­ bare Nähe der elektrischen Zuführungen sowie der IDT-Elek­ troden zu der im allgemeinen elektrolythaltigen Meßlösung vermieden. Damit werden Korrosionsprobleme verhindert, die im allgemeinen bei für diesen Zweck verwendeten SAW-Bauele­ menten auftreten und Langzeitstabilität sowie Lebensdauer des Sensors deutlich erhöht. Darüber hinaus erleichtert die strikte Separation der Elektroden die Reinigung der Kri­ stalloberfläche und die Filmpräparation.

Hinsichtlich der Empfindlichkeit gibt es für die drei aku­ stischen Wellenbauelemente die folgenden in Fig. 2 darge­ stellten Beziehungen zwischen Frequenz und Massenbelegung:

Der Schwingquarz 20 weist die höchste Massenempfindlichkeit dieser drei vorgestellten Bauelemente auf. Jedoch ist bei diesem Bauelement die höchste Betriebsfrequenz auf etwa 20 bis 30 MHz beschränkt. Damit ist natürlich auch die meßbare Massenbelegung durch diesen Grenzwert eingeschränkt.

SAW-Bauelemente 21 arbeiten bei höheren Frequenzen als Schwingquarze und können daher geringere Massenänderungen detektieren. Sie können jedoch nicht wirksam in Flüssigkei­ ten arbeiten, da die Wellenausbreitung durch die Viskosität von Film oder Flüssigkeit sowie durch Moden-Konversion be­ einträchtigt wird.

APM-Sensoren 22 weisen im Gegensatz zu Quarzresonatoren und SAW eine nur geringe Massenempfindlichkeit auf.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen selektiven Immunosensor hoher Empfindlichkeit bereitzustellen.

Die Aufgabe wird gelöst mit den Merkmalen der Patentansprü­ che.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen und Zeichnungen erläutert.

Fig. 1 zeigt den Querschnitt eines SAW-Sensors, wobei 10 das Substrat, 11 die Reaktionsschicht, 12 den Empfangs-IDT, 13 den Sende-IDT und 14 den zu untersuchenden Analyten dar­ stellt. Entsprechende Bezeichnungen 10′ bis 14′ gelten für den im Querschnitt dargestellten APM-Sensor.

Fig. 2 zeigt die Frequenz-Massenbelegungs-Beziehung von Schwingquarzen 20, SAW-Bauelementen 21 und APM-Bauelementen 22.

Fig. 3 zeigt die praktisch ermittelte 30 und die theoretisch errechnete 31 Frequenz-Massenempfindlichkeits-Beziehung für APM-Sensoren.

Fig. 4 zeigt einen Querschnitt durch einen Teil eines APM- Sensors entlang der Linie I-I gemäß Fig. 6, wobei 40 das Substrat, 41 die Reaktionsschicht und 45 eine Fingerelek­ trode des IDT wiedergibt.

Fig. 5 zeigt schematisch sich überlappende elektroakustische Spektren eines 50 MHz bzw. eines 75 MHz IDT, 50 bzw. 51, wo­ bei mit 52 andere auftretende Nebenmoden des Spektrums dar­ gestellt sind.

Fig. 6 zeigt die Draufsicht auf eine Vorrichtung ausgelegt zur Kompensation äußerer Einflüsse mit den Bedeutungen 60 für das Substrat, 62 und 63 für Empfangs- bzw. Sende-IDT der Meßstrecke, die mit einer aktiven Reaktionsschicht 61 verse­ hen ist, sowie 62′ und 63′ für die Referenzstrecke, die mit einer für den zu messenden Stoff unempfindlichen Reaktions­ schicht 61′ versehen ist oder unbelegt ist.

Fig. 7 gibt das Temperaturverhalten für eine einfache 70 und für eine doppelte 71 Verzögerungsleitung, letztere in Tempe­ raturkompensationsschaltung wieder.

Fig. 8 und Fig. 9 sind Meßkurven, die mit den erfindungsge­ mäßen Sensoren erhalten werden.

Fig. 10 zeigt den Querschnitt einer bevorzugten Ausführungs­ form eines Sensors mit einer Gitterstruktur 101 an der den IDT 102 gegenüberliegenden Substratoberfläche.

Fig. 11 zeigt den Querschnitt einer weiter ausgebildeten Ausführungsform eines Sensors gemäß Fig. 10 mit einer weite­ ren Gitterstruktur 113 zwischen den IDT 112.

Die Erfindung stellt einen Sensor zum spezifischen Nachweis von Teilchen oder Molekülen bereit, mit einem plattenförmi­ gen Substrat, in dem sich akustische Plattenmoden ausbilden können, einem ersten und zweiten elektroakustischen Wandler auf der Unterseite des Substrats und einer Reaktionsschicht auf der Oberseite des Substrats, wobei der erste elektroaku­ stische Wandler eine akustische Welle mit einer ersten Fun­ damentalfrequenz und m-ten Harmonischen aussendet (m = 1, 2, 3, 4, . . .), der zweite elektroakustische Wandler so ausgebil­ det ist, daß dieser eine akustische Welle mit einer zweiten Fundamentalfrequenz und n-ten Harmonischen (n = 1, 2, 3, 4, . . .) empfangen kann, wobei die Frequenz mindestens einer m-ten (m = 1, 2, 3, 4, . . . Harmonischen im wesentlichen gleich der Frequenz einer n-ten (n = 1, 2, 3, 4, . . .) Harmo­ nischen ist. Alternativ können die Wandler und die Reakti­ onsschicht gemeinsam auf entweder der Unterseite oder Ober­ seite angeordnet sein. Weiterhin ist es möglich, daß die Wandler bzw. die Reaktionsschicht auf der Unter- und Ober­ seite vorhanden sind. Die Wirkungsweise des gemäß Anspruch 1 ausgebildeten Sensors wird genauer nachstehend in dieser Be­ schreibung und in dem Beispiel erläutert.

Die Empfindlichkeit eines akustischen Sensors hängt von der Art der Wechselwirkung zwischen Probensubstanz, akustischer Welle, dem verwendeten Wellentyp und dem Kristallschnitt ab. Zum spezifischen Molekülnachweis wird bevorzugt der soge­ nannte Massenbelegungseffekt ausgenutzt. Moleküle, die an eine Kristalloberfläche gebunden werden, erhöhen deren Mas­ senbelegung und reduzieren so die Ausbreitungsfrequenz f_o der akustischen Welle.

Die Ausführungsform gemäß Anspruch 2 weist eine Massen­ empfindlichkeit auf, die proportional zu f² ist, df/dm_s = -0,0366 · f^2,01, Fig. 3, 30. Theoretische Berechnungen, die den Sensorkristall als isotropes Medium behandeln, sagen voraus, daß die Massenempfindlichkeit von APM-Sensoren pro­ portional zu f_o/h ansteigt, wobei h die Dicke des Sensorkri­ stalles bezeichnet, S. J. Martin, A.J. Ricco, T.M. Niemczyk, G.C. Fryer, Sensors and Actuators 20 253 (1989). Zieht man jedoch die anisotrope Struktur von ZX-LiNbO₃ in Betracht, ergibt sich eine Proportionalität zu f^1,7, df/dm = -0,0791·f^1,70, Fig. 3, 31. Es wird angenommen, daß die er­ höhte Massenempfindlichkeit bei dem erfindungsgemäßen Sensor auf die Kopplung zwischen APM und OFW (Oberflächenwellen) zurückzuführen ist.

Vorzugsweise wird die Vorrichtung so ausgebildet, daß sich die nachstehend erläuterte Verhaltensweise einstellt.

Bei bestimmten Kombinationen von Substrat (z. B. LiNbO₃) und Ausrichtung (ZX-LiNbO₃) wird die Ausstrahlung der Volumen­ wellen (bulk waves, BAW) durch Vorliegen von akustischen Pseudooberflächenwellen (pseudo-SAW; PSAW) beeinflußt. PSAW liegen bei den meisten Substratmaterialien in bestimmten Ausrichtungen vor mit einem unterschiedlichen Grad an Dämpfung und elektroakustischer Kopplung. Die Dämpfung ist auf die Abstrahlung von Energie aus den PSAW in die sich fortpflanzenden Volumenwellen (BAW) zurückzuführen. ZX- LiNbO₃ weist vorwiegend eine PSAW-Ausrichtung auf und die Abstrahlung der Massewelle wird durch das Vorliegen einer PSAW beeinflußt. In diesem Fall verstärkt die von den PSAW abgestrahlte Volumenwelle die elektroakustische Kopplung von einem oder mehreren Plattenmoden mit vorwiegend (transver­ sal) horizontaler Polarisation hinsichtlich der restlichen Moden in dem Spektrum.

Bei dünnen parallelen Platten erzeugt die PSAW in Volumen­ wellen abgestrahlte Energie verschiedene Moden, die sich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten fortpflanzen, und gleichzeitig den Randbedingungen an der oberen und unteren Fläche der Platte genügen. Solche Moden werden PSAW-APM ge­ nannt und werden bei den erfindungsgemäßen Biosensoren ange­ wendet. Es ist anzumerken, daß die Moden alle drei Teilchen­ verschiebungen aufweisen, hinsichtlich zweien davon (verti­ kal und longitudinal) jedoch nur geringe oder vernachlässig­ bare, verglichen mit der schräg horizontalen Verschiebung.

Die gemessene Empfindlichkeit ist proportional zu f², wobei f die Frequenz darstellt. Die Abhängigkeit gemäß f² ist ver­ mutlich auf Oberflächenwellen zurückzuführen. Die ausgewähl­ ten Moden weisen stärkere oberflächen-typische Dämpfungsfel­ der auf, die mit den PSAW verbunden sind. Diese PSAW neigen dazu, die Energie der APM an der Oberfläche zu lokalisieren.

Bei einem geeigneten Eingangs-IDT ist die sensitive Oberflä­ che (oder der Wechselwirkungsbereich) derart gestaltet, daß der einen Störeinfluß liefernde Film eine SAW-ähnliche kon­ tinuierliche Schwingung mit der durch die Oberfläche be­ grenzten Energie "sieht". Es ist zu beachten, daß jeder ein­ fallende akustische Strahl an der Grenzfläche als Quelle für PSAW wirkt, da die Ausrichtung eine PSAW-Ausrichtung ist. Die gemessene f²-Abhängigkeit der Masseempfindlichkeit für die Plattenmoden an ZX-LiNbO₃ ist eine Folge der von APM ab­ geleiteten PSAW. Das führt dazu, daß die PSAW-APM sehr empfindlich auf einen Störeinflüsse ausübenden Film reagie­ ren und somit insbesondere den Einsatz bei Biosensoren er­ möglichen.

Es wurde ermittelt, daß bei der Arbeitsfrequenz von 51,1 MHz beispielsweise eine Massenempfindlichkeit von -99,4 [Hz · mm²/ng] erreichbar ist. In Tabelle I sind für APM-Sensoren auf der Basis von ZX-LiNbO₃ Arbeitsfrequenz und Massen­ empfindlichkeit dargestellt. Die Indices bedeuten: ^m) = Meßwert, ^c) = extrapolierter Wert, *) Messung bei einer hö­ heren Harmonischen.

Arbeitsfrequenz [MHz]
Massenempfindlichkeit [Hz · mm²/ng] |13,2|-6,44 m)
26,4|-24,7 m)
34,0|-48,7 m)
41,6/41,8	-65,9 m)/-59,4 m)
51,1|-99,4 c)
153,3|-904,5 c)*

Die Werte besonders jene ab etwa 20 MHz sind bereits für APM-Sensoren unerwartet hoch.

Die APM-Sensoren können gemäß vorliegender Erfindung so aus­ gelegt werden, daß z. B. über die Variation des Metallisie­ rungsverhältnisses von 0,7 a 1,5 ein Spektrum akusti­ scher Wellen erzeugt wird, das reich an höheren Harmonischen ist. Durch geeignete Wahl der Meßanordnung kann bei einer bevorzugten Harmonischen gearbeitet werden. Sende- und Empfangs-IDT können beispielsweise in 4-Finger-Struktur aus­ gelegt sein und die in Anspruch 6 dargelegten Parameter auf­ weisen. Im vorliegenden Fall ist m = n = 3. Diese Betriebs­ weise genügt den praktischen Erfordernissen die z. B. an eine praktische Messung einer Antigenankopplung an die mit Anti­ körpern belegte Kristalloberfläche gestellt werden.

Durch unterschiedliche Ausbildung von Sende- und Empfangs- IDT auf dem piezoelektrischen ZX-LiNbO₃-Kristall ist es mög­ lich, bei den höheren Frequenzen die senderseitige Fundamen­ talfrequenz und Nebenmoden zu unterdrücken und somit ein noch höheres Signal- zu Rauschverhältnis zu erreichen. Wird beispielsweise ein Sende-IDT als Vierfingerstruktur ausge­ bildet und bei 50 MHz betrieben, wobei ein Elektrodenmetal­ lisierungsverhältnis a von 1 a 1,5 zur Anwendung kommt (siehe Fig. 4, in der ein Querschnitt durch einen APM-Sensor dargestellt ist und worin d den Abstand zwischen der Kante eines IDT-Fingers 46 zur gleichen Kante des nächsten IDT- Fingers 47 darstellt und λ die Periode des IDT darstellt) so werden höhere Harmonische z. B. 150 MHz, (dritte Harmoni­ sche), 250 MHz, (fünfte Harmonische) usw. erzeugt. Bei Aus­ legung des Empfänger IDTs in Dreifingeranordnung, der für eine Fundamentalfrequenz von 75 MHz ausgebildet ist, ergeben sich die höheren Harmonischen 150 MHz (zweite Harmonische), 300 MHz (vierte Harmonische) usw. Von dem vom Sende-IDT aus­ gestrahlten Spektrum werden daher die Fundamentalfrequenz von 50 MHz und weitere Nebenmoden unterdrückt und vornehm­ lich jene Frequenz empfangen, die mit einer Harmonischen des Empfangs-IDT annähernd übereinstimmt. In dem erörterten Bei­ spiel geschieht dies bei einer Frequenz von 150 MHz. Wenn die Vielfachen der Harmonischen des Sende-IDT mit m bezeich­ net werden und die Vielfachen der Harmonischen des Empfangs- IDT mit n, so liegt hier eine Übereinstimmung vor, wenn m = 3 ist und n = 2 ist. Diese Vorgehensweise wird näher durch Fig. 5 erläutert.

Mit derartigen APM-Sensoren, die mit einer Frequenz von etwa 150 MHz arbeiten, ist eine Massenbelegung von etwa 0,22 ng/mm² nachweisbar. Dieser Wert ist mit Antigenbelegungs­ dichten zu vergleichen, die typischerweise in der Immunosen­ sorik erzielt werden.

Die erfindungsgemäße Ausnutzung von höheren Harmonischen, und/oder die besondere Ausgestaltung der IDT zur Unter­ drückung der senderseitigen Fundamentalfrequenz sowie von Nebenmoden führt somit bei ausreichend handhabbaren Platten­ dicken h zu praktisch nutzbaren Bauelementen, die für die weitere Ausgestaltung der Sensoroberflächen robust genug sind, eine sehr geringe Stoffmenge in Lösung durch eine spe­ zifische Massenbelegung nachweisen zu können und dazu den Vorteil der Korrosionsbeständigkeit gegenüber elektrolythal­ tigen Flüssigkeiten aufweisen.

Das Plattenmodenspektrum einer dünnen Kristallplatte ist durch das Verhältnis von Plattendicke h zu IDT-Periode λ be­ stimmt. Nur wenn dieses Verhältnis geeignet gewählt wird, läßt sich ein Spektrum mit einer oder mehreren dominanten Moden und ausreichendem Nebenmodenabstand erhalten. Hohe Werte von h/λ; wie sie beim Design hochfrequenter APM auf Kristallen gut handhabbarer Dicke auftreten, führen zu uner­ wünschten Störungen des Sensorsignals durch unzureichende Nebenmodenunterdrückung und geringen Nebenmodenabstand. Die Verwendung höherer Harmonischer vermeidet dieses Problem. Zwar wird bei höheren Frequenzen gemessen, aber bei geeigne­ ter Ausgestaltung der Elektroden wird wie oben erläutert, die Modendichte stark reduziert bzw. im wesentlichen durch den Wert von h/λ für die Fundamentalfrequenz bestimmt. Im Vergleich zu SAW-Bauelementen, die vorwiegend nur eine akustische Mode und deren Harmonische übertragen, ist die Konstruktion eines APM-Sensors, der bei höheren Harmonischen arbeitet, wesentlich aufwendiger, da ein breites Moden­ spektrum zu berücksichtigen ist.

Für eine praktische Anwendung des Sensors sind viskoelasti­ sche Einflüsse von Film und Flüssigkeit zu berücksichtigen. Derartige Einflüsse tendieren dazu, dem durch Massenbelegung hervorgerufenen Meßsignal entgegenzuwirken. Dabei ist zu er­ warten, daß dieser Effekt mit abnehmender Kristalldicke an Bedeutung gewinnt. Der Verzicht auf die Verwendung sehr dün­ ner Kristallplatten durch den Einsatz höherer Harmonischer bietet daher über die bessere Handhabbarkeit des Sensors hinaus den Vorteil, daß viskoelastische Einflüsse von Film und Flüssigkeit begrenzt werden.

Vorzugsweise wird der erfindungsgemäße APM-Sensor in einer Vorrichtung betrieben, bei der zwei Wandleranordnungen mit jeweils einem ersten und einem zweiten Wandler vorliegen, wobei eine als Meßanordnung und die andere als Referenzan­ ordnung dient. Praktisch wird dies derart gestaltet, daß wie in Fig. 6 dargelegt, zwei Verzögerungsstrecken auf dem piezoelektrischen Kristall aufgebracht werden, wobei zwi­ schen den jeweiligen Sende- 63, 63′ bzw. Empfangs-IDT 62, 62′ jeweils stofflich identische Schichten 61, 61′ aufge­ bracht werden, die sich lediglich hinsichtlich der Aktivität zu dem zu messenden Stoff unterscheiden. Dies kann bei­ spielsweise durch nachträgliche Desaktivierung einer dieser Strecken erfolgen, die dann als Referenz 61′ dient. Die Be­ schichtungen sind nicht notwendigerweise ausschließlich zwi­ schen den IDT lokalisiert. Sie können auch die nicht kontak­ tierte Sensoroberfläche großflächig bedecken. Durch Diffe­ renzschaltung können Temperatureffekte und unspezifische Massenbelegung gegeneinander aufgehoben werden (vgl. Fig. 7 für Temperaturkompensation).

Für den Nachweis eines Antigens durch einen Antikörper wird durch verschiedene Immobilisierungsverfahren eine den Anti­ körper enthaltende Schicht auf den Sensor aufgebracht. Dies kann unter Verwendung von Aminosilan und Glutaraldehyd mit durch Ionenaustausch- oder Affinitätschromatographie auf­ gereinigtem Antikörper erfolgen. Weitere Möglichkeiten sind die Verwendung von Dextranfilmen oder die Verwendung von Si­ likagel. Die nachstehende Tabelle 11 zeigt die Antigenbin­ dungskapazitäten entsprechend derivatisierter Kristallober­ flächen, wie sie mit Hilfe von Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA) bestimmt wurden.

Tabelle II

Wird der Sensor in der vorstehend angeführten Differenz­ schaltung betrieben, so kann eine der beiden vorliegenden Strecken mit UV-Strahlung desaktiviert bzw. gar nicht mit einem Rezeptor versehen werden und als Referenzstrecke die­ nen.

Die erfindungsgemäßen APM-Sensoren sind neben dem vorwiegend zugedachten Zweck, nämlich zur Verfolgung und Bestimmung von Immunoreaktionen, d. h. Antikörper-Antigen-Reaktionen, Anti­ gen-Antikörper-Reaktionen und Kombinationen davon auch zum Nachweis anderer spezifisch bindender Proteine und Makromo­ leküle geeignet, die nach dem Rezeptor-Akzeptor-Prinzip sich umsetzen und eine genügende Massenbelegung erzeugen. Als Beispiele können neben biologisch und biochemisch interes­ santen Proteinen auch andere organische Polymerisate, anor­ ganische Metallionen und pH-Änderungen angeführt werden. Sowohl Erhöhungen als auch Erniedrigungen der Massenbelegung sind meßbar.

Das nachstehende Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel Nachweis von Antigen-Antikörper-Reaktionen unter Verwendung eines APM-Sensors bei 151 MHz

Ein APM-Sensor wurde konstruiert, so daß der Sende-IDT und der Empfangs-IDT mit 50,37 MHz Fundamentalfrequenz betrieben wurden, d. h. es wurde bei einer Frequenz von 151,1 MHz (dritte Harmonische für den Sende-IDT und für den Empfangs- IDT) gearbeitet. Der Sensorkristall besteht aus zwei neben­ einander liegenden Sensorstrecken.

Technische Daten des APM-Bauelements:
Dicke der Kristallplatte von ZX-LiNbO₃ h = 0,5 mm
Fundamentalfrequenz f etwa 50,4 MHz, λ = 88 µm (h = Platten­ dicke, λ = Wellenlänge des IDT).

Die Elektrodenbreite wird als a · d/2 festgelegt, wobei d = λ/4 und a das Elektrodenmetallisierungsverhältnis wie in An­ spruch 4 ausgewiesen ist.

Beide Sensorstrecken wurden zunächst unter Verwendung von Aminosilan und Glutaraldehyd beschichtet. Anschließend wurde nur auf einer der beiden Strecken AC-aufgereinigter Antikör­ per (rabbit anti goat IgG) immobilisiert. Diese Bahn diente im folgenden als Meßstrecke, die andere Bahn als Referenz­ strecke.

Nach 1 Stunden wurde der Referenzflüssigkeit (1,6 ml Phos­ phatpuffer) 20 µl (48 µg) Antigen (goat anti-rabbit IgG) zu­ gesetzt und das Differenzsignal zwischen aktiver und desak­ tivierter Sensorstrecke beobachtet. Es war eine deutliche Reduzierung der akustischen Ausbreitungsfrequenz, bedingt durch eine wesentlich stärkere Reaktion der aktiven Sen­ sorstrecke, zu verzeichnen, vgl. Fig. 8. Erneute Antigen­ zugabe (20 µl) 48 µg nach 2,5 Stunden führte nur noch zu einer geringen Signaländerung. Die Bindungsstellen an der Kristalloberfläche waren bereits nahezu vollständig abgesät­ tigt. Injektion von 20 µl (48 µg) Antigen nach 3,5 Stunden beeinflußte das Differenzsignal nicht mehr. Dieses Beispiel zeigt, daß der Nachweis von Antigen mit einem Antikörper be­ schichteten APM-Sensor möglich ist.

Der Versuch wurde wiederholt unter ähnlichen Bedingungen, jedoch unter Verwendung von goldgelabeltem, Antigen. In die­ sem Fall betrug die Meßfrequenz 153,3 MHz, die Fundamental­ frequenz 51,1 MHz. Nach 2 Stunden wurde der Referenzflüssig­ keit (1,6 ml PBS) 10 µl (1,1 µg) Antigen (goat anti-rabbit IgG Goldkonjugat) zugesetzt und das Differenzsignal zwischen aktiver und desaktivierter Sensorstrecke beobachtet. Auch in diesem Fall war eine deutliche Reduzierung der akustischen Ausbreitungsfrequenz, bedingt durch eine stärkere Reaktion der aktiven Sensorstrecke zu beobachten, vgl. Fig. 9. Er­ neute Antigenzugabe (10 µl, 1,1 µg) nach 4 Stunden führte nur noch zu einer vergleichsweise geringen Signaländerung. Die Bindungsstellen an der Kristalloberfläche waren bereits nahezu abgesättigt. Injektion von 10 µl (1,1 µg) Antigen nach 6 Stunden beeinflußte das Differenzsignal nicht mehr. Nach 8 Stunden wurden dem System 10 µl (26 µg) Antikörper vom Typ rabbit anti-goat IgG zugesetzt. Dieser Antikörpertyp kann mit goat anti-rabbit IgG Goldkonjugat sowohl in der Lö­ sung als auch an der Sensoroberfläche reagieren. Dabei bil­ den sich in der Lösung Antigen/Antikörper-Komplexe, die - ebenso wie der Antikörper selbst - an der Sensoroberfläche reagieren. Dabei bilden sich in der Lösung Antigen/Anti­ körper-Komplexe, die - ebenso wie der Antikörper selbst - an der Sensoroberfläche adsorbieren können. Tatsächlich wurde wiederum eine Änderung im Differenzsignal beobachtet. Es konnte auch in diesem Fall ein Nachweis von Antigen erbracht werden.

Die erfindungsgemäßen Sensoren weisen vorzugsweise ein piezoelektrisches Substrat mit Ausrichtung (beispielsweise ZX-LiNbO₃) mit zwei unterschiedlichen Arten von IDT-Struktu­ ren (Sender und Empfänger) mit unterschiedlicher Anzahl an Elektrodenpaaren auf, die bei unterschiedlichen Frequenzen betrieben werden. Der Aufbau der Sende- bzw. Empfängerelek­ troden ist so auszulegen, daß die von PSAW herrührenden Plattenmoden sich nicht überlappen und nur ein ausgewählter Mod für den Meßvorgang verwendet wird, vgl. Fig. 5. Dabei spielen für die Wahl der Fundamentalfrequenz Ausgestaltung und Anzahl der Fingerelektroden eine Rolle.

In anderen Worten, Sende- und Empfangs-IDT sind derart aus­ zulegen, daß sie einschließlich der Harmonischen über einen gewünschten Bereich des Spektrums jeden anderen Mod ausfil­ tern (unterdrücken) und nur Modenpaare, bei den Harmonische mit im wesentlichen gleicher Frequenz vorliegen oder mehrere im Spektrum ausreichend beabstandete Modenpaare bilden. Bei dem anhand von Fig. 5 gezeigten Beispiel wird ein erstes Mo­ denpaar bei einer Frequenz von 150 MHz von der zweiten Har­ monischen des einen Wandlers und der dritten Harmonischen des anderen Wandlers gebildet. Ein weiteres Modenpaar bilden die sechste und neunte Harmonische bei einer Frequenz von 450 MHz. Ziel einer solchen Maßnahme ist es durch Nebenmoden unbeeinflußte Einzelmoden hoher Frequenz zu erhalten. Eine solche Unterdrückung von Nebenmoden vermeidet eine Beein­ trächtigung der Filterwirkung und folglich der Phasen­ verschiebung und erhöht die Sensorempfindlichkeit und die Reproduzierbarkeit.

Eine detaillierte Untersuchung des mit jedem elektroakusti­ schen Wandler in der Struktur verbundenen Plattenmoden­ spektrums, eine geeignete Auswahl der Betriebsfrequenz jedes Wandlers, eine geeignete Wahl des Abstandes der Wandler und der Plattendicke führen zu einer optimal ausgelegten Meßvor­ richtung.

Eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Sensors gemäß Fig. 10 bzw. 11 weist eine oder mehrere Gitterstruktu­ ren auf dem Substrat auf. Mindestens eine der Gitterstruktu­ ren kann als Metallgitter ausgebildet werden und/oder in der Oberfläche eingebettet vorliegen. Diese Modifizierung der Plattenoberfläche bewirkt die Umwandlung von PSAW in Plattenmoden. Die Empfindlichkeit der Sensoroberfläche, die der mit IDT versehenen Substratoberfläche gegenüberliegt, wird erhöht.

Vorzugsweise weisen die Gitterstrukturen Periodizität auf. Hinsichtlich der Geometrie sind parallel zur Längsrichtung der Fingerstrukturen der elektroakustischen Wandler ausge­ richtete Nuten bevorzugt, vgl. Fig. 10 und 11. Die Gitterstruktur kann auf der mit IDT versehenen Substrat­ seite, auf der gegenüberliegenden Substratseite und jeweils auf beiden Seiten angeordnet sein. Letztere Ausführungsform ist bevorzugt. Im Falle der ersteren und der letzteren Aus­ führungsform hierbei ist vorzugsweise eine Gitterstruktur im Bereich zwischen den Wandlern (IDT) angeordnet.

Liegen die Periodizität aufweisenden Nuten auf der den elek­ troakustischen Wandlern gegenüberliegenden Substratseite vor, vgl. Fig. 11, so können Plattenmoden in PSAW zurückge­ wandelt werden, die zur Messung verwendbar sind oder einfach die Wechselwirkung zwischen Welle und dem zu messenden Me­ dium erhöhen. Es ist anzumerken, daß diese Substratausrich­ tungen vorwiegend PSAW-Ausrichtungen sind und diese PSAW eine überwiegende schräg horizontale Teilchenverschiebung auslösen. Die in dieser Ausführungsform angewendeten Nuten sind flach. Sind sowohl auf der Unterseite als auch auf der Oberfläche des Substrats periodische Gitterstrukturen ange­ ordnet, so sind gleichgeformte und gemäß Fig. 11 angeordnete Nuten 111, 113 bevorzugt.

Eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Sen­ sors besitzt auf der flachen, den elektroakustischen Wand­ lern gegenüberliegenden Substratoberfläche eine dünne Me­ tallschicht mit der bevorzugten Dicke q 0,01 µm q 0,5 µm. Änderungen der Bedingungen an dieser Fläche können sie für Massen empfindlicher machen, was zu besser meßbaren Störeinflüssen auf die Plattenmoden führt. Es ist anzumer­ ken, daß bei bestimmter Ausrichtung durch die Metallisierung die PSAW in SAW umgewandelt werden. Alternativ oder zusätzlich kann zwischen den Wandlern eine durchgehende Metallisierung angeordnet sein.

Claims (25)

1. Sensor insbesondere zum Nachweis von spezifischen Teil­ chen oder Molekülen mit einem plattenförmigen Substrat, in dem sich akustische Plattenmoden ausbilden können, einem ersten und zweiten elektroakustischen Wandler auf der Unterseite und/oder Oberseite des Substrats und einer Reaktionsschicht auf der Oberseite und/oder Unter­ seite des Substrats, dadurch gekennzeichnet, daß der erste elektroakustische Wandler eine akustische Welle mit einer ersten Fundamentalfrequenz und m-ten Harmoni­ schen (m = 1, 2, 3, 4, . . .) aussendet, der zweite elek­ troakustische Wandler so ausgebildet ist, daß dieser eine akustische Welle mit einer zweiten Fundamentalfre­ quenz und n-ten Harmonischen (n = 1, 2, 3, 4, . . .) empfangen kann, wobei die Frequenz mindestens einer m- ten (m = 1, 2, 3, 4, . . . Harmonischen im wesentlichen gleich der Frequenz einer n-ten Harmonischen (n = 1, 2, 3, 4, . . .) ist.

2. Sensor nach Anspruch 1, wobei als plattenförmiges Substrat ein piezoelektrischer Kristall verwendet wird und die Plattendicke weniger als 2 mm beträgt.

3. Sensor nach Anspruch 1 oder 2, wobei als plattenförmiges Substrat ein ZX-LiNbO₃-Kristall verwendet wird.

4. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die elek­ troakustischen Wandler als ineinandergreifende Fin­ gerstrukturen (Interdigital Transducer, IDT) ausgebildet sind.

5. Sensor nach Anspruch 4, wobei die IDT ein Metallisie­ rungsverhältnis von 0,7 a 1,8, vorzugsweise von 1 < a < 1,5 aufweisen.

6. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei m gleich n ist.

7. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei m un­ gleich ist.

8. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der sen­ dende und der empfangende elektroakustische Wandler für ein Fundamentalfrequenz von etwa 50 MHz ausgelegt sind und bei der 3. Harmonischen von etwa 150 MHz betrieben werden, die Plattendicke des Substrats 0,5 mm beträgt, jeder Wandler (IDT) 4 Finger pro Periode aufweist mit einer Wellenlänge von 88 µm.

9. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und Anspruch 7, wobei der sendende elektroakustische Wandler, der mit einer Fundamentalfrequenz von etwa 50 MHz betrieben wird, eine Harmonische von m = 3 erzeugt und der empfan­ gende elektroakustische Wandler, der eine Fundamental­ frequenz von etwa 75 MHz aufweist, eine Harmonische von n = 2 empfängt, so daß eine Meßfrequenz von etwa 150 MHz vorliegt.

10. Sensor nach Anspruch 9 mit folgenden Parametern:

• - Fundamentalfrequenz des sendenden IDT von etwa 50 MHz
• - Meßfrequenz des sendenden IDT in Form der 3. Harmoni­ schen und des empfangenden IDT in Form der zweiten Harmonischen von etwa 150 MHz
• - Plattendicke 0,5 mm
• - Wellenlänge von etwa 88 µm für den sendenden, 4 Finger aufweisenden IDT
• - Wellenlänge von etwa 58,67 µm für den empfangenden 3 Finger aufweisenden IDT.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zwei Wandleranordnungen mit jeweils einem 1. und einem 2. Wandler vorliegen, wobei eine als Meßanordnung und die andere als Referenzanordnung dient.

12. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Re­ aktionsschicht ausgewählt ist aus einem Dextranfilm, einem mit Aminosilan und Glutaraldehyd erhältlichen Film und einem Film auf der Basis von Silicagel.

13. Sensor nach Anspruch 12, wobei die Reaktionsschicht zur Messung einer Protein-Protein-Kopplung ausgelegt ist.

14. Sensor nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Reaktions­ schicht Antikörper und/oder Antigene enthält.

15. Sensor nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei die Meßanordnung mit einer für die nachzuweisenden spezifi­ schen Teilchen oder Moleküle empfindlichen Reaktions­ schicht und die Referenzanordnung mit einem stofflich ähnlichen, für die nachzuweisenden spezifischen Teilchen oder Moleküle unempfindlichen Schicht, insbesondere mit einer nachträglich desaktivierten Reaktionsschicht gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12 versehen wird.

16. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Substrat mindestens eine Gitter­ struktur aufweist.

17. Sensor nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Gitterstrukturen Periodizität auf­ weist.

18. Sensor nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Gitterstrukturen auf der einen Substratoberfläche und/oder auf der anderen Substratoberfläche ausgebildet ist.

19. Sensor nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch ge­ kennzeichnet, daß mindestens eine der Gitterstrukturen im Bereich zwischen den Wandlern (IDT) angeordnet ist.

20. Sensor nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch ge­ kennzeichnet, daß mindestens eine der Gitterstrukturen auf der Oberfläche als Metallgitter ausgebildet ist.

21. Sensor nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch ge­ kennzeichnet, daß mindestens eine der Gitterstrukturen in Form von vorzugsweise flachen Nuten oder Rillen in die Oberfläche eingebettet ist.

22. Sensor nach einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Gitterstruktur parallel zur Längs­ richtung der Fingerstrukturen der elektroakustischen Wandler ausgerichtet ist.

23. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die den Wandlern (IDT) gegenüberlie­ gende Substratoberfläche und/oder die zwischen den Schallwandlern liegende Substratoberfläche durchgehend metallisiert ist.

24. Sensor nach Anspruch 23, wobei die Metallschicht eine Dicke q von 0,01 µm q 0,5 µm aufweist.

25. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch ge­ kennzeichnet, daß sich in dem plattenförmigen Substrat durch Pseudooberflächenwellen (PSAW) angeregte Platten­ moden ausbilden.