DE4407439C2 - Method and device for serial sampling of biological samples - Google Patents
Method and device for serial sampling of biological samplesInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Se rienprobenahme biologischer Proben aus einem Reaktions raum mittels einer Probenahmesonde mit Absperrmitteln sowie ein damit durchführbares Verfahren der Serienprobenahme biologischer Proben zur Untersuchung des zeitlichen Ablaufs von Bioreaktionen in einem Reak tionsraum unter Zumischung von Inaktivierungsmittel am Probenahmeort mit einer als Doppelrohr ausgebildeten Probenahmesonde.The invention relates to a device for Se biological sampling from a reaction space using a sampling probe with shut-off devices and a process of the Serial sampling of biological samples for examination the timing of bioreactions in a reak tion room with the addition of inactivating agent on Sampling site with a double tube Sampling probe.
Für die Untersuchung der Kinetik innerhalb biologischer Systeme spielt die Probenahme eine wesentliche Rolle, wobei insbesondere bei Schnellablauf instationärer Stoffwechselvorgänge in Mikroorganismen eine rasche Folge von Probenahmen in ausreichender Menge für genü gend empfindliche Bestimmungen von ggf. nur in geringen Konzentrationen vorliegenden Komponenten wichtig ist. For the study of the kinetics within biological Systems sampling plays an essential role being transient, especially when running quickly Metabolic processes in microorganisms a rapid Sequence of sampling in sufficient quantity for sufficient sensitive sensitive determinations of possibly only in small Concentrations of components present is important.
Bekannt sind unterschiedliche Probenahmetechniken wie:Different sampling techniques are known, such as:
Die klassischen Probenahmesysteme sind zur Entnahme von 2-5 Proben pro Stunde mit zwischengeschalteter Dampfsterilisation (Probevolumen 0.01-1 l) vorgesehen. Primäres Ziel ist neben der Entnahme einer repräsentativen Probe die Vermeidung einer Kontamination des Reaktorinhalts und der gezogenen Probe. Neben dem klassischen 3-Ventil-System zur Probenahme werden auch Kolbenventil-Konstruktionen eingesetzt (Standardisierungs- und Ausrüstungsempfehlungen für Bioreaktoren und periphere Einrichtungen, DECHEMA, 1991, 45-62).The classic sampling systems are designed to take 2-5 samples per Hour with intermediate steam sterilization (sample volume 0.01-1 l) intended. The primary goal is to take a representative sample avoiding contamination of the reactor contents and the drawn ones Sample. In addition to the classic 3-valve sampling system, too Piston valve designs used (standardization and Equipment recommendations for bioreactors and peripheral facilities, DECHEMA, 1991, 45-62).
Insbesondere zur Bestimmung von intrazellulären Enzymaktivitäten mit Hilfe der Fließ-Injektions-Analytik (FIA) wurden entsprechende Probenahmesysteme entwickelt. Hierbei wird die Probe mit einer Pumpe (Peristaltik- oder Kolbenpumpe) aus dem Reaktionsraum angesaugt und in einer nachgeschalteten Verdünnungs- und/oder Mischkammer mit Inaktivierungsreagenz versetzt. Hierdurch lassen sich Inaktivierungszeiten von 5 Sekunden erreichen (Spohn, U.; Voss, H.: Probenahmesysteme für die online- Prozeßanalytik in der Sterilfermentation. Jahrbuch Biotechnologie, Carl Hanser Verlag München Wien 1992, 227-253).In particular for the determination of intracellular enzyme activities with the help of Flow injection analysis (FIA) were appropriate sampling systems developed. Here, the sample is pumped (peristaltic or Piston pump) sucked out of the reaction chamber and in one downstream dilution and / or mixing chamber with Inactivating reagent added. This enables inactivation times of 5 Seconds (Spohn, U .; Voss, H .: Sampling systems for online Process analysis in sterile fermentation. Biotechnology Yearbook, Carl Hanser Verlag München Wien 1992, 227-253).
Zur kontinuierlichen Probenahme wird ein Koaxialkatheter vorgeschlagen, bei dem die Probe im Zentralrohr abgesaugt und Inaktivierungsreagenz im Sekundärrohr zugeführt wird, so daß direkt ab der Probenahmestelle eine Inaktivierung der Probe erfolgen kann, bevor in einer nachgeschalteten Dialysezelle Zellmasse und höhermolekulare Substanzen abgetrennt werden (Holst et a.: Appl. Microbiol. Biotechnol. 28 (1988) 32-36).A coaxial catheter is proposed for continuous sampling, at where the sample is aspirated in the central tube and inactivating reagent in the Secondary tube is supplied so that a directly from the sampling point Inactivation of the sample can be done before in a downstream Dialysis cell mass and higher molecular weight substances are separated (Holst et al .: Appl. Microbiol. Biotechnol. 28 (1988) 32-36).
Über eine HPLC-Kapillare wird die Probe pneumatisch aus dem Reaktor gefördert und über ein Ventil einem Probensammler zugeführt. Die Probe wird in evakuierte Glasröhrchen injiziert, die 35% Perchlorsäurelösung enthalten, die auf -25°C vorgekühlt ist. Damit läßt sich eine Probenfrequenz von maximal 0.5/Sekunde erreichen (Theobald, U., Baltes, M.: Bizzi, M.; Reuss, M.: Biochemical Engineering - Stuttgart, Gustav Fischer Stuttgart New York 1991, 361-364). The sample is pneumatically removed from the reactor via an HPLC capillary conveyed and fed to a sample collector via a valve. The sample is in evacuated glass tubes injected containing 35% perchloric acid solution, the is pre-cooled to -25 ° C. This allows a maximum sample frequency 0.5 / second (Theobald, U., Baltes, M .: Bizzi, M .; Reuss, M .: Biochemical Engineering - Stuttgart, Gustav Fischer Stuttgart New York 1991, 361-364).
Keine dieser bekannten Probenahmetechniken ist für Pro benahmefrequenzen von mehr als 1/sec geeignet.None of these known sampling techniques are for Pro sampling frequencies of more than 1 / sec are suitable.
Ziel der Erfindung ist daher eine Probenahme, bei der mit relativ geringem Aufwand hohe Probenahmefrequenzen erreicht werden können, wobei vorzugsweise Probemengen je Untersuchungspunkt angestrebt werden, die eine Un tersuchung zellinterner Komponente gestatten.The aim of the invention is therefore a sampling in which high sampling frequencies with relatively little effort can be achieved, preferably sample amounts for each examination point, the one Un Allow cell-internal component to be examined.
Die zu diesem Zweck entwickelte erfindungsgemäße Vor richtung der eingangs genannten Art ist gekennzeichnet durch zumindest ein an die Sonde angekoppeltes bzw. an koppelbares Probenrohr von ausreichender Länge zur Auf nahme der über einen Untersuchungszeitraum hinweg aus dem Reaktionsraum entnommenen, aufeinander folgenden Einzelproben einer Probenserie.The invention developed for this purpose Direction of the type mentioned is marked by at least one coupled to the probe Couplable sample tube of sufficient length for opening except that over a period of investigation consecutive withdrawn from the reaction chamber Individual samples of a sample series.
Die Durchführung einer Serienprobenahme mit Hilfe einer solchen Vorrichtung mit Doppelrohrsonde erfolgt in der Weise, daß man die aufeinanderfolgenden Proben in zu mindest ein mit Sperrflüssigkeit gefülltes Probenrohr von ausreichender Länge zur Aufnahme der Probenserie unter Verdrängung der Sperrflüssigkeit schickt, das nach Beendigung der Serienprobenahme entsprechend der gewünschten Zeitunterteilung der Untersuchungsproben in einzelne Abschnitte zerteilt wird.Carrying out a serial sampling with the help of a such a device with a double tube probe takes place in the Way that you can consecutive samples in at least one sample tube filled with sealing liquid of sufficient length to accommodate the sample series with displacement of the sealing liquid that sends after the end of the series sampling according to the desired time division of the test samples in dividing individual sections.
Weitere Besonderheiten von Verfahren und Vorrichtung ergeben sich aus den Patentansprüchen 2-6 und 8-11.Other special features of the method and device result from the claims 2-6 and 8-11.
Gemäß der Erfindung wird eine Serienprobenahme mit ho hen Meßfrequenzen (je nach Unterteilung bis zu 100/sec) in reproduzierbarer Weise ermöglicht, wobei der appara tive Aufwand relativ gering bleibt, jedoch durch Be rücksichtigung innerer Standards hohe Genauigkeiten er zielt werden und bei entsprechend hoher Probenahmemenge selbst zellinterne Komponenten in ihrer zeitlichen Än derung analysiert werden können.According to the invention, a serial sampling with ho hen measuring frequencies (depending on the subdivision up to 100 / sec) in a reproducible way, the appara tive effort remains relatively low, but through Be consideration of internal standards high accuracy be aimed and with a correspondingly high sampling quantity even cell-internal components in their temporal changes change can be analyzed.
Die Erfindung ist damit besonders geeignet für die bio technologische Forschung, um schnelle komplexe Reaktio nen unter definierten Bedingungen im Bioreaktor verfol gen zu können. Diese Möglichkeiten wirken sich auf die Bioverfahrenstechnik zur Ermittlung kurzzeitiger Ein flüsse lokaler Konzentrationsgradienten auf den Stoff wechsel von Produktionsorganismen aus.The invention is therefore particularly suitable for the bio technological research to rapid complex reaction in the bioreactor under defined conditions to be able to. These options affect the Bioprocess engineering for the determination of short-term on flows of local concentration gradients on the substance change from production organisms.
Das erfindungsgemäß vorgesehene Probenrohr hat insbe sondere Absperrmittel an den Enden und wird zweckmäßi gerweise am Ende der Probenahmeserie eingefroren. In dieser Form ist eine Unterteilung in gewünschte Einzel proben einfach zu bewerkstelligen.The sample tube provided according to the invention has in particular special shut-off means at the ends and is expedient partially frozen at the end of the sampling series. In This form is a subdivision into the desired individual easy to do.
Die an das Probenrohr angeschlossene bzw. anschließbare Probenahmesonde, die über einen Anschlußstutzen in den Reaktionsraum eingeführt werden kann, kann insbesondere in an sich bekannter Weise durch ein Doppelrohr gebil det werden, dessen beide Leitungszüge in enger Nach barschaft zur Sondenspitze miteinander in Verbindung stehen, wodurch über die Sondenspitze bzw. das Sonden ende zutretende Proben unmittelbar daran anschließend mit Inaktivierungsmittel gemischt werden können, so daß eine Inaktivierung innerhalb von 10-20 msec erreicht werden kann. Besonders zweckmäßig erfolgt die Zumi schung an einer Erweiterung der Sondenspitze über einen von der Spitze weggerichteten Schrägeinlauf des Inakti vierungsmittels, das vorzugsweise in einem Winkel von 30-60° zur Sondenachse in den erweiterten Sondenraum eintritt, der anschließend an die Zumischstelle mit statischen Mischelementen versehen ist.The one connected or connectable to the sample tube Sampling probe, which has a connecting piece in the Reaction space can be introduced, in particular gebil in a conventional manner through a double tube be detected, its two lines in close proximity Shaft to probe tip in connection with each other stand, whereby the probe tip or the probes end applicable samples immediately afterwards can be mixed with inactivating agents so that deactivated within 10-20 msec can be. Zumi is particularly useful an extension of the probe tip over a diagonal inlet of the Inakti facing away from the top Vierungsmittel, which is preferably at an angle of 30-60 ° to the probe axis in the extended probe space occurs, which then goes to the mixing point static mixing elements is provided.
Der Zulauf der Probenflüssigkeit (unter Verdrängung der zu Beginn im Probenrohr vorhandenen Sperrflüssigkeit) erfolgt vorzugsweise durch Druckförderung mittels einer Druckdifferenz, die zwischen dem Reaktionsraum (aus dem die Probe entnommen wird) und dem Probenrohrende herrscht. Das Inaktivierungsmittel wird zweckmäßiger weise mittels eines Tauchrohres aus einem abgeschlos senen Inaktivierungsmittelvorrat durch entsprechende Druckaufprägung gefördert, wobei das gewünschte Mischungsverhältnis durch entsprechende Steuerung der Förderdrucke erreicht werden kann. Anstelle der pneu matischen Förderung könnten selbstverständlich auch Pumpen zur Bewegung der Proben- und Inaktivierungs mittelströme vorgesehen sein.The inflow of the sample liquid (displacing the barrier liquid present in the sample tube at the beginning) is preferably carried out by pressure promotion by means of a Pressure difference between the reaction space (from the the sample is taken) and the sample tube end prevails. The inactivating agent becomes more convenient closed by means of a dip tube its inactivating agent stock by appropriate Promoting pressure, the desired Mixing ratio through appropriate control of the Delivery pressures can be achieved. Instead of the pneu Matic funding could of course also Pumps for moving sample and inactivation medium flows can be provided.
Die beigefügte schematische Zeichnung veranschaulicht
die Erfindung anhand eines speziellen Ausführungsbei
spiels:
Wie man sieht, greift die Sonde 1 durch einen Anschluß
stutzen 2 in der Reaktorwand abgedichtet in einen
Reaktionsraum 3, aus dem über die Sondenspitze 4 Proben
mittels der Druck
differenz zwischen dem Reaktionsraum 3 und dem Ende 5
des an die Sonde angeschlossenen Probenrohres 6
kontinuierlich oder intermittierend abgezogen werden.
Über die Leitung 7 der Sonde 1 wird Inaktivierungs
mittel der Erweiterung 8 der Probenahmeleitung der
Sonde insbesondere über eine von der Sondenspitze
wegweisende Verbindungsleitung zugeführt. Anschließend
daran sind statische Mischelemente 9 im Sondenrohr
vorgesehen. Die Inaktivierungsmittelleitung 7 steht
über ein Ventil 10 mit anschließendem Tauchrohr mit
einem abgeschlossenen Inaktivierungsmittelraum 11 in
Verbindung, der über eine mit Ventil versehene Leitung
12 auf Förderdruck gebracht werden kann. Das Proben
nahmerohr 13 der Sonde 1 steht über ein Ventil 14 ggf.
unter Zwischenschaltung eines Ventils 15 mit dem
Probenrohr 6 in Verbindung.The attached schematic drawing illustrates the invention using a special exemplary embodiment:
As can be seen, the probe 1 engages through a connecting piece 2 sealed in the reactor wall in a reaction chamber 3 , from which, via the probe tip 4, samples by means of the pressure difference between the reaction chamber 3 and the end 5 of the sample tube 6 connected to the probe or continuously be subtracted intermittently. Via the line 7 of the probe 1 , inactivation means of the extension 8 of the sampling line of the probe is supplied in particular via a connecting line pointing away from the probe tip. Static mixing elements 9 are then provided in the probe tube. The inactivating agent line 7 is connected via a valve 10 with a subsequent immersion tube to a closed inactivating agent space 11 which can be brought to delivery pressure via a valve 12 provided with a valve. The sampling tube 13 of the probe 1 is connected via a valve 14, possibly with the interposition of a valve 15, to the sample tube 6 .
Der Probenahme- und Inaktivierungsvorgang gestaltet
sich folgendermaßen:
Das Probenrohr ist vor Beginn der Messung mit einer
Sperrflüssigkeit (z. B. deionisiertes Wasser) gefüllt.
Diese Sperrflüssigkeit wird bei der Probenahme
verdrängt. Die Geschwindigkeit der Probenahme wird
über den Druckverlust bei der Durchströmung des
Probenrohrs bestimmt. Ist das Probenrohr mit
inaktivierter Probe gefüllt, so werden beide Ventile
am Probenrohr geschlossen, die Probenahme ist
beendet. Damit ist der instationäre zeitliche Verlauf
der Reaktion im Reaktor räumlich im Probenrohr
konserviert.The sampling and inactivation process is as follows:
Before starting the measurement, the sample tube is filled with a sealing liquid (e.g. deionized water). This barrier liquid is displaced during sampling. The speed of sampling is determined by the pressure loss when flowing through the sample tube. If the sample tube is filled with inactivated sample, both valves on the sample tube are closed and sampling is finished. The transient course of the reaction in the reactor is thus spatially preserved in the sample tube.
Zur Analyse wird das Probenrohr von der Probenahmesonde getrennt und die Proben nach Öffnen der Ventile in gewünschter Unterteilung entnommen und analysiert.For analysis, the sample tube is removed from the Sampling probe separated and the samples after opening the valves in the desired subdivision and analyzed.
Um eine Rückvermischung bei der Probeentnahme zu vermeiden, kann das Probenrohr tiefgefroren werden. Im gefrorenen Zustand werden die gewünschten Probenvolumina aus dem Probenrohr heraus geschnitten und getrennt aufgetaut und analysiert.To ensure backmixing during sampling the sample tube can be frozen. In the frozen state, the desired ones Cut sample volumes out of the sample tube and thawed and analyzed separately.
Um auch Flüssigkeitsproben mit veränderlichem Gasgehalt reproduzierbar analysieren können, ist dem Reaktionsgemisch im Reaktor ein "Interner Standard" (IS) in definierter Konzentration beigegeben. Der Interne Standard darf durch die Reaktion in seiner Konzentration nicht verändert werden. Der Interne Standard darf die Reaktion nicht beeinflussen. Das Probenahmesystem ist zweckmäßigerweise komplett sterilisierbar.For liquid samples with variable The ability to analyze gas content in a reproducible way is that Reaction mixture in the reactor an "internal standard" (IS) added in a defined concentration. Of the Internal standard allowed by the reaction in its Concentration cannot be changed. The internal Standard must not influence the reaction. The sampling system is expediently complete sterilizable.
Die Probenahmesonde ist insbesondere passend zu Normstutzen (2) ausgeführt.The sampling probe is especially designed to match standard spigots ( 2 ).
Ist der Druckverlust im Probenrohr zu hoch, so kann durch Einfügen eines schnell schaltenden Mehrwegeventils zwischen Probenahmesonde und Probenrohr dieses in mehrere kürzere Teilstücke aufgeteilt werden.If the pressure drop in the sample tube is too high, it can by inserting a quick switching Multiway valve between sampling probe and Sample tube this into several shorter sections be divided.
Eine Möglichkeit zur Verringerung der Rückvermischung stellt die Segmentierung des Probenstroms bei der Probenahme vor Eintritt in das Probenahmerohr durch periodisches Einspeisen einer zweiten nicht mischbaren flüssigen Phase oder Gasphase (z. B. Luft) mit entsprechender Frequenz in den Probenahmestrom (etwa über 15) dar.One way to reduce backmixing represents the segmentation of the sample stream at the Sampling before entering the sampling tube periodically feeding a second one not miscible liquid phase or gas phase (e.g. air) with a corresponding frequency in the sampling stream (about 15).
Die Dimensionierung des vorstehend beschriebenen
Probenahmesystems richtet sich nach den gewünschten
analytischen Aufgaben für die Probenahme. Speziell für
Proben zur Untersuchung zellinterner Komponenten, deren
Konzentration sich innerhalb der inaktivierten Probe
nicht mehr verändern soll (wobei zusätzlich durch
Zumischung von gekühltem Inaktivierungsmittel für ein
"Einfrieren" des Entnahmezustandes gesorgt werden kann)
sind folgende Abmessungen zweckmäßig:
Die Probenleitung 13 der Sonde hat einen Durchmesser
von 4 bis 8 mm und endet in einer auf 2 bis 4 mm
verjüngten Sondenspitze 4. Vom Probeneinlaß 5 mm
entfernt befindet sich die auf 4 bis 8 mm aufgeweitete
Mischstelle 8, in welche die Inaktivierungsmittel
leitung (Durchmesser 2 bis 4 mm) unter einem Winkel von
30 bis 60° zur Sondenachse mündet. Die Mischelemente 9
sind auf einer Länge von 2 bis 5 cm vorgesehen. Das
Probenrohr 6 hat eine Länge von 20 bis 150 m und kann
mit einem "Windungs-Durchmesser" von 20 bis 30 cm
weitgehend horizontal aufgewickelt sein.The dimensioning of the sampling system described above is based on the desired analytical tasks for sampling. The following dimensions are particularly useful for samples for the analysis of cell-internal components, the concentration of which should no longer change within the inactivated sample (whereby the addition of cooled inactivating agent can also "freeze" the removal state):
The sample line 13 of the probe has a diameter of 4 to 8 mm and ends in a probe tip 4 tapered to 2 to 4 mm. From the sample inlet 5 mm away is the mixing point 8 widened to 4 to 8 mm, into which the inactivating agent line (diameter 2 to 4 mm) opens at an angle of 30 to 60 ° to the probe axis. The mixing elements 9 are provided over a length of 2 to 5 cm. The sample tube 6 has a length of 20 to 150 m and can be wound up largely horizontally with a "winding diameter" of 20 to 30 cm.
Es folgt ein Beispiel für die Durchführung der erfindungsgemäßen Probenahme. The following is an example of how the sampling according to the invention.
Mit Hilfe dynamischer Untersuchungen (Aufprägung von Pulsen oder Sprungfunktionen) unter definierten Bedingungen, wie sie im Bioreaktor einstellbar sind, lassen sich "Flaschenhälse" im Stoffwechsel identifizieren. Aus dem dynamischen Verlauf der zellinternen Metabolite können (teil-)strukturierte Stoffwechselmodelle identifiziert werden. Werden solche Untersuchungen innerhalb weniger Minuten durchgeführt, kann der Einfluß einer Regulation auf genetischer Ebene ausgeschlossen werden.With the help of dynamic investigations (stamping of Pulses or step functions) under defined Conditions that can be set in the bioreactor can "bottle necks" in the metabolism identify. From the dynamic course of the Cell-internal metabolites can be (partially) structured Metabolism models are identified. Become such Examinations carried out within a few minutes, can be the influence of regulation at the genetic level be excluded.
Zur dynamischen Untersuchung des katabolen Stoffwechsels von Zymomonas mobilis sind hohe Probenahmefrequenzen erforderlich, da dieses Bakterium in der Lage ist, große Stoffmengen in sehr kurzer Zeit umzusetzen. Die maximale zellmassenspezifische Glucose-Aufnahmegeschwindigkeit von Zymomonas mobilis wurde im stationären Zustand zu qS,max, = 144 mmol Glucose/(g Trockensubstanz * h) bestimmt (D. Weuster-Botz: Continuous ethanol production by Zymomonas mobilis in a fluidized bed reactor. Part I. Kinetic studies of immobilization in macroporous glass beads. Appl Microbiol Biotechnol (1993) 39 : 679-584). Bei einem durchschnittlichem zellinternem Volumen von 2 ml/g TS bedeutet dies, daß Zymomonas mobilis in einer Sekunde 20 mmol/l Glucose aufnehmen kann. Daher sind Meßfrequenzen größer 1/Sekunde erforderlich.For the dynamic investigation of the catabolic metabolism of Zymomonas mobilis, high sampling frequencies are required because this bacterium is able to convert large amounts of substances in a very short time. The maximum cell mass-specific glucose uptake rate of Zymomonas mobilis was determined in the steady state to q S, max , = 144 mmol glucose / (g dry substance * h) (D. Weuster-Botz: Continuous ethanol production by Zymomonas mobilis in a fluidized bed reactor. Part I. Kinetic studies of immobilization in macroporous glass beads. Appl Microbiol Biotechnol (1993) 39: 679-584). With an average internal volume of 2 ml / g TS, this means that Zymomonas mobilis can absorb 20 mmol / l glucose in one second. Therefore, measuring frequencies greater than 1 / second are required.
In einem 30 l Rührkesselfermenter (Arbeitsvolumen 20 l, 6-Blatt-Radial-Rührer) mit Standard-Meß- und Regelungstechnik (Drehzahl(n)-, Volumen(V)-, Druck(P)-, Temperatur(T)- und pH-Regelung) wird Zymomonas mobilis kontinuierlich bei einer Verweilzeit von 10 h im Fließgleichgewicht kultiviert (Glucose im Zulauf = 120 g/l, pH = 5.0, T = 30°C). Dabei läßt sich eine Zelldichte von 1.8 g TS/l erzielen. Die Glukosekonzentration im Fermenter beträgt 6.08 g/l, die Produktkonzentration (Ethanol) 55 g/l. Es sind also Glucose-limitierte Bedingungen eingestellt (KS=0.13 g/l). Die Mediumzusammensetzung (rein mineralisches Medium) ist in der Literatur angegeben (siehe oben).In a 30 l stirred tank fermenter (working volume 20 l, 6-blade radial stirrer) with standard measuring and control technology (speed (n) -, volume (V) -, pressure (P) -, temperature (T) - and pH control), Zymomonas mobilis is continuously cultivated in a steady state with a dwell time of 10 h (inflow of glucose = 120 g / l, pH = 5.0, T = 30 ° C.). A cell density of 1.8 g TS / l can be achieved. The glucose concentration in the fermenter is 6.08 g / l, the product concentration (ethanol) 55 g / l. So glucose-limited conditions are set (K S = 0.13 g / l). The medium composition (purely mineral medium) is given in the literature (see above).
Zusätzlich wird als Interner Standard (IS) 20 µmol/l Maltose ins Medium eingewogen. Maltose kann von Zymomonas mobilis nicht aufgenommen werden.In addition, the internal standard (IS) is 20 µmol / l Weighed maltose into the medium. Maltose can be from Zymomonas mobilis will not be included.
In einem seitlichen 25 mm "Ingold"-Stutzen des Standard- Rührkesselfermenters befindet sich die Probenahmesonde, die bei der Sterilisation des Fermenters mitsterilisiert wird. Das Ventil zur Zuführung des Inaktivierungsreagenz und das Ventil am Probenrohr sind geschlossen. Das Probenrohr aus Polypropylen hat einen Durchmesser von 8 mm, eine Länge von 80 m und ist mit einem Durchmesser von 25 cm aufgewickelt (100 Wicklungen). Als Sperrflüssigkeit wird Wasser verwendet.In a 25 mm "Ingold" spigot of the standard Stirred tank fermenter is the sampling probe, which also sterilizes during the sterilization of the fermenter becomes. The valve for supplying the inactivation reagent and the valve on the sample tube are closed. The Sample tube made of polypropylene has a diameter of 8 mm, a length of 80 m and has a diameter of 25 cm wound (100 windings). As a barrier liquid water is used.
Im Reaktor ist in axialer Richtung über die gesamte Eintauchtiefe ein perforiertes Tauchrohr angebracht, das ebenfalls über ein Ventil abgeschlossen ist. Daran angeschlossen ist eine Vorlage mit 100 ml Glukosekonzentrat (400 g/l). Der Druck im Vorlagebehälter beträgt 4 bar. Mit dieser Anordnung lassen sich bei Öffnen des Ventils zur Aufgabe eines Glucose-Pulses bei maximaler Rührerdrehzahl (n = 1000 u/min) Mischzeiten von weniger als 100 ms erzielen. Die Konzentration an Glucose im Fermenter beträgt direkt nach Aufgabe des Glucosepulses 2,0 g/l (nicht glucoselimitierte Bedingungen).In the reactor is in the axial direction over the entire Immersion depth a perforated immersion tube attached to the is also completed via a valve. That attached is a template with 100 ml Glucose concentrate (400 g / l). The pressure in the reservoir is 4 bar. With this arrangement, Opening the valve to give up a glucose pulse maximum stirrer speed (n = 1000 rpm) mixing times of achieve less than 100 ms. The concentration of glucose in the fermenter immediately after the Glucose pulse 2.0 g / l (not glucose limited Conditions).
Der Vordruck im Fermenter zum Transport der Probe in das Probenrohr wird bei dem gewählten Rohrdurchmesser von 8 mm auf 400 mbar eingestellt. Die Perchlorsäurevorlage (35%ige Lösung) wird auf -25°C gekühlt und ebenfalls mit einem Vordruck von 400 mbar beaufschlagt.The form in the fermenter for transporting the sample into the Sample tube will be at the selected tube diameter of 8 mm set to 400 mbar. The perchloric acid template (35% solution) is cooled to -25 ° C and also with a pre-pressure of 400 mbar.
Der Probenahme- und Inaktivierungsvorgang gliedert sich in 5 Phasen:The sampling and inactivation process is structured in 5 phases:
- 1. Starten der Probenahme durch zeitgleiches Öffnen der Ventile an der Probenahmesonde und am Probenrohr (Ausgangskonzentrationen).1. Start sampling by opening the Valves on the sampling probe and on the sample tube (Initial concentrations).
- 2. Aufgeben eines Glukosepulses nach 20 Sekunden durch Öffnen des Ventils der Glucosevorlage (Die Messungen im Bereich der Mischzeit können später bei der Auswertung nicht berücksichtigt werden).2. Apply a glucose pulse after 20 seconds Open the valve of the glucose template (the measurements in The mixing time range can be used later in the evaluation not be considered).
- 3. Beenden der Probenahme nach 5 Minuten durch Schließen aller Ventile, wenn das Probenrohr vollständig mit Probe gefüllt ist.3. Stop sampling after 5 minutes by closing all valves when the sample tube is completely filled with sample is filled.
- 4. Abtrennen des Probenrohrs von der Probenahmesonde und Einfrieren des Probenrohrs.4. Disconnect the sample tube from the sampling probe and Freeze the sample tube.
- 5. Zerlegen des gefrorenen Progenahmerohrs in äquidistante Teilstücke von 5 ml Inhalt. Nach dem Auftauen können die Teilproben analysiert werden.5. Disassemble the frozen sampling tube into equidistant sections of 5 ml content. After this The partial samples can be analyzed by thawing.
Bei dieser Vorgehensweise wird ein inaktivierter Probenahmestrom von 15 ml/s erzielt. Das bedeutet, die zeitliche Auflösung liegt bei 3 Proben / Sekunde, es wird also eine Meßzeit von 333 ms erzielt. Durch die Probenahme wird das Reaktorvolumen um 2.25 l verringert (11.25%).With this procedure, a disabled Sampling flow of 15 ml / s achieved. That means the temporal resolution is 3 samples / second, it will thus achieved a measuring time of 333 ms. Through the Sampling, the reactor volume is reduced by 2.25 l (11.25%).
Durch Analyse des Internen Standards läßt sich das Mischungsverhältnis Probe und Inaktivierungsreagenz im Rahmen der Meßgenauigkeit bestimmen.This can be done by analyzing the internal standard Mixing ratio of sample and inactivating reagent in the Determine the scope of the measuring accuracy.
Die Analytik der einzelnen Stoffwechselintermediate erfolgt nach Vorbehandlung der Probe (abzentrifugieren bei 30 000 g, 30 min, 4°C und Lyophilisieren des Überstands) in der Regel biochemisch. Die Konzentrationen der phosphorylierten Verbindungen, wie sie im katabolen Stoffwechselweg überwiegend vorliegen, können in einfacher Weise mit Hilfe von 31P-NMR-Messung der Perchlorsäureextrakte gleichzeitig bestimmt werden.The analysis of the individual metabolic intermediates takes place after pretreatment of the sample (centrifugation at 30,000 g, 30 min, 4 ° C and lyophilizing the Supernatant) usually biochemically. The concentrations of the phosphorylated compounds as they are in the catabolic Metabolic pathway predominantly exist in easily using the 31P NMR measurement of the Perchloric acid extracts can be determined simultaneously.
Mit dieser Technik kann der dynamische Konzentrationsverlauf von Glucose-6-P, 6-P-Gluconat, 2-keto-3-deoxy-6-P-Gluconat, Glyceraldehyd-3-P, Glycerate- 1,3-P, 3-P-Glycerate, 2-P-Glycerate, ATP, ADP, UTP, UDP gemessen werden.With this technique the dynamic Concentration curve of glucose-6-P, 6-P-gluconate, 2-keto-3-deoxy-6-P-gluconate, glyceraldehyde-3-P, glycerate- 1,3-P, 3-P-glycerates, 2-P-glycerates, ATP, ADP, UTP, UDP be measured.
Bei bekanntem intrazellulärem Volumen (Zymomonas mobilis 2 ml/g TS) lassen sich daraus die intrazellulären Konzentrationen berechnen.If the intracellular volume (Zymomonas mobilis 2 ml / g TS), the intracellular Calculate concentrations.
Die intrazelluläre Konzentrationen der Metabolite, die auch extern vorliegen (Glucose, Lactat, Acetat, Ethanol, Glycerin, Acetoin, Acetaldehyd) können aufgrund des ungünstigen Volumenverhältnisses intern/extern nicht bestimmt werden.The intracellular concentrations of the metabolites that also available externally (glucose, lactate, acetate, ethanol, Glycerin, acetoin, acetaldehyde) can be due to the unfavorable internal / external volume ratio not be determined.
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