DE4319215C2 - Akustoelektrischer Flüssigkeitssensor - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen akustoelektrischen Flüssigkeits­ sensor zum Nachweis von Biomolekülen nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1, wie er aus der EP 0 542 469 A1 bekannt ist.

Es gibt bis lang einige etablierte analytische Verfahren um auch Biomoleküle zu analysieren, die sich aber meist aufwendi­ ger und teurer Labormethoden bedienen (HPLC, GC-MS). Eine ähn­ lich preisgünstige Alternative zu der hier beschriebenen Me­ thode stellen hingegen die sogenannten Immunoassays dar. Diese basieren ebenfalls auf der Bindung eines Analyten an einen An­ tikörper, benutzen aber zwangsläufig ein indirektes Verfahren für den Nachweis dieser Bindung. Dabei wird der Probe ein ra­ dioaktiv-, fluoreszenz- oder enzymmarkiertes analyt-analoges Molekül zugesetzt, das mit dem Analyt um die Antikörperbinde­ stellen konkurriert. Zur Auswertung ist damit ein Verfahren nötig, das aus mehreren Reagenzienzuführ-, Inkubations- und Waschgängen besteht; die Gesamtzeit pro Assay beträgt typi­ scherweise eine Stunde. Eine Verwendung der On-line-Methode ist damit ausgeschlossen.

Darüber hinaus wurden weitere Immunosensorprinzipien in der Literatur beschrieben. Nach Meinung vieler Autoren weichen sie immer noch stark von der Idealvorstellung eines preisgün­ stigen, genügend empfindlichen zukünftigen Immunosensors ab: In mehreren Übersichtsartikeln wurden solche Methoden bereits aufgrund ihrer hohen Kosten (Oberflächen-Plasmonen-Resonanz, Gitterkoppler, Differentielles Interferometer) bzw. wegen ih­ rer niedrigen Empfindlichkeit (Potentiometrischer Immunosen­ sor) kritisiert, während der Immunosensor auf Oberflächenwel­ len (OFW)-Basis bislang favorisiert wurde.

Am Versagen der OFWB′s im Medium Wasser konnte letzterer bis­ lang allerdings nicht in Betracht gezogen werden.

Ein akustoelektrischer Sensor ist aus der US 4,735,906 be­ kannt. Als Substrat wurde Quarz verwendet, die Arbeitsfrequenz betrug ca. 10 MHz. Aufgrund dieser niedrigen Arbeitsfrequenz ist dieser Sensor nur unter hohen Dämpfungsverlusten in wäßri­ ger Lösung lauffähig.

Ein weiterer Sensor mit niedrigen Arbeitsfrequenzen ist in J. E. Roederer et al., Microgravimetric Immunoassay with Piezo­ electric Crystals, Anal. Chem. 1983, 55, S. 2333 bis 2336 be­ schrieben.

Desweiteren ist aus der EP 0 361 729 A2 ein Sensor mit nur ei­ nem Sensorelement bekannt, welcher eine Schutzschicht zur räumlichen Trennung von Substrat und Wasser aufweist. Dieser Sensor weist bei einer Arbeitsfrequenz <100 MHz Dämpfungen zwischen 30 und 40 dB auf, wodurch eine hohe Störanfälligkeit bei starkem Rauschen verursacht wird.

Aufgabe der Erfindung ist es nun, einen Sensor der e. g. Art zur Verfügung zu stellen, der einen empfindlichen, rauscharmen und hochspezifischen Nachweis von Biomolekülen in wäßriger Lö­ sung erlaubt.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die Merkmale des Pa­ tentanspruchs 1. Die Unteransprüche beschreiben vorteilhafte Ausgestaltungen des Sensors.

Der Sensor ermöglicht die spezifische Messung der Anwesenheit bzw. der Konzentration verschiedener Biomoleküle wie Proteine, Enzyme sowie komplexerer Makromoleküle - Teile des Erbgutes (DNS, RNS) oder verschiedene Krankheitserreger (z. B. Viren oder Bakterien) - durch Direktnachweis der Bindung an spezifi­ sche Antikörper in wäßrigen Lösungen. Mit dieser Methode sind damit keine zeitaufwendige Verfahren mehr notwendig, die auf die Konkurrenz zwischen gelabelten und ungelabelten Analyten beruhen (indirektes Nachweisverfahren bei Immunoassays).

Bei dem Sensor handelt es sich um einen massensensitiven Sen­ sor, der die bei der Sorption des Analyten verursachten Schallgeschwindigkeitsänderung von akustischen Oberflächenwel­ len (OFW) nutzt, um auf die sorbierte Masse des Analyten und somit auf dessen Anwesenheit bzw. Konzentration in Wasser zu­ rückzuschließen.

Um eine analytenspezifische Sorptionsreaktion zu erhalten, sind selektive Beschichtungen auf dem OFW-Substrat notwendig. Besondere Flexibilität ist hierbei dann gewährleistet, wenn diese Beschichtungen aus Antikörpern bestehen, zumal sich diese gegen beliebige - in der klinischen Diagnose relevante - Makromoleküle kostengünstig herstellen lassen. Bei dem erfin­ dungsgemäßen Sensor handelt es sich also um einen echten Immu­ nosensor der seine Daten in-situ ermittelt und damit um eine echte On-line-Meßmethode für Bioanalytik ermöglicht.

Hinsichtlich der Sensorik von Gasen ist der Einsatz von soge­ nannten OFW-Bauelementen (OFWB oder englisch: SAW-Devices, SAWD) bekannt. Um jedoch abweichend von der bisher etablierten Technik der chemischen Gassensorik mit OFW′s auch Biomoleküle zu detektieren, muß dieser Sensortyp in flüssigen Medien, re­ spektive Wasser, betrieben werden können. Dies war bisher nicht möglich, da Oberflächenwellen in Flüssigkeiten eine zu große Laufstreckendämpfung erfahren und diese Bauelemente so­ mit in diesem Medium nicht funktionsfähig sind. Ein Grund für diese hohe Dämpfung liegt an dem bei Standard-OFW′s verwende­ ten Oberflächenwellentyp: Der sogenannten Rayleigh-Welle. Die­ ser Wellentyp besteht aus einem longitudinalen Bewegungsanteil in Ausbreitungsrichtung (senkrecht zur OF). Die zuletzt ge­ nannte Bewegungskomponente ist für die hohe Dämpfungsverluste verantwortlich: Sie koppelt in Flüssigkeiten an die dort mög­ lichen longitudinalen Ausbreitungsmoden an und besitzt eine ähnliche Schallgeschwindigkeit, wodurch sie gut in die umge­ bende Flüssigkeit dissipieren kann.

Der hier beschriebene Sensor verwendet deshalb sogenannte ho­ rizontal polarisierte, transversale Oberflächenwellen (HPT, OFW oder englisch kurz: surface transverse waves, STW), eine spezielle Form des Oberflächenwellentyps der "Leaky"-Welle. Die STW′s besitzen keine Bewegungskomponenten senkrecht zur Oberfläche und können deshalb an keine ausbreitungsfähige Mode in Flüssigkeiten ankoppeln.

Untersuchungen haben gezeigt, daß HPT-OFWB′s in Flüssigkeiten tatsächlich zufriedenstellend arbeiten. Allerdings ist dies nur auf Flüssigkeiten mit sehr niedriger Dielektrizitätskon­ stante (ε<10) beschränkt. Bei Flüssigkeiten mit hoher DK, wie z. B. Wasser (ε≈78) kann auch ein HPT-OFWB, wie er üblicher­ weise in der Elektronik verwendet wird, nicht mehr arbeiten. Der Grund hierfür ist die - im Vergleich zu Wasser - sehr viel kleinere DK des piezoelektrischen Substratmaterials, das meist aus Quarz mit einer DK von ε = 4.55 besteht. Die für den pie­ zoelektrischen Effekt und damit zur Erzeugung der OFW′s not­ wendigen elektrischen Felder müssen sich hauptsächlich im Sub­ stratmaterial des OFWB befinden. Dies ist jedoch bei der An­ wendung eines Quarz-HPT-OFWB im Wasser grundsätzlich nicht der Fall: Die Orte größter Feldintensität befinden sich hauptsäch­ lich außerhalb des Substrates im Medium Wasser und können da­ mit keine Verzerrungen im Substratmaterial mehr erzeugen (kein Piezoeffekt).

Das Substratmaterial des Sensors besteht deshalb aus Lithi­ umtantalat (LiTaO₃) das unter einem Winkel von 36° bezüglich seiner "Y"-Kristallachse geschnitten wurde (Die Laufrichtung der HPT-OFW′s ist hierbei in Richtung der "X"-Achse). Unter diesen Bedingungen besitzt dieser Kristallschnitt eine für die STW′s relevante DK von ε ≈ 43. Bei diesem hohen Wert, halb so groß wie derjenige von Wasser, lassen sich auch in diesem Me­ dium HPT-OFW genügender Intensität erzeugen und wieder detek­ tieren, so daß ein Betrieb in Wasser ohne weiteres möglich ist. Die Dämpfungszunahme beträgt hierbei etwa nur 6 dB, womit die Gesamtdämpfung dieser Bauteile in Wasser damit nur etwa 8-10 dB betragen.

Die Empfindlichkeit für Massenbeladung von OFW′s steigt qua­ dratisch mit der Arbeitsfrequenz.

Um die bei einem Immunosensor zu erwartenden geringen Mengen von Proteinmolekülen auf einer immobilisierten Antikörper­ schicht detektieren zu können, sollte das HPT-OFWB eine aus­ reichende Empfindlichkeit für Massenbeladung und damit eine hohe Arbeitsfrequenz <200 MHz aufweisen.

Seit kurzem sind OFWB′s erhältlich, die aus dem genannten Sub­ stratmaterial bestehen, den genannten Wellentyp nutzen und eine genügend hohe Arbeitsfrequenz aufweisen. In atmosphäri­ scher Umgebung betrieben, dienen sie hierbei ausschließlich elektronischen Zwecken, wie beispielsweise als frequenzselek­ tierendes Element in Funktelefonen. Mit einer sonst unerreich­ ten, extrem niedrigen Laufstreckendämpfung an Luft von nur etwa -3 dB stellen diese HPT-OFWB′s in solchen Geräten ein we­ sentlicher Bestandteil dar und wurden speziell für solche An­ wendungen entwickelt und optimiert.

Allerdings sind diese günstigen Eigenschaften mit der naturge­ mäß hohen Temperaturempfindlichkeit des Materials LiTaO₃ er­ kauft, so daß im Allgemeinen sowohl in der Elektronik als auch in der "konventionellen" OFW-Gassensorik Quarz als Substratma­ terial vorgezogen wird.

Der Nachteil der dadurch auftretenden erhöhten Temperaturemp­ findlichkeit (in der Gassensorik mit OFWB′s sehr störend), wirkt sich in Flüssigkeiten kaum aus, da die Sensortemperatur sehr gut von der Temperatur des Flüssigkeitsstromes bestimmt wird und diese problemlos hinreichend konstant gehalten werden kann.

Gegenüber der herkömmlichen Bioanalytik bietet der Sensor eine Reihe von Vorteilen:

• - Echte On-line-Meßmethode: Meßwert sofort auswertbar
• - Kostengünstig
• - Empfindlichkeit wie Bio-Assay
• - Auf beliebige Biosysteme übertragbar
• - Direkt kompatibel mit der Digitalelektronik
• - Sorptionsverläufe direkt auswertbar
• - Reversible Sorptionen und deren Verlauf ebenfalls direkt auswertbar
• - Sensoren sind bereits miniaturisiert und könnten so, zu Arrays verbunden, auch weitaus komplexere Analysen bewerk­ stelligen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Beispiels und der Figur näher erläutert.

Die Figur zeigt den schematischen Aufbau eines Sensors.

Die beiden Oberflächenwellensensorelemente 1, 2 sind mit Hilfe der HF-Verstärker 4 als low-loss-Filter verschaltet, und stel­ len akustische Resonatoren dar.

Die Signale aus den Resonatoren werden einem Mischer 5 zuge­ führt, dessen Ausgangssignale z. B. durch einen Frequenzzähler weiterverarbeitet werden.

Mit Hilfe der digitalen Strukturen 3 werden die HPT-OFW′s an­ geregt.

Für die Beschichtung mit den spezifischen Antigenen oder Anti­ körpern wird zuerst ein Monolayer aus Aminopropyltri­ methoxysilan oder Aminopropyltriethoxysilan in üblicher Weise auf die Oberfläche aufgebracht.

Auf diesen Schichten werden dann mit Hilfe von Glutaraldehyd­ lösung die Antikörper oder Antigene für Meßsensor 1 und Refe­ renzsensor 2 ausgerichtet fixiert.

Als Antikörper für den Referenzsensor bei Untersuchungen an menschlichem Blut sollen solche Verbindungen gewählt werden, welche nur mit Proteinen reagieren, welche im menschlichen Körper nicht vorkommen (z. B. Pflanzenproteine).

Der Meßsensor war beispielhaft zum Nachweis von Glukoseoxidase mit monoklonalen Antikörpern gegen Glucoseoxidase beladen, während der Referenzsensor mit monoklonaren Antikörpern gegen Peroxidase beladen war.

Bei der Messung werden beide Sensorelemente 1, 2 mit der glei­ chen Probenlösung beladen (stationär oder im Durchfluß).

Die auf den Oberflächen der Sensorelemente fixierten Antikör­ per binden dann hochspezifisch die ihnen entsprechenden Pro­ teine.

Dies führt zu einer Änderung der Massenbelegung der Sen­ soroberfläche und damit zu einer Änderung der Schwingungsfre­ quenzen der beiden Resonatorfilter. Durch den Mischer 5 wird so direkt die Differenz der beiden Flächenbelegungen erfaßt.

Durch den mit unspezifischen Antikörpern beladenen Referenz­ sensor wird so auch die unspezifische Adsorption von Proteinen an der beladenen Oberfläche des Meßsensors erfaßt und kompen­ siert. Dadurch konnte der Untergrund drastisch reduziert wer­ den.

Zur Regenerierung des Sensors eignen sich wegen der empfindli­ chen Sensorelemente nur einige wenige Regenerierlösungen. Am geeignetsten waren:

• a) wäßrige dreimolare Thiocyanatlösung
• b) 5 bis 20%ige wäßrige Dioxanlösung
• c) 50%ige Ethylenglycollösung gepuffert im basischen.

Für die hier dargestellte Anordnung wurden Bauelemente von MuRata (Japan) mit der Typenbezeichnung SAF254MB40T gewählt. Das OFWB befindet sich in einem rechteckförmigen Gehäuse (12×7,3×3,5 mm³), das die elektrischen Anschlüsse mittels Glas­ einschmelzungen nach außen-führt. Das OFWB ist im Gehäuse mit diesen Anschlüssen in der üblichen Weise mittels Bonddrähte verbunden.

Für die Anwendung als Biosensor wurden an zwei Stellen am Ge­ häusedeckel Bohrungen angebracht, wonach dort versilberte Stutzen (l = 6,3 mm, Φ_a = 2 mm, Φ_i = 1.5 mm) angelötet wurden. Da das Gehäuse aus Edelstahl besteht, mußte zum Weichlöten Or­ thophosphorsäure als Flußmittel verwendet werden. An den Stut­ zen können flexible Silikonschläuche angebracht werden, womit sich das Bauteil mit Analytflüssigkeit durchströmen läßt. Das Volumen des Sensorgehäuses beträgt nur 80 µl und ist damit auch für teure Analytflüssigkeiten bestens geeignet.

Ebenfalls verwendbar sind SAF380MB40T von MuRata oder die Bau­ teile B4512 (Best.Nr. B39451-B4512-B310) und B4514 (Best.Nr. B3947/-B4514-B310) von Siemens Matsushita Components.

Diese Bauteile wurden als Low-Loss-Filter für Mobilfunk und Funktelefone entwickelt.

Claims (4)

1. Akustoelektrischer Sensor, bestehend aus zwei Ober­ flächenwellensensorelementen von denen eines mit einer spe­ zifischen Adsorptionsschicht versehen ist, wobei die Ober­ flächenwellensensorelemente im Modus der horizontal polari­ sierten transversalen Oberflächenwellen schwingen, und wo­ bei die Dielektrizitätskonstante des Substrats der Ober­ flächenwellensensorelemente eine Dielektrizitätskonstante größer als 30 ist, dadurch gekennzeichnet, daß

• a) die Arbeitsfrequenz der Oberflächenwellensensorelemente (1, 2) größer als 200 MHz ist,
• b) und die Dämpfung der Oberflächenwellensensorelemente (1, 2) in Wasser kleiner als 10 dB ist.

2. Akustoelektrischer Sensor nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Substrat der Oberflächenwellensensor­ elemente (1, 2) Lithiumtantalat ist.

3. Akustoelektrischer Sensor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Oberflächenwellensensorelemente (1, 2) Low-Loss-Filter mit einer Laufstreckendämpfung in Luft von etwa -3dB verwendet werden, die als frequenzselektie­ rende Elemente in der Nachrichtentechnik entwickelt wurden.

4. Akustoelektrischer Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß eines der Oberflächenwellen­ sensorelemente (1, 2) kovalent mit einer Schicht mit einem Antikörper für den spezifischen Nachweis von einzelnen Pro­ teinen in Mischungen versehen ist und das andere Oberflächenwellensensorelement kovalent mit einer Schicht von unspezifischen Antikörpern versehen ist.