DE4417078A1 - Chamber for microscopic examination of organic material - Google Patents
Chamber for microscopic examination of organic materialInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zum Mikroskopieren von Testzellen, Gewebeschnitten oder dergleichen organischem Material, mit einer im wesentlichen geschlossenen Kultivierungs-Kammer mit einem Aufnahmebereich für das organische Material, wobei die Kammer wenigstens ein quer zur Beobachtungsrichtung angeordnetes Beobachtungsfenster für eine optische Beobachtungseinrichtung, wie Mikroskop und/oder Kamera aufweist und wenigstens eine Einlaßöffnung sowie wenigstens eine Auslaßöffnung für eine Nährflüssigkeit hat.The invention relates to a device for Microscopy of test cells, tissue sections or the same organic material, with an essentially closed cultivation chamber with a reception area for the organic material, the chamber at least one Observation window arranged transversely to the direction of observation for an optical observation device, such as a microscope and / or camera and at least one inlet opening and at least one outlet opening for a nutrient liquid Has.
Eine solche Vorrichtung ist bereits bekannt und kann beispielsweise auf dem Objekttisch eines Mikroskops positioniert sein, damit das in der Kammer befindliche biologische Material, beispielsweise Testzellen oder Gewebeschnitte, durch das Beobachtungsfenster der Kammer hindurch mit dem Mikroskop in vergrößertem Maßstab betrachtet oder untersucht werden kann. Dabei kann an den Ein- und Auslaßöffnungen der Kammer ein Perfusionssystem angeschlossen sein, das eine kontinuierliche oder diskontinuierliche Erneuerung einer in der Kammer befindlichen Nährflüssigkeit ermöglicht. Die Testzellen können dadurch über einen längeren Zeitraum hinweg, beispielsweise länger als 10 Minuten, auf dem Mikroskop-Objekttisch unter definierten äußeren Bedingungen vital erhalten werden, um beispielsweise dynamische Prozesse zu untersuchen.Such a device is already known and can for example on the microscope stage be positioned so that the in the chamber biological material, for example test cells or Tissue sections through the chamber's observation window viewed with the microscope on an enlarged scale or can be examined. It can at the input and Outlet openings of the chamber connected to a perfusion system be a continuous or discontinuous Renewal of a nutrient liquid in the chamber enables. As a result, the test cells can last longer Period, for example longer than 10 minutes, on the Microscope stage under defined external conditions vital, for example dynamic processes to investigate.
Nachteilig ist dabei jedoch, daß das in der geschlossenen Kultur-Kammer befindliche Zellmaterial für weitergehende Untersuchungen kaum zugänglich ist, und daß Erkenntnisse über in dem Zellmaterial ablaufende dynamische Vorgänge praktisch nur auf optische Beobachtungen gestützt werden können.The disadvantage here, however, is that in the closed Culture chamber located cell material for further Research is hardly accessible and that knowledge about dynamic processes taking place in the cell material are practical can only be based on optical observations.
Es besteht deshalb die Aufgabe, eine Vorrichtung der eingangs genannten Art zu schaffen, mit der parallel zu der optischen, beispielsweise durch Mikroskopieren gewonnenen Information, unter definierten äußeren Bedingungen und über einen längeren Zeitraum hinweg, zusätzliche Erkenntnisse über das organische Material gewonnen werden können.There is therefore the task of a device of the beginning to create the type mentioned, with which parallel to the optical, for example information obtained by microscopy, under defined external conditions and over a longer period Period, additional insights into the organic Material can be obtained.
Die Lösung dieser Aufgabe besteht darin, daß die Vorrichtung in der Kammer wenigstens einen physiologischen Sensor aufweist, der zumindest dicht benachbart zu dem Aufnahmebereich angeordnet ist.The solution to this problem is that the device at least one physiological sensor in the chamber has, which is at least closely adjacent to the Recording area is arranged.
In vorteilhafter Weise ermöglicht der in die Kammer integrierte Sensor eine zu den optischen, beispielsweise durch Mikroskopieren erhaltenen Informationen parallele Meßsignalgewinnung, mit der zusätzliche Aussagen, beispielsweise über zytophysiologische Abläufe möglich werden. So können beispielsweise pH-, Sauerstoffkonzentrations-, Ionenkonzentrations-, Zellpotential-, Impedanz- oder Temperaturmessungen über einen längeren Zeitraum unter definierten äußeren Bedingungen durchgeführt werden, wobei eine gleichzeitige optische Beobachtung der Zell- oder Gewebekultur möglich ist.Advantageously, this allows in the chamber integrated sensor one to the optical, for example by Microscopy obtained information in parallel Measurement signal acquisition with which additional statements for example through cytophysiological processes. For example, pH, oxygen concentration, Ion concentration, cell potential, impedance or Temperature measurements over a long period of time defined external conditions are carried out, whereby simultaneous optical observation of the cell or Tissue culture is possible.
Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, daß mehrere Sensoren in der Kammer angeordnet sind, die eine parallele Meßsignalgewinnung ermöglichen. Dabei können Sensoren für Temperatur, pH-Wert, Sauerstoffkonzentration, NO, Ionenkonzentration und für elektrische Parameter vorgesehen sein, so daß wichtige physikalisch-chemische Größen des Zell-Milieus einer Kontrolle zugänglich sind.A particularly advantageous embodiment of the invention provides that several sensors are arranged in the chamber, which enable parallel measurement signal acquisition. Here can sensors for temperature, pH, Oxygen concentration, NO, ion concentration and for electrical parameters are provided so that important physico-chemical parameters of the cell environment of a control are accessible.
Die Sensoren können außerdem für homogene enzymatische Bestimmungen verwendet werden, so daß eine enzymatische Analyse von Substraten, die von den Zellen ins Medium abgegeben oder diesem entnommen werden, mit extern zugesetzter Enzymaktivität (z. B. Oxydasen oder Peroxydasen) ebenso möglich ist, wie die Bestimmung der katalytischen Aktivität von Enzymen, welche die Zellen durch Exozytose freisetzen.The sensors can also be used for homogeneous enzymatic Determinations are used so that an enzymatic Analysis of substrates from cells into the medium delivered or removed from it, with externally added Enzyme activity (e.g. oxidases or peroxidases) is also possible is how to determine the catalytic activity of Enzymes that release the cells through exocytosis.
In vorteilhafter Weise wird somit eine Meß-, Beobachtungs- und Kultivierungs-Kammer zur Verfügung gestellt, die mehrere, sich sinnvoll ergänzende und gegebenenfalls gegenseitig kontrollierende Detektionsmöglichkeiten für Messungen von zellulären Prozessen aufweisen kann. Dies ermöglicht insbesondere auch eine Korrelation der von den einzelnen Sensoren über einen längeren Zeitraum ermittelten Meßwerte, beispielsweise durch die Erstellung von Ortskurven, so daß die Zuverlässigkeit von Aussagen über in der Kammer befindliches biologisches Material verbessert ist. Ferner sind vergleichende metabolische Messungen ohne den notwendigen Gebrauch von zytotoxischen Farbstoffen möglich.A measurement, observation and Cultivation Chamber provided several, themselves sensibly complementary and if necessary mutually controlling detection possibilities for measurements of cellular processes. this makes possible in particular also a correlation of the individual Sensors measured values over a longer period of time, for example by creating locus curves so that the Reliability of statements about what is in the chamber biological material is improved. Furthermore are comparative metabolic measurements without the necessary Use of cytotoxic dyes possible.
Durch die kontinuierliche Erneuerung der in der Kammer befindlichen Nährflüssigkeit eignet sich die Vorrichtung besonders für Messungen an immobilisiertem biologischem Material. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann sowohl zu wissenschaftlichen Zwecken eingesetzt werden als auch als Bio- Sensor Verwendung finden, beispielsweise bei der Gewässerkontrolle, wobei eine Probe des zu untersuchenden Wassers durch zusätzliche Perfusionskanäle in die Kammer eingeleitet und mittels der Sensoren und gegebenenfalls durch optische Beobachtung untersucht wird.Through the continuous renewal of the in the chamber the device is suitable especially for measurements on immobilized biological Material. The device according to the invention can both used for scientific purposes as well as bio Find sensor, for example in the Water control, taking a sample of the sample to be examined Water through additional perfusion channels into the chamber initiated and by means of the sensors and, if necessary, by optical observation is examined.
Eine Weiterbildung der Erfindung sieht vor, daß eine Wandung der Kammer Aufnahmeöffnungen hat, in welche die Sensoren mit Sensorhaltern lösbar einsetzbar, vorzugsweise einschraubbar oder einsteckbar sind. Die Sensoren sind dadurch auf einfache Weise austauschbar, so daß die Kammer, je nach Anwendungsfall, mit der gewünschten Sensor-Konfiguration bestückt werden kann.A further development of the invention provides that a wall the chamber has openings in which the sensors Detachable sensor holders, preferably screw-in or are insertable. This makes the sensors simple Interchangeable, so that the chamber, depending on the application, can be equipped with the desired sensor configuration.
Zweckmäßigerweise sind zum Verschließen nicht benötigter Aufnahmeöffnungen Verschlußstopfen vorgesehen. Die Anzahl der verwendeten Sensoren kann dann an die jeweilige Applikation angepaßt werden. Bei Bedarf kann die Kammer auch ohne Sensoren, als reine Kultivier- und/oder Mikroskopier-Kammer oder für andere optische Untersuchungen verwendet werden.Expediently, closures are not required Receiving openings sealing plugs are provided. The number of The sensors used can then be sent to the respective application be adjusted. If necessary, the chamber can also be used without Sensors, as a pure cultivation and / or microscopy chamber or used for other optical examinations.
Besonders günstig ist, wenn die Längserstreckungsrichtung von wenigstens zwei Sensorhaltern schräg zur Beobachtungsrichtung oder senkrecht zum Aufnahmebereich angeordnet ist und wenn für die Beobachtungseinrichtung, insbesondere für eine Kondensorlinse, zwischen den Sensorhaltern zumindest ein trichterförmiger Bereich vorgesehen ist. Die Sensoren sind dann um das Beobachtungsfenster herum, mit ihrer Meßspitze schräg nach innen geneigt oder senkrecht zum Beobachtungsbereich ausgerichtet, so daß oberhalb des Beobachtungsfensters genügend Raum für eine Kondensorlinse, ein Objektiv oder dergleichen optisches Gerät verbleibt, und die Meßspitze der Sensoren dennoch dicht benachbart zu dem Beobachtungsbereich der zu untersuchenden Zell- oder Gewebesubstanz angeordnet ist.It is particularly favorable if the longitudinal direction of at least two sensor holders at an angle to the direction of observation or is arranged perpendicular to the recording area and if for the observation device, in particular for a Condenser lens, at least one between the sensor holders funnel-shaped area is provided. The sensors are then around the observation window with its measuring tip slanted inwards or perpendicular to the Observation area aligned so that above the Observation window enough space for a condenser lens, a lens or the like optical device remains, and the measuring tip of the sensors is nevertheless closely adjacent to the Observation area of the cell or cells to be examined Tissue substance is arranged.
Damit das in das Kammer befindliche organische Material möglichst genau auf Normaltemperatur (bei Säugerzellen 37,0°C) gehalten werden kann, ist es vorteilhaft, wenn die Kammer temperierbar ist.So that the organic material in the chamber as close as possible to normal temperature (in mammalian cells 37.0 ° C), it is advantageous if the Chamber is temperature controlled.
Eine Ausführungsform der Erfindung sieht vor, daß die Kammer einen Flüssigkeitskanal oder eine Hohlwand für Temperierflüssigkeit, mit einem Flüssigkeitszulauf und einem Flüssigkeitsablauf aufweist und daß der Flüssigkeitskanal oder dergleichen vorzugsweise an einer dem Beobachtungsfenster abgewandten Seite, zumindest über einen Teil des Umfanges verlaufend, an der Kammer angeordnet ist. Der Flüssigkeitskanal kann dann mit einer Umwälzpumpe mit einem thermostatisch geregeltem Wasserbad und einem Wasserkreislauf verbunden sein, so daß das zu untersuchende Zellmaterial sehr exakt auf einer vorgegebenen Temperatur gehalten werden kann.An embodiment of the invention provides that the chamber a liquid channel or a cavity wall for Bath liquid, with one liquid inlet and one Has liquid drain and that the liquid channel or the like preferably at one of the observation window opposite side, at least over part of the circumference trending, is arranged on the chamber. Of the Liquid channel can then be used with a circulation pump thermostatically controlled water bath and a water circuit be connected so that the cell material to be examined is very can be kept exactly at a predetermined temperature.
Eine andere Ausführungsform sieht vor, daß wenigstens eine Kammerwand mit einer vorzugsweise thermostatisch geregelten Elektroheizung beheizbar ist. Eine solche Elektroheizung kann beispielsweise mit einem Halbleiter-Temperatursensor geregelt sein, mit dem die Temperatur in der Meß-Kammer mit großer Genauigkeit eingestellt werden kann.Another embodiment provides that at least one Chamber wall with a preferably thermostatically controlled Electric heating is heated. Such an electric heater can regulated for example with a semiconductor temperature sensor be with which the temperature in the measuring chamber with large Accuracy can be adjusted.
Eine Weiterbildung der Erfindung sieht vor, daß die Kammer einen austauschbaren Träger, insbesondere eine Kulturschale, für das organische Material aufweist, und daß die Kammer für dessen Einsetzen und Entnehmen eine verschließbare Entnahmeöffnung hat. Das Kultursubstrat ist dadurch austauschbar, so daß beispielsweise Glasträger oder Polystyrol-Gewebekulturschalen für den Einmalgebrauch gleichermaßen Verwendung finden können. Besonders vorteilhaft ist dabei, daß die zu untersuchenden Zellen zur Vorkultivierung auf dem Träger im Brutschrank inkubiert werden können. Das Zellmaterial kann dazu auf einer Gewebekulturschale praktisch ohne Kontaminationsgefahr und unter besonders einfacher Handhabung zwischen einer Kultur im Inkubator und in der Kammer transferiert werden. Die Vorkultivierung erlaubt eine höhere experimentelle Produktivität, was besonders beim Testen mehrerer Zell populationen vorteilhaft ist. Für spezielle Untersuchungs methoden, wie z. B. die Patch-Clamp-Methode oder die Mikroinjektion von Substanzen in Zellen, ist außerdem auch eine offene Kultivierung möglich.A further development of the invention provides that the chamber an exchangeable carrier, in particular a culture dish, for the organic material, and that the chamber for its insertion and removal a lockable Has removal opening. The culture substrate is thereby interchangeable, so that for example glass supports or Disposable polystyrene tissue culture dishes can be used equally. Particularly advantageous is that the cells to be examined for Pre-cultivation can be incubated on the carrier in the incubator can. The cell material can do this on a Tissue culture dish practically without risk of contamination and under particularly easy handling between a culture in the Incubator and transferred to the chamber. The Pre-cultivation allows a higher experimental Productivity, especially when testing multiple cells populations is beneficial. For special examination methods such as B. the patch clamp method or Microinjection of substances in cells is also also open cultivation possible.
Zweckmäßigerweise ist vorgesehen, daß die Kammer ein erstes Gehäuseteil und ein zweites Gehäuseteil aufweist, daß das erste, vorzugsweise in Gebrauchsstellung oberseitig angeordnete Gehäuseteil die Sensoren aufweist, daß in dem zweiten, vorzugsweise unterseitig angeordneten Gehäuseteil das Beobachtungsfenster und das zu untersuchende organische Material vorgesehen ist und daß die beiden Gehäuseteile lösbar miteinander verbindbar sind. Das erste Gehäuseteil kann dann auf einfache Weise zusammen mit den Sensoren und ggf. auch mit den Anschlüssen für das Perfusionssystem aus der Vorrichtung entnommen werden, so daß das zu untersuchende organische Material gut zugänglich ist. Da die gesamten elektrischen Anschlüsse für die Sensoren an dem ersten, entnehmbaren Gehäuseteil vorgesehen sind, kann das zweite Gehäuseteil auf einfache Weise mit dem darin befindlichen Zell- oder Gewebematerial, beispielsweise zur Vorkultivierung der Zellen, in einem Brutschrank inkubiert werden.It is expediently provided that the chamber has a first Housing part and a second housing part has that first, preferably in the use position on the top arranged housing part has the sensors that in the second, preferably arranged on the underside of the housing Observation window and the organic to be examined Material is provided and that the two housing parts are detachable are interconnectable. The first housing part can then in a simple way together with the sensors and possibly also with the connections for the perfusion system from the device are removed so that the organic to be examined Material is easily accessible. Because the entire electrical Connections for the sensors on the first, removable Housing part are provided, the second housing part simple way with the cell or Tissue material, for example for the pre-cultivation of the cells, incubated in an incubator.
Vorteilhaft ist, wenn die Kammer, vorzugsweise an einer dem Beobachtungsfenster abgewandten Kammerwandung, ein Zusatzfenster aufweist. Das in der Kammer befindliche organische Material kann dann mit einer auf das Zusatzfenster gerichteten Lichtquelle zum Mikroskopieren durchleuchtet werden. Außerdem kann das Zusatzfenster auch zum Beobachten verwendet werden. Wenn das Beobachtungsfenster an der Unterseite der Vorrichtung und das Zusatzfenster an deren Oberseite vorgesehen ist, kann die Vorrichtung sowohl mit inversen, als auch mit nichtinversen Mikroskopen verwendet werden, d. h. das Objektiv des Mikroskopes kann sowohl an der Unterseite, als auch an der Oberseite der Vorrichtung angeordnet sein.It is advantageous if the chamber, preferably on one of the Observation window facing away from the chamber wall, a Has additional windows. The one in the chamber organic material can then be placed on the additional window directed light source for microscopy become. The additional window can also be used for observation be used. If the observation window on the Bottom of the device and the additional window on its Top is provided, the device can both with inverted, as well as used with non-inverse microscopes become, d. H. the microscope lens can be attached to both Bottom, as well as on the top of the device be arranged.
Vorteilhaft ist, wenn das Zusatzfenster einstückig mit dem ersten Gehäuseteil ausgebildet ist und vorzugsweise aus biologisch inertem, hochtransparentem Kunststoff besteht. Das erste Gehäuseteil kann dann besonders einfach, beispielsweise als im wesentlichen kreisscheibenförmiger Polykarbonat-Körper ausgebildet sein, mit einem darin mittig angeordnetem dünnen Zusatzfenster, das dem zu untersuchenden Zellmaterial dicht benachbart ist und mit einem im Vergleich zu dem Aufnahmefenster dickeren Bereich, der um das Zusatzfenster umläuft und die Aufnahmeöffnungen für die Sensoren und ggf. die Ein- und Auslaßöffnungen für das Perfusionssystem aufweist. Die im Bereich des Zusatzfensters verringerte Wandstärke ermöglicht dabei, ein Objektiv oder eine Kondensorlinse mit hoher Apertur möglichst nahe an die Objektebene heranführen zu können.It is advantageous if the additional window in one piece with the is formed first housing part and preferably made of biologically inert, highly transparent plastic. The the first housing part can then be particularly simple, for example as an essentially circular polycarbonate body be formed with a thinly arranged therein Additional window that is sealed to the cell material to be examined is adjacent and with a compared to that Recording window thicker area around the additional window rotates and the receiving openings for the sensors and possibly the inlet and outlet openings for the perfusion system having. The reduced in the area of the additional window Wall thickness enables a lens or a Condenser lens with high aperture as close as possible to the To be able to bring up the object level.
Besonders günstig ist, wenn zum Einstellen der Kammerhöhe zwischen den Gehäuseteilen ein elastischer Distanzring vorgesehen ist, und wenn der Distanzring mit einer insbesondere einen Schraubring aufweisenden Spannvorrichtung zwischen den Gehäuseteilen einspannbar ist. Die Kammerhöhe und der Abstand der Sensoren zu dem zu untersuchenden Zellmaterial können dann durch Variieren des auf den elastischen Distanzring mittels der Spannvorrichtung ausgeübten Spanndruckes stufenlos und reproduzierbar eingestellt werden. Dabei kann an der Spannvorrichtung eine Skala oder eine Anzeige vorgesehen sein, an der die jeweils eingestellte Kammerhöhe ablesbar ist. Damit die Sensoren beim Verstellen der Kammerhöhe nicht beschädigt werden können, kann ferner ein Begrenzungsanschlag vorgesehen sein, der ein versehentliches Einstellen einer zu geringen Kammerhöhe verhindert. Bestimmte experimentelle Techniken, wie beispielsweise die Bestimmung der metabolischen Aktivität von Zellen durch Messung des pH- Wertes und der Sauerstoff-Konzentration, setzen ein hohes Zellenzahl- zu Kammervolumen-Verhältnis beziehungsweise eine extrem geringe Kammerhöhe voraus, so daß in solchen Fällen die Kammerhöhe entsprechend anpaßbar ist. Die Variierbarkeit der Kammerhöhe bietet darüber hinaus die Möglichkeit, die durch die Nährflüssigkeitsströmung auf die Zellen ausgeübten strömungs-Scherkräfte zu reduzieren, indem die Kammerhöhe während der Perfusionsintervalle vorübergehend vergrößert wird.It is particularly favorable if to adjust the chamber height an elastic spacer ring between the housing parts is provided, and if the spacer ring with a in particular a clamping device having a screw ring can be clamped between the housing parts. The chamber height and the distance of the sensors to the cell material to be examined can then be adjusted by varying the elasticity Spacer ring exerted by means of the clamping device Clamping pressure can be set continuously and reproducibly. A scale or a can be on the clamping device Display should be provided on which the currently set Chamber height is readable. So that the sensors when adjusting the chamber height can not be damaged can also Limit stop may be provided which is an accidental Preventing the chamber from being set too low. Certain experimental techniques such as determination the metabolic activity of cells by measuring the pH Value and the oxygen concentration, set a high Cell number to chamber volume ratio or one extremely low chamber height ahead, so that in such cases the Chamber height is adjustable accordingly. The variability of Chamber height also offers the possibility of passing through the nutrient flow exerted on the cells to reduce flow shear forces by increasing the chamber height temporarily enlarged during perfusion intervals becomes.
Zweckmäßigerweise ist vorgesehen, daß die Kammer gasdicht ist. Dadurch wird eine kontrollierte Begasung der zu untersuchenden Zellen, beispielsweise durch Einstellen des CO₂-Gehaltes der den Zellen zugeführten Nährflüssigkeit ermöglicht.It is expediently provided that the chamber is gas-tight is. This ensures controlled fumigation of the investigating cells, for example by adjusting the CO₂ content of the nutrient fluid supplied to the cells enables.
Die Kammer kann außerdem zum Befestigen an einem Objekttisch eines Mikroskops Haltemittel oder Befestigungsstellen für Haltemittel aufweisen. Hierzu können beispielsweise außenseitig an der Kammer Vorsprünge vorgesehen sein, die in Funktionsstellung in entsprechende Vertiefungen des Objekttisches eingreifen.The chamber can also be attached to a stage a microscope holding means or attachment points for Have holding means. You can do this, for example Projections may be provided on the outside of the chamber Functional position in corresponding wells of the Intervene on the object table.
Zweckmäßigerweise ist vorgesehen, daß die Sensoren zur Verbindung mit einer externen Anzeige- oder Auswertevorrichtung Anschlußkabel aufweisen und daß die Vorrichtung eine Zugentlastung für die Anschlußkabel hat. Unzulässig hohe Zugkräfte an den Anschlüssen der Sensoren sowie ein zu starkes Knicken der Anschlußkabel, insbesondere im Bereich der Sensorhalter, wird dadurch vermieden. Außerdem sind die Anschlußkabel durch die Zugentlastung besser geführt.It is expediently provided that the sensors for Connection to an external display or evaluation device Have connection cable and that the device Has strain relief for the connection cable. Impermissibly high Tractive forces at the connections of the sensors as well as too strong Kinking the connection cable, especially in the area of Sensor holder is avoided. Besides, they are Connection cable better guided through the strain relief.
Nachstehend sind Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert.Below are exemplary embodiments of the invention based on the Drawing explained in more detail.
Es zeigen in unterschiedlichen Maßstäben und zum Teil stärker schematisiert:They show on different scales and sometimes more schematized:
Fig. 1 eine Aufsicht auf die erfindungsgemäße Vorrichtung, welche die um das Beobachtungsfenster herum angeordneten Sensoren sowie die Perfusionskanäle erkennen läßt, Fig. 1 is a plan view of the inventive apparatus which can detect the sensors arranged and the Perfusionskanäle to the observation window around,
Fig. 2 einen Schnitt durch die Ebene A-B der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung, wobei für das zu untersuchende organische Material ein scheibenförmiger Träger vorgesehen ist, Fig. 2 shows a section through the plane AB shown in FIG. 1 device, with a disc-shaped support is provided for the organic material to be examined,
Fig. 3 eine Darstellung ähnlich Fig. 2, wobei jedoch statt des scheibenförmigen Trägers eine in die Vorrichtung eingesetzte Kulturschale für das zu untersuchende organische Material vorgesehen ist und Fig. 3 is a view similar to FIG. 2, but with a culture dish used in the device is intended for the organic material to be examined, instead of the disc-shaped carrier and
Fig. 4 einen Schnitt durch die Ebene C-D der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung, wobei auch die Zugentlastung für die Sensorkabel erkennbar ist. Fig. 4 shows a section through the plane CD of the device shown in Fig. 1, wherein the strain relief for the sensor cable can also be seen.
Eine im ganzen mit 1 bezeichnete Vorrichtung zum Mikroskopieren von Testzellen, Gewebeschnitten oder dergleichen organischem Material weist eine im wesentlichen geschlossene Kultivierungskammer 2 mit einem Aufnahmebereich 3 für das organische Material auf. Die Kammer 2 hat ein quer zur Beobachtungsrichtung 4 angeordnetes Beobachtungsfenster 5 für ein Mikroskop, eine Kamera oder dergleichen Beobachtungseinrichtung. Die Kammer 2 weist ferner zwei Einlaßöffnungen 6 und zwei Auslaßöffnungen 7 auf, mit denen eine in der Kammer befindliche Nährflüssigkeit regeneriert werden kann. Die Einlaßöffnungen 6 und die Auslaßöffnungen 7 sind hierzu mit Verbindungsschläuchen 8 an einem Perfusionssystem angeschlossen. In die Kammer 2 greifen außerdem folgende Sensoren ein: Zwei Thermofühler 9, zwei Referenz-Elektroden (Ag/AgCI) 10, zwei Mikro-pH-Elektroden 11, zwei Mikro-O₂-Elektroden 12, zwei Interdigitalkondensatoren 13, und zwei Zellpotentialsensoren 14. Die Sensoren 9 bis 14 sind jeweils doppelt vorhanden, um eine Kontrolle zu ermöglichen. Die Sensoren 9 bis 12 sind mit ihrer Meßspitze 15 benachbart zu dem Aufnahmebereich 3 für das organische Material angeordnet, während die Sensoren 13, 14 für einen Bewuchs mit den zu untersuchenden Zellen unmittelbar im Aufnahmebereich 3 angeordnet. Die Sensoren 9 bis 14 ermöglichen während der Beobachtung ein paralleles Abgreifen von Meßwerten an dem organischen Material. In vorteilhafter Weise können durch die Sensoren 9 bis 14 zusätzliche Informationen, beispielsweise über zytophysiologische Abläufe in einer in der Kammer 2 befindlichen Zellkultur gewonnen werden. Durch Korrelation der mit den einzelnen Sensoren 9 bis 14 gewonnenen Meßergebnissen kann die Zuverlässigkeit von Aussagen über den Zustand der in der Kammer 2 befindlichen Zellen und insbesondere auch über den Ablauf dynamischer Prozesse verbessert werden. Dabei ermöglicht ein an den Einlaßöffnungen 6 und den Auslaßöffnungen 7 angeschlossenes Perfusionssystem das in der Kammer 2 befindliche Zell- oder Gewebematerial über einen längeren Zeitraum vital zu erhalten, damit die dynamischen Eigenschaften in der Zellkultur ablaufender physikalisch-chemischer Vorgänge noch besser detektiert werden können. Die Vorrichtung 1 eignet sich besonders für immobilisiertes biologisches Material und kann zu Forschungszwecken, als Bio-Sensor oder als Testsystem für biologisches oder organisches Material verwendet werden.A device designated as 1 for microscoping test cells, tissue sections or the like organic material has an essentially closed cultivation chamber 2 with a receiving area 3 for the organic material. The chamber 2 has an observation window 5 arranged transversely to the observation direction 4 for a microscope, a camera or the like observation device. The chamber 2 also has two inlet openings 6 and two outlet openings 7 , with which a nutrient liquid located in the chamber can be regenerated. For this purpose, the inlet openings 6 and the outlet openings 7 are connected to a perfusion system with connecting tubes 8 . The following sensors also engage in chamber 2 : two thermal sensors 9 , two reference electrodes (Ag / AgCI) 10 , two micro-pH electrodes 11 , two micro-O₂ electrodes 12 , two interdigital capacitors 13 , and two cell potential sensors 14 . The sensors 9 to 14 are duplicated in order to enable control. The sensors 9 to 12 are arranged with their measuring tip 15 adjacent to the receiving area 3 for the organic material, while the sensors 13 , 14 for growth with the cells to be examined are arranged directly in the receiving area 3 . The sensors 9 to 14 enable parallel measurement of measured values from the organic material during the observation. Advantageously, the sensors 9 to 14 can be used to obtain additional information, for example about cytophysiological processes in a cell culture located in the chamber 2 . By correlating the measurement results obtained with the individual sensors 9 to 14 , the reliability of statements about the state of the cells in the chamber 2 and in particular also about the course of dynamic processes can be improved. A perfusion system connected to the inlet openings 6 and the outlet openings 7 enables the cell or tissue material located in the chamber 2 to be kept vital over a longer period of time, so that the dynamic properties of the physical and chemical processes taking place in the cell culture can be detected even better. The device 1 is particularly suitable for immobilized biological material and can be used for research purposes, as a bio-sensor or as a test system for biological or organic material.
Die Kultivierungs-Kammer 2 hat ein erstes Gehäuseteil 16, das die Sensoren 9 bis 14, die Einlaßöffnungen 6 und die Auslaßöffnungen 7 für das Nährmedium aufweist. Das erste Gehäuseteil 16 hat Aufnahmeöffnungen 17, in welche die Sensoren 9 bis 14 mit Sensorhaltern 18a, 18b und auch die Verbindungsschläuche 8 für das Perfusionssystem lösbar einsetzbar sind. Die Sensoren 9 bis 14 sind dadurch austauschbar, so daß die Kammer 2, abhängig von dem gewünschten Verwendungszweck, mit unterschiedlichen Sensor- Konfigurationen bestückt werden kann. Dabei können einzelne, nicht benötigte Aufnahmeöffnungen mit Verschlußstopfen abgedichtet sein. Die Kammer 2 kann somit auch ohne Sensoren, als reine Kultivierungs- und Beobachtungskammer betrieben werden.The cultivation chamber 2 has a first housing part 16 which has the sensors 9 to 14 , the inlet openings 6 and the outlet openings 7 for the nutrient medium. The first housing part 16 has receiving openings 17 , into which the sensors 9 to 14 with sensor holders 18 a, 18 b and also the connecting tubes 8 for the perfusion system can be detachably inserted. The sensors 9 to 14 are thereby interchangeable, so that the chamber 2 can be equipped with different sensor configurations, depending on the intended use. Individual, unneeded receiving openings can be sealed with sealing plugs. The chamber 2 can thus also be operated without sensors, as a pure cultivation and observation chamber.
Die Kammer 2 hat ferner ein zweites Gehäuseteil 22 mit einem in einer Hohlwand angeordneten Flüssigkeitskanal 19, der einen Flüssigkeitszulauf 20 und einem Flüssigkeitsablauf 21 für eine Temperierflüssigkeit aufweist. Die Kammer 2 ist dadurch temperierbar und kann beispielsweise mit dem Flüssigkeitszulauf 20 und dem Flüssigkeitsablauf 21 mit einem thermostatisch geregelten Wasserkreislauf verbunden werden, damit das in der Kammer 2 befindliche organische Material möglichst genau auf einer konstanten Temperatur, beispielsweise 37,0°C, gehalten werden kann. Der Flüssigkeitskanal 19 ist ist in dem zweiten Gehäuseteil 22 vorgesehen und läuft am Umfang des ersten Gehäuseteiles um. Das zweite Gehäuseteil 22 besteht im wesentlichen aus Edelstahl und weist einen mit dem Flüssigkeitskanal 19 gut wärmeleitend verbundenen Wärmeübertragungssteg 23 auf, der mit seiner wärmeübertragenden Fläche mit der Unterseite des Kammerbodens thermisch gekoppelt ist. Zur Verbesserung der Wärmeleitung ist zwischen dem Kammerboden und dem Wärmeübertragungssteg 23 eine wärmeübertragende Zwischen schicht 24 vorgesehen. Die Kammer 2 kann dadurch über ihren Umfang gleichmäßig mit dem Flüssigkeitskanal 19 temperiert werden.The chamber 2 also has a second housing part 22 with a liquid channel 19 arranged in a hollow wall, which has a liquid inlet 20 and a liquid outlet 21 for a bath liquid. The chamber 2 can thereby be temperature-controlled and can be connected, for example, to the liquid inlet 20 and the liquid outlet 21 with a thermostatically controlled water circuit so that the organic material in the chamber 2 is kept as precisely as possible at a constant temperature, for example 37.0 ° C. can. The liquid channel 19 is provided in the second housing part 22 and runs around the circumference of the first housing part. The second housing part 22 consists essentially of stainless steel and has a heat transfer web 23 which is connected to the liquid channel 19 with good thermal conductivity and which is thermally coupled with its heat transfer surface to the underside of the chamber bottom. To improve the heat conduction, a heat-transferring intermediate layer 24 is provided between the chamber bottom and the heat transfer web 23 . The chamber 2 can be tempered uniformly over its circumference with the liquid channel 19 .
Der den Kammerboden bildende Träger 25 für das organische Material ist austauschbar. Das in das zweite Gehäuseteil 22 eingesetzte erste Gehäuseteil 16 ist dazu mit einem Schraubring 26 lösbar mit diesem verbindbar. Der Schraubring 26 greift in Gebrauchsstellung mit seinem Innengewinde in ein am Außenumfang des zweiten Gehäuseteiles 22 angeordnetes Außengewinde ein und übergreift mit einem innenseitig vorgesehenen Vorsprung 27 eine mit Halteschrauben 29 an dem ersten Gehäuseteil 16 befestigte Andruckplatte 28. Das erste Gehäuseteil 16 ist dadurch in Gebrauchsstellung fest mit dem zweiten Gehäuseteil 22 verbunden und kann nach Lösen des Schraubringes 26 auf einfache Weise, zusammen mit den Sensoren 9 bis 14, aus dem zweiten Gehäuseteil 22 entnommen werden. Der Träger 25, beispielsweise eine Kulturschale 30, kann dann zum kultivieren des zu untersuchenden Zellmaterials in einem Brutschrank aus der Vorrichtung 1 entnommen werden. Durch Austauschen des Trägers 25 besteht außerdem die Möglichkeit, in schneller Taktfolge unterschiedliche Gewebekulturen mit der Vorrichtung 1 zu untersuchen.The carrier 25 forming the chamber floor for the organic material is exchangeable. For this purpose, the first housing part 16 inserted into the second housing part 22 can be detachably connected to the latter with a screw ring 26 . In the position of use, the screw ring 26 engages with its internal thread in an external thread arranged on the outer circumference of the second housing part 22 and, with a projection 27 provided on the inside, engages over a pressure plate 28 fastened with retaining screws 29 on the first housing part 16 . The first housing part 16 is thereby firmly connected to the second housing part 22 in the position of use and can be removed from the second housing part 22 in a simple manner together with the sensors 9 to 14 after loosening the screw ring 26 . The carrier 25 , for example a culture dish 30 , can then be removed from the device 1 in an incubator in order to cultivate the cell material to be examined. By exchanging the carrier 25, there is also the possibility of examining different tissue cultures with the device 1 in a rapid cycle.
Zum Einstellen der Kammerhöhe ist zwischen den Gehäuseteilen 16, 22 ein elastischer Distanzring 31 vorgesehen, der durch Verstellen des Schraubringes 26 mit definierter Vorspannkraft zwischen den Gehäuseteilen 16, 22 eingespannt werden kann. Die jeweils eingestellte Kammerhöhe kann dabei mit Hilfe von Markierungen, die am Außenumfang des Schraubringes 26 und am Außenumfang des zweiten Gehäuseteils 22 angebracht sind, abgelesen werden. Die Kammerhöhe kann dadurch, abhängig von der Stellung des Schraubringes 26, eingestellt werden, so daß beispielsweise zur Bestimmung der metabolischen Aktivität von Zellen durch Messung des pH-Wertes und der Sauerstoffkonzentration eine geringe Kammerhöhe gewählt werden kann, während die Kammerhöhe für die Dauer der Perfusionsintervalle angehoben wird, damit die auf die Zellen ausgeübten Strömungs-Scherkräfte gering sind. Der elastische Distanzring 31 bewirkt gleichzeitig eine besonders gute Abdichtung des Kammervolumens. Um ein Beschädigen der Sensoren 9 bis 14 oder des organischen Materials durch versehentliches Einstellen einer zu kleinen Kammerhöhe zu verhindern, weist das zweite Gehäuseteil 22 eine Anschlagfläche 39 für die Andruckplatte 28 auf. Die Anschlagfläche 39 begrenzt den Verstellweg für die Andruckplatte 28 und gibt dadurch die kleinste einzustellende Kammerhöhe vor.For adjusting the height of chamber 22, a resilient spacer ring 31 between the housing parts 16, provided which can be clamped by moving the screw ring 26 with a defined prestressing force between the housing parts 16, 22nd The respectively set chamber height can be read off with the help of markings which are attached to the outer circumference of the screw ring 26 and to the outer circumference of the second housing part 22 . The chamber height can thereby be set depending on the position of the screw ring 26 , so that, for example, a small chamber height can be selected for determining the metabolic activity of cells by measuring the pH and the oxygen concentration, while the chamber height for the duration of the perfusion intervals is raised so that the flow shear forces exerted on the cells are low. The elastic spacer ring 31 also provides a particularly good seal of the chamber volume. In order to prevent damage to the sensors 9 to 14 or the organic material by inadvertently setting a chamber height that is too small, the second housing part 22 has a stop surface 39 for the pressure plate 28 . The stop surface 39 limits the adjustment path for the pressure plate 28 and thereby specifies the smallest chamber height to be set.
Das erste Gehäuseteil 16 weist an der dem Beobachtungsfenster 5 gegenüberliegenden Kammerwand ein Zusatzfenster 35 auf, an dem eine Lichtquelle zum Durchleuchten des zu untersuchenden Zellmaterials positioniert werden kann. An dem Zusatzfenster 35 kann auch ein Objektiv positioniert werden, so daß das in der Kammer befindliche organische Material dann von der Oberseite her betrachtet werden kann. Die Lichtquelle kann in diesem Fall an dem Beobachtungsfenster 5 eingekoppelt werden. Die Vorrichtung 1 eignet sich deshalb sowohl für inverse, als auch für nichtinverse Mikroskope.The first housing part 16 has, on the chamber wall opposite the observation window 5 , an additional window 35 , on which a light source for illuminating the cell material to be examined can be positioned. A lens can also be positioned on the additional window 35 so that the organic material in the chamber can then be viewed from the top. In this case, the light source can be coupled into the observation window 5 . The device 1 is therefore suitable for both inverse and non-inverse microscopes.
Das erste Gehäuseteil 16 ist einstückig mit dem Zusatzfenster 35 verbunden und besteht aus biologisch inertem, hochtransparentem Kunststoff. Das erste Gehäuseteil 16 weist einen kreisringförmigen Umfang auf und hat an seiner Oberseite 32 eine konzentrisch dazu angeordnete trichterförmige Vertiefung 33, die nach unten hin durch das bündig zur oberen Kammerwandung 34 angeordnete Beobachtungsfenster 5 begrenzt ist. Eine Kondensorlinse oder ein Objektiv mit großem Aperturwinkel können dadurch bis dicht an das zu untersuchende Zellmaterial herangeführt werden.The first housing part 16 is connected in one piece to the additional window 35 and consists of biologically inert, highly transparent plastic. The first housing part 16 has an annular circumference and has on its upper side 32 a funnel-shaped depression 33 which is arranged concentrically thereto and which is delimited at the bottom by the observation window 5 which is arranged flush with the upper chamber wall 34 . A condenser lens or a lens with a large aperture angle can thus be brought close to the cell material to be examined.
Die Längserstreckungsrichtung der Sensorhalter 18a ist schräg zur Beobachtungsrichtung 4 angeordnet, und die Sensoren 9 bis 12 sind mit ihrer Meßspitze 15 schräg nach innen in Richtung auf den Aufnahmebereich 3 ausgerichtet. Wie Fig. 1 erkennen läßt, sind die Sensoren 9 bis 12 außerdem auf einem zu dem Außenrand des kreisrunden Zusatzfensters 35 konzentrisch angeordneten Kreis in gleichen Abständen um das Zusatzfenster 5 herum positioniert. Die Sensoren 9 bis 12 sind dadurch mit ihrer Meßspitze 15 dicht benachbart zu dem zu untersuchenden Zellmaterial angeordnet und dennoch verbleibt oberhalb des Zusatzfensters 35 ein etwa trichterförmiger Bereich, in dem beispielsweise eine Kondensorlinse eines Mikroskops positioniert werden kann.The longitudinal direction of the sensor holder 18 a is arranged obliquely to the direction of observation 4 , and the sensors 9 to 12 are aligned with their measuring tip 15 obliquely inwards towards the receiving area 3 . As can be seen in FIG. 1, the sensors 9 to 12 are also positioned on a circle concentrically arranged to the outer edge of the circular additional window 35 at equal intervals around the additional window 5 . The sensors 9 to 12 are thereby arranged with their measuring tip 15 closely adjacent to the cell material to be examined, and yet an approximately funnel-shaped area remains above the additional window 35 in which, for example, a condenser lens of a microscope can be positioned.
Als Zugentlastung und zum Befestigen der Anschlußkabel 38 für die Sensoren 9 bis 14 und/oder der Verbindungsschläuche 8 für die Perfusion weist die Vorrichtung 1 einen an der Andruckplatte 28 befestigten Haltering 36 auf.As a strain relief and for attaching the connecting cables 38 for the sensors 9 to 14 and / or the connecting tubes 8 for the perfusion, the device 1 has a retaining ring 36 attached to the pressure plate 28 .
Ferner sind zum Befestigen der Vorrichtung 1, beispielsweise an einem Objekttisch eines Mikroskops, an der der Unterseite des zweiten Gehäuseteiles 22 Vertiefungen 37 zum Einsetzen von Haltestiften vorgesehen.Furthermore, for fastening the device 1 , for example on an object table of a microscope, on the underside of the second housing part 22 there are recesses 37 for inserting retaining pins.
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