DE4414793C1

DE4414793C1 - Procedure for the determination of cytotoxicity using in vitro cultivated pollen tubes (PTG test)

Info

Publication number: DE4414793C1
Application number: DE19944414793
Authority: DE
Inventors: Hermann Walterbusch; Ute Joos; Rolf Dr Kappler
Original assignee: WALTERBUSCH HERMANN DIPL BIOL
Current assignee: WALTERBUSCH HERMANN DIPL BIOL
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1994-04-28
Publication date: 1996-02-01
Anticipated expiration: 2014-04-29
Also published as: WO1995030023A1

Description

The pollen tube growth test (PTG test)

Zunehmend wird nach Verfahren gesucht, mit deren Hilfe die Zahl der Tierversuche in Forschung und Industrie reduziert werden kann. Insbesondere im Bereich der Cytotoxizität werden zur Zeit viele Tests auf der Basis von Zellkulturen entwickelt, die Tierversuche zur akuten Toxizität (z. B. LD₅₀-Tests an Nagetieren) oder zur Haut- und Augentoxizität (z. B. den Kaninchenaugen-Irritationstest nach Draize) ersetzen können. Für diese Anwendungen wurde Mitte der achtziger Jahre auch der Pollenschlauch- Wachstumstest entwickelt (Kappler und Kristen, Environmental and Experimental Botany, Nr. 27, S. 305ff., 1987). Nach einer Ringstudie, die in den Jahren 1990-1993 von der US-amerikanischen CTFA durchgeführt wurde, ist dieser sogenannte PTG-Test (Pollen Tube Growth Test) hervorragend geeignet, den Kaninchenaugen-Irritationstests nach Draize zu ersetzen (Gettings et al., In vitro Toxicology Nr. 4, S. 247ff., 1991; Gettings, Newsletter of the Johns Hopkins Center for Alternatives to Animal Testing, Nr. 11, S. 4f., 1993). Es ist somit sehr wahrscheinlich, daß der PTG-Test zu den Verfahren gehören wird, die in den nächsten Jahren als offizieller Ersatz des Draize-Testes bekannt werden, welcher ab 1998 in den Staaten der EG verboten sein wird.There is an increasing search for methods with the help of which the number of animal experiments in research and industry can be reduced. Especially in the area of Cytotoxicity, many tests are currently being developed based on cell cultures, animal experiments on acute toxicity (e.g. LD₅₀ tests on rodents) or on skin and replace eye toxicity (e.g., the Draize rabbit eye irritation test) can. For these applications, the Pollen tube growth test developed (Kappler and Kristen, Environmental and Experimental Botany, No. 27, pp. 305ff., 1987). After a ring study in the Years 1990-1993 was carried out by the United States CTFA, this is so-called PTG test (Pollen Tube Growth Test) is excellently suited to the To replace rabbit eye irritation tests according to Draize (Gettings et al., In vitro Toxicology No. 4, pp. 247ff., 1991; Gettings, Newsletter of the Johns Hopkins Center for Alternatives to Animal Testing, No. 11, pp. 4f., 1993). So it is very likely that the PTG test will be one of the methods described in the will be known as the official replacement of the Draize test in the next few years, 1998 will be banned in the states of the EC.

Der PTG-Test beruht auf der in vitro-Kultivierung von Tabakpollenschläuchen der Art Nicotiana sylvestris Spegazz. & Comes, deren Wachstum durch die Zugabe der Testsubstanz gehemmt wird. Eine detaillierte Methodenbeschreibung findet sich bei Kristen et al. (BioEngineering Nr. 5/1993, S. 39ff.; Journal of the Society for Cosmetic Chemistry, Nr. 44, S. 153ff., 1993). In einem einfachen Kulturmedium aus Saccharose, Calciumnitrat, Borsäure und dem Puffer Morpholinoethansulfonsäure keimen Pollenkörper aus und bilden Pollenschläuche, die über einen Zeitraum von ca. 24 h kontinuierlich und schnell wachsen. Sterile Bedingungen sind nicht erforderlich. Der Pollen läßt sich nach der Ernte trocknen und bei -20°C über mehrere Jahre ohne Verlust der Keimfähigkeit lagern. Durch die Zugabe verschiedener Konzentrationen der Testsubstanz zur Pollenschlauchkultur läßt sich diejenige Konzentration bestimmen, die das Wachstum der Pollenschläuche zu genau 50% gegenüber einer unbehandelten Kontrolle hemmt. Dies ist der sogenannte ED₅₀-Wert (Effektive Dosis 50%), der als Maß für die Toxizität einer Substanz bestimmt wird.The PTG test is based on the in vitro cultivation of tobacco pollen tubes Kind Nicotiana sylvestris Spegazz. & Comes whose growth is due to the addition of the Test substance is inhibited. A detailed description of the methods can be found at Kristen et al. (BioEngineering No. 5/1993, pp. 39ff .; Journal of the Society for Cosmetic Chemistry, No. 44, pp. 153ff., 1993). In a simple culture medium Sucrose, calcium nitrate, boric acid and the buffer morpholinoethanesulfonic acid germinate pollen bodies and form pollen tubes that over a period of approx. Grow continuously and quickly for 24 hours. Sterile conditions are not required. The pollen can be dried after harvest and at -20 ° C for several years without Store loss of germination capacity. By adding different concentrations the concentration of the test substance for pollen tube culture determine the growth of pollen tubes to exactly 50% compared to one inhibits untreated control. This is the so-called ED₅₀ value (effective dose 50%), which is determined as a measure of the toxicity of a substance.

Die Auswertung des Tests beruht also auf der Messung des Pollenschlauchwachstums. Bis vor wenigen Jahren geschah dies durch eine mikroskopische Längenmessung von bis zu 100 Schläuchen je Testansatz, was sehr zeitaufwendig und deshalb für toxikologische Reihenuntersuchungen nicht praktikabel war.The evaluation of the test is therefore based on the measurement of pollen tube growth. Until a few years ago, this was done using a microscopic length measurement of up to 100 tubes per test batch, which is very time consuming and therefore for toxicological screening was not practical.

Nach dem bei Kristen et al. (s. o.) beschriebenen Verfahren wird das Pollenschlauchwachstum durch eine spezifische Farbrekation bestimmt. Der Farbstoff Alcian blue bindet reversibel an Zellwände. Werden die Testansätze nach der Inkubation, d. h. nach dem 18stündigen Wachstum, mit Alcian blue gefärbt, anschließend der Farbüberschuß ausgewaschen und dann durch eine pH-Absenkung der Farbstoff wieder von den Zellwänden abgelöst, korreliert die Menge des wieder gelösten Farbstoffes mit der Menge der produzierten Zellwand. Je besser die Pollenschläuche gewachsen waren, desto mehr Zellwand haben sie produziert und um so mehr Farbstoff haben sie gebunden bzw. bei der Entfärbung wieder abgegeben. Die Farbstoffkonzentration im Überstand nach der Entfärbung wird photometrisch bestimmt.According to the Kristen et al. (see above) Pollen tube growth determined by a specific color regeneration. The dye Alcian blue binds reversibly to cell walls. Are the test approaches after the Incubation, d. H. after 18 hours of growth, dyed with Alcian blue, then washed out the excess color and then by lowering the pH the dye detached from the cell walls, correlates the amount of the again dissolved dye with the amount of cell wall produced. The better that Pollen tubes had grown, the more cell walls they produced and the more dye they have bound or released again when decolorized. The dye concentration in the supernatant after decolorization becomes photometric certainly.

Eine Alternative zur Färbemethode stellt die Trübungsmessung dar (Kappler und Kristen 1987, s. o.). Hier wird nach dem 18stündigen Wachstum - ohne weitere Färbungsschritte - die Trübung der Pollenschlauchsuspension photometrisch gemessen. Je länger die Pollenschläuche gewachsen waren, desto trüber ist die Suspension. Ein bisher nur unvollständig gelöstes Problem dieser Methode liegt darin, daß die Pollenschläuche sehr stark zur Verklumpung neigen. Für eine Trübungsmessung muß die Probe jedoch möglichst homogen vorliegen. In dem traditionellen Verfahren nach Kappler und Kristen (1987, s. o.) wird die Homogenisierung der Pollenschläuche durch eine sehr starke Ultrabeschallung bewerkstelligt. Dabei muß in einem aufwendigen Arbeitsgang jede Probe einzeln im Reagenzglas mit einem Ultraschallrüssel behandelt werden.Turbidity measurement is an alternative to the staining method (Kappler and Kristen 1987, p. O.). Here is after 18 hours of growth - without further Staining steps - the turbidity of the pollen tube suspension photometrically measured. The longer the pollen tubes had been growing, the cloudy it was Suspension. A problem with this method that has been solved only incompletely so far is that the pollen tubes are very prone to clumping. For one However, the sample must be as homogeneous as possible. By doing traditional methods according to Kappler and Kristen (1987, see above) Homogenization of the pollen tubes through a very strong ultrasonic system accomplished. Each sample must be individually in a complex process Test tube to be treated with an ultrasound proboscis.

Problem

Das bislang durchgeführte Verfahren des PTG-Tests ist mit mehreren methodischen Nachteilen behaftet. Zum einen ist der Pollen stark hydrophob und muß beim Ansetzen des Pollentestes aufwendig im Kulturmedium homogen suspendiert werden, bevor er gleichmäßig auf die Kulturgefäße verteilt werden kann. Da der Test auf einem Vergleich der Pollenschlauchmengen in schadstoffversetzten Proben mit einem Kontrollansatz beruht, ist die absolut gleichmäßige Verteilung ("Aliquotierung") des Pollen auf die Probengefäße eine zentrale Grundvoraussetzung des Verfahrens.The procedure of the PTG test carried out so far has several methodological ones Disadvantages. Firstly, the pollen is highly hydrophobic and must Preparation of the pollen test can be suspended homogeneously in the culture medium, before it can be distributed evenly over the culture vessels. Because the test on a comparison of the amounts of pollen tubes in contaminated samples with one Control approach is based, the absolutely even distribution ("aliquoting") of the Pollen on the sample vessels is a key prerequisite for the procedure.

Zudem ist die konventionelle Färbe- und Entfärbeprozedur langwierig und bislang nur in großvolumigen und zentrifugierbaren Gefäßen durchführbar. Auch müssen bei dem herkömmlichen Verfahren großvolumige Inkubationsgefäße (50 ml) verwendet werden, und die Pollenschlauchsuspension muß nach der Inkubation in Reagenzgläser umgefüllt werden.In addition, the conventional dyeing and bleaching procedure is lengthy and so far only Can be carried out in large-volume and centrifugable vessels. Also have to large volume incubation vessels (50 ml) are used in the conventional method and the pollen tube suspension must be put into test tubes after incubation be decanted.

Der hier vorgelegten Erfindung liegt das Problem zugrunde, den PTG-Test für Reihenuntersuchungen soweit zu vereinfachen, daß er vom ersten bis zum letzten Schritt in ein und demselben Gefäß durchzuführen ist. Direkt nach der Ernte sollte der Pollen in definierten Mengen in die Gefäße verbracht werden und weiterhin lager- und versandfähig bleiben. Nach Durchführung des Testes sollte auch die Auswertung, d. h. die Bestimmung des Pollenschlauch-Wachstums, direkt im Gefäß stattfinden.The invention presented here addresses the problem of the PTG test for To simplify screening examinations to the extent that it runs from the first to the last Step in one and the same vessel. Immediately after the harvest Pollen in defined quantities are placed in the vessels and continue to be stored and remain ready for dispatch. After the test has been carried out, the evaluation, d. H. the determination of pollen tube growth take place directly in the vessel.

Troubleshooting

Durch die in den Patentansprüchen 1 bis 6 aufgeführten Merkmale wird das Problem gelöst, gebrauchsfertige Testpräparate herzustellen, die auch langfristig lager- und transportfähig sind. Wird Pollen der Art Nicotiana sylvestris wasserfrei in einem organischen leicht flüchtigen Lösungsmittel suspendiert, hat dies keinerlei negativen Einfluß auf seine spätere Keimfähigkeit, solange eventuell vorhandene Restspuren des Lösungsmittels keinen toxischen Effekt haben. Für Hexan und einige andere stark unpolare Organika (z. B. Tetrachlorethylen) ist ein solcher toxischer Effekt nicht gegeben. Hexan hat zudem den Vorteil, das Material der handelsüblichen Mikrotiterplatten nicht anzugreifen. Pollen kann nach einer homogenen Suspendierung im Lösungsmittel mit einer Pipette in definierten Mengen auf die Testgefäße verteilt werden. Nach Abdampfen des Lösungsmittel verbleibt nur der Pollen im Gefäß, der an der Gefäßwandung haftet. Die Haftung des Pollen im Einweggefäß kann durch Zusätze zum Medium noch weiter erhöht werden. Erfindungsgemäß sollten solche Zusätze bei Raumtemperatur fest sein und sowohl in Wasser als auch in apolaren Lösungsmitteln löslich sein, um eine gleichmäßige Vermengung mit dem Pollen und den restlichen Bestandteilen des Mediums zu gewährleisten. Sie dürfen auch in hohen Konzentrationen nicht toxisch für die Pollenkeimung oder das Pollenschlauchwachstum sein. Diese Kriterien werden beispielsweise durch Polyethylenglykole höherer Kettenlänge erfüllt. Als sehr gut geeignet erwiesen sich z. B. PEG 4000 und PEG 6000, die auch bei 10% Endkonzentration für den Pollen nicht toxisch sind. Diese Stoffe haben zudem den Vorteil, die Benetzbarkeit der Mikrotiterwandung soweit zu erhöhen, daß bei der späteren Testdurchführung ein homogeneres Wachstum erzielt wird.The problem is solved by the features listed in claims 1 to 6 solved to produce ready-to-use test preparations that are also long-term storage and are transportable. Nicotiana sylvestris pollen becomes water-free in one suspended organic volatile solvent, this has no negative impact on its later germination, as long as any residual traces of the solvent have no toxic effect. For hexane and some other strongly non-polar organics (e.g. tetrachlorethylene) there is no such toxic effect. Has hexane also the advantage that the material of the commercially available microtiter plates is not to attack. Pollen can be used after a homogeneous suspension in the solvent a pipette in defined quantities on the test tubes. To Evaporation of the solvent leaves only the pollen in the vessel that is attached to the Vascular wall adheres. The adhesion of the pollen in the disposable container can be increased to the medium can be further increased. According to the invention, such additives should Be solid at room temperature, both in water and in apolar solvents be soluble to ensure even mixing with the pollen and the rest Ensure components of the medium. They are also allowed in high Concentrations not toxic for pollen germination or that Be pollen tube growth. These criteria are, for example, by Polyethylene glycols of higher chain length met. It turned out to be very suitable e.g. B. PEG 4000 and PEG 6000, which also at 10% final concentration for the pollen are not toxic. These substances also have the advantage of being wettable To increase the microtiter wall to such an extent that a more homogeneous growth is achieved.

Derart aliquotierter Pollen kann ohne weiteres über mehrere Wochen bei -20°C gelagert werden. Als weiterer Vorteil ist der mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels aliquotierte Pollen kaum noch hydrophob und läßt sich somit später beim Ansetzen des PTG-Testes problemlos im wäßrigen Medium suspendieren. Für einen Test müssen vor der Inkubation nur noch die Testsubstanzen in wäßriger Verdünnung auf die Fertigpräparate aufgetraten werden, es entfällt die Anfertigung und Aliquotierung der Pollensuspension.Such aliquoted pollen can easily at -20 ° C for several weeks be stored. Another advantage is that with the help of an organic Solvent-aliquoted pollen is hardly hydrophobic and can be removed later when preparing the PTG test, easily suspend in the aqueous medium. For Before the incubation, only the test substances have to be tested in aqueous Dilution on the finished products occur, there is no preparation and aliquoting of the pollen suspension.

Eine zusätzliche Vereinfachung ist durch die in Patentanspruch 3 und 4 formulierten Verfahren gegeben. Wird vor der Aliquotierung des Pollen das Kulturmedium in die Gefäße verbracht und das darin enthaltene Wasser abgedampft, entfällt beim späteren Ansetzen des PTG-Testes auch die Handhabung des Kulturmediums. Somit sind alle notwendigen Bestandteile für einen PTG-Test - Kulturmedium und Pollen - im Fertigpräparat vorbereitet, so daß zu einem beliebigen Zeitpunkt nur noch eine wäßrige Lösung (z. B. die Testsubstanz) hinzugefügt werden muß, um den Test zu starten. Für dieses Verfahren ist es vorteilhaft, den Saccharose-Gehalt des Mediums abzusenken, da Saccharose hygroskopisch ist und somit das Abdampfen des Wassers aus dem Medium erschwert. Pollen der Art N. sylvestris wächst auch bei einer Saccharose-Endkonzentration von nur 1% ebensogut wie in den herkömmlichen 5% Saccharose. Als Einweggefäße kommen - neben den unten erwähnten Mikrotiterplatten - auch beispielsweise 1,5 ml oder 2 ml Polyethylengefäße mit Schnappdeckel oder andere laborübliche Kleingefäße in Betracht.An additional simplification is through the formulated in claims 3 and 4 Given procedures. If the culture medium is transferred to the pollen before aliquoting Containers spent and the water contained evaporated, does not apply to the later Applying the PTG test also handling the culture medium. So everyone is necessary components for a PTG test - culture medium and pollen - in Prepared preparation, so that only one at a time aqueous solution (e.g. the test substance) must be added to the test start. For this process it is advantageous to determine the sucrose content of the medium lower, since sucrose is hygroscopic and thus the evaporation of the water difficult from the medium. N. sylvestris pollen also grows in one Final sucrose concentration of just 1% as well as in the conventional 5% Sucrose. As disposable containers come - in addition to those mentioned below Microtiter plates - also with 1.5 ml or 2 ml polyethylene tubes, for example Snap-on lids or other small laboratory vessels customary in the laboratory.

Die in den Patentansprüchen 7 bis 10 formulierten Merkmale ermöglichen zudem eine Vereinfachung der Testausweitung. Die Verwendung von Mikrotiterplatten (v. a. solche mit 96 Vertiefungen) ist die zur Zeit größtmögliche Vereinfachung einer Zellkultur. Die Vorteile gegenüber dem herkömmlichen Verfahren, das in 50-ml- Gläsern durchgeführt wird, liegen in der Platzersparnis, in einem reduzierten Verbrauch der verwendeten Lösungen (z. B. Pollen, Kulturmedium, Färbelösung etc.) und vor allem in einem vereinfachten Arbeitsgang, da ein Umfüllen der Pollenschlauchsuspension nach dem 18stündigen Wachstum entfällt. Zudem sind mittlerweile sog. Multipetten weit verbreitet, mit deren Hilfe in 8 oder 12 Vertiefungen gleichzeitig pipettiert werden kann. Jedoch ist die Färbe- und Entfärbemethode zur Bestimmung des Pollenschlauchwachstums in konventionellen Mikrotiterplatten nicht möglich, da die Vertiefungen bei den Platten mit 96 Löchern nur ein Volumen von 300 µl aufweisen und somit nicht genug Spielraum für ein reproduzierbares Absaugen des Überstandes lassen. Hier gibt es erfindungsgemäß zwei Lösungsansätze:The features formulated in claims 7 to 10 also enable Simplify test expansion. The use of microtiter plates (especially 96-deep) is currently the simplest possible one Cell culture. The advantages over the conventional method, which is available in 50 ml Glasses performed are in the space saving, in a reduced Use of the solutions used (e.g. pollen, culture medium, staining solution etc.) and above all in a simplified process, since a transfer of the Pollen tube suspension after 18 hours of growth is eliminated. Also are Meanwhile so-called multipettes are widely used, with the help of 8 or 12 Wells can be pipetted at the same time. However, the coloring and Decolorization method for the determination of pollen tube growth in conventional Microtiter plates are not possible because the wells in the plates with 96 holes only have a volume of 300 µl and therefore not enough scope for one reproducible suction of the supernatant. Here there are according to the invention two approaches:

- According to the method mentioned in claim 10 are not conventional Microtiter plates are used, but so-called deep-well microtiter plates, which have very deep holes that can hold 1 ml to 1.5 ml of liquid. They can also be centrifuged. In them, the conventional dyeing and Decolorization processes are carried out. When using multipettes and Microtiter plate photometer reduces the workload compared to conventional methods to a fraction.
- The second solution is the long-known one Turbidity measurement used. However, this delivers without further measures none to homogenize the clumped pollen tube pellet reproducible data. Mechanical homogenization using ultrasound would be too expensive, because due to the high energies required each Depression would have to be sounded individually. Here is the invention chemical homogenization by a strong change in the pH value significant simplification. In concentrations of less than 0.1N up to 1N Hydrochloric acid and caustic soda do not become one even after 60 minutes of incubation Hydrolysis of the cell wall, but they float the pellet homogeneously (at shorter incubation times can also have higher acid or Lye concentrations are used). By subsequent at least triple recording / draining the sample with a pipette becomes a very get homogeneous pollen tube suspension, the turbidity (as a measure of the Pollen tube growth) directly with a microtiter plate photometer any wavelength can be measured. The most advantageous is one Measurement in the range of 400 nm.

Nach den in den Patentansprüchen 11 und 12 genannten Verfahren wird das Wachstum der Pollenschläuche in den Mikrotiterplatten verbessert bzw. dem Standardverfahren nach Kristen et al. (s. o.) angeglichen. Eine Veränderung der Pollenkonzentration im Medium (2,5 mg Pollen/ml Medium Endkonzentration) ist nicht ratsam, da für einige Substanzen der ED₅₀-Wert in Abhängigkeit von der Pollenkonzentration variiert. Je größer das Volumen der Pollensuspension in den Mikrotiterplatten, desto schlechter wächst der einzelne Pollenschlauch. Beispielsweise wird bei einem Gesamtvolumen von 100 µl je Vertiefung eine geringere Gesamtschlauchmenge produziert als bei einem Gesamtvolumen von nur 60 µl. Andererseits werden die Schläuche bei sehr geringen Volumina derart lang, daß sie sehr stark verklumpen und somit nicht mehr für eine Trübungsmessung homogenisierbar sind. Für die Trübungsmessung nach chemischer Homogenisierung wird erfindungsgemäß ein Gesamtvolumen je Vertiefung von 40-60 µl Pollensuspension vorgeschlagen. Die so erzielten ED₅₀-Werte entsprachen größenordnungsmäßig den Werten, die mit dem konventionellen Verfahren gewonnen wurden.According to the method mentioned in claims 11 and 12, the Growth of pollen tubes in the microtiter plates improved or that Standard methods according to Kristen et al. (see above). A change in Pollen concentration in the medium (2.5 mg pollen / ml medium final concentration) not advisable, because for some substances the ED₅₀ value depends on the Pollen concentration varies. The larger the volume of the pollen suspension in the Microtiter plates, the worse the individual pollen tube grows. For example becomes less with a total volume of 100 µl per well Total hose volume produced than with a total volume of only 60 µl. On the other hand, the tubes become so long with very small volumes that they clump very strongly and therefore no longer for turbidity measurement are homogenizable. For turbidity measurement after chemical homogenization according to the invention, a total volume of 40-60 μl per well Pollen suspension proposed. The ED₅₀ values achieved in this way corresponded in the order of magnitude the values obtained with the conventional method were.

Da das flüchtige Ethanol, welches üblicherweise für die 100%ige Wachstumshemmung in der Nullwachstumskontrolle eingesetzt wird, in benachbarte Vertiefungen diffundieren kann und dort zu einer leichten Wachstumshemmung führt, wird erfindungsgemäß die Verwendung nichtflüchtiger Agenzien für die Nullwachstumskontrolle, beispielsweise 10% NaCl, vorgeschlagen. Außerdem sollte die Mikrotiterplatte so verschlossen werden, daß jede Vertiefung für sich gasdicht abgeschlossen ist. Dies kann beispielsweise durch Parafilm oder handelsübliches Mikrotiterklebeband erfolgen.Because the volatile ethanol, which is usually used for the 100% Inhibition of growth in zero growth control is used in neighboring Can diffuse depressions and there lead to a slight inhibition of growth, according to the invention the use of non-volatile agents for the Zero growth control, for example 10% NaCl, proposed. Besides, should the microtiter plate should be closed so that each well is gas-tight is completed. This can be done, for example, with parafilm or commercially available Microtiter adhesive tape.

Embodiment 1

In jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte (96 Vertiefungen) werden 30 µl konventionelles Pollenmedium (wie bei Kristen et al., s. o.) pipettiert. Anschließend wird über mehrere Stunden bei 70°C das Wasser abgedampft.30 µl are placed in each well of a microtiter plate (96 wells) conventional pollen medium (as in Kristen et al., see above). Subsequently the water is evaporated off at 70 ° C. for several hours.

Frisch geernteter und getrockneter Pollen (s. Kristen et al., s. o.) wird in einer Konzentration von 5 mg/ml in wasserfreiem Hexan (p. a.) durch Schütteln suspendiert. In jede Vertiefung der bereits mit Medium versetzten Mikrotiterplatte werden 30 µl der Pollensuspension pipettiert und anschließend wird über ca. 30 min bei Raumtemperatur das Hexan abgedampft. Die so präparierte Platte kann jetzt entweder sofort verwendet oder für den späteren Gebrauch bei -20°C gelagert werden.Freshly harvested and dried pollen (see Kristen et al., See above) is in one Concentration of 5 mg / ml in anhydrous hexane (p. A.) Suspended by shaking. 30 µl are placed in each well of the microtiter plate that has already been mixed with medium the pollen suspension is pipetted and then added for approx. 30 min The hexane evaporated at room temperature. The plate prepared in this way can now either used immediately or stored at -20 ° C for later use.

Für den Testansatz wird eine Verdünnungsreihe der Testsubstanz vorbereitet. Von jeder zu testenden Konzentration werden 60 µl in je eine Vertiefung der Mikrotiterplatte pipettiert. Für die Bestimmung des Kontrollwachstums werden 60 µl doppeldestilliertes Wasser verwendet, für die Bestimmung des Nullwachstums 60 µl 10% NaCl. Durch die Zugabe einer wäßrigen Lösung zu den Fertigpräparaten hydratisiert der getrocknete Pollen und wird die Pollenkeimung induziert.A dilution series of the test substance is prepared for the test batch. Of for each concentration to be tested, 60 µl are placed in one well of each Pipetted microtiter plate. For the determination of the control growth, 60 µl double distilled water used for the determination of zero growth 60 µl 10% NaCl. By adding an aqueous solution to the finished product the dried pollen hydrates and pollen germination is induced.

Nun wird die Platte kräftig geschüttelt (Vortex), um eine homogene Verteilung des Pollen zu erreichen, mit Parafilm fest verschlossen und dann 18 h bei 25°C im Dunkeln inkubiert.Now the plate is shaken vigorously (vortex) to ensure a homogeneous distribution of the To reach pollen, tightly closed with parafilm and then 18 h at 25 ° C in Incubated in the dark.

Zur Bestimmung des Pollenschlauchwachstums nach 18stündiger Inkubation werden je 100 µl 1N HCl in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte pipettiert, in jeder Vertiefung dreimal mit einer 10 µl Eppendorfpipette (bevorzugt mit einer Multipette) aufgezogen und dann innerhalb von 10 Minuten die Trübung der Pollenschlauchsuspension im Mikrotiterplatten-Photometer 405 nm gemessen. To determine the pollen tube growth after 18 hours of incubation Pipette 100 µl of 1N HCl into each well of the microtiter plate, in each well drawn up three times with a 10 µl Eppendorf pipette (preferably with a Multipette) and then within 10 minutes the turbidity of the pollen tube suspension in the Microtiter plate photometer 405 nm measured.

Embodiment 2

In jede Vertiefung einer Deep-Well-Mikrotiterplatte (96 Vertiefungen) werden 20 µl Pollenmedium (2% Saccharose, 10% Polyethylenglykol 4000, 0,02% Borsäure, 0,142% Calciumnitrat, 0,4% Morpholinoethansulfonsäure, mit KOH auf pH 5,6 eingestellt) pipettiert und anschließend bei Raumtemperatur das Wasser abgedampft.20 µl are placed in each well of a deep-well microtiter plate (96 wells) Pollen medium (2% sucrose, 10% polyethylene glycol 4000, 0.02% boric acid, 0.142% calcium nitrate, 0.4% morpholinoethanesulfonic acid, with KOH to pH 5.6 adjusted) and then evaporated the water at room temperature.

Frisch geernteter und getrockneter Pollen (s. Kristen et al., s. o.) wird in einer Konzentration von 5 mg/ml in wasserfreiem Hexan (p. a.) durch Schütteln suspendiert. In jede Vertiefung der bereits mit Medium versetzten Mikrotiterplatte werden 20 µl der Pollensuspension pipettiert und anschließend wird über ca. 30 min bei Raumtemperatur das Hexan abgedampft. Die so präparierte Platte kann jetzt entweder sofort verwendet oder für den späteren Gebrauch bei -20°C gelagert werden.Freshly harvested and dried pollen (see Kristen et al., See above) is in one Concentration of 5 mg / ml in anhydrous hexane (p. A.) Suspended by shaking. 20 µl are placed in each well of the microtiter plate that has already been mixed with medium the pollen suspension is pipetted and then added for approx. 30 min The hexane evaporated at room temperature. The plate prepared in this way can now either used immediately or stored at -20 ° C for later use.

Für den Testansatz wird eine Verdünnungsreihe der Testsubstanz vorbereitet. Von jeder zu testenden Konzentration werden 40 µl in je eine Vertiefung der Mikrotiterplatte pipettiert. Für die Bestimmung des Kontrollwachstums werden 40 µl doppeldestilliertes Wasser verwendet, für die Bestimmung des Nullwachstums 40 µl 10% NaCl.A dilution series of the test substance is prepared for the test batch. Of for each concentration to be tested, 40 µl are placed in one well of each Pipetted microtiter plate. To determine the control growth, 40 µl double distilled water used for the determination of zero growth 40 µl 10% NaCl.

Nun wird die Platte kräftig geschüttelt (Vortex), um eine homogene Verteilung des Pollen zu erreichen, mit Parafilm fest verschlossen und dann 18 h bei 25°C inkubiert.Now the plate is shaken vigorously (vortex) to ensure a homogeneous distribution of the To reach pollen, tightly closed with parafilm and then incubated at 25 ° C for 18 h.

Zur Bestimmung des Pollenschlauchwachstums nach 18stündiger Inkubation wird in der Deep-Well-Mikkrotiterplatte mit je 500 µl konventioneller Alcian-blue-Färbelösung (Kristen et al., s. o.) 20 min gefärbt, bei 1000 g abzentrifugiert, der Überstand bis auf 300 µl abgesogen und viermal durch wiederholtes Resuspendieren in 1 ml aqua bidest. mit nachfolgender Zentrifugation gewaschen. Anschließend wird durch Zugabe von 400 µl 40% Zitronensäure 10 min entfärbt, abzentrifugiert und der Überstand in eine konventionelle Mikrotiterplatte überführt, in der die Farbintensität mit einem Mikrotiterplatten-Photometer bei 618 nm gemessen wird. Für das Färben, Waschen, Entfärben und für den Transfer können Multipetten oder Laborautomaten verwendet werden.To determine pollen tube growth after 18 hours of incubation, in the deep-well microtiter plate, each with 500 µl conventional Alcian blue staining solution (Kristen et al., See above) stained for 20 min, centrifuged at 1000 g, the supernatant except 300 µl are sucked off and four times by repeated resuspending in 1 ml of aqua bidest. washed with subsequent centrifugation. Then by adding 400 µl 40% citric acid decolorized for 10 min, centrifuged and the supernatant in a transferred conventional microtiter plate, in which the color intensity with a Microtiter plate photometer is measured at 618 nm. For dyeing, washing, Decolorize and for the transfer multipettes or laboratory machines can be used will.

Claims

1. Method for cytotoxicity determination with the aid of in vitro cultivated pollen tubes (PTG test), characterized in that ready-to-use preparations are prepared by water-free distribution of the dried pollen on disposable containers, in which the aliquoted pollen is stored, the pollen tube growth test is carried out and the test evaluation can be carried out, the pollen being pipetted into homogeneous suspensions in a water-free, non-polar organic solvent in homogeneous amounts and then the organic solvent is evaporated at room temperature.

2. The method according to claim 1, characterized, that the organic solvent is hexane.

3. The method according to claim 1, characterized, that before the water-free distribution of the pollen, the growth medium in the Disposable tubes are pipetted and then the water contained in the medium is completely evaporated.

4. The method according to claim 3, characterized, that the sucrose content of the medium is reduced to a final concentration of 1%.

5. The method according to claim 1 to 4, characterized, that an additive is added to the growth medium, which the liability of Pollen in the vessel improves without adversely affecting the Pollen germination and pollen tube growth comes.

6. The method according to claim 5, characterized, that the growth medium up to 10% final concentration long chain, at Polyethylene glycols that are solid at room temperature (e.g. PEG 4000 or PEG 6000) be added.

7. The method according to claim 1, characterized, that the disposable tubes are microtiter plates in which the test evaluation, d. H. the measurement of pollen tube growth takes place directly.

8. The method according to claim 7, characterized, that immediately after the incubation the measurement of the Pollen tube growth through turbidity measurement according to chemical Homogenization takes place.

9. The method according to claim 8, characterized, that the pollen tubes after incubation in the microtiter plates by a sharp increase or decrease in pH, e.g. B. by a Add the same volume of 1N sodium hydroxide solution or hydrochloric acid, and by then draw up and down with a pipette at least three times are homogenized so far that a reproducible determination of the Amount of pollen tubing is possible through turbidity measurement.

10. The method according to claim 7, characterized, that the culture vessels are centrifugable deep-well microtiter plates, the relatively deep holes have a capacity of at least 1 ml and in which the test evaluation with the conventional staining and decolorization process can take place.

11. The method according to claim 7, characterized, that for the pollen tube culture in the microtiter plates a maximum of 60 µl Pollen suspension (final volume) when using the chemical Homogenization a minimum of 40 µl pollen suspension (final volume) can be used.

12. The method according to claim 7, characterized, that for zero growth control when performing the test in Microtiter plates a non-volatile agent, for example about 10% NaCl in aqueous solution is used.