DE4344425A1 - Collecting N-terminal peptide fragments of proteins - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Sammeln von amino-terminalen Peptidfragmenten (im folgenden als N-terminal bezeichnet), wobei ein N-terminales Pep tidfragment eines Proteins oder Peptids gesammelt wird.The present invention relates to a method and a Device for collecting amino-terminal peptide fragments (im hereinafter referred to as the N-terminal), an N-terminal Pep tid fragment of a protein or peptide is collected.
Im herkömmlichen Verfahren zum Sammeln terminaler Peptidfrag mente, um N-terminale- oder C-terminale Aminosäuren zu analysieren, bestehen Probleme, wie große mechanische Verlust- und Kontaminie rungsgefahr, komplexe Durchführung, die Notwendigkeit vergleichs weise großer Probenvolumen und unzuverlässige Sequenzergebnisse.In the conventional method of collecting terminal peptide fragments elements to analyze N-terminal or C-terminal amino acids, there are problems such as large mechanical loss and contamination risk of development, complex implementation, the need for comparison wise large sample volumes and unreliable sequence results.
Als ein abgewandeltes Verfahren, das frei von diesen Nachteilen ist, offenbart die japanische Offenlegungsschrift Nr. 235600/1989 ein Verfahren, in dem ein Peptid mit Lys-C spezifischem Spaltenzym aufgespalten wird; das jeweils entstehende Peptidfragment wird an einem festen Träger mit einer funktionellen Gruppe gebunden, die in der Lage ist, mit der α-Aminogruppe des Peptidfragments und der ε-Aminogruppe des Lys (Lysin) im Peptidfragment zu reagieren, um eine kovalente Bindung auszubilden; anschließend wird die Peptidbin dung zwischen dem α-Amino-terminalen Aminosäurerest des jeweiligen Fragments und dem benachbarten Aminosäurerest durch Säurebehandlung gespalten und das entstandene freigesetzte C-terminale Peptidfrag ment gesammelt. Die gleiche Veröffentlichung offenbart auch, daß das so gewonnene C-terminale Peptidfragment einer Aminosäuresequenz analyse durch verschiedene herkömmliche Verfahren unterzogen werden kann.As a modified process that is free from these disadvantages Japanese Patent Application Laid-Open No. 235600/1989 a method in which a peptide with Lys-C specific column enzyme is split up; the resulting peptide fragment is on a solid support with a functional group bound in is able to with the α-amino group of the peptide fragment and the ε-amino group of the lys (lysine) in the peptide fragment to react form a covalent bond; then the peptide bin between the α-amino-terminal amino acid residue of the respective Fragments and the neighboring amino acid residue by acid treatment cleaved and the resulting released C-terminal peptide fragment ment collected. The same publication also reveals that C-terminal peptide fragment of an amino acid sequence obtained in this way analysis by various conventional methods can.
Jedoch ist beim Sammeln eines N-terminalen Peptidfragments die Lösung der oben genannten Nachteile bisher nicht vollständig er folgt.However, when collecting an N-terminal peptide fragment, the Solving the above-mentioned drawbacks so far has not completely follows.
Insbesondere, wenn das Probenvolumen sehr gering ist, ist es schwierig, ein N-terminales Peptid zu sammeln, so daß die nachfol gende Aminosäuresequenzanalyse nicht beendet werden kann. Andere Probleme, wie mechanischer Verlust und Kontaminierung, bleiben ungelöst. Ferner wurde die Aminosäuresequenz eines Proteins herkömm lich durch den Edman-Abbau analysiert. Die Vorrichtung für den Edman-Abbau, die die Analyse automatisch durchführen kann, ist im Handel erhältlich. Da jedoch die N-terminal blockierten Proteine dem Edman-Abbau nicht unterzogen werden können, ist die Analyse durch den Edman-Abbau in diesem Fall nicht anwendbar.Especially when the sample volume is very small, it is difficult to collect an N-terminal peptide, so that the subsequent amino acid sequence analysis cannot be ended. Other Problems such as mechanical loss and contamination remain unsolved. Furthermore, the amino acid sequence of a protein has become conventional analyzed by Edman mining. The device for the Edman degradation, which can perform the analysis automatically, is in the Available commercially. However, since the N-terminally blocked proteins Edman degradation cannot be subjected to analysis the Edman degradation is not applicable in this case.
Daher besteht die Notwendigkeit, ein neues Verfahren zum Sam meln eines N-terminalen Peptidfragments, das frei von diesen Proble men ist, und eine automatisierte Vorrichtung zum Sammeln eines N-terminalen Peptidfragments für die praktische Anwendung zu entwickeln.Therefore, there is a need to start a new procedure for Sam of an N-terminal peptide fragment that is free from these problems men, and an automated device for collecting a Develop N-terminal peptide fragments for practical use.
Um die zuvor beschriebenen Probleme zu lösen und ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das es gestattet, das komplette und effi ziente Sammeln eines N-terminalen Peptidfragments durchzuführen und nützlich in der darauf folgenden Aminosäuresequenzierung ist, hat sich der Erfinder der Entwicklungsarbeit gewidmet und die vorliegen de Erfindung geschaffen.To solve the problems described above and a procedure to provide, which allows the complete and effi efficient collection of an N-terminal peptide fragment and useful in subsequent amino acid sequencing the inventor devoted himself to the development work and the available de invention created.
Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Sammeln eines N-terminalen Peptidfragments. Das Verfahren besitzt die folgenden Stufen: Die ε-Aminogruppe des Lys in einem Protein, dessen N-terminale α-Aminogruppe blockiert ist, wird acetyliert, um ein ε-acetyliertes Protein zu ergeben; eine chemische und/oder enzymatische Behandlung wird durchgeführt, um das zuvor erwähnte ε-acetylierte Protein aufzuspalten; die entstandenen Peptidfragmente werden auf einen festen Träger gebunden, der eine funktionelle Gruppe besitzt, die zum Reagieren mit einer freien Aminogruppe der Peptidfragmente unter Ausbildung einer kovalenten Bindung in der Lage ist; ein nicht gebundenes N-terminal blockiertes Peptidfragment wird auf einer Polymermembran oder einem Glasfaserfilter, mit einer funktionellen Gruppe vom Allylamintyp derivatisiert, gesammelt; und das gesammelte N-terminal blockierte Peptidfragment wird auf der Polymermembran oder dem Glasfaserfilter über die Carboxygruppe des gewonnenen Fragments (d. h. N-terminal blockiertes Peptidfragment) durch Ausbilden einer kovalenten Bindung immobilisiert.In particular, the invention relates to a method for Collect an N-terminal peptide fragment. The process owns the following stages: the ε-amino group of the lys in a protein, whose N-terminal α-amino group is blocked is acetylated to to give an ε-acetylated protein; a chemical and / or enzymatic treatment is carried out to the aforementioned to split ε-acetylated protein; the resulting peptide fragments are bound on a solid support that is functional Has group that to react with a free amino group Peptide fragments to form a covalent bond in the Location is; an unbound N-terminally blocked peptide fragment is on a polymer membrane or a glass fiber filter, with a derivatized functional group of the allylamine type, collected; and the collected N-terminally blocked peptide fragment is on the Polymer membrane or the glass fiber filter over the carboxy group of the recovered fragment (i.e., N-terminally blocked peptide fragment) immobilized by forming a covalent bond.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine Vorrichtung zum N-terminalen Peptidfragmentsammeln.The present invention also relates to a device for Collect N-terminal peptide fragment.
Genauer besitzt sie eine Säule, die mit einem festen Träger gepackt ist, der eine funktionelle Gruppe besitzt, die zum Reagieren mit einer freien Aminogruppe unter Ausbildung einer kovalenten Bin dung in der Lage ist; ein Mittel zum Aufgeben der Peptidfragmente auf die Säule, wobei die Peptidfragmente durch Aufspalten eines Proteins, dessen N-terminale α-Aminogruppe blockiert und die ε-Ami nogruppe des Lys im Protein acetyliert sind, erhalten werden; ein Mittel zum Einbringen eines Eluents in die Säule; eine Gewinnungs flasche mit einer Polymermembran oder einem Glasfaserfilter, die mit einer Carboxylgruppe reagieren können; eine Fluidleitung, die die Säule mit der Gewinnungsflasche für das Fließen des Eluats von der Säule zu der Gewinnungsflasche verbindet; ein Mittel zum Immobili sieren der Peptidfragmente auf dem festen Träger in der Säule; ein Mittel zum Sammeln des N-terminal blockierten Peptidfragments im Eluat, das nicht auf dem festen Träger auf der Polymermembran oder dem Glasfaserfilter in der Gewinnungsflasche immobilisiert ist; und ein Mittel zum Immobilisieren des gesammelten N-terminal blockierten Peptidfragments auf der Polymermembran oder dem Glasfaserfilter in der Gewinnungsflasche.More precisely, it has a column with a solid support is packed, which has a functional group that is to react with a free amino group to form a covalent bin manure is capable; a means for loading the peptide fragments onto the column, the peptide fragments being broken down by a Protein whose N-terminal α-amino group blocks and the ε-Ami no group of the Lys are acetylated in the protein can be obtained; a Means for introducing an eluent into the column; a winning one bottle with a polymer membrane or a glass fiber filter, with a carboxyl group can react; a fluid line that the Column with the recovery bottle for the flow of the eluate from the Connects column to the extraction bottle; a means of immobilization fix the peptide fragments on the solid support in the column; a Means for collecting the N-terminally blocked peptide fragment in the Eluate that is not on the solid support on the polymer membrane or the glass fiber filter is immobilized in the extraction bottle; and a means of immobilizing the collected N-terminally blocked Peptide fragments on the polymer membrane or the glass fiber filter in the extraction bottle.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Sammeln eines N-termi nalen Peptidfragments kann das N-terminale Peptidfragment aus einer sehr kleinen Probenmenge gesammelt werden und direkt der Massen analyse ohne Membranimmobilisierung zugeführt werden, um dessen Aminosäuresequenz zu bestimmen; und dessen Aminosäuresequenz kann ebenso nach einer darauffolgenden Behandlung mit einem Acylaminosäu re freisetzenden Enzym analysiert werden. Da auch das N-terminale Peptidfragmentsammeln und dessen Immobilisieren schnell in der selben Flasche durchgeführt werden können, und da das so gewonnene immobilisierte N-terminale Peptidfragment direkt in den Reaktor des Aminosäuresequenzanalysators gegeben werden kann, bestehen die Vorteile sehr geringer Kontaminierungsgefahr und sehr geringen mechanischen Verlusts. Zusammengefaßt hat das Verfahren gemäß vor liegender Erfindung es ermöglicht, das N-terminale Peptidfragment in der Probe halbautomatisch zu sammeln und zu immobilisieren.According to the inventive method for collecting an N-termi nal peptide fragment, the N-terminal peptide fragment from a very small amount of sample can be collected and directly the masses analysis without membrane immobilization can be applied to its Determine amino acid sequence; and its amino acid sequence can likewise after a subsequent treatment with an acylamino acid re releasing enzyme can be analyzed. Since also the N-terminal Collect peptide fragments and immobilize them quickly in the can be carried out in the same bottle, and since the so obtained immobilized N-terminal peptide fragment directly in the reactor of the Amino acid sequence analyzer can be given, which consist Advantages of very low risk of contamination and very low mechanical loss. In summary, the procedure according to lying invention allows the N-terminal peptide fragment in collect and immobilize the sample semi-automatically.
Die vorliegende Erfindung kann durch die folgende detaillierte Beschreibung und die beiliegenden Zeichnungen, die nur zur Erläute rung beigefügt sind, und damit die vorliegende Erfindung nicht einschränken, besser verstanden werden.The present invention can be detailed by the following Description and accompanying drawings, for illustrative purposes only tion are attached, and thus the present invention restrict, be better understood.
Fig. 1 zeigt ein schematisches Diagramm, der den Verfahrens ablauf des N-terminalen Peptidfragmentsammelns gemäß der vorliegen den Erfindung zeigt. Fig. 1 shows a schematic diagram showing the procedure of the N-terminal peptide fragment collection according to the present invention.
Fig. 2 zeigt ein schematisches Diagramm einer Vorrichtung zum N-terminalen Peptidfragmentsammeln und dessen Immobilisierung gemäß der vorliegenden Erfindung. Fig. 2 shows a schematic diagram of a device for N-terminal peptide fragment and collecting the immobilization according to the present invention.
Die Bezugszahlen der Fig. 2 bezeichnen die folgenden Elemente:The reference numbers in FIG. 2 denote the following elements:
Element 1 ist ein Reaktor, Element 2 eine Gewinnungsflasche, Element 3 eine Fluidleitung, Element 4 eine N2-Spülleitung, Element 5 eine Membran und Element 6 ein Heizblock.Element 1 is a reactor, Element 2 is a recovery bottle, Element 3 is a fluid line, Element 4 is an N 2 purge line, Element 5 is a membrane and Element 6 is a heating block.
Im Verfahren gemäß vorliegender Erfindung wird die ε-Amino gruppe des Lys (Lysin) im gewünschten Protein, dessen N-terminale α-Aminogruppe blockiert ist, mit Acetylimidazol, Essigsäurean hydrid oder ähnlichem acetyliert. Wenn Essigsäureanhydrid verwendet wird, kann es nahezu perfekt durch N2-Spülen entfernt werden, wie später beschrieben wird. In der vorliegenden Erfindung wird die N- terminale α-Aminogruppe des Proteins mit einer Acetylgruppe etc. blockiert.In the method according to the present invention, the ε-amino group of the lys (lysine) in the desired protein, whose N-terminal α-amino group is blocked, is acetylated with acetylimidazole, acetic anhydride or the like. If acetic anhydride is used, it can be almost perfectly removed by N 2 purging, as will be described later. In the present invention, the N-terminal α-amino group of the protein is blocked with an acetyl group, etc.
Als nächstes wird eine chemische und/oder enzymatische Behand lung, als Mittel zum Aufspalten eines Proteins gemäß Erfindung durchgeführt; eine bekannte chemische Behandlung wird für die Spal tung durch chemische Techniken durchgeführt. Zu diesen Behandlungen zählt das Aufspalten an einem Met-Rest mit CNBr und Aufspalten an einem Trp-Rest mit CNBr-DMSO-HCl, aber sie sind nicht auf diese Beispiele beschränkt, so lange die zuvor beschriebene Wirkung ein tritt.Next, a chemical and / or enzymatic treatment lung, as a means for breaking down a protein according to the invention carried out; A well-known chemical treatment is used for the spal processing carried out by chemical techniques. To these treatments counts splitting on a Met residue with CNBr and splitting a Trp residue with CNBr-DMSO-HCl, but they're not on this Examples are limited as long as the effect described above occurs.
Gemäß vorliegender Erfindung wird die Enzymbehandlung zum Aufspalten des Peptids mit einem Enzym durchgeführt. Zu diesen Behandlungen zählt Chymotrypsinverdauen oder Aufspalten an einem Glu-Rest mit V8-Protease, aber sie sind nicht auf diese Beispiele beschränkt, so lange die zuvor beschriebene Wirkung eintritt.According to the present invention, the enzyme treatment for digesting the peptide is carried out with an enzyme. These treatments include chymotrypsin digestion or cleavage on a Glu residue with V 8 protease, but they are not limited to these examples as long as the effect described above occurs.
Anschließend wird als Mittel zum Immobilisieren der Peptid fragmente jedes entstandene Fragment mit einem festen Träger umge setzt, der eine funktionelle Gruppe besitzt, die zum Reagieren mit einer freien Aminogruppe des entstandenen Fragments unter Ausbildung einer kovalenten Bindung zum Immobilisieren der Peptidfragmente mit einer freien α-Aminogruppe in der Lage ist; es wird mit einer Lösung zum Eluieren eines N-terminalen blockierten Peptidfragments (im folgenden als Eluent bezeichnet), die Trifluoressigsäure (TFA) etc. zum Sammeln der N-terminal blockierten Peptidfragmente enthält, gespült.It is then used as a means of immobilizing the peptide fragments each resulting fragment with a solid support who has a functional group that is able to react with a free amino group of the resulting fragment under formation a covalent bond to immobilize the peptide fragments is capable of a free α-amino group; it comes with a solution to elute an N-terminal blocked peptide fragment (im hereinafter referred to as eluent), trifluoroacetic acid (TFA) etc. for collecting the N-terminally blocked peptide fragments, rinsed.
In vorliegender Erfindung ist eine funktionelle Gruppe, die in der Lage ist, mit einer freien Aminogruppe unter Ausbildung einer kovalenten Bindung zu reagieren, beispielsweise die Imid-, Aldehyd-, Cyan-, Acetyl-, Succinyl-, Maleyl- und Isothiocyanatgruppe, wobei die Isothiocyanatgruppe mit Hinblick auf ihre spezifische Reaktivi tät mit der Aminogruppe bevorzugt wird. Auch ist der feste Träger mit solchen funktionellen Gruppen ein fester Träger, der aus einem Material, wie poröses Glas, Silicagel oder Polystyrol, beispiels weise DITC-Polyvinylalkohol besteht. Gemäß vorliegender Erfindung werden die Peptidfragmente auf eine Säule aufgebracht, die mit einem festen Träger zum Immobilisieren der Peptidfragmente gepackt ist.In the present invention is a functional group which in is able to form a free amino group to form a to react covalent bond, for example the imide, aldehyde, Cyan, acetyl, succinyl, maleyl and isothiocyanate group, wherein the isothiocyanate group with regard to their specific reactivities is preferred with the amino group. Also is the solid support with such functional groups a solid support that consists of a Material such as porous glass, silica gel or polystyrene, for example there is DITC polyvinyl alcohol. According to the present invention the peptide fragments are applied to a column, which with a solid support for immobilizing the peptide fragments is packed.
Als Mittel zum Sammeln eines nicht-immobilisierten N-terminal blockierten Peptidfragments wird die entstandene Reaktionsmischung mit einem Eluent, das Trifluoressigsäure (TFA) etc. enthält, gewa schen, um das N-terminal blockierte Peptidfragment auf einer Poly mermembran oder einem Glasfaserfilter zu sammeln. Da insbesondere die α-Aminogruppe des N-terminalen Peptidfragments blockiert ist und da die ε-Aminogruppe des Lys in dem Fragment acetyliert ist, wird das N-terminal blockierte Peptidfragment nicht auf dem festen Träger gebunden. Das Eluent wird auf die Säule gegeben und das N-terminal blockierte Peptidfragment wird im Eluent eluiert. Dieses N-terminal blockierte Peptidfragment wird in einer Gewinnungsflasche gesammelt, die die Polymermembran oder das Glasfaserfilter besitzt, die mit einer Carboxygruppe reagieren können. In der vorliegenden Erfindung wird die Säule mit der Gewinnungsflasche über eine Fluidleitung verbunden, um das Eluat von der Säule in die Gewinnungsflasche zu leiten.As a means of collecting a non-immobilized N-terminal blocked peptide fragment becomes the resulting reaction mixture with an eluent containing trifluoroacetic acid (TFA) etc., wa around the N-terminally blocked peptide fragment on a poly membrane or a glass fiber filter. Because in particular the α-amino group of the N-terminal peptide fragment is blocked and since the ε-amino group of the Lys is acetylated in the fragment the N-terminally blocked peptide fragment was not on the solid support bound. The eluent is placed on the column and the N-terminal blocked peptide fragment is eluted in the eluent. This N-terminal blocked peptide fragment is collected in a recovery bottle, which has the polymer membrane or the glass fiber filter with a carboxy group can react. In the present invention the column with the extraction bottle is connected to a fluid line connected to the eluate from the column into the recovery bottle conduct.
In der vorliegenden Erfindung ist die mit einer Aminogruppe derivatisierte Polymermembran beispielsweise die Allylaminmembran PVDF (Polyvinylidendifluorid) (Sequelon-AATM, hergestellt durch MilliGen). Die als Stoff für den Glasfaserfilter mit einer Amino gruppe derivatisierte Trägerglasfaser ist beispielsweise ein Amino propylglas und/oder Aminophenylglas. Die Polymermembrangröße, bei spielsweise bevorzugt 8 bis 10 mm Durchmesser, ist nicht beschränkt, so lange die Polymermembran als solche in der Gewinnungsflasche zum Fraktionssammeln eingebracht und als solche in der Reaktionskammer patrone des Sequenzierers eingesetzt werden kann.In the present invention, the polymer membrane derivatized with an amino group is, for example, the allylamine membrane PVDF (polyvinylidene difluoride) (Sequelon-AA ™ , manufactured by MilliGen). The carrier glass fiber derivatized as a material for the glass fiber filter with an amino group is, for example, an amino propyl glass and / or aminophenyl glass. The polymer membrane size, for example preferably 8 to 10 mm in diameter, is not limited as long as the polymer membrane as such is introduced into the extraction bottle for fraction collection and can be used as such in the reaction chamber of the sequencer.
Anschließend wird als Mittel zum Immobilisieren des gesammelten N-terminal blockierten Peptidfragments wasserlösliches Carbodiimid (1-Ethyl-3-(3′-dimethylaminopropyl)carbodiimid HCl; EDC) auf die Polymermembran oder den Glasfaserfilter gegeben, nachdem das N- terminal blockierte Peptidfragment gesammelt wurde und die Membran oder der Glasfaserfilter für eine Weile stehengelassen wurde, wonach es mit Acetonitril gewaschen und anschließend getrocknet wird. Durch diese Behandlung wird das N-terminal blockierte Peptidfragment auf der Membran oder dem Glasfaserfilter über die C-terminale Carbox ylgruppe des N-terminal blockierten Peptidfragments oder die Seiten kettencarboxylgruppe des Asp (Asparginsäure) und/oder Glu (Glutamin säure) des N-terminal blockierten Peptidfragments immobilisiert.It is then collected as a means of immobilizing the N-terminally blocked peptide fragment water-soluble carbodiimide (1-Ethyl-3- (3'-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl; EDC) on the Polymer membrane or the glass fiber filter after the N- Terminally blocked peptide fragment was collected and the membrane or the glass fiber filter has been left for a while, after which it is washed with acetonitrile and then dried. By this treatment will target the N-terminally blocked peptide fragment the membrane or the glass fiber filter via the C-terminal carbox yl group of the N-terminally blocked peptide fragment or the sides chain carboxyl group of Asp (aspartic acid) and / or Glu (glutamine acid) of the N-terminally blocked peptide fragment.
Wenn das durch ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung gewonnene N-terminal blockierte Peptidfragment, das auf der Polymer membran oder dem Glasfaserfilter immobilisiert ist, eine Acetyl gruppe besitzt, wird es mit einem Acylamino Acid-Releasing EnzymTM (leicht im Handel von Takara Shuzo, P/N 7301 erhältlich) behandelt. Obwohl von dem Acylaminosäure freisetzendem Enzym bekannt ist, daß es nicht auf Proteine mit hohem Molekulargewicht wirkt, kann es zum Behandeln von Spaltfragmenten, wie das zuvor beschriebene immobili sierte N-terminal blockierte Peptidfragment, verwendet werden.If the N-terminally blocked peptide fragment obtained by a method according to the present invention, which is immobilized on the polymer membrane or on the glass fiber filter, has an acetyl group, it is treated with an acylamino acid-releasing enzyme TM (readily available from Takara Shuzo, P. / N 7301 available) treated. Although the enzyme releasing acylamino acid is known not to act on high molecular weight proteins, it can be used to treat cleavage fragments, such as the immobilized N-terminally blocked peptide fragment described above.
Nach der obigen Enzymbehandlung wird die Polymermembran oder der Glasfaserfilter mit einer Waschflüssigkeit, die wäßriges Aceto nitril oder wäßriges Methanol enthält, gewaschen, um die Reagenzien einschließlich des Enzyms zu entfernen, und anschließend in die Reaktionskammerpatrone des Proteinsequenzierers eingesetzt.After the above enzyme treatment, the polymer membrane or the glass fiber filter with a washing liquid, the aqueous aceto Contains nitrile or aqueous methanol, washed to the reagents including removing the enzyme, and then into the Reaction chamber cartridge of the protein sequencer used.
Wenn das N-terminal blockierte Peptidfragment, das auf der Polymermembran oder dem Glasfaserfilter immobilisiert ist, die Formyl- und/oder Pyroglutamylgruppe besitzt, kann jedes als Vor behandlung vor der Aminosäuresequenzanalyse durch einen Sequenzierer mit Salzsäure oder Hydrazin oder dergleichen, um die blockierenden Gruppe der N-terminalen α-Aminogruppe zu entfernen, behandelt wer den. Wenn das N-terminal blockierte Peptidfragment die Pyroglutamyl gruppe besitzt, ist es ebenso möglich, es mit einem Enzym zu behan deln, um die blockierende Gruppe der N-terminalen α-Aminogruppe zu entfernen.If the N-terminally blocked peptide fragment that is on the Polymer membrane or the glass fiber filter is immobilized, the Formyl and / or pyroglutamyl group, each can be as a pre treatment by a sequencer before amino acid sequence analysis with hydrochloric acid or hydrazine or the like to block Remove group of the N-terminal α-amino group, treated who the. When the N-terminal blocked peptide fragment the pyroglutamyl group, it is also possible to treat it with an enzyme to the blocking group of the N-terminal α-amino group remove.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Arbeits beispiele in näheren Einzelheiten beschrieben, aber die vorliegende Erfindung wird durch sie nicht eingeschränkt.The present invention will work through the following examples described in more detail, but the present They do not limit invention.
Das Verfahren zum Sammeln eines N-terminalen Peptidfragments gemäß vorliegender Erfindung wird mit Bezug auf die Fig. 1 und 2 erläutert.The method for collecting an N-terminal peptide fragment according to the present invention will be explained with reference to FIGS. 1 and 2.
Fig. 1 zeigt ein schematisches Diagramm, das den Verfahrens ablauf des N-terminalen Peptidfragmentsammelns gemäß vorliegender Erfindung darstellt. Fig. 1 shows a schematic diagram illustrating the process of N-terminal peptide fragment collection according to the present invention.
Fig. 2 zeigt ein schematisches Diagramm der Vorrichtung zum N- terminal Peptidfragmentesammeln und dessen erfindungsgemäße Immobi lisierung. Fig. 2 shows a schematic diagram of the device for N-terminal peptide fragment collection and its immobilization according to the invention.
Zuerst wird die ε-Aminogruppe des Lys im gewünschten Protein, dessen N-terminale α-Aminogruppe mit einer Acetylgruppe blockiert wurde, mit Acetylimidazol, Essigsäureanhydrid oder ähnlichem bei Raumtemperatur über etwa 20 Minuten acetyliert. Insbesondere wurde zu der Proteinlösung Essigsäureanhydrid unter starkem Rühren zu getropft. Anschließend wurde die Mischung gefriergetrocknet. Darauf wurde eine chemische und/oder Enzymbehandlung gemäß eines herkömm lichen Verfahrens [H.V. Huang, Method in Enzymology, 91, 318 (1983); W.C. Mahoney et al., Biochem., 20, 443, (1981); S.M. Zingde et al., Anal. Biochem., 115, 10, (1986); K.A. Thomas et al., J. Biol. Chem. 256, 9156, (1981)] oder ein Verfahren, das in einem bekannten, von Enzymherstellern (z. B. Boehriner Mannheim, Takara Shuzo, Warington Enzyme) zur Verfügung gestellten Protokoll beschrieben ist, durch geführt. In einem Verfahren wird beispielsweise das acetylierte Protein in 50 mM Tris-HCl Puffer (pH-Wert 0,8) gelöst und mit TPCK- Trypsin bei 37°C über 18 Stunden verdaut und die Reaktion bei 100°C über 5 Minuten beendet. Das Protein wurde an den Arg-Resten gespal ten. In einem anderen Verfahren wurde das in 25 mM Ammoniumbicarbo nat-Puffer (pH-Wert 7,8) gelöste acetylierte Protein mit S. aureus V8-Protease bei 25°C über 18 Stunden verdaut. Die Reaktion wurde durch Erwärmen auf 100°C über 3 Minuten beendet. Das Protein wurde an den Glu-Resten gespalten.First, the ε-amino group of the Lys in the desired protein whose N-terminal α-amino group has been blocked with an acetyl group is acetylated with acetylimidazole, acetic anhydride or the like at room temperature for about 20 minutes. In particular, acetic anhydride was added dropwise to the protein solution with vigorous stirring. The mixture was then freeze-dried. Then chemical and / or enzyme treatment according to a conventional method [HV Huang, Method in Enzymology, 91, 318 (1983); WC Mahoney et al., Biochem., 20, 443, (1981); SM Zingde et al., Anal. Biochem., 115, 10, (1986); KA Thomas et al., J. Biol. Chem. 256, 9156, (1981)] or a method described in a known protocol provided by enzyme manufacturers (e.g. Boehriner Mannheim, Takara Shuzo, Warington Enzyme) is carried out. In one method, for example, the acetylated protein is dissolved in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 0.8) and digested with TPCK-trypsin at 37 ° C. for 18 hours and the reaction is ended at 100 ° C. for 5 minutes. The protein was cleaved at the Arg residues. In another method, the acetylated protein dissolved in 25 mM ammonium bicarbonate buffer (pH 7.8) was S. aureus V 8 protease at 25 ° C. for 18 hours digested. The reaction was stopped by heating at 100 ° C for 3 minutes. The protein was cleaved at the Glu residues.
Darauf wurde die so gewonnene Reaktionsmischung in eine Säule, die mit DITC-CPG (DITC-Perlen, hergestellt durch Sigma Corporation, siehe JP-OS Nr. 235600/1989) gepackt war, injiziert, und die Atmo sphäre des Reaktionssystems wurde durch N2 ersetzt, gefolgt durch eine Kupplungsreaktion über etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur. Diese Reaktion wird bevorzugt in der Säule eines Reaktors 1 ausgeführt, der mit einer Heizung ausgerüstet ist, um optimale Reaktionsbedin gungen bei 30°C bis 60°C, bevorzugt bei 48°C über 1 Stunde zu ge währleisten. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Säule mit einem Eluent (50% Acetonitril/2-propanol-Lösung (3/7 Volumenverhältnis), die 0,1% Trifluoressigsäure enthält) gewaschen, um das N-terminal blockierte Peptidfragment zu sammeln. Das N-terminal blockierte Peptidfragment wurde im Eluent eluiert und in einer Gewinnungsfla sche 2 über eine Fluidleitung 3 gewonnen. Die Fragmente außer dem N- terminal blockierten Peptidfragment wurden so auf dem festen Träger (DITC-Perlen) durch ihre α-Aminogruppen immobilisiert. Then, the reaction mixture thus obtained was injected into a column packed with DITC-CPG (DITC beads manufactured by Sigma Corporation, see JP-OS No. 235600/1989), and the atmosphere of the reaction system was purified by N 2 replaced, followed by a coupling reaction for about 1 hour at room temperature. This reaction is preferably carried out in the column of a reactor 1 which is equipped with a heater in order to ensure optimal reaction conditions at 30 ° C. to 60 ° C., preferably at 48 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, the column was washed with an eluent (50% acetonitrile / 2-propanol solution (3/7 volume ratio) containing 0.1% trifluoroacetic acid) to collect the N-terminally blocked peptide fragment. The N-terminally blocked peptide fragment was eluted in the eluent and obtained in a recovery bottle 2 via a fluid line 3 . The fragments other than the N-terminally blocked peptide fragment were thus immobilized on the solid support (DITC beads) by their α-amino groups.
Da andererseits das N-terminal blockierte peptidfragmenthaltige Eluat in der Gewinnungsflasche 2 Reagenzien, Detergenz und anderes, die für die chemische und/oder Enzymbehandlung verwendet werden, enthielt, wurde die Gewinnungsflasche 2 mit einem N2-Gasstrom, der aus der mit der Gewinnungsflasche 2 verbundenen N2-Spülleitung 4 abgegeben wird, gespült, um das Eluat zu verdampfen und zu trocknen, das das N-terminal blockierte Peptidfragment gelöst enthält. Im folgenden wurde die Gewinnungsflasche 2 in einen Heizblock 6 gesetzt und bei 55°C über 10 Minuten gehalten, worauf weiter mit N2 gespült, um das Lösungsmittel zu entfernen und auf Raumtemperatur abgekühlt.On the other hand, since the N-terminally blocked peptide fragment-containing eluate in the recovery bottle 2 contained reagents, detergent and others used for the chemical and / or enzyme treatment, the recovery bottle 2 was charged with an N 2 gas flow from that with the recovery bottle 2 connected N 2 purge line 4 is flushed to evaporate and dry the eluate, which contains the N-terminally blocked peptide fragment dissolved. Subsequently, the recovery bottle 2 was placed in a heating block 6 and held at 55 ° C for 10 minutes, followed by further flushing with N 2 to remove the solvent and cooled to room temperature.
Während sich eine Membran 5 in der Gewinnungsflasche 2 befin det, wurden 30 bis 50% Acetonitril (nicht mehr als 30 µl) hinzuge geben. Anschließend wurde 15 µl eines Reaktionsagenz (0,1 M 4-Mor pholinethansulfonsäure (MES), pH-Wert 5,0, 15% Acetonitril, 10 mg/ml wasserlösliches Carbodiimid (1-Ethyl-3-(3′-dimethylaminopro pyl)carbodiimid HCl; EDC) zugegeben und die Mischung bei Raumtempe ratur über 20 Minuten stehen gelassen. Nach dieser Behandlung wurde das N-terminal blockierte Peptidfragment über die C-terminalen Carboxylgruppen im N-terminalen Peptidfragment und teilweise über die Seitenkettencarboxylgruppen der Asp (Asparaginsäure) und/oder Glu (Glutaminsäure) im N-terminalen Peptidfragmente auf der Membran 5 immobilisiert.While a membrane 5 is in the extraction bottle 2 , 30 to 50% acetonitrile (not more than 30 μl) was added. 15 μl of a reaction agent (0.1 M 4-morpholineethanesulfonic acid (MES), pH 5.0, 15% acetonitrile, 10 mg / ml water-soluble carbodiimide (1-ethyl-3- (3′-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl; EDC) was added and the mixture was left to stand at room temperature for 20 minutes After this treatment, the N-terminally blocked peptide fragment was transferred via the C-terminal carboxyl groups in the N-terminal peptide fragment and partly via the side chain carboxyl groups of Asp (aspartic acid) and / or Glu (glutamic acid) immobilized in the N-terminal peptide fragments on the membrane 5 .
Darauf wurde die Membran 5 herausgenommen und mehrmals abwech selnd mit Methanol und destilliertem Wasser gewaschen und dann gespült oder getrocknet. Darauf wurde das zuvor beschriebene Acyla mino Acid-Releasing EnzymTM (hergestellt durch Takara Shuzo, P/N 7301) hinzugegeben, um die N-terminale Aminosäure zu entfernen. Insbesondere wurde der Membran ein 1 mM DTT und Acylamino Acid- Releasing Enzyme haltiger 0,2 M PO4-Puffer (pH-Wert 7,2) zugegeben und bei 37°C über 12 Stunden inkubiert. Die Membran 5 wurde weiter hin mit Wasser und Methanol gewaschen und dann dem Proteinsequenzie rer (Modell PPSQ-10, Shimadzu Corporation) zugeführt. Als Ergebnis wurde die Aminosäuresequenz, beginnend bei dem zweiten Aminosäure rest vom N-Terminus, bestimmt.The membrane 5 was then removed and alternately washed several times with methanol and distilled water and then rinsed or dried. Then the Acyla mino Acid-Releasing Enzyme TM described above (manufactured by Takara Shuzo, P / N 7301) was added to remove the N-terminal amino acid. In particular, a 0.2 mM PO 4 buffer (pH 7.2) containing 1 mM DTT and acylamino acid-releasing enzyme was added to the membrane and incubated at 37 ° C. for 12 hours. The membrane 5 was further washed with water and methanol and then fed to the protein sequencer (model PPSQ-10, Shimadzu Corporation). As a result, the amino acid sequence starting from the second amino acid residue from the N-terminus was determined.
Die vorliegende Erfindung ist so beschrieben, daß offensicht lich ist, daß sie vielfach abgewandelt werden kann. Diese Variatio nen können nicht als Abweichung vom Geist und Umfang der Erfindung angesehen werden, und alle Abweichungen, die für den Fachmann offen sichtlich sind, sollen vom Schutzbereich der folgenden Ansprüche erfaßt werden.The present invention is described so that obvious Lich is that it can be modified in many ways. This variation Neither can be considered a departure from the spirit and scope of the invention are considered, and all deviations that are open to the expert are intended to be within the scope of the following claims be recorded.
Claims (6)
- a) Acetylierung der ε-Aminogruppe des Lys in einem Protein, dessen N-terminale ε-Aminogruppe blockiert ist, um ein ε-acetylier tes Protein zu ergeben;
- b) Aufspalten des in Stufe a) erhaltenen ε-acetylierten Proteins, um Peptidfragmente zu ergeben;
- c) Umsetzen der in Stufe b) erhaltenen Peptidfragmente mit einem festen Träger, der eine funktionelle Gruppe aufweist, die zur Umsetzung mit einer freien Aminogruppe unter Ausbildung einer kova lenten Bindung fähig ist, um die Peptidfragmente mit einer freien Aminogruppe zu immobilisieren;
- d) Sammeln eines N-terminal blockierten Peptidfragments, das in Stufe c) nicht immobilisiert wurde, auf einer Polymermembran oder einem Glasfaserfilter, die mit einer Carboxylgruppe reagieren kön nen; und
- e) Immobilisieren des in Stufe d) gesammelten N-terminal blockierten Peptidfragments auf der Polymermembran oder Glasfaser filter.
- a) acetylation of the ε-amino group of the lys in a protein whose N-terminal ε-amino group is blocked to give an ε-acetylated protein;
- b) splitting the ε-acetylated protein obtained in step a) to give peptide fragments;
- c) reacting the peptide fragments obtained in step b) with a solid support which has a functional group which is capable of reaction with a free amino group to form a covalent bond in order to immobilize the peptide fragments with a free amino group;
- d) collecting an N-terminally blocked peptide fragment, which was not immobilized in step c), on a polymer membrane or a glass fiber filter which can react with a carboxyl group; and
- e) Immobilizing the N-terminally blocked peptide fragment collected in step d) on the polymer membrane or glass fiber filter.
einer Säule, gepackt mit einem festen Träger, der eine funktio nelle Gruppe, die zum Reagieren mit einer freien Aminogruppe unter Ausbildung einer kovalenten Bindung fähig ist, besitzt;
einem Mittel zum Aufbringen von Peptidfragmenten auf die Säule, wobei die Peptidfragmente durch Aufspalten eines Proteins gewonnen werden, dessen N-terminale α-Aminogruppe blockiert und die ε-Amino gruppe des Lys des Proteins acetyliert sind;
einem Mittel zum Aufbringen eines Eluents auf die Säule;
einer Gewinnungsflasche mit einer Polymermembran oder einem Glasfaserfilter, die mit einer Carboxylgruppe reagieren können;
einer Fluidleitung, die die Säule mit der Gewinnungsflasche verbindet, um das Eluat von der Säule zu der Gewinnungsflasche zu leiten;
einem Mittel zum Immobilisieren des Peptidfragments auf einem festen Träger in der Säule;
einem Mittel zum Sammeln des N-terminal blockierten Peptid fragments im Eluat, das nicht auf dem festen Träger, auf der Poly mermembran oder dem Glasfaserfilter in der Gewinnungsflasche immobi lisiert ist; und
einem Mittel zum Immobilisieren des gesammelten N-terminal blockierten Peptidfragments auf der Polymermembran oder dem Glasfa serfilter in der Gewinnungsflasche.6. Device for collecting an N-terminal peptide fragment, comprising:
a column packed with a solid support having a functional group capable of reacting with a free amino group to form a covalent bond;
a means for applying peptide fragments to the column, the peptide fragments being obtained by splitting a protein whose N-terminal α-amino group is blocked and the ε-amino group of the lys of the protein are acetylated;
a means for applying an eluent to the column;
a recovery bottle with a polymer membrane or a glass fiber filter that can react with a carboxyl group;
a fluid line connecting the column to the recovery bottle to direct the eluate from the column to the recovery bottle;
means for immobilizing the peptide fragment on a solid support in the column;
a means for collecting the N-terminally blocked peptide fragment in the eluate which is not immobilized on the solid support, on the polymer membrane or on the glass fiber filter in the recovery bottle; and
a means for immobilizing the collected N-terminally blocked peptide fragment on the polymer membrane or the glass fiber filter in the recovery bottle.
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