DE4417078C2 - Device for microscoping biological cells - Google Patents
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung nach dem Oberbegriff von Anspruch 1.The invention relates to a device according to the preamble of claim 1.
Eine solche Vorrichtung ist bereits aus US 4,974,952 bekannt. Sie kann beispielsweise auf dem Objekttisch eines Mikroskops positioniert werden, damit das in der Prüfkammer befindliche biologische Material, beispielsweise Testzellen oder Gewebeschnitte, durch das Beobachtungsfenster der Prüfkammer hindurch mit einem Mikroskop in vergrößertem Maßstab betrachtet oder untersucht werden kann. Bei der vorbekannten Vorrichtung sind die Ein- und Auslaßöff nungen der Prüfkammer an einem Perfusionssystem angeschlossen, das eine kontinuierliche oder diskontinuierliche Erneuerung der in der Prüfkammer befindlichen Nährflüssigkeit ermöglicht. Die Vorrichtung weist dazu Perfusionskanäle auf, die mit den Ein- und Auslaßöffnungen der Prüfkammer verbundenen sind. In den Perfusionskanälen sind Temperatursensoren angeordnet, die mit einer Vorrichtung zur Temperaturregelung der Nährflüssigkeit verbunden sind. Die Testzellen können dadurch über einen längeren Zeitraum hinweg, beispielsweise länger als 10 Minuten, auf dem Mikroskop-Objekttisch unter definierten äußeren Bedingungen vital erhalten werden, um beispielsweise dynamische Prozesse zu untersuchen. Nachteilig ist dabei jedoch, daß das in der geschlossenen Prüfkammer befindliche Zellmaterial für weitergehende Untersuchungen kaum zugänglich ist, und daß Erkenntnisse über in dem Zellmaterial ablaufende dynamische Vorgänge praktisch nur auf optische Beobachtungen gestützt werden können.Such a device is already known from US 4,974,952. You can, for example, on the stage of a microscope be positioned so that the one located in the test chamber biological material, for example test cells or tissue sections, through the observation window of the test chamber with a Microscope can be viewed or examined on an enlarged scale can. In the previously known device, the inlet and outlet are test chamber connections to a perfusion system that a continuous or discontinuous renewal of the in the Test chamber located nutrient fluid allows. The device for this purpose has perfusion channels with the inlet and outlet openings connected to the test chamber. Are in the perfusion channels Temperature sensors arranged with a device for Temperature control of the nutrient fluid are connected. The test cells can, for example, over a longer period of time longer than 10 minutes, on the microscope stage under defined external conditions are vital to for example to examine dynamic processes. The disadvantage is however, that that in the closed test chamber Cell material is hardly accessible for further investigations, and that knowledge about dynamic processes taking place in the cell material Processes are practically based only on optical observations can.
Aus DE 39 24 701 A1 ist auch bereits ein Mikroskopinkubator bekannt, der eine geschlossene Kultivierungskammer zur Aufnahme einer Petrischale mit einer darin befindlichen Zellkultur hat. Der Mikroskopinkubator weist Sensoren auf, die mit einer zentralen Steuereinheit zur Regelung der physiologischen Bedingungen in der Kultivierungskammer verbunden sind. Auch bei dieser Vorrichtung besteht das Problem, daß die Untersuchungen an dem Zellmaterial auf optische Beobachtungen beschränkt sind.A microscope incubator is also already known from DE 39 24 701 A1 known to hold a closed cultivation chamber a petri dish with a cell culture inside. Of the Microscope incubator has sensors that work with a central Control unit for regulating the physiological conditions in the Cultivation chamber are connected. Even with this device there is the problem that the studies on the cell material are limited to optical observations.
Es besteht deshalb die Aufgabe, eine Vorrichtung der eingangs genannten Art zu schaffen, mit der parallel zu der optischen, beispielsweise durch Mikroskopieren gewonnenen Information, unter definierten äußeren Bedingungen und über einen längeren Zeitraum hinweg, zusätzliche Erkenntnisse über das biologische Material gewonnen werden können.There is therefore the task of a device of the beginning to create the type mentioned, with which parallel to the optical, for example, information obtained by microscopy, under defined external conditions and over a longer period away, additional knowledge about the biological material can be won.
Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst.This object is achieved with the features of patent claim 1.
In vorteilhafter Weise ermöglichen die in die Prüfkammer integrierten Sensoren eine zu den optischen, durch Mikroskopieren erhaltenen Informationen parallele Meßsignalgewinnung an den Zellen, wobei mehrere physikalisch-chemische Größen des Zell-Milieus gleichzeitig einer Kontrolle zugänglich sind. Somit werden zusätzliche Informationen über zytophysiologische Abläufe bereitgestellt. Insbesondere kann durch eine Korrelation der mit den einzelnen Sensoren gewonnenen Meßergebnisse die Zuverlässigkeit von Aussagen über den Zustand der in der Prüfkammer befindlichen Zellen verbessert werden. Auch können dynamische Prozesse besser beobachtet werden. Die Sensoren können außerdem für homogene enzymatische Bestimmungen verwendet werden, so daß eine enzymatische Analyse von Substraten, die von den Zellen ins Medium abgegeben oder diesem entnommen werden, mit extern zugesetzter Enzymaktivität (z. B. Oxydasen oder Peroxydasen) ebenso möglich ist, wie die Bestimmung der katalytischen Aktivität von Enzymen, welche die Zellen durch Exozytose freisetzen.The integrated in the test chamber advantageously allow Sensors one of the optical ones obtained by microscopy Information parallel measurement signal acquisition on the cells, where several physico-chemical quantities of the cell milieu at the same time are accessible to a control. Thus, additional Information about cytophysiological processes provided. In particular, through a correlation with the individual Measurement results obtained the reliability of Statements about the condition of the cells in the test chamber be improved. Dynamic processes can also be observed better will. The sensors can also be used for homogeneous enzymatic Determinations are used so that an enzymatic analysis of substrates that are released by the cells into the medium or this with externally added enzyme activity (e.g. Oxidases or peroxidases) is also possible, as is the determination the catalytic activity of enzymes that pass through the cells Release exocytosis.
In vorteilhafter Weise wird somit eine Meß-, Beobachtungs- und Kultivierungs-Kammer zur Verfügung gestellt, die mehrere, sich sinnvoll ergänzende und gegebenenfalls gegenseitig kontrollierende Detektionsmöglichkeiten für Messungen von zellulären Prozessen aufweisen kann. Dies ermöglicht insbesondere auch eine Korrela tion der von den einzelnen Sensoren über einen längeren Zeitraum ermittelten Meßwerte, beispielsweise durch die Erstellung von Ortskurven, so daß die Zuverlässigkeit von Aussagen über in der Prüfkammer befindliches biologisches Material verbessert ist. Ferner sind vergleichende metabolische Messungen ohne den notwendigen Gebrauch von zytotoxischen Farbstoffen möglich.A measurement, observation and Cultivation Chamber provided several, themselves sensibly complementary and possibly mutually controlling Detection options for measurements of cellular processes can have. In particular, this also enables a correla tion of the individual sensors over a longer period of time determined measured values, for example by creating Locus curves, so that the reliability of statements about in the Biological material located in the test chamber is improved. Further are comparative metabolic measurements without the necessary Use of cytotoxic dyes possible.
Durch die kontinuierliche Erneuerung der in der Prüfkammer befindlichen Nährflüssigkeit eignet sich die Vorrichtung besonders für Messungen an immobilisiertem biologischem Material. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann sowohl zu wissenschaftlichen Zwecken eingesetzt werden als auch als Bio-Sensor Verwendung finden, beispielsweise bei der Gewässerkontrolle, wobei eine Probe des zu untersuchenden Wassers durch zusätzliche Perfusionskanäle in die Prüfkammer eingeleitet und mittels der Sensoren und gegebenenfalls durch optische Beobachtung untersucht wird.Through the continuous renewal of the in the test chamber the device is particularly suitable for measurements on immobilized biological material. The The device of the invention can be used both for scientific purposes Used as a bio-sensor, for example in water control, with a sample of the examining water through additional perfusion channels into the Test chamber initiated and by means of the sensors and, if necessary is examined by optical observation.
Eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, daß die Sensoren wenigstens einen Thermofühler, wenigstens eine miniaturi sierte pH-Elektrode, wenigstens eine Mikro-Sauerstoffelektrode, wenigstens einen NO-Sensor, wenigstens einen Impedanzsensor und oder wenigstens einen Potentialsensor umfassen. So können pH-, Sauerstoffkonzentrations-, Ionenkonzentrations-, Zellpotential-, Impedanz- oder Temperaturmessungen über einen längeren Zeitraum unter definierten äußeren Bedingungen durchgeführt werden, wobei eine gleichzeitige optische Beobachtung der Zell- oder Gewebekultur möglich ist.An advantageous embodiment of the invention provides that the Sensors at least one thermal sensor, at least one miniaturi based pH electrode, at least one micro-oxygen electrode, at least one NO sensor, at least one impedance sensor and or comprise at least one potential sensor. So pH, Oxygen concentration, ion concentration, cell potential, Long-term impedance or temperature measurements be carried out under defined external conditions, whereby simultaneous visual observation of cell or tissue culture is possible.
Eine Weiterbildung der Erfindung sieht vor, daß eine Wandung der Prüfkammer Aufnahmeöffnungen hat, in welche die Sensoren mit Sensorhaltern lösbar einsetzbar sind. Die Sensoren können beispielsweise in die Aufnahmeöffnungen einsteckbar oder einschraub bar sein und sind somit auf einfache Weise austauschbar, so daß die Prüfkammer, je nach Anwendungsfall, mit der gewünschten Sensor- Konfiguration bestückt werden kann.A further development of the invention provides that a wall of the Test chamber has openings in which the sensors with Sensor holders can be used releasably. The sensors can For example, insertable or screwed into the receiving openings be bar and are thus easily interchangeable, so that the test chamber, depending on the application, with the desired sensor Configuration can be populated.
Zweckmäßigerweise sind zum Verschließen nicht benötigter Aufnahmeöff nungen Verschlußstopfen vorgesehen. Die Anzahl der verwendeten Sensoren kann dann an die jeweilige Applikation angepaßt werden. Bei Bedarf kann die Prüfkammer auch ohne Sensoren, als reine Kultivier- und/oder Mikroskopier-Kammer oder für andere optische Untersuchungen verwendet werden.It is expedient for the opening not required to be closed Plug provided. The number of used Sensors can then be adapted to the respective application. If required, the test chamber can also be used as a pure one without sensors Cultivation and / or microscopy chamber or for other optical Investigations can be used.
Besonders günstig ist, wenn die Längserstreckungsrichtung von wenigstens zwei Sensorhaltern schräg zur Beobachtungsrichtung oder senkrecht zum Aufnahmebereich verläuft und wenn für den Kondensor oder das objektiv zwischen den Sensorhaltern in dem Gehäuseteil eine trichterförmige Vertiefung vorgesehen ist. Die Sensoren sind dann um das Beobachtungsfenster herum, mit ihrer Meßspitze schräg nach innen geneigt oder senkrecht zum Beobachtungs bereich ausgerichtet, so daß oberhalb des Beobachtungsfensters genügend Raum für eine Kondensorlinse, ein Objektiv oder dergleichen optisches Gerät verbleibt, und die Meßspitze der Sensoren dennoch dicht benachbart zu dem Beobachtungsbereich der zu untersuchenden Zell- oder Gewebesubstanz angeordnet ist.It is particularly favorable if the longitudinal direction of at least two sensor holders at an angle to the direction of observation or runs perpendicular to the recording area and if for the Condenser or the objective between the sensor holders in the A funnel-shaped depression is provided in the housing part. The Sensors are then around the observation window, with theirs Measuring tip inclined inwards or perpendicular to the observation area aligned so that above the observation window enough space for a condenser lens, a lens or the like optical device remains, and the measuring tip of the sensors nevertheless closely adjacent to the observation area of the person to be examined Cell or tissue substance is arranged.
Damit das in das Prüfkammer befindliche biologische Material möglichst genau auf Normaltemperatur (bei Säugerzellen 37,0°C) gehalten werden kann, ist es vorteilhaft, wenn die Vorrichtung zum Temperieren der Prüfkammer einen Flüssigkeitskanal oder eine Hohlwand für Temperierflüssigkeit aufweist. Der Flüssigkeitskanal kann dann mit einer Umwälzpumpe mit einem thermostatisch geregelten Wasserbad und einem Wasserkreislauf verbunden sein, so daß das zu untersuchende Zellmaterial sehr exakt auf einer vorgegebenen Temperatur gehalten werden kann. Der Flüssigkeitskanal oder die Hohlwand sind vorzugsweise an einer dem Beobachtungsfenster abgewandten Seite des Gehäuseteils, zumindest über einen Teil des Umfanges der Prüfkammer verlaufend, angeordnet.This means the biological material in the test chamber as close as possible to normal temperature (37.0 ° C for mammalian cells) can be kept, it is advantageous if the device for Tempering the test chamber a liquid channel or a Has cavity wall for bath fluid. The fluid channel can then be used with a circulating pump with a thermostatically controlled Water bath and a water cycle to be connected, so that too investigating cell material very precisely on a given Temperature can be maintained. The liquid channel or the Cavity wall are preferably at one of the observation window opposite side of the housing part, at least over part of the Running around the circumference of the test chamber, arranged.
Eine andere Ausführungsform sieht vor, daß wenigstens eine Kammerwand mit einer vorzugsweise thermostatisch geregelten Elektroheizung beheizbar ist. Eine solche Elektroheizung kann beispielsweise mit einem Halbleiter-Temperatursensor geregelt sein, mit dem die Temperatur in der Prüfkammer mit großer Genauigkeit eingestellt werden kann.Another embodiment provides that at least one Chamber wall with a preferably thermostatically controlled Electric heating is heated. Such an electric heater can can be controlled, for example, with a semiconductor temperature sensor, with which the temperature in the test chamber with great accuracy can be adjusted.
Eine Weiterbildung der Erfindung sieht vor, daß der Aufnahmebereich als Kulturschale ausgebildet und von der Prüfkammer entfernbar ist. Das Kultursubstrat ist dadurch austauschbar. Dabei können beispielsweise Glasträger oder Polystyrol-Gewebekulturschalen für den Einmalgebrauch gleichermaßen Verwendung finden. Besonders vorteilhaft ist dabei, daß die zu untersuchenden Zellen zur Vorkultivierung auf dem Träger im Brutschrank inkubiert werden können. Das Zellmaterial kann dazu auf einer Gewebekulturschale praktisch ohne Kontaminationsgefahr und unter besonders einfacher Handhabung zwischen einer Kultur im Inkubator und der Prüfkammer transferiert werden. Die Vorkultivierung erlaubt eine höhere experimentelle Produktivität, was besonders beim Testen mehrerer Zellpopulationen vorteilhaft ist. Für spezielle Untersuchungs methoden, wie z. B. die Patch-Clamp-Methode oder die Mikroinjek tion von Substanzen in Zellen, ist außerdem auch eine offene Kultivierung möglich. Zum Einsetzen und Entnehmen der Kulturschale kann die Prüfkammer eine verschließbare Entnahmeöffnung aufweisen.A further development of the invention provides that the receiving area is designed as a culture dish and can be removed from the test chamber. The culture substrate is therefore interchangeable. You can for example glass supports or polystyrene tissue culture dishes equally suitable for single use. Especially It is advantageous that the cells to be examined for Pre-cultivation can be incubated on the carrier in the incubator can. For this purpose, the cell material can be placed on a tissue culture dish practically without risk of contamination and under particularly simple Handling between a culture in the incubator and the test chamber be transferred. Pre-cultivation allows a higher one experimental productivity, which is especially true when testing multiple Cell populations is beneficial. For special examination methods such as B. the patch clamp method or the microinjek tion of substances in cells is also an open one Cultivation possible. For inserting and removing the culture dish the test chamber can have a closable removal opening.
Zweckmäßigerweise ist vorgesehen, daß die Vorrichtung außer dem ersten Gehäuseteil ein zweites Gehäuseteil aufweist, daß das erste in Gebrauchsstellung oberseitig angeordnete Gehäuseteil die Sensoren und das zweite, unterseitig angeordnete Gehäuseteil das Beobachtungs fenster und den Aufnahmebereich für das biologische Material aufweist und daß die beiden Gehäuseteile lösbar miteinander verbindbar sind. Das erste Gehäuseteil kann dann auf einfache Weise zusammen mit den Sensoren und ggf. auch mit den Anschlüssen für das Perfusionssystem aus der Vorrichtung entnommen werden, so daß das zu untersuchende biologische Material gut zugänglich ist. Da die gesamten elektrischen Anschlüsse für die Sensoren an dem ersten, entnehmbaren Gehäuseteil vorgesehen sind, kann das zweite Gehäuseteil auf einfache Weise mit dem darin befindlichen Zell- oder Gewebemate rial, beispielsweise zur Vorkultivierung der Zellen, in einem Brutschrank inkubiert werden.Advantageously, it is provided that the device in addition to the first housing part has a second housing part that the first in the position of use, the sensors are arranged on the top of the housing and the second housing part arranged on the underside of the observation window and the receiving area for the biological material and that the two housing parts releasably connectable are. The first housing part can then be put together in a simple manner with the sensors and possibly also with the connections for the Perfusion system can be removed from the device, so that the biological material to be examined is easily accessible. Since the entire electrical connections for the sensors on the first, removable housing part are provided, the second housing part in a simple way with the cell or tissue mate contained therein rial, for example for preculturing the cells, in one Incubator to be incubated.
Besonders günstig ist, wenn zum Einstellen der Kammerhöhe zwischen den Gehäuseteilen ein elastischer Distanzring vorgesehen ist, und wenn der Distanzring mit einer insbesondere einen Schraubring aufweisenden Spannvorrichtung zwischen den Gehäuseteilen einspannbar ist. Die Kammerhöhe und der Abstand der Sensoren zu dem zu untersuchenden Zellmaterial können dann durch Variieren des auf den elastischen Distanzring mittels der Spannvorrichtung ausgeübten Spanndruckes stufenlos und reproduzierbar eingestellt werden. Dabei kann an der Spannvorrichtung eine Skala oder eine Anzeige vorgesehen sein, an der die jeweils eingestellte Kammerhöhe ablesbar ist. Damit die Sensoren beim Verstellen der Kammerhöhe nicht beschädigt werden können, kann ferner ein Begrenzungsanschlag vorgesehen sein, der ein versehentliches Einstellen einer zu geringen Kammerhöhe verhindert. Bestimmte experimentelle Techniken, wie beispielsweise die Bestimmung der metabolischen Aktivität von Zellen durch Messung des pH-Wertes und der Sauerstoff-Konzentration, setzen ein hohes Zellenzahl- zu Kammervolumen-Verhältnis beziehungsweise eine extrem geringe Kammerhöhe voraus, so daß in solchen Fällen die Kammerhöhe entsprechend anpaßbar ist. Die Variierbarkeit der Kammerhöhe bietet darüber hinaus die Möglichkeit, die durch die Nährflüssigkeitsströmung auf die Zellen ausgeübten Strömungs- Scherkräfte zu reduzieren, indem die Kammerhöhe während der Perfusionsintervalle vorübergehend vergrößert wird.It is particularly advantageous if to adjust the chamber height between the housing parts an elastic spacer is provided, and if the spacer with a screw ring in particular having clamping device clamped between the housing parts is. The chamber height and the distance of the sensors to that too investigating cell material can then by varying the on the elastic spacer exerted by means of the clamping device Clamping pressure can be set continuously and reproducibly. Here A scale or a display can be provided on the clamping device be at which the respective set chamber height can be read. So that the sensors are not damaged when adjusting the chamber height limit stop can also be provided, the accidental setting of a too low chamber height prevented. Certain experimental techniques, such as the determination of the metabolic activity of cells by Measurement of the pH value and the oxygen concentration begin high cell number to chamber volume ratio or one extremely low chamber height ahead, so that in such cases the Chamber height is adjustable accordingly. The variability of Chamber height also offers the possibility of passing through the flow of nutrient fluid exerted on the cells Reduce shear forces by changing the chamber height during the Perfusion intervals are temporarily increased.
Zweckmäßigereweise ist vorgesehen, daß die Prüfkammer gasdicht ist. Dadurch wird eine kontrollierte Begasung der zu untersuchenden Zellen, beispielsweise durch Einstellen des CO₂-Gehaltes der den Zellen zugeführten Nährflüssigkeit ermöglicht.It is expediently provided that the test chamber is gas-tight. This ensures controlled fumigation of the patient to be examined Cells, for example by adjusting the CO₂ content of the Nutrient fluid supplied to cells.
Die Prüfkammer kann außerdem zum Befestigen an einem Objekttisch eines Mikroskops Haltemittel oder Befestigungsstellen für Haltemittel aufweisen. Hierzu können beispielsweise außenseitig an der Prüfkammer Vorsprünge vorgesehen sein, die in Funktionsstellung in entsprechende Vertiefungen des Objekttisches eingreifen.The test chamber can also be attached to an object table a microscope holding means or fastening points for holding means exhibit. This can be done, for example, on the outside of the test chamber Projections may be provided, which correspond to the functional position Intervene in the recesses of the object table.
Zweckmäßigerweise ist vorgesehen, daß die Sensoren zur Verbindung mit einer externen Anzeige- oder Auswertevorrichtung Anschlußkabel aufweisen und daß die Vorrichtung eine Zugentlastung für die Anschlußkabel hat. Unzulässig hohe Zugkräfte an den Anschlüssen der Sensoren sowie ein zu starkes Knicken der Anschlußkabel, insbesondere im Bereich der Sensorhalter, wird dadurch vermieden. Außerdem sind die Anschlußkabel durch die Zugentlastung besser geführt.It is expediently provided that the sensors for the connection with an external display or evaluation device connecting cable have and that the device has a strain relief for the Has connection cable. Impermissibly high tensile forces at the connections the sensors as well as an excessive kinking of the connection cables, this is avoided in particular in the area of the sensor holder. In addition, the connection cables are better due to the strain relief guided.
Nachstehend sind Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert.Below are exemplary embodiments of the invention based on the Drawing explained in more detail.
Es zeigen in unterschiedlichen Maßstäben und zum Teil stärker schematisiert:They show on different scales and sometimes more schematized:
Fig. 1 Eine Aufsicht auf die erfindungsgemäße Vorrichtung, welche die um das Beobachtungsfenster herum angeordneten Sensoren sowie die Perfusionskanäle erkennen läßt, Fig. 1 A plan view of the inventive apparatus which can detect the sensors arranged and the Perfusionskanäle to the observation window around,
Fig. 2 einen Schnitt durch die Ebene A-B der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung, wobei für das zu untersuchende biologische Material ein scheibenförmiger Träger vorgesehen ist, Fig. 2 shows a section through the plane AB shown in FIG. 1 device, with a disc-shaped support is provided for the biological material to be examined,
Fig. 3 eine Darstellung ähnlich Fig. 2, wobei jedoch statt des scheibenförmigen Trägers eine in die Vorrichtung eingesetzte Kulturschale für das zu untersuchende biologische Material vorgesehen ist und Fig. 3 is a view similar to FIG. 2, but with a culture dish used in the device is intended for the biological material to be examined, instead of the disc-shaped carrier and
Fig. 4 einen Schnitt durch die Ebene C-D der in Fig. 1 dar gestellten Vorrichtung, wobei auch die Zugentlastung für die Sensorkabel erkennbar ist. Fig. 4 shows a section through the plane CD of the device shown in Fig. 1, wherein the strain relief for the sensor cable can be seen.
Eine im ganzen mit 1 bezeichnete Vorrichtung zum Mikroskopieren von Testzellen, Gewebeschnitten oder dergleichen biologischem Material weist eine im wesentlichen geschlossene Kultivierungs- Prüfkammer 2 mit einem Aufnahmebereich 3 für das biologische Material auf. Die Prüfkammer 2 hat ein quer zur Beobachtungsrichtung 4 angeordnetes Beobachtungsfenster 5 für ein Mikroskop, eine Kamera oder dergleichen Beobachtungseinrichtung. Die Prüfkammer 2 weist ferner zwei Einlaßöffnungen 6 und zwei Auslaßöffnungen 7 auf, mit denen eine in der Prüfkammer befindliche Nährflüssigkeit regeneriert werden kann. Die Einlaßöffnungen 6 und die Auslaßöffnungen 7 sind hierzu mit Verbindungsschläuchen 8 an einem Perfusionssystem angeschlossen. In die Prüfkammer 2 greifen außerdem folgende Sensoren ein: Zwei Thermofühler 9, zwei Referenz-Elektroden (Ag/AgCI) 10, zwei Mikro-pH-Elektroden 11, zwei Mikro-Sauerstoffel ektroden 12, zwei Interdigitalkondensatoren 13, und zwei Zell potentialsensoren 14. Die Sensoren 9 bis 14 sind jeweils doppelt vorhanden, um eine Kontrolle zu ermöglichen. Die Sensoren 9 bis 12 sind mit ihrer Meßspitze 15 benachbart zu dem Aufnahmebereich 3 für das biologische Material angeordnet, während die Sensoren 13, 14 für einen Bewuchs mit den zu untersuchenden Zellen unmittelbar im Aufnahmebereich 3 angeordnet. Die Sensoren 9 bis 14 ermöglichen während der Beobachtung ein paralleles Abgreifen von Meßwerten an dem biologischen Material. In vorteilhafter Weise können durch die Sensoren 9 bis 14 zusätzliche Informationen, beispielsweise über zytophysiologische Abläufe in einer in der Prüfkammer 2 befindlichen Zellkultur gewonnen werden. Durch Korrelation der mit den einzelnen Sensoren 9 bis 14 gewonnenen Meßergebnissen kann die Zuverlässigkeit von Aussagen über den Zustand der in der Prüfkammer 2 befindlichen Zellen und insbesondere auch über den Ablauf dynamischer Prozesse verbessert werden. Dabei ermöglicht ein an den Einlaßöffnungen 6 und den Auslaßöffnungen 7 angeschlossenes Perfusionssystem das in der Prüfkammer 2 befindliche Zell- oder Gewebematerial über einen längeren Zeitraum vital zu erhalten, damit die dynamischen Eigenschaften in der Zellkultur ablaufender physikalisch-chemischer Vorgänge noch besser detektiert werden können. Die Vorrichtung 1 eignet sich besonders für immobilisiertes biologisches Material und kann zu Forschungszwecken, als Bio-Sensor oder als Testsystem für biologisches Material verwendet werden.A device designated as 1 for microscoping test cells, tissue sections or the like biological material has an essentially closed cultivation test chamber 2 with a receiving area 3 for the biological material. The test chamber 2 has an observation window 5 arranged transversely to the direction of observation 4 for a microscope, a camera or the like observation device. The test chamber 2 also has two inlet openings 6 and two outlet openings 7 , with which a nutrient liquid located in the test chamber can be regenerated. For this purpose, the inlet openings 6 and the outlet openings 7 are connected to a perfusion system with connecting tubes 8 . The following sensors also engage in the test chamber 2 : two thermal sensors 9 , two reference electrodes (Ag / AgCI) 10 , two micro-pH electrodes 11 , two micro-oxygen electrodes 12 , two interdigital capacitors 13 , and two cell potential sensors 14 . The sensors 9 to 14 are duplicated in order to enable control. The sensors 9 to 12 are arranged with their measuring tip 15 adjacent to the receiving area 3 for the biological material, while the sensors 13 , 14 for growth with the cells to be examined are arranged directly in the receiving area 3 . The sensors 9 to 14 enable parallel measurement of measured values from the biological material during the observation. Advantageously, the sensors 9 to 14 can be used to obtain additional information, for example about cytophysiological processes in a cell culture located in the test chamber 2 . By correlating the measurement results obtained with the individual sensors 9 to 14 , the reliability of statements about the state of the cells in the test chamber 2 and in particular also about the course of dynamic processes can be improved. A perfusion system connected to the inlet openings 6 and the outlet openings 7 enables the cell or tissue material in the test chamber 2 to be kept vital over a longer period of time, so that the dynamic properties of physico-chemical processes taking place in the cell culture can be detected even better. The device 1 is particularly suitable for immobilized biological material and can be used for research purposes, as a bio-sensor or as a test system for biological material.
Die Kultivierungs-Prüfkammer 2 hat ein erstes Gehäuseteil 16, das die Sensoren 9 bis 14, die Einlaßöffnungen 6 und die Auslaßöffnungen 7 für das Nährmedium aufweist. Das erste Gehäuseteil 16 hat Aufnahmeöffnungen 17, in welche die Sensoren 9 bis 14 mit Sensorhaltern 18a, 18b und auch die Verbindungsschläuche 8 für das Perfusionssystem lösbar einsetzbar sind. Die Sensoren 9 bis 14 sind dadurch austauschbar, so daß die Prüfkammer 2, abhängig von dem gewünschten Verwendungszweck, mit unterschiedlichen Sensor- Konfigurationen bestückt werden kann. Dabei können einzelne, nicht benötigte Aufnahmeöffnungen mit Verschlußstopfen abgedichtet sein. Die Prüfkammer 2 kann somit auch ohne Sensoren, als reine Kultivierungs- und Beobachtungsprüfkammer betrieben werden.The cultivation test chamber 2 has a first housing part 16 which has the sensors 9 to 14 , the inlet openings 6 and the outlet openings 7 for the nutrient medium. The first housing part 16 has receiving openings 17 , into which the sensors 9 to 14 with sensor holders 18 a, 18 b and also the connecting tubes 8 for the perfusion system can be detachably inserted. The sensors 9 to 14 are thereby interchangeable, so that the test chamber 2 can be equipped with different sensor configurations, depending on the intended use. Individual, unneeded receiving openings can be sealed with sealing plugs. The test chamber 2 can thus also be operated without sensors, as a pure cultivation and observation test chamber.
Die Prüfkammer 2 hat ferner ein zweites Gehäuseteil 22 mit einem in einer Hohlwand angeordneten Flüssigkeitskanal 19, der einen Flüssigkeitszulauf 20 und einem Flüssigkeitsablauf 21 für eine Temperierflüssigkeit aufweist. Die Prüfkammer 2 ist dadurch temperierbar und kann beispielsweise mit dem Flüssigkeitszulauf 20 und dem Flüssigkeitsablauf 21 mit einem thermostatisch geregelten Wasserkreislauf verbunden werden, damit das in der Prüfkammer 2 befindliche biologische Material möglichst genau auf einer konstanten Temperatur, beispielsweise 37,0°C, gehalten werden kann. Der Flüssigkeitskanal 19 ist in dem zweiten Gehäuseteil 22 vorgesehen und läuft am Umfang des ersten Gehäuseteiles um. Das zweite Gehäuseteil 22 besteht im wesentlichen aus Edelstahl und weist einen mit dem Flüssigkeitskanal 19 gut wärmeleitend verbundenen Wärmeübertragungssteg 23 auf, der mit seiner wärmeübertragenden Fläche mit der Unterseite des Kammerbodens thermisch gekoppelt ist. Zur Verbesserung der Wärmeleitung ist zwischen dem Kammerboden und dem Wärmeübertragungssteg 23 eine wärmeübertragende Zwischenschicht 24 vorgesehen. Die Prüfkammer 2 kann dadurch über ihren Umfang gleichmäßig mit dem Flüssigkeitskanal 19 temperiert werden.The test chamber 2 also has a second housing part 22 with a liquid channel 19 arranged in a hollow wall, which has a liquid inlet 20 and a liquid outlet 21 for a bath liquid. The test chamber 2 can thus be temperature-controlled and can be connected, for example, to the liquid inlet 20 and the liquid outlet 21 with a thermostatically controlled water circuit so that the biological material in the test chamber 2 is kept as precisely as possible at a constant temperature, for example 37.0 ° C can. The liquid channel 19 is provided in the second housing part 22 and runs around the circumference of the first housing part. The second housing part 22 consists essentially of stainless steel and has a heat transfer web 23 which is connected to the liquid channel 19 with good thermal conductivity and which is thermally coupled with its heat transfer surface to the underside of the chamber bottom. To improve the heat conduction, a heat-transferring intermediate layer 24 is provided between the chamber base and the heat transfer web 23 . The test chamber 2 can thus be tempered uniformly over its circumference with the liquid channel 19 .
Der den Kammerboden bildende Träger 25 für das biologische Material ist austauschbar. Das in das zweite Gehäuseteil 22 eingesetzte erste Gehäuseteil 16 ist dazu mit einem Schraubring 26 lösbar mit diesem verbindbar. Der Schraubring 26 greift in Gebrauchsstellung mit seinem Innengewinde in ein am Außenumfang des zweiten Gehäuseteiles 22 angeordnetes Außengewinde ein und übergreift mit einem innenseitig vorgesehenen Vorsprung 27 eine mit Halteschrauben 29 an dem ersten Gehäuseteil 16 befestigte Andruckplatte 28. Das erste Gehäuseteil 16 ist dadurch in Gebrauchsstellung fest mit dem zweiten Gehäuseteil 22 verbunden und kann nach Lösen des Schraubringes 26 auf einfache Weise, zusammen mit den Sensoren 9 bis 14, aus dem zweiten Gehäuseteil 22 entnommen werden. Der Träger 25, beispielsweise eine Kulturschale 30, kann dann zum Kultivieren des zu untersuchenden Zellmaterials in einem Brutschrank aus der Vorrichtung 1 entnommen werden. Durch Austauschen des Trägers 25 besteht außerdem die Möglichkeit, in schneller Taktfolge unterschiedliche Gewebekulturen mit der Vorrichtung 1 zu untersuchen.The carrier 25 forming the chamber floor for the biological material is exchangeable. For this purpose, the first housing part 16 inserted into the second housing part 22 can be detachably connected to the latter with a screw ring 26 . In the position of use, the screw ring 26 engages with its internal thread in an external thread arranged on the outer circumference of the second housing part 22 and, with a projection 27 provided on the inside, engages over a pressure plate 28 fastened with retaining screws 29 on the first housing part 16 . The first housing part 16 is thereby firmly connected to the second housing part 22 in the position of use and can be removed from the second housing part 22 in a simple manner together with the sensors 9 to 14 after loosening the screw ring 26 . The carrier 25 , for example a culture dish 30 , can then be removed from the device 1 in an incubator in order to cultivate the cell material to be examined. By exchanging the carrier 25, there is also the possibility of examining different tissue cultures with the device 1 in a rapid cycle.
Zum Einstellen der Kammerhöhe ist zwischen den Gehäuseteilen 16, 22 ein elastischer Distanzring 31 vorgesehen, der durch Verstellen des Schraubringes 26 mit definierter Vorspannkraft zwischen den Gehäuseteilen 16, 22 eingespannt werden kann. Die jeweils eingestellte Kammerhöhe kann dabei mit Hilfe von Markierungen, die am Außenumfang des Schraubringes 26 und am Außenumfang des zweiten Gehäuseteils 22 angebracht sind, abgelesen werden. Die Kammerhöhe kann dadurch, abhängig von der Stellung des Schraubringes 26, eingestellt werden, so daß beispielsweise zur Bestimmung der metabolischen Aktivität von Zellen durch Messung des pH-Wertes und der Sauerstoffkonzentration eine geringe Kammerhöhe gewählt werden kann, während die Kammerhöhe für die Dauer der Perfusionsintervalle angehoben wird, damit die auf die Zellen ausgeübten Strömungs-Scherkräfte gering sind. Der elastische Distanzring 31 bewirkt gleichzeitig eine besonders gute Abdichtung des Kammervolumens. Um ein Beschädigen der Sensoren 9 bis 14 oder des biologischen Materials durch versehentli ches Einstellen einer zu kleinen Kammerhöhe zu verhindern, weist das zweite Gehäuseteil 22 eine Anschlagfläche 39 für die Andruck platte 28 auf. Die Anschlagfläche 39 begrenzt den Verstellweg für die Andruckplatte 28 und gibt dadurch die kleinste einzustellende Kammerhöhe vor.For adjusting the height of chamber 22, a resilient spacer ring 31 between the housing parts 16, provided which can be clamped by moving the screw ring 26 with a defined prestressing force between the housing parts 16, 22nd The chamber height set in each case can be read off with the aid of markings which are provided on the outer circumference of the screw ring 26 and on the outer circumference of the second housing part 22 . The chamber height can thereby be set depending on the position of the screw ring 26 , so that, for example, a small chamber height can be selected for determining the metabolic activity of cells by measuring the pH and the oxygen concentration, while the chamber height for the duration of the perfusion intervals is raised so that the flow shear forces exerted on the cells are low. The elastic spacer ring 31 also provides a particularly good seal of the chamber volume. In order to prevent damage to the sensors 9 to 14 or the biological material by accidentally setting an excessively small chamber height, the second housing part 22 has a stop surface 39 for the pressure plate 28 . The stop surface 39 limits the adjustment path for the pressure plate 28 and thereby specifies the smallest chamber height to be set.
Das erste Gehäuseteil 16 weist an der dem Beobachtungsfenster 5 gegenüberliegenden Kammerwand ein Zusatzfenster 35 auf, an dem eine Lichtquelle zum Durchleuchten des zu untersuchenden Zell materials positioniert werden kann. An dem Zusatzfenster 35 kann auch ein Objektiv positioniert werden, so daß das in der Prüfkammer befindliche biologische Material dann von der Oberseite her betrachtet werden kann. Die Lichtquelle kann in diesem Fall an dem Beobachtungsfenster 5 eingekoppelt werden. Die Vorrichtung 1 eignet sich deshalb sowohl für inverse, als auch für nichtinverse Mikroskope, d. h. das objektiv des Mikroskopes kann sowohl an der Unterseite, als auch an der Oberseite der Vorrichtung angeordnet sein.The first housing part 16 has, on the chamber wall opposite the observation window 5 , an additional window 35 , on which a light source for illuminating the cell material to be examined can be positioned. A lens can also be positioned on the additional window 35 so that the biological material in the test chamber can then be viewed from the top. In this case, the light source can be coupled into the observation window 5 . The device 1 is therefore suitable for both inverse and non-inverse microscopes, ie the objective of the microscope can be arranged both on the underside and on the top of the device.
Das erste Gehäuseteil 16 ist einstückig mit dem Zusatzfenster 35 verbunden und besteht aus biologisch inertem, hochtransparentem Kunststoff, beispielsweise aus Polykarbonat. Das erste Gehäuseteil 16 weist einen kreisringförmigen Umfang auf und hat an seiner Oberseite 32 eine konzentrisch dazu angeordnete trichterförmige Vertiefung 33, die nach unten hin durch das bündig zur oberen Kammerwandung 34 angeordnete Beobachtungsfenster 5 begrenzt ist. In einem im Vergleich zu dem Zusatzfenster 35 dickeren, um dieses umlaufenden Bereich weist das erste Gehäuseteil 16 die Aufnahmeöff nungen 17 für die Sensoren (9 bis 14) und die Ein- und Auslaßöff nungen 20, 21 für das Perfusionssystem auf. Eine Kondensorlinse oder ein Objektiv mit großem Aperturwinkel können dadurch bis dicht an das zu untersuchende Zellmaterial herangeführt werden. The first housing part 16 is connected in one piece to the additional window 35 and consists of biologically inert, highly transparent plastic, for example of polycarbonate. The first housing part 16 has an annular circumference and has on its upper side 32 a funnel-shaped depression 33 which is arranged concentrically thereto and which is delimited at the bottom by the observation window 5 which is arranged flush with the upper chamber wall 34 . In a thicker compared to the additional window 35 around this circumferential area, the first housing part 16 has the receiving openings 17 for the sensors ( 9 to 14 ) and the inlet and outlet openings 20 , 21 for the perfusion system. A condenser lens or a lens with a large aperture angle can thus be brought close to the cell material to be examined.
Die Längserstreckungsrichtung der Sensorhalter 18a verläuft schräg zur Beobachtungsrichtung 4 und die Sensoren 9 bis 12 sind mit ihrer Meßspitze 15 schräg nach innen in Richtung auf den Aufnahmebereich 3 ausgerichtet. Wie Fig. 1 erkennen läßt, sind die Sensoren 9 bis 12 außerdem auf einem zu dem Außenrand des kreisrunden Zusatzfensters 35 konzentrisch angeordneten Kreis in gleichen Abständen um das Zusatzfenster 5 herum positioniert. Die Sensoren 9 bis 12 sind dadurch mit ihrer Meßspitze 15 dicht benachbart zu dem zu untersuchenden zellmaterial angeordnet und dennoch verbleibt oberhalb des Zusatzfensters 35 ein etwa trichterförmiger Bereich, in dem beispielsweise eine Kondensorlinse eines Mikroskops positioniert werden kann.The longitudinal direction of the sensor holder 18 a extends obliquely to the direction of observation 4 and the sensors 9 to 12 are aligned with their measuring tip 15 obliquely inwards towards the receiving area 3 . As can be seen in FIG. 1, the sensors 9 to 12 are also positioned on a circle concentrically arranged to the outer edge of the circular additional window 35 at equal intervals around the additional window 5 . The sensors 9 to 12 are thus arranged with their measuring tip 15 closely adjacent to the cell material to be examined, and yet an approximately funnel-shaped area remains above the additional window 35 in which, for example, a condenser lens of a microscope can be positioned.
Als Zugentlastung und zum Befestigen der Anschlußkabel 38 für die Sensoren 9 bis 14 und/oder der Verbindungsschläuche 8 für die Perfusion weist die Vorrichtung 1 einen an der Andruckplatte 28 befestigten Haltering 36 auf.As a strain relief and for attaching the connecting cables 38 for the sensors 9 to 14 and / or the connecting tubes 8 for the perfusion, the device 1 has a retaining ring 36 attached to the pressure plate 28 .
Ferner sind zum Befestigen der Vorrichtung 1, beispielsweise an einem Objekttisch eines Mikroskops, an der der Unterseite des zweiten Gehäuseteiles 22 Vertiefungen 37 zum Einsetzen von Haltestiften vorgesehen.Furthermore, for attaching the device 1 , for example on an object table of a microscope, on the underside of the second housing part 22, depressions 37 are provided for inserting retaining pins.
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