JP3353278B2 - Method for fractionating peptide N-terminal fragment - Google Patents

Method for fractionating peptide N-terminal fragment

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Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、タンパク質やペプチド
のアミノ末端（以下、Ｎ末端と略す）フラグメントを分
取することからなる、ペプチドＮ末端フラグメントの分
取方法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for separating N-terminal fragments of a peptide, which comprises separating amino-terminal (hereinafter abbreviated as N-terminal) fragments of proteins and peptides.

【０００２】[0002]

【従来の技術・発明が解決しようとする課題】従来、ペ
プチドのＮ末端およびＣ末端のアミノ酸配列の分析を行
うこと等を目的とするペプチド末端のフラグメントの分
取において、メカニカルロスやコンタミネーションが起
きやすいこと、さらに、操作が煩雑であることや比較的
多量のサンプルが必要なこと、配列決定に不確実性が生
じる等の問題点を有している。これらの欠点を克服した
改良方法として、Ｃ末端ペプチドの分取方法としては、
ペプチドをＬｙｓ−Ｃ特異切断酵素により切断処理した
後、生じた各フラグメントのαアミノ基およびεアミノ
基と反応して共有結合を形成しうる官能基を有する固体
に結合させ、次いで各ペプチドのαアミノ末端アミノ酸
残基と隣接するアミノ酸残基との間のペプチド結合を酸
処理により切断し、遊離のＣ末端ペプチドを分取する方
法（特開平１−２３５６００号公報）が知られており、
さらに同公報には、この分取方法により得られたＣ末端
ペプチドを用いて各種アミノ酸配列分析法によりアミノ
酸配列分析が可能であると開示されている。2. Description of the Related Art Conventionally, in the separation of peptide terminal fragments for the purpose of analyzing amino acid sequences at the N-terminal and C-terminal of a peptide, mechanical loss and contamination have been considered. It has problems that it is likely to occur, that the operation is complicated, that a relatively large amount of sample is required, and that there is uncertainty in sequencing. As an improved method for overcoming these drawbacks, as a method for fractionating a C-terminal peptide,
After the peptide is cleaved with a Lys-C-specific cleavage enzyme, the resulting fragment is bound to a solid having a functional group capable of forming a covalent bond by reacting with the α-amino group and ε-amino group of each fragment. A method is known in which a peptide bond between an amino-terminal amino acid residue and an adjacent amino acid residue is cleaved by an acid treatment to separate a free C-terminal peptide (Japanese Patent Laid-Open No. 1-235600).
Further, the publication discloses that amino acid sequence analysis can be performed by various amino acid sequence analysis methods using the C-terminal peptide obtained by this fractionation method.

【０００３】しかしながら、Ｎ末端ペプチドの分取方法
においては、前記の問題点が未だ充分解決されていると
はいえない。すなわち、サンプルが微量である場合、Ｎ
末端ペプチドの分取が困難であり、分取後のアミノ酸の
配列分析を最後まで完全に行うことができないという欠
点やメカニカルロス、コンタミネーションの発生といっ
た問題点が解決されておらず、これらを解決したＮ末端
ペプチドの分取方法の開発および一連の操作が自動化さ
れた実用的なＮ末端ペプチド分取装置の開発が望まれて
いる。[0003] However, in the method for fractionating an N-terminal peptide, the above problems cannot be said to be sufficiently solved. That is, if the sample is very small, N
Solving the drawbacks of difficulties in terminal peptide separation and the inability to completely analyze the sequence of amino acids after completion, and the problems of mechanical loss and contamination, have been solved. Development of a method for fractionating the N-terminal peptide described above and development of a practical N-terminal peptide fractionation apparatus in which a series of operations are automated are desired.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】前記問題点を解決し、微
量なサンプルであっても完全かつ効率よくペプチドの分
取を行うとともに、引き続きアミノ酸配列の分析を行う
ことが可能で、しかも簡便な方法であるペプチドＮ末端
フラグメントの分取方法について鋭意検討した結果、本
発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems In order to solve the above problems, it is possible to carry out complete and efficient fractionation of a peptide even in a small amount of sample, and to continue analysis of an amino acid sequence. As a result of intensive studies on the method for fractionating the peptide N-terminal fragment, the present invention has been completed.

【０００５】即ち、本発明は、アミノ末端（Ｎ末端）の
αアミノ基がブロックされたペプチドにおいて、Ｌｙｓ
のεアミノ基をアセチル化し、該アセチル化体を化学的
処理および／または酵素的処理を行い、得られた各フラ
グメントのαアミノ基およびＬｙｓのεアミノ基と反応
して共有結合を形成しうる官能基を有する固体と各フラ
グメントとを反応させ、次いで遊離のＮ末端フラグメン
トをアリルアミン型官能基で誘導体化されたポリマーの
膜またはガラス繊維濾紙上で分取し、分取されたＮ末端
フラグメントを水溶性カルボジイミド等を用いて該Ｎ末
端フラグメント中のカルボキシル基を介して、該ポリマ
ーの膜または該ガラス繊維濾紙上に共有結合により固定
化することを特徴とする、ペプチドＮ末端フラグメント
の分取方法に関する。That is, the present invention relates to a peptide in which the α-amino group at the amino terminus (N-terminus) is blocked.
Is acetylated, and the acetylated product is subjected to a chemical treatment and / or an enzymatic treatment, and can react with the α-amino group of each of the obtained fragments and the ε-amino group of Lys to form a covalent bond. The solid having a functional group is reacted with each fragment, and the free N-terminal fragment is then fractionated on a polymer membrane or glass fiber filter paper derivatized with an allylamine-type functional group, and the fractionated N-terminal fragment is separated. A method for fractionating an N-terminal fragment of a peptide, comprising immobilizing a covalent bond on the polymer membrane or the glass fiber filter paper through a carboxyl group in the N-terminal fragment using a water-soluble carbodiimide or the like. About.

【０００６】以下に、本発明を具体的に説明する。本発
明の方法では、まず、Ｎ末端のαアミノ基がブロックさ
れた目的のペプチド（タンパク質）の、Ｌｙｓのεアミ
ノ基をアセチルイミダゾールまたは無水酢酸等でアセチ
ル化を行なう。ここで、無水酢酸を用いた場合、後述の
Ｎ2 パージによりほぼ完全に除去が可能である。Hereinafter, the present invention will be described specifically. In the method of the present invention, first, the ε-amino group of Lys of the target peptide (protein) in which the α-amino group at the N-terminal is blocked is acetylated with acetylimidazole or acetic anhydride. Here, when acetic anhydride is used, it can be almost completely removed by N 2 purging described later.

【０００７】次に、化学的および／または酵素的処理を
行う。本発明において公知の化学的処理とは、化学的手
法によりペプチドのクリーベイジを行う処理をさす。該
処理として具体的には、例えばＣＮＢｒによるＭｅｔ残
基での切断や、ＣＮＢｒ−ＤＭＳＯ−ＨＣｌによるＴｒ
ｐ残基での切断等が挙げられるが、前記の作用を有する
ものであれば特に限定されるものではない。本発明にお
いて酵素的処理とは、酵素を用いてペプチドのクリーベ
イジを行う処理をさす。該処理として具体的には、例え
ばキモトリプシン分解や、Ｖ8 プロテアーゼによるＧｌ
ｕ残基での開裂等が挙げられるが、前記の作用を有する
ものであれば特に限定されるものではない。Next, a chemical and / or enzymatic treatment is performed. The known chemical treatment in the present invention refers to a treatment for cleave of a peptide by a chemical technique. Specifically, the treatment may be, for example, cleavage at a Met residue with CNBr, or TrTr with CNBr-DMSO-HCl.
Cleavage at the p residue may be mentioned, but is not particularly limited as long as it has the above action. In the present invention, the enzymatic treatment refers to a treatment for cleaving a peptide using an enzyme. Specific examples the process, and for example chymotrypsin degradation, Gl by V 8 protease
Cleavage at the u residue may be mentioned, but is not particularly limited as long as it has the above-mentioned action.

【０００８】次に、得られた各フラグメントのαアミノ
基およびＬｙｓのεアミノ基と反応して共有結合を形成
しうる官能基を有する固体と各フラグメントとを反応さ
せ固定化し、トリフルオロ酢酸等を含有する洗浄液で洗
浄を行う。本発明においてアミノ基と反応して共有結合
を形成しうる官能基とは、イミド基、アルデヒド基、シ
アノ基、アセチル基、サクシニル基、マレイル基、イソ
チオシアナート基等が挙げられるが、アミノ基との特異
的反応性の点から、ならびに結合後の特異的切断の目的
からイソチオシアナート基が好適である。また、該官能
基を有する固体とは固体担体をさし、例えば、多孔性ガ
ラス、シリカゲル、ポリスチレン等の材質のものが挙げ
られ、具体的にはＤＩＴＣ−ポリスチレン等が挙げられ
る。Next, a solid having a functional group capable of forming a covalent bond by reacting with the α-amino group of each of the obtained fragments and the ε-amino group of Lys is reacted with each of the fragments to be immobilized. Is washed with a washing solution containing The functional group capable of forming a covalent bond by reacting with an amino group in the present invention includes an imide group, an aldehyde group, a cyano group, an acetyl group, a succinyl group, a maleyl group, an isothiocyanate group, and the like. An isothiocyanate group is preferred from the viewpoint of specific reactivity with and for the purpose of specific cleavage after binding. Further, the solid having the functional group means a solid carrier, for example, a material such as porous glass, silica gel, and polystyrene, and specifically, DITC-polystyrene and the like.

【０００９】Ｎ末端フラグメントは、αアミノ基がブロ
ックされており、また、Ｌｙｓのεアミノ基がアセチル
化されているので、前記反応により固定化されず、遊離
のＮ末端フラグメントとして洗浄後の液中に溶出する。
これを回収する目的で、遊離のＮ末端フラグメントをア
リルアミン型官能基で誘導体化されたポリマーの膜また
はガラス繊維濾紙上で分取する。本発明においてアミノ
基で誘導体化されたポリマーの膜またはガラス繊維濾紙
とは、例えば、具体的にはポリマーの膜としては、アリ
ルアミンメンブランであるＰＶＤＦ (ポリビニリデンダ
イフルオライド)(Sequelon AA TM、Milligen社)等が、
ガラス繊維濾紙の材料である担体ガラス繊維としては、
アミノプロピルグラス、アミノフェニルグラス等が挙げ
られる。また、ポリマーの膜のサイズは８〜１０ｍｍφ
が良く、フラクションを分取するバイアル内にそのまま
装填でき、そのままシーケンサーのリアクションチェン
バーカートリッジに入る大きさであればよい。Since the N-terminal fragment has an α-amino group blocked and the ε-amino group of Lys is acetylated, the N-terminal fragment is not immobilized by the above-mentioned reaction, and becomes a free N-terminal fragment after washing. Elutes in.
To recover this, the free N-terminal fragment is fractionated on a polymer membrane or glass fiber filter paper derivatized with an allylamine-type functional group. The film or glass fiber filter paper derivatized polymer with amino group in the present invention, for example, the film of the specific polymer, PVDF allyl amine membrane (polyvinylidene die fluoride) (Sequelon AA TM, Milligen Company)
As the carrier glass fiber which is the material of the glass fiber filter paper,
Aminopropyl glass, aminophenyl glass and the like can be mentioned. The size of the polymer film is 8 to 10 mmφ.
Any size can be used as long as it can be directly loaded into the vial for fraction collection and can be directly loaded into the reaction chamber cartridge of the sequencer.

【００１０】次に、分取後のポリマーの膜またはガラス
繊維濾紙に水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ））を加えて
しばらくの間放置した後、該膜（またはガラス繊維濾
紙）をアセトニトリルで洗浄し、乾燥させる。このと
き、Ｎ末端フラグメント中のＣ末端カルボキシル基もし
くは該フラグメント中のＡｓｐ（アスパラギン酸）およ
び／またはＧｌｕ（グルタミン酸）の側鎖カルボキシル
基を介して膜に固定化される。Next, water-soluble carbodiimide (EDC)) is added to the polymer membrane or glass fiber filter paper after the separation, and the membrane (or glass fiber filter paper) is washed with acetonitrile and dried. Let it. At this time, it is immobilized on the membrane via the C-terminal carboxyl group in the N-terminal fragment or the side chain carboxyl group of Asp (aspartic acid) and / or Glu (glutamic acid) in the fragment.

【００１１】尚、本発明の方法により得られた、該ポリ
マーの膜または該ガラス繊維濾紙上に固定化されたペプ
チドＮ末端フラグメントがアセチル基を有する場合は、
アシルアミノ酸遊離酵素（Acylamino acid-releasing e
nzyme)（宝酒造より市販されているので容易に入手可能
である）により、該ポリマーの膜（または該ガラス繊維
濾紙）に固定化されたペプチドＮ末端フラグメントを処
理する。アシルアミノ酸遊離酵素は、分子の大きいタン
パク質には作用しないことが知られているので、上述の
固定化されたペプチドＮ末端フラグメントのように断片
化されたフラグメントに用いることが可能である。前記
酵素処理の後、該ポリマーの膜（または該ガラス繊維濾
紙）の膜上の酵素残渣を洗浄液（含水アセトニトリルま
たは含水メタノール）により洗い流してから、バイアル
内にそのまま装填して、シーケンサーのリアクションチ
ェンバーカートリッジに挿入することができる。When the peptide N-terminal fragment immobilized on the polymer membrane or the glass fiber filter obtained by the method of the present invention has an acetyl group,
Acylamino acid-releasing e
nzyme) (commercially available from Takara Shuzo) to treat the peptide N-terminal fragment immobilized on the polymer membrane (or the glass fiber filter paper). Acyl amino acid releasing enzyme is known not to act on large-molecule proteins, and thus can be used for fragmented fragments such as the immobilized peptide N-terminal fragment described above. After the enzymatic treatment, the enzyme residue on the membrane of the polymer membrane (or the glass fiber filter paper) is washed away with a washing solution (aqueous acetonitrile or hydrated methanol), and then directly loaded into a vial, and a reaction chamber cartridge of a sequencer is used. Can be inserted.

【００１２】また、シーケンサーによる分析を行う際の
前処理として、該ポリマーの膜（または該ガラス繊維濾
紙）に固定化されたペプチドＮ末端フラグメントがホル
ミル基および／またはピログルタミル基を有している場
合、それぞれ塩酸あるいはヒドラジン等で処理すること
により、Ｎ末端のαアミノ基のブロックを除去すること
ができる。ここで、ペプチドＮ末端フラグメントがピロ
グルタミル基を有している場合は、エンザイムによる処
理により、Ｎ末端のαアミノ基のブロックを除去するこ
とも可能である。[0012] As a pretreatment for analysis by a sequencer, the peptide N-terminal fragment immobilized on the polymer membrane (or the glass fiber filter paper) has a formyl group and / or a pyroglutamyl group. In this case, the block of the N-terminal α-amino group can be removed by treating each with hydrochloric acid or hydrazine. Here, when the peptide N-terminal fragment has a pyroglutamyl group, it is also possible to remove the block of the N-terminal α-amino group by treatment with an enzyme.

【００１３】[0013]

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこの実施例によりなんら限定される
ものではない。 実施例１ 本発明のペプチドＮ末端フラグメント分取方法につい
て、図１および図２を用いて以下に説明する。図１は、
本発明におけるＮ末端フラグメントの分取の各工程の流
れを示す概略図である。図２は、本発明におけるＮ末端
フラグメントの分取および固定化を行なう装置の概略構
成図である。以下、図２の概略構成図に従って説明す
る。まず、Ｎ末端がブロックされた目的のペプチド（タ
ンパク質）の、Ｌｙｓのεアミノ基をアセチルイミダゾ
ールまたは無水酢酸等で室温にて２０分間程度のアセチ
ル化を行った。（無水酢酸を用いた場合、後述のＮ2 パ
ージによりほぼ完全に除去が可能である。）次に、化学
的および／または酵素的処理を常法（Methodin Enzymol
ogy等の文献に記載の方法または各酵素メーカーにより
公知のプロトコールに記載の方法）に従って行った。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following Examples, which should not be construed as limiting the present invention. Example 1 A method for fractionating a peptide N-terminal fragment of the present invention will be described below with reference to FIGS. FIG.
It is the schematic which shows the flow of each process of fractionation of the N-terminal fragment in this invention. FIG. 2 is a schematic configuration diagram of an apparatus for fractionating and immobilizing an N-terminal fragment according to the present invention. Hereinafter, description will be given according to the schematic configuration diagram of FIG. First, the ε-amino group of Lys of the target peptide (protein) whose N-terminal was blocked was acetylated with acetylimidazole or acetic anhydride for about 20 minutes at room temperature. (When using acetic anhydride, it is possible to almost completely removed by N 2 purge below.) Next, a conventional method of chemical and / or enzymatic treatment (Methodin Enzymol
ogy et al. or a method described in a protocol known by each enzyme manufacturer).

【００１４】その後、反応混合物をＤＩＴＣ−ＣＰＧ
（ＤＩＴＣ−ビーズ、シグマ社製、特開平１−２３５６
００号公報参照）に注入し、反応系を窒素置換して、室
温で１時間程度のカップリング反応を行った。これらの
反応は反応最適条件下で行うためにヒーターを有する反
応槽１のカラム内でおこなうことが望ましい。反応終了
後、洗浄液（０．１％トリフルオロ酢酸を含有する５０
％アセトニトリル・２−プロパノール溶液（体積比３／
７）で洗浄した。この時、洗浄液中にはＮ末端のαアミ
ノ基がブロックされたＮ末端フラグメントが溶出するの
で、該洗浄液を回収容器２に回収した。この結果、Ｎ末
端フラグメント以外のフラグメントは固定化された。Thereafter, the reaction mixture was treated with DITC-CPG.
(DITC-beads, manufactured by Sigma, JP-A 1-2356)
No. 00), the reaction system was replaced with nitrogen, and a coupling reaction was carried out at room temperature for about 1 hour. These reactions are desirably carried out in a column of the reaction tank 1 having a heater in order to carry out the reaction under optimum conditions. After the completion of the reaction, the washing solution (50% containing 0.1% trifluoroacetic acid)
% Acetonitrile / 2-propanol solution (volume ratio 3 /
Washed in 7). At this time, since the N-terminal fragment in which the N-terminal α-amino group was blocked elutes in the washing solution, the washing solution was collected in the collection container 2. As a result, fragments other than the N-terminal fragment were immobilized.

【００１５】一方、回収容器２内のＮ末端フラグメント
を含有する溶出液には、化学的および／または酵素的処
理時の試薬バッファー、デタージェント類が混入してい
るので、同回収容器２に対して設けたＮ2 パージライン
４よりＮ2 パージを回収容器２内に送り、ペプチドＮ末
端フラグメントが溶解している溶出液を蒸発・乾燥させ
た。次に、回収容器２をヒートブロック６に入れ５５℃
で保温したのち、さらにＮ2 パージを行って溶媒を除去
した後、室温に戻した。同回収容器２に膜５をいれたま
ま、この中に３０〜５０％アセトニトリル（３０μｌ以
下）を加えた。次に、反応液（0.1M 4−モルホリンエタ
ンスルホン酸（ＭＥＳ）ｐＨ5.0 、15％アセトニトリ
ル、10mg/ml 水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ））１５μ
ｌを加えて２０分間放置した。このとき、αアミノ基が
ブロックされたＮ末端フラグメント中のＣ末端カルボキ
シル基もしくは該フラグメント中のＡｓｐ（アスパラギ
ン酸）および／またはＧｌｕ（グルタミン酸）の側鎖カ
ルボキシル基を介してＮ末端フラグメントが膜５に固定
化された。On the other hand, the eluate containing the N-terminal fragment in the collection container 2 contains reagent buffers and detergents during chemical and / or enzymatic treatment. the N 2 purge than N 2 purge line 4 provided Te sent to the collection container 2, evaporated and dried eluate peptide N-terminal fragment is dissolved. Next, the collection container 2 is placed in the heat block 6 and set at 55 ° C.
After keeping the temperature at, the solvent was removed by purging with N 2 , and the temperature was returned to room temperature. 30-50% acetonitrile (30 μl or less) was added thereto while the membrane 5 was kept in the collection container 2. Next, the reaction solution (0.1 M 4-morpholineethanesulfonic acid (MES) pH 5.0, 15% acetonitrile, 10 mg / ml water-soluble carbodiimide (EDC)) 15 μm
1 was added and left for 20 minutes. At this time, the N-terminal fragment is bound to the membrane 5 via the C-terminal carboxyl group in the N-terminal fragment in which the α-amino group is blocked or the side chain carboxyl group of Asp (aspartic acid) and / or Glu (glutamic acid) in the fragment. Was immobilized.

【００１６】次に、膜５をとり出し、メタノールと蒸留
水で交互に数回膜５を洗浄し、リンスまたは乾燥させた
後、前述のアシルアミノ酸遊離酵素（宝酒造製）により
Ｎ末端のアミノ酸を除去した。さらに膜５を洗浄してシ
ーケンサーにアプライした。その結果、アミノ酸配列の
うちＮ末端より２番目からの配列が検出できた。Next, the membrane 5 is taken out, washed alternately several times with methanol and distilled water, rinsed or dried, and the N-terminal amino acid is removed by the aforementioned acylamino acid releasing enzyme (Takara Shuzo). Removed. Further, the membrane 5 was washed and applied to a sequencer. As a result, a sequence from the N-terminal to the second from the amino acid sequence was detected.

【００１７】[0017]

【発明の効果】本発明の分取方法によれば、非常に微量
のサンプルからでもＮ末端フラグメントの分取を行うこ
とが可能で、これを膜に固定化せずにそのまま質量分析
により配列を決定することが可能で、さらに引き続きア
シルアミノ酸遊離酵素で処理を行なってからアミノ酸配
列分析を行うことも可能である。また、フラグメントの
分取と固定化とを同一容器内で迅速に行うとともに、得
られた固定化物をそのままアミノ酸配列分析に用いる分
析機の反応器に取りつけることができるので、コンタミ
ネーションの危険性が非常に少ない上、更にメカニカル
ロスも少ないという利点がある。すなわち、本発明の方
法が提供されることにより、サンプルのＮ末端フラグメ
ントを半自動的に分取し、かつ固定化することが可能と
なった。According to the fractionation method of the present invention, it is possible to fractionate an N-terminal fragment even from a very small amount of sample, and the sequence is directly analyzed by mass spectrometry without being immobilized on a membrane. The amino acid sequence can be determined, and the amino acid sequence can be analyzed after the subsequent treatment with an acyl amino acid releasing enzyme. In addition, the separation and immobilization of fragments can be performed quickly in the same container, and the obtained immobilized product can be directly attached to the reactor of an analyzer used for amino acid sequence analysis, thereby reducing the risk of contamination. There is an advantage that the amount is very small and the mechanical loss is also small. That is, the provision of the method of the present invention makes it possible to semi-automatically separate and immobilize the N-terminal fragment of a sample.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】図１は、本発明におけるＮ末端フラグメントの
分取の各工程の流れを示す概略図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing the flow of each step of fractionation of an N-terminal fragment in the present invention.

【図２】図２は、本発明におけるＮ末端フラグメントの
分取および固定化を行なう装置の概略構成図である。FIG. 2 is a schematic configuration diagram of an apparatus for fractionating and immobilizing an N-terminal fragment according to the present invention.

【符号の説明】 １ 反応槽 ２ 回収容器 ３ 反応液送液ライン ４ Ｎ2 パージライン ５ 膜 ６ ヒートブロック[Explanation of Signs] 1 reaction tank 2 collection vessel 3 reaction solution sending line 4 N 2 purge line 5 membrane 6 heat block

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/68 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/08 C07K 1/00 - 1/36 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)──────────────────────────────────────────────────の Continuation of the front page (51) Int.Cl. 7 identification code FI G01N 33/68 G01N 33/68 (58) Field surveyed (Int.Cl. 7 , DB name) C12P 21/00-21/08 C07K 1/00-1/36 JICST file (JOIS) BIOSIS / WPI (DIALOG)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 アミノ末端（Ｎ末端）のαアミノ基がブ
ロックされたペプチドにおいて、Ｌｙｓのεアミノ基を
アセチル化し、該アセチル化体を化学的処理および／ま
たは酵素的処理を行い、得られた各フラグメントのαア
ミノ基およびＬｙｓのεアミノ基と反応して共有結合を
形成しうる官能基を有する固体と各フラグメントとを反
応させ、次いで遊離のＮ末端フラグメントをアリルアミ
ン型官能基で誘導体化されたポリマーの膜またはガラス
繊維濾紙上で分取し、分取されたＮ末端フラグメントを
水溶性カルボジイミド等を用いて該Ｎ末端フラグメント
中のカルボキシル基を介して、該ポリマーの膜または該
ガラス繊維濾紙上に共有結合により固定化することを特
徴とする、ペプチドＮ末端フラグメントの分取方法。1. A peptide in which the α-amino group at the amino terminus (N-terminus) is blocked, the ε-amino group of Lys is acetylated, and the acetylated product is subjected to chemical treatment and / or enzymatic treatment. Reacting each fragment with a solid having a functional group capable of forming a covalent bond by reacting with the α-amino group of each fragment and the ε-amino group of Lys, and then derivatizing the free N-terminal fragment with an allylamine-type functional group Separated on a polymer film or glass fiber filter paper, and the separated N-terminal fragment is subjected to the carboxyl group in the N-terminal fragment using a water-soluble carbodiimide or the like, and the polymer film or the glass fiber is separated. A method for fractionating an N-terminal fragment of a peptide, which is immobilized on a filter paper by a covalent bond.
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