DE4407439A1 - Method and appts. for studying rapid biological reactions - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Unter suchung des zeitlichen Ablaufs von Bioreaktionen in einem Reaktionsraum durch aufeinanderfolgende Entnahme biologischer Proben daraus unter Zumischung von Inakti vierungsmittel am Probenahmeort mit einer als Doppel rohr ausgebildeten Probenahmesonde sowie auf eine Vor richtung zur Durchführung des Verfahrens.The invention relates to a method for sub search for the timing of bioreactions in a reaction space by successive removal biological samples from it with admixture of Inakti agent at the sampling site with a double tube-shaped sampling probe and on a pre direction to carry out the procedure.
Für die Untersuchung der Kinetik innerhalb biologischer Systeme spielt die Probenahme eine wesentliche Rolle, wobei insbesondere bei Schnellablauf instationärer Stoffwechselvorgänge in Mikroorganismen eine rasche Folge von Probenahmen in ausreichender Menge für genügend empfindliche Bestimmungen von gegebenenfalls nur in geringen Konzentrationen vorliegenden Kompo nenten wichtig ist.For the study of the kinetics within biological Systems sampling plays an essential role being transient, especially when running quickly Metabolic processes in microorganisms a rapid Sequence of sampling in sufficient quantities for sufficiently sensitive provisions of where appropriate compo present only in low concentrations is important.
Bekannt sind unterschiedliche Probenahmetechniken wie:Different sampling techniques are known, such as:
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1. Manuelle Probenahmetechniken:
Die klassischen Probenahmesysteme sind zur Entnahme von 2-5 Proben pro Stunde mit zwischengeschalteter Dampfsterilisation (Probevolumen 0.01-1 l) vorgesehen. Primäres Ziel ist neben der Entnahme einer repräsentativen Probe die Vermeidung einer Kontamination des Reaktorinhalts und der gezogenen Probe. Neben dem klassischen 3-Ventil-System zur Probenahme werden auch Kolbenventil-Konstruktionen eingesetzt (Standardisierungs- und Ausrüstungsempfehlungen für Bioreaktoren und periphere Einrichtungen, DECHEMA, 1991, 45-62).1. Manual sampling techniques:
The classic sampling systems are designed for taking 2-5 samples per hour with intermediate steam sterilization (sample volume 0.01-1 l). In addition to taking a representative sample, the primary goal is to avoid contamination of the reactor contents and the sample taken. In addition to the classic 3-valve sampling system, piston valve designs are also used (recommendations for standardization and equipment for bioreactors and peripheral equipment, DECHEMA, 1991, 45-62). -
2. Probenahmesysteme für die On-line-Prozeßanalytik:
Insbesondere zur Bestimmung von intrazellulären Enzymaktivitäten mit Hilfe der Fließ-Injektions-Analytik (FIA) wurden entsprechende Probenahmesysteme entwickelt. Hierbei wird die Probe mit einer Pumpe (Peristaltik- oder Kolbenpumpe) aus dem Reaktionsraum angesaugt und in einer nachgeschalteten Verdünnungs- und/oder Mischkammer mit Inaktivierungsreagenz versetzt. Hierdurch lassen sich Inaktivierungszeiten von 5 Sekunden erreichen (Spohn, U.; Voss, H.: Probenahmesysteme für die online- Prozeßanalytik in der Sterilfermentation. Jahrbuch Biotechnologie, Carl Hanser Verlag München Wien 1992, 227-253).2. Sampling systems for on-line process analysis:
Corresponding sampling systems have been developed in particular for the determination of intracellular enzyme activities with the aid of flow injection analysis (FIA). Here, the sample is sucked out of the reaction chamber with a pump (peristaltic or piston pump) and inactivation reagent is added in a downstream dilution and / or mixing chamber. In this way, inactivation times of 5 seconds can be achieved (Spohn, U .; Voss, H .: Sampling systems for online process analysis in sterile fermentation. Yearbook Biotechnology, Carl Hanser Verlag Munich Vienna 1992, 227-253). -
3. Koaxialkatheter:
Zur kontinuierlichen Probenahme wird ein Koaxialkatheter vorgeschlagen, bei dem die Probe im Zentralrohr abgesaugt und Inaktivierungsreagenz im Sekundärrohr zugeführt wird, so daß direkt ab der Probenahmestelle eine Inaktivierung der Probe erfolgen kann, bevor in einer nachgeschalteten Dialysezelle Zellmasse und höhermolekulare Substanzen abgetrennt werden (Holst et al.: Appl. Microbiol. Biotechnol. 28 (1988) 32-36).3. Coaxial catheter:
For continuous sampling, a coaxial catheter is proposed in which the sample is drawn off in the central tube and inactivating reagent is fed into the secondary tube, so that the sample can be inactivated directly from the sampling point before cell mass and higher molecular weight substances are separated in a downstream dialysis cell (Holst et al .: Appl. Microbiol. Biotechnol. 28 (1988) 32-36). -
4. Schnelle Probenahme mit Ventiltechnik und Probensammler:
Über eine HPLC-Kapillare wird die Probe pneumatisch aus dem Reaktor gefördert und über ein Ventil einem Probensammler zugeführt. Die Probe wird in evakuierte Glasröhrchen injiziert, die 35% Perchlorsäurelösung enthalten, die auf -25°C vorgekühlt ist. Damit läßt sich eine Probenfrequenz von maximal 0.5/Sekunde erreichen (Theobald, U.; Baltes, M.; Rizzi, M.; Reuss, M.: Biochemical Engineering - Stuttgart, Gustav Fischer Stuttgart New York 1991, 361-364).4. Fast sampling with valve technology and sample collector:
The sample is pneumatically conveyed out of the reactor via an HPLC capillary and fed to a sample collector via a valve. The sample is injected into evacuated glass tubes containing 35% perchloric acid solution which is pre-cooled to -25 ° C. A sample frequency of maximum 0.5 / second can thus be achieved (Theobald, U .; Baltes, M .; Rizzi, M .; Reuss, M .: Biochemical Engineering - Stuttgart, Gustav Fischer Stuttgart New York 1991, 361-364).
Keine dieser bekannten Probenahmetechniken ist für Probenahmefrequenzen von mehr als 1/sec geeignet.None of these known sampling techniques are for Sampling frequencies of more than 1 / sec are suitable.
Ziel der Erfindung ist daher eine Probenahme, bei der mit relativ geringem Aufwand hohe Probenahmefrequenzen erreicht werden können, wobei vorzugsweise Probemengen je Untersuchungspunkt angestrebt werden, die eine Untersuchung zellinterner Komponenten gestatten.The aim of the invention is therefore a sampling in which high sampling frequencies with relatively little effort can be achieved, preferably sample amounts for each examination point, one Allow internal components to be examined.
Das zu diesem Zweck entwickelte erfindungsgemäße Verfahren der eingangs genannten Art ist dadurch gekennzeichnet, daß man die aufeinanderfolgenden Proben in zumindest ein mit Sperrflüssigkeit gefülltes Proben rohr von ausreichender Länge zur Aufnahme der Proben serie unter Verdrängung der Sperrflüssigkeit schickt, das (bzw. dessen Inhalt) nach Beendigung der Serien probenahme - ggf. eingefroren - entsprechend der gewünschten Zeitunterteilung der Untersuchungsproben in einzelne Abschnitte zerteilt wird.The inventive developed for this purpose This is the procedure of the type mentioned at the beginning characterized in that the successive samples in at least one sample filled with sealing liquid tube of sufficient length to hold the samples series with displacement of the barrier liquid, this (or its content) after the end of the series sampling - if necessary frozen - according to the desired time division of the test samples in dividing individual sections.
Weitere Besonderheiten des Verfahrens ergeben sich aus den Ansprüchen 2 bis 4.Further peculiarities of the method result from claims 2 to 4.
Gemäß der Erfindung wird eine Serienprobenahme mit hohen Meßfrequenzen (je nach Unterteilung bis zu 100/sec) in reproduzierbarer Weise ermöglicht, wobei der apparative Aufwand relativ gering bleibt, jedoch durch Berücksichtigung innerer Standards hohe Genauigkeiten erzielt werden und bei entsprechend hoher Probenahmemenge selbst zellinterne Komponenten in ihrer zeitlichen Änderung analysiert werden können.According to the invention, a serial sampling with high measuring frequencies (depending on the subdivision up to 100 / sec) in a reproducible manner, whereby the expenditure on equipment remains relatively low, however by considering internal standards high Accuracies can be achieved and at a correspondingly high level Sampling amount even in your cell internal components changes over time can be analyzed.
Die Erfindung ist damit besonders geeignet für die biotechnologische Forschung, um schnelle komplexe Reaktionen unter definierten Bedingungen im Bioreaktor verfolgen zu können. Diese Möglichkeiten wirken sich auf die Bioverfahrenstechnik zur Ermittlung kurz zeitiger Einflüsse lokaler Konzentrationsgradienten auf den Stoffwechsel von Produktionsorganismen aus.The invention is therefore particularly suitable for biotechnological research to fast complex Reactions under defined conditions in the bioreactor to be able to track. These options work to the bio-process engineering for the determination briefly influences of local concentration gradients the metabolism of production organisms.
Eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt neben einer Probenahmesonde mit Absperrmitteln ein an die Sonde angekoppeltes bzw. ankoppelbares Probenrohr von ausreichender Länge zur Aufnahmen von Probenserien innerhalb eines gewünschten Zeitraums. Dieses Probenrohr hat insbesondere Absperr mittel an den Enden und wird zweckmäßigerweise am Ende der Probennahmeserie eingefroren. In dieser Form ist eine Unterteilung in gewünschte Einzelproben einfach zu bewerkstelligen.A device for performing the invention In addition to a sampling probe, the method also includes Shut-off means a coupled to the probe or Couplable sample tube of sufficient length for Recordings of sample series within a desired one Period. This sample tube has a shut-off in particular medium at the ends and expediently at the end frozen in the sample series. Is in this form a division into desired individual samples accomplish.
Die an das Probenrohr angeschlossene bzw. anschließbare Probenahmesonde, die über einen Anschlußstutzen in den Reaktionsraum eingeführt werden kann, wird in an sich bekannter Weise durch ein Doppelrohr gebildet, dessen beide Leitungszüge in enger Nachbarschaft zur Sonden spitze miteinander in Verbindung stehen, wodurch über die Sondenspitze bzw. das Sondenende zutretende Proben unmittelbar daran anschließend mit Inaktivierungsmittel gemischt werden können, so daß eine Inaktivierung innerhalb von 10-20 msec erreicht werden kann. Besonders zweckmäßig erfolgt die Zumischung an einer Erweiterung der Sondenspitze über einen von der Spitze weggerichteten Schrägeinlauf des Inaktivierungsmittels, das vorzugsweise in einem Winkel von 30 bis 60° zur Sondenachse in den erweiterten Sondenraum eintritt, der anschließend an die Zumischstelle mit statischen Misch elementen versehen ist.The one connected or connectable to the sample tube Sampling probe, which has a connecting piece in the Reaction space can be introduced in itself known manner formed by a double tube, the both lines in close proximity to the probes pointed to each other, causing over the probe tip or the end of the probe immediately afterwards with inactivating agent can be mixed so that inactivation can be reached within 10-20 msec. Mixing is particularly expedient on one Extension of the probe tip by one from the tip directional sloping inlet of the inactivating agent, preferably at an angle of 30 to 60 ° Probe axis enters the expanded probe space that then to the mixing point with static mixing elements is provided.
Der Zulauf der Probenflüssigkeit (unter Verdrängung der zu Beginn im Probenrohr vorhandenen Sperrflüssigkeit) erfolgt vorzugsweise durch Druckförderung mittels einer Druckdifferenz, die zwischen dem Reaktionsraum (aus dem die Probe entnommen wird) und dem Probenrohrende herrscht. Das Inaktivierungsmittel wird zweckmäßiger weise mittels eines Tauchrohres aus einem abgeschlos senen Inaktivierungsmittelvorrat durch entsprechende Druckaufprägung gefördert, wobei das gewünschte Mischungsverhältnis durch entsprechende Steuerung der Förderdrucke erreicht werden kann. Anstelle der pneu matischen Förderung könnten selbstverständlich auch Pumpen zur Bewegung der Proben- und Inaktivierungs mittelströme vorgesehen sein.The inflow of the sample liquid (displacing the barrier liquid present in the sample tube at the beginning) is preferably carried out by pressure promotion by means of a Pressure difference between the reaction space (from the the sample is taken) and the sample tube end prevails. The inactivating agent becomes more convenient closed by means of a dip tube its inactivating agent stock by appropriate Promoting pressure, the desired Mixing ratio through appropriate control of the Delivery pressures can be achieved. Instead of the pneu Matic funding could of course also Pumps for moving sample and inactivation medium flows can be provided.
Die beigefügte schematische Zeichnung veranschaulicht die Erfindung anhand eines speziellen Ausführungsbei spiels:The attached schematic drawing illustrates the invention based on a special embodiment games:
Wie man sieht, greift die Sonde 1 durch einen Anschluß stutzen 2 in der Reaktorwand abgedichtet in einen Reaktionsraum 3, aus dem über die Sondenspitze 4 Proben (insbesondere kontinuierlich) mittels der Druck differenz zwischen dem Reaktionsraum 3 und dem Ende 5 des an die Sonde angeschlossenen Probenrohres 6 kontinuierlich oder intermittierend abgezogen werden. Über die Leitung 7 der Sonde 1 wird Inaktivierungs mittel der Erweiterung 8 der Probenahmeleitung der Sonde insbesondere über eine von der Sondenspitze wegweisende Verbindungsleitung zugeführt. Anschließend daran sind statische Mischelemente 9 im Sondenrohr vorgesehen. Die Inaktivierungsmittelleitung 7 steht über ein Ventil 10 mit anschließendem Tauchrohr mit einem abgeschlossenen Inaktivierungsmittelraum 11 in Verbindung, der über eine mit Ventil versehene Leitung 12 auf Förderdruck gebracht werden kann. Das Proben nahmerohr 13 der Sonde 1 steht über ein Ventil 14 ggf. unter Zwischenschaltung eines Ventils 15 mit dem Probenrohr 6 in Verbindung.As can be seen, the probe 1 engages through a connecting piece 2 sealed in the reactor wall in a reaction chamber 3 , from which 4 samples (in particular continuously) via the probe tip by means of the pressure difference between the reaction chamber 3 and the end 5 of the connected to the probe Sample tube 6 are withdrawn continuously or intermittently. Via the line 7 of the probe 1 , inactivation means of the extension 8 of the sampling line of the probe is supplied in particular via a connecting line pointing away from the probe tip. Static mixing elements 9 are then provided in the probe tube. The inactivating agent line 7 is connected via a valve 10 with a subsequent immersion tube to a closed inactivating agent space 11 which can be brought to delivery pressure via a valve 12 provided with a valve. The sampling tube 13 of the probe 1 is connected via a valve 14, possibly with the interposition of a valve 15, to the sample tube 6 .
Der Probenahme- und Inaktivierungsvorgang gestaltet sich folgendermaßen: The sampling and inactivation process designed yourself as follows:
Das Probenrohr ist vor Beginn der Messung mit einer Sperrflüssigkeit (z. B. deionisiertes Wasser) gefüllt. Diese Sperrflüssigkeit wird bei der Probenahme verdrängt. Die Geschwindigkeit der Probenahme wird über den Druckverlust bei der Durchströmung des Probenrohrs bestimmt. Ist das Probenrohr mit inaktivierter Probe gefüllt, so werden beide Ventile am Probenrohr geschlossen, die Probenahme ist beendet. Damit ist der instationäre zeitliche Verlauf der Reaktion im Reaktor räumlich im Probenrohr konserviert.The sample tube is with a before the measurement Bulking liquid (e.g. deionized water) filled. This barrier liquid is used during sampling repressed. The speed of sampling will be about the pressure loss when flowing through the Specimen tube determined. Is the sample tube with Inactivated sample filled, so both valves closed on the sample tube, the sampling is completed. This is the transient temporal course the reaction in the reactor spatially in the sample tube preserved.
Zur Analyse wird das Probenrohr von der Probenahmesonde getrennt und die Proben nach Öffnen der Ventile in gewünschter Unterteilung entnommen und analysiert.For analysis, the sample tube is removed from the Sampling probe separated and the samples after opening the valves in the desired subdivision and analyzed.
Um eine Rückvermischung bei der Probeentnahme zu vermeiden, kann das Probenrohr tiefgefroren werden. Im gefrorenen Zustand werden die gewünschten Probenvolumina aus dem Probenrohr herausgeschnitten und getrennt aufgetaut und analysiert.To ensure backmixing during sampling the sample tube can be frozen. In the frozen state, the desired ones Cut sample volumes out of the sample tube and thawed and analyzed separately.
Um auch Flüssigkeitsproben mit veränderlichem Gasgehalt reproduzierbar analysieren können, ist dem Reaktionsgemisch im Reaktor ein "Interner Standard" (IS) in definierter Konzentration beigegeben. Der Interne Standard darf durch die Reaktion in seiner Konzentration nicht verändert werden. Der Interne Standard darf die Reaktion nicht beeinflussen.For liquid samples with variable The ability to analyze gas content in a reproducible way is that Reaction mixture in the reactor an "internal standard" (IS) added in a defined concentration. Of the Internal standard allowed by the reaction in its Concentration cannot be changed. The internal Standard must not influence the reaction.
Das Probenahmesystem ist zweckmäßigerweise komplett sterilisierbar.The sampling system is expediently complete sterilizable.
Die Probenahmesonde ist insbesondere passend zu Normstutzten (2) ausgeführt.The sampling probe is especially designed to match standard connectors ( 2 ).
Ist der Druckverlust im Probenrohr zu hoch, so kann durch Einfügen eines schnell schaltenden Mehrwegeventils zwischen Probenahmesonde und Probenrohr dieses in mehrere kürzere Teilstücke aufgeteilt werden.If the pressure drop in the sample tube is too high, it can by inserting a quick switching Multiway valve between sampling probe and Sample tube this into several shorter sections be divided.
Eine Möglichkeit zur Verringerung der Rückvermischung stellt die Segmentierung des Probenstroms bei der Probenahme vor Eintritt in das Probenahmerohr durch periodisches Einspeisen einer zweiten nicht mischbaren flüssigen Phase oder Gasphase (z. B. Luft) mit entsprechender Frequenz in den Probenahmestrom (etwa über 15) dar.One way to reduce backmixing represents the segmentation of the sample stream at the Sampling before entering the sampling tube periodically feeding a second one not miscible liquid phase or gas phase (e.g. air) with a corresponding frequency in the sampling stream (about 15).
Die Dimensionierung des vorstehend beschriebenen Probenahmesystems richtet sich nach den gewünschten analytischen Aufgaben für die Probenahme. Speziell zur Proben zur Untersuchung zellinterner Komponenten, deren Konzentration sich innerhalb der inaktivierten Probe nicht mehr verändern soll (wobei zusätzlich durch Zumischung von gekühltem Inaktivierungsmittel für ein "Einfrieren" des Entnahmezustandes gesorgt werden kann) sind folgende Abmessungen zweckmäßig:The dimensioning of the one described above Sampling system depends on the desired analytical tasks for sampling. Especially for Samples for the investigation of cell internal components, their Concentration within the inactivated sample should no longer change (whereby additionally by Admixture of cooled inactivating agent for a "Freezing" of the removal state can be ensured) the following dimensions are appropriate:
Die Probenleitung 13 der Sonde hat einen Durchmesser von 4 bis 8 mm und endet in einer auf 2 bis 4 mm verjüngten Sondenspitze 4. Vom Probeneinlaß 5 mm entfernt befindet sich die auf 4 bis 8 mm aufgeweitete Mischstelle 8, in welche die Inaktivierungsmittel leitung (Durchmesser 2 bis 4 mm) unter einem Winkel von 30 bis 60° zur Sondenachse mündet. Die Mischelemente 9 sind auf einer Länge von 2 bis 5 cm vorgesehen. Das Probenrohr 6 hat eine Länge von 20 bis 150 m und kann mit einem "Windungs-Durchmesser" von 20 bis 30 cm weitgehend horizontal aufgewickelt sein.The sample line 13 of the probe has a diameter of 4 to 8 mm and ends in a probe tip 4 tapered to 2 to 4 mm. From the sample inlet 5 mm away is the mixing point 8 widened to 4 to 8 mm, into which the inactivating agent line (diameter 2 to 4 mm) opens at an angle of 30 to 60 ° to the probe axis. The mixing elements 9 are provided over a length of 2 to 5 cm. The sample tube 6 has a length of 20 to 150 m and can be wound up largely horizontally with a "winding diameter" of 20 to 30 cm.
Es folgt ein Beispiel für die Durchführung der erfindungsgemäßen Probenahme. The following is an example of how the sampling according to the invention.
Mit Hilfe dynamischer Untersuchungen (Aufprägung von Pulsen oder Sprungfunktionen) unter definierten Bedingungen, wie sie im Bioreaktor einstellbar sind, lassen sich "Flaschenhälse" im Stoffwechsel identifizieren. Aus dem dynamischen Verlauf der zellinternen Metabolite können (teil-)strukturierte Stoffwechselmodelle identifiziert werden. Werden solche Untersuchungen innerhalb weniger Minuten durchgeführt, kann der Einfluß einer Regulation auf genetischer Ebene ausgeschlossen werden.With the help of dynamic investigations (stamping of Pulses or step functions) under defined Conditions that can be set in the bioreactor can "bottle necks" in the metabolism identify. From the dynamic course of the Cell-internal metabolites can be (partially) structured Metabolism models are identified. Become such Examinations carried out within a few minutes, can be the influence of regulation at the genetic level be excluded.
Zur dynamischen Untersuchung des katabolen Stoffwechsels von Zymomonas mobilis sind hohe Probenahmefrequenzen erforderlich, da dieses Bakterium in der Lage ist, große Stoffmengen in sehr kurzer Zeit umzusetzen. Die maximale zellmassenspezifische Glucose-Aufnahmegeschwindigkeit von Zymomonas mobilis wurde im stationären Zustand zu qS,max = 144 mmol Glucose /(g Trockensubstanz * h) bestimmt (D. Weuster-Botz: Continuous ethanol production by Zymomonas mobilis in a fluidized bed reactor. Part I. Kinetic studies of immobilization in macroporous glass beads. Appl Microbiol Biotechnol (1993) 39: 679-584). Bei einem durchschnittlichem zellinternem Volumen von 2 ml/g TS bedeutet dies, daß Zymomonas mobilis in einer Sekunde 20 mmol/l Glucose aufnehmen kann. Daher sind Meßfrequenzen größer 1/Sekunde erforderlich.For the dynamic investigation of the catabolic metabolism of Zymomonas mobilis, high sampling frequencies are required because this bacterium is able to convert large amounts of substances in a very short time. The maximum cell mass-specific glucose uptake rate of Zymomonas mobilis was determined in the steady state to q S, max = 144 mmol glucose / (g dry substance * h) (D. Weuster-Botz: Continuous ethanol production by Zymomonas mobilis in a fluidized bed reactor. Part I. Kinetic studies of immobilization in macroporous glass beads. Appl Microbiol Biotechnol (1993) 39: 679-584). With an average internal volume of 2 ml / g TS, this means that Zymomonas mobilis can absorb 20 mmol / l glucose in one second. Therefore, measuring frequencies greater than 1 / second are required.
In einem 30 l Rührkesselfermenter (Arbeitsvolumen 20 l, 6-Blatt-Radial-Rührer) mit Standard-Meß- und Regelungstechnik (Drehzahl(n)-, Volumen(V)-, Druck(P)-, Temperatur(T)- und pH-Regelung) wird Zymomonas mobilis kontinuierlich bei einer Verweilzeit von 10 h im Fließgleichgewicht kultiviert (Glucose im Zulauf = 120 g/l, pH = 5.0, T = 30°C). Dabei läßt sich eine Zelldichte von 1.8 g TS/l erzielen. Die Glukosekonzentration im Fermenter beträgt 0.08 g/l, die Produktkonzentration (Ethanol) 55 g/l. Es sind also Glucose-limitierte Bedingungen eingestellt (KS=0.13 g/l). Die Mediumszusammensetzung (rein mineralisches Medium) ist in der Literatur angegeben (siehe oben).In a 30 l stirred tank fermenter (working volume 20 l, 6-blade radial stirrer) with standard measuring and control technology (speed (n) -, volume (V) -, pressure (P) -, temperature (T) - and pH control), Zymomonas mobilis is continuously cultivated in a steady state with a dwell time of 10 h (inflow of glucose = 120 g / l, pH = 5.0, T = 30 ° C.). A cell density of 1.8 g TS / l can be achieved. The glucose concentration in the fermenter is 0.08 g / l, the product concentration (ethanol) 55 g / l. So glucose-limited conditions are set (K S = 0.13 g / l). The medium composition (purely mineral medium) is given in the literature (see above).
Zusätzlich wird als Interner Standard (IS) 20 µmol/l Maltose ins Medium eingewogen. Maltose kann von Zymomonas mobilis nicht aufgenommen werden.In addition, the internal standard (IS) is 20 µmol / l Weighed maltose into the medium. Maltose can be from Zymomonas mobilis will not be included.
In einem seitlichen 25 mm "Ingold"-Stutzen des Standard- Rührkesselfermenters befindet sich die Probenahmesonde, die bei der Sterilisation des Fermenters mitsterilisiert wird. Das Ventil zur Zuführung des Inaktivierungsreagenz und das Ventil am Probenrohr sind geschlossen. Das Probenrohr aus Polypropylen hat einen Durchmesser von 8 mm, eine Länge von 80 m und ist mit einem Durchmesser von 25 cm aufgewickelt (100 Wicklungen). Als Sperrflüssigkeit wird Wasser verwendet.In a 25 mm "Ingold" spigot of the standard Stirred tank fermenter is the sampling probe, which also sterilizes during the sterilization of the fermenter becomes. The valve for supplying the inactivation reagent and the valve on the sample tube are closed. The Sample tube made of polypropylene has a diameter of 8 mm, a length of 80 m and with a diameter of 25 cm wound (100 windings). As a barrier liquid water is used.
Im Reaktor ist in axialer Richtung über die gesamte Eintauchtiefe ein perforiertes Tauchrohr angebracht, das ebenfalls über ein Ventil abgeschlossen ist. Daran angeschlossen ist eine Vorlage mit 100 ml Glukosekonzentrat (400 g/l). Der Druck im Vorlagebehälter beträgt 4 bar. Mit dieser Anordnung lassen sich bei Öffnen des Ventils zur Aufgabe eines Glucose-Pulses bei maximaler Rührerdrehzahl (n = 1000 l/min) Mischzeiten von weniger als 100 ms erzielen. Die Konzentration an Glucose im Fermenter beträgt direkt nach Aufgabe des Glucosepulses 2,0 g/l (nicht glucoselimitierte Bedingungen).In the reactor is in the axial direction over the entire Immersion depth a perforated immersion tube attached to the is also completed via a valve. That attached is a template with 100 ml Glucose concentrate (400 g / l). The pressure in the reservoir is 4 bar. With this arrangement, Opening the valve to give up a glucose pulse maximum stirrer speed (n = 1000 l / min) mixing times of achieve less than 100 ms. The concentration of glucose in the fermenter immediately after the Glucose pulse 2.0 g / l (not glucose limited Conditions).
Der Vordruck im Fermenter zum Transport der Probe in das Probenrohr wird bei dem gewählten Rohrdurchmesser von 8 mm auf 400 mbar eingestellt. Die Perchlorsäurevorlage (35%ige Lösung) wird auf -25°C gekühlt und ebenfalls mit einem Vordruck von 400 mbar beaufschlagt.The form in the fermenter for transporting the sample into the Sample tube is at the selected tube diameter of 8 mm set to 400 mbar. The perchloric acid template (35% solution) is cooled to -25 ° C and also with a pre-pressure of 400 mbar.
Der Probenahme- und Inaktivierungsvorgang gliedert sich in 5 Phasen:The sampling and inactivation process is structured in 5 phases:
- 1. Starten der Probenahme durch zeitgleiches Öffnen der Ventile an der Probenahmesonde und am Probenrohr (Ausgangskonzentrationen).1. Start sampling by opening the Valves on the sampling probe and on the sample tube (Initial concentrations).
- 2. Aufgeben eines Glukosepulses nach 20 Sekunden durch Öffnen des Ventils der Glucosevorlage (die Messungen im Bereich der Mischzeit können später bei der Auswertung nicht berücksichtigt werden).2. Apply a glucose pulse after 20 seconds Open the valve of the glucose template (the measurements in the The mixing time range can be used later in the evaluation not be considered).
- 3. Beenden der Probenahme nach 5 Minuten durch Schließen aller Ventile, wenn das Probenrohr vollständig mit Probe gefüllt ist.3. Stop sampling after 5 minutes by closing all valves when the sample tube is completely filled with sample is filled.
- 4. Abtrennen des Probenrohrs von der Probenahmesonde und Einfrieren des Probenrohrs.4. Disconnect the sample tube from the sampling probe and Freeze the sample tube.
- 5. Zerlegen des gefrorenen Progenahmerohrs in äquidistante Teilstücke von 5 ml Inhalt. Nach dem Auftauen können die Teilproben analysiert werden.5. Disassemble the frozen sampling tube into equidistant sections of 5 ml content. After this The partial samples can be analyzed by thawing.
Bei dieser Vorgehensweise wird ein inaktivierter Probenahmestrom von 15 ml/s erzielt. Das bedeutet, die zeitliche Auflösung liegt bei 3 Proben/Sekunde, es wird also eine Meßzeit von 333 ms erzielt. Durch die Probenahme wird das Reaktorvolumen um 2.25 l verringert (11.25%).With this procedure, a disabled Sampling flow of 15 ml / s achieved. That means the temporal resolution is 3 samples / second, it will thus achieved a measuring time of 333 ms. Through the Sampling, the reactor volume is reduced by 2.25 l (11.25%).
Durch Analyse des Internen Standards läßt sich das Mischungsverhältnis Probe und Inaktivierungsreagenz im Rahmen der Meßgenauigkeit bestimmen.This can be done by analyzing the internal standard Mixing ratio of sample and inactivating reagent in the Determine the scope of the measuring accuracy.
Die Analytik der einzelnen Stoffwechselintermediate erfolgt nach Vorbehandlung der Probe (abzentrifugieren bei 30 000 g, 30 min, 4°C und Lyophilisieren des Überstands) in der Regel biochemisch. Die Konzentrationen der phosphorylierten Verbindungen, wie sie im katabolen Stoffwechselweg überwiegend vorliegen, können in einfacher Weise mit Hilfe von 31P-NMR-Messung der Perchlorsäureextrakte gleichzeitig bestimmt werden.The analysis of the individual metabolic intermediates takes place after pretreatment of the sample (centrifugation at 30,000 g, 30 min, 4 ° C and lyophilizing the Supernatant) usually biochemically. The concentrations of the phosphorylated compounds as they are in the catabolic Metabolic pathway predominantly exist in easily using the 31P NMR measurement of the Perchloric acid extracts can be determined simultaneously.
Mit dieser Technik kann der dynamische Konzentrationsverlauf von Glucose-6-P, 6-P-Gluconat, 2- keto-3-deoxy-6-P-Gluconat, Glyceraldehyd-3-P, Glycerate- 1,3-P, 3-P-Glycerate, 2-P-Glycerate, ATP, ADP, UTP, UDP gemessen werden.With this technique the dynamic Concentration curve of glucose-6-P, 6-P-gluconate, 2- keto-3-deoxy-6-P-gluconate, glyceraldehyde-3-P, glycerate- 1,3-P, 3-P-glycerates, 2-P-glycerates, ATP, ADP, UTP, UDP be measured.
Bei bekanntem intrazellulärem Volumen (Zymomonas mobilis 2 ml/g TS) lassen sich daraus die intrazellulären Konzentrationen berechnen.If the intracellular volume (Zymomonas mobilis 2 ml / g TS), the intracellular Calculate concentrations.
Die intrazelluläre Konzentrationen der Metabolite, die auch extern vorliegen (Glucose, Lactat, Acetat, Ethanol, Glycerin, Acetoin, Acetaldehyd) können aufgrund des ungünstigen Volumenverhältnissen intern/extern nicht bestimmt werden.The intracellular concentrations of the metabolites that also available externally (glucose, lactate, acetate, ethanol, Glycerin, acetoin, acetaldehyde) can be due to the unfavorable internal / external volume ratios be determined.
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