DE4323913A1 - Trennmaterialien für die hydrophobe Chromatographie - Google Patents

Trennmaterialien für die hydrophobe Chromatographie

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DE4323913A1 DE19934323913 DE4323913A DE4323913A1 DE 4323913 A1 DE4323913 A1 DE 4323913A1 DE 19934323913 DE19934323913 DE 19934323913 DE 4323913 A DE4323913 A DE 4323913A DE 4323913 A1 DE4323913 A1 DE 4323913A1
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Description

Die Erfindung betrifft Trennmaterialien für die hydrophobe Chromato­ graphie.
Für die Flüssigkeitschromatographie auf der Grundlage von hydrophoben Wechselwirkungen sind zwei Gruppen von Trennmaterialien gebräuchlich:
  • a) Trennmaterialien für die Umkehrphasenchromatographie (reversed phase chromatography, RP-Chromatography), die eine hohe Liganden­ dichte aufweisen, werden hauptsächlich zur Trennung niedermole­ kularer Substanzen in nicht-wäßrigen Eluenten verwendet.
  • b) Trennmaterialien für die hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC), die geringere Ligandendichten aufweisen, und die im allge­ meinen Liganden mit geringerer Hydrophobizität (z. B. C₄-Alkyl oder C₇-Aryl, statt C₈- oder C₁₈-Alkyl bei der RP-Chromatographie) aufweisen, werden hauptsächlich zur Trennung von Proteinen mit wäßrigen Eluenten benutzt. Dem Starteluenten wird ein chaotropes Salz, beispielsweise 2 M Ammoniumsulfat, zugesetzt; im Verlauf des Gradienten wird die Salzkonzentration verringert.
Trennmaterialien für die hydrophobe Interaktionschromatographie sind im Stand der Technik bekannt. Als Basisträger sind Polysaccharide, die auch vernetzt sein können, sowie vernetzte Poly(meth)acrylate gebräuchlich. In jedem Fall sind die Basisträger mit niedrig Alkyl- oder Arylresten, beispielsweise mit Butyl, Phenyl oder Benzyl, substituiert. Ein bekanntes Herstellverfahren für diese Materialien beruht auf der Umsetzung eines Basisträgers, der Oxirangruppen enthält, mit einem Alkohol in Gegenwart von Bortrifluoridetherat.
Bei der Verwendung der aus dem Stand der Technik bekannten Trenn­ materialien beobachtet man häufig eine unzureichende Trennwirkung. Weitere häufig beobachtete Nachteile dieser Materialien sind Verringerung der biologischen Aktivität und/oder Verluste durch unspezifische irreversible Bindung des Analyten. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Trenn­ materialien mit verbesserten Eigenschaften insbesondere für die hydrophobe Interaktionschromatographie bereitzustellen.
Aus der unveröffentlichten Anmeldung DE 43 10 964 sind oxiranhaltige aktivierte Trägermaterialien bekannt, bei denen Monomere der Formel I auf einen hydroxylgruppenhaltigen Basisträger aufgepfropft sind,
worin
R¹, R² und R³ unabhängig voneinander H oder CH₃,
R⁴ H, C₁-C₅-Alkyl oder C₆-C₁₂-Aryl
und
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5
bedeuten.
Es wurde gefunden, daß sich diese aktivierten Trägermaterialien in an sich bekannter Weise zu Trennmaterialien für die hydrophobe Interaktions­ chromatographie umsetzen lassen. Die resultierenden Trennmaterialien weisen verbesserte Eigenschaften auf.
Gegenstand der Erfindung sind somit Trennmaterialien für die hydrophobe Chromatographie auf der Grundlage von hydroxylgruppenhaltigen Basisträgern, auf deren Oberflächen Polymere kovalent gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) der Basisträger aliphatische Hydroxylgruppen enthält,
  • b) die kovalentgebundenen Polymeren über eine endständige Monomereinheit an den Basisträger gebunden sind,
  • c) die Polymeren Monomereinheiten der Formel IIa und/oder IIb enthalten,
  • d) die Monomereinheiten linear verknüpft sind,
worin
R¹, R² und R³ unabhängig voneinander H oder CH₃,
R⁴ H, C₁-C₅-Alkyl oder C₆-C₁₂-Aryl,
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5,
Z O oder NH
und
R⁵ C₁-C₂₀-Alkyl, C₆-C₂₅-Aryl, C₇-C₂₅-Alkylaryl oder C₇-C₂₅-Arylalkyl, die auch einfach oder mehrfach mit Nitril oder C₁-C₅-Alkoxy derivatisiert sein können, wobei auch eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen durch NH oder O oder auch eine oder mehrere CH-Gruppen durch N ersetzt sein können,
oder
R⁵ -[(CH₂)m-O-]o-R⁶
worin
m 2 oder 3,
o eine ganze Zahl zwischen 1 und 200
und
R⁶ H oder C₁-C₅-Alkyl
bedeuten.
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Trennmaterialien für die hydrophobe Interaktionschromatographie bei der Trennung von Gemischen mindestens zweier Substanzen, insbesondere zur Trennung von Proteinen.
Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Herstellung von Trenn­ materialien für die hydrophobe Interaktionschromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß aus DE 43 10 964 bekannte oxiranhaltige aktivierte Trägermaterialien mit Alkoholen oder Phenolen der Formel III
R⁵-OH (III)
oder mit Aminen der Formel IV
R⁵-NH₂ (IV)
umgesetzt werden, worin R⁵ die oben genannten Bedeutungen besitzt. Die Umsetzung mit Alkoholen wird bevorzugterweise in Gegenwart von Bortrifluoridetherat ausgeführt.
Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Trennung von Gemischen mindestens zweier Substanzen, insbesondere zur Trennung von Proteinen, mittels hydrophober Interaktionschromatographie unter Verwendung der erfindungsgemäßen Trennmaterialien.
In Abbildung Ia ist eine Trennung der Proteine Cytochrom C, Myoglobin, Lysozym und Chymotrypsinogen an einem erfindungsgemäßen Trenn­ material dargestellt; Abb. 1b zeigt zum Vergleich eine Trennung derselben Mischung an einem aus dem Stand der Technik bekannten Material.
Die hydrophoben Alkyl- oder Arylreste R⁵ liegen als Substituenten von Poly(meth)acrylaten vor, die auf einem hydroxylgruppenhaltigen Basisträger aufgepfropft sind. Dabei bedeuten die Reste R⁵ die dem Fachmann für den Zweck der hydrophoben Chromatographie (d. h. der RP-Chromatographie und insbesondere der hydrophoben Interaktionschromatographie) bekannten hydrophoben Substituenten, dazu gehören C₁-C₂₀-Alkyl, C₆-C₂₅-Aryl, C₇-C₂₅-Alkylaryl oder C₇-C₂₅-Arylalkyl, die auch einfach oder mehrfach mit Nitril oder C₁-C₅-Alkoxy derivatisiert sein können, wobei auch eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen durch NH oder O oder auch eine oder mehrere CH-Gruppen durch N ersetzt sein können, oder Polyethoxy- oder Polypropoxyderivate. Für die hydrophobe Interaktionschromatographie werden die Reste C₂-C₅-Alkyl wie z. B. Ethyl, Propyl, n-Butyl, n-Pentyl oder auch verzweigte Reste wie z. B. i-Butyl, t-Butyl, i-Amyl, Neopentyl, sowie C₆-C₁₄-Aryl, wie z. B. Phenyl, Naphthyl, Anthracyl, Phenanthryl, oder auch C₇-C₁₀-Alkylaryl oder C₇-C₁₀-Arylalkyl, wie z. B. Benzyl, bevorzugt.
Diese Reste werden in einer polymeranalogen Umsetzung eingeführt, indem man die entsprechenden Alkohole R⁵-OH in Gegenwart von Bortrifluor­ etherat mit Oxiranen umsetzt. Bei der polymeranalogen Umsetzung dient ein oxiranhaltiges Polymerisat, das auf einen hydroxylgruppenhaltigen Basis­ träger aufgepfropft ist, als Oxirankomponente. Phenole R⁵-OH und Amine R⁵-NH₂ werden in Gegenwart von Natronlauge zur Reaktion mit der Oxirankomponente gebracht. Die Reaktionspartner können auch vertauscht werden: In diesem Fall wird ein hydroxylgruppenhaltiger Träger mit einem Oxiranderivat, wie z. B. 2,3-Epoxypropylphenylether, in Gegenwart von Bortrifluoretherat umgesetzt.
Der Grad der Hydrophobizität läßt sich durch die Wahl des Substituenten R⁵, sowie durch den Substitutionsgrad beeinflussen. Überschüssige Oxiran­ gruppen lassen sich in bekannter Weise durch Behandeln mit verdünnter Schwefelsäure entfernen.
Die folgenden Beispiele sollen den Gegenstand näher erläutern; diese Beispiele stellen keine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes dar.
Beispiele Beispiel 1 Herstellung eines oxiran-aktivierten Trägers ausgehend von Fractogel®-TSK HW 65 (S)
Zu einer Suspension aus 50 ml sedimentiertem Fractogel®-TSK HW 65 (S) und 25 ml Wasser werden mit 2 g Ammoniumcer(IV)nitrat (gelöst in 25 ml 2 M HNO₃) bei Raumtemperatur unter starkem Rühren vermischt. Nach 1 Minute erfolgt die Zugabe einer Lösung von 3 g (2,3-Epoxypropyl)­ methacrylat in 30 ml Dioxan. Es wird 3 Stunden weitergerührt.
Anschließend wird die Reaktionssuspension erst mit destilliertem Wasser und dann mit 0,05 M EDTA-Lösung gewaschen.
Beispiel 2 Synthese eines n-butyl-substituierten Trägermaterials
50 g getrocknete Gel hergestellt nach Beispiel 1 werden in 250 ml 1,4-Dioxan suspendiert und 50 ml 1-Butanol zugegeben. Anschließend werden 30 ml Bortrifluorid-Ethyletherkomplex zugegeben und die Lösung eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird das Reaktionsprodukt abgesaugt und mit Aceton und Wasser gewaschen.
Beispiel 3 Synthese eines benzyl-substituierten Trägermaterials
Entsprechend der Vorschrift nach Beispiel 2 wird ein benzyl-substituiertes Trägermaterial hergestellt, indem anstelle von 1-Butanol Benzylalkohol eingesetzt wird.
Beispiel 4 Synthese eines phenyl-substituierten Trägermaterials
100 ml Fractogel-Epoxytentakelgel werden in einer Lösung aus 0,6 M NaOH und 0,5 M Phenol suspendiert. Die Lösung wird bei 40°C 12 Stunden gerührt. Anschließend wird das Material abgesaugt und 2 Stunden bei 40°C in einer 0,5 M Schwefelsäurelösung langsam gerührt. Danach wird mit 0,25 M Phosphatpuffer (pH 7) bis zum Neutralpunkt, anschließend mit Wasser gewaschen.
Beispiel 5 Variante für eine Synthese eines phenyl-substituierten Trägermaterials
25 ml oxiranhaltiges Gel, hergestellt nach Beispiel 1, werden mit 100 ml 0,5 M Schwefelsäure 2 Stunden bei 40°C behandelt, wobei das Diolderivat entsteht. Dieses wird mehrfach mit Dioxan gewaschen und in 25 ml getrock­ netem Dioxan suspendiert. Man überführt in einen 100 ml Erlenmeyerkolben mit Trockenrohr und pipettiert 3 ml BF₃-Etherat und anschließend 10 ml 2,3-Epoxypropylphenylether dazu und schüttelt 45 min bei Raumtemperatur. Das Produkt wird dreimal mit Dioxan und anschließend mit Wasser gewaschen.
Beispiel 6 Synthese eines (aminobutyl)-substituierten Trägermaterials
Zu 50 ml eines nach Beispiel 1 hergestellten Geles werden 100 ml einer wäßrigen Lösung aus 0,2 M n-Butylamin und 0,2 M Natriumkarbonatpuffer (pH = 11) zugegeben. Die Lösung wird 24 Stunden bei 40°C gerührt. Anschließend wird das Material abgesaugt und 2 Stunden bei 40°C in einer 0,5 M Schwefelsäurelösung langsam gerührt. Danach wird mit 0,25 M Phosphatpuffer (pH 7) bis zum Neutralpunkt, anschließend mit Wasser gewaschen.
Beispiel 7 Synthese eines mit Polyethylenglykol substituierten Trägermaterials
Zu 50 ml eines nach Beispiel 1 hergestellten Geles werden 100 ml einer wäßrigen Lösung aus 20 g Polyethylenglykol (PEG 6000) und 0,3 M Natriumkarbonatpuffer (pH = 13) gegeben. Die Suspension wird 24 Stunden bei 40°C gerührt. Anschließend wird das Material abgesaugt und 2 Stunden bei 40°C in einer 0,5 M Schwefelsäurelösung langsam gerührt. Danach wird mit 0,25 M Phosphatpuffer (pH 7) bis zum Neutralpunkt, anschließend mit Wasser gewaschen.
Anwendungsbeispiel A Trennung von Proteinen an einem n-butyl-substituierten Trägermaterial
Trägermaterial, hergestellt nach Beispiel 2, wird in eine SuperFormance® Glassäule (50 × 10 mm) gefüllt und mit dem Auftragepuffer (1,8 M (NH₄)₂SO₄ in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0) äquilibriert. Eine Mischung enthaltend Cytochrom, Myoglobin, Lysozym und Chymotrypsino­ gen (je 4 mg/ml) wird aufgetragen (200 µl). Eluiert wird bei einem Fluß von 1 ml/min mit einem Gradienten von 1,8 M bis 0 M (NH₄)₂SO₄ in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 (Dauer 30 Minuten). Das Elutionsdiagramm wird durch Photometrie bei 280 nm gemessen.
Die vier Proteine werden vollständig getrennt (siehe Abb. 1a).
Anwendungsbeispiel B Trennung von Proteinen an einem benzyl-substituierten Trägermaterial
Trägermaterial, hergestellt nach Beispiel 3, wird in eine SuperFormance® Glassäule (50 × 10 mm) gefüllt. Probe und Chromatographiebedingungen sind dieselben wie in Anwendungsbeispiel A beschrieben.
Auch bei diesem Material werden die vier Proteine vollständig getrennt; das Elutionsdiagramm ähnelt dem von Anwendungsbeispiel A.
Vergleichsbeispiel C Trennung von Proteinen an einem n-butyl-substituierten Trägermaterial aus dem Stand der Technik
Kommerziell erhältliches Trägermaterial (n-butylsubstituiertes vernetztes Polymethacrylat) wird in eine SuperFormance® Glassäule (50 × 10 mm) gefüllt. Probe und Chromatographiebedingungen sind dieselben wie in Anwendungsbeispiel A beschrieben.
Im Gegensatz zu dem Anwendungsbeispiel A werden die vier Proteine nicht vollständig getrennt; siehe Abb. 1b.
Da die in Anwendungsbeispiel A und Vergleichsbeispiel C benutzten Trennmaterialien einen sehr ähnlichen Basisträger (vernetztes Poly­ methacrylat) besitzen, ist diese Wirkung überraschend.
Vergleichsbeispiel D Trennung von Proteinen an einem benzyl-substituierten Trägermaterial aus dem Stand der Technik
Kommerziell erhältliches Trägermaterial (benzylsubstituierte vernetzte Agarose) wird in eine SuperFormance® Glassäule (50 × 10 mm) gefüllt. Probe und Chromatographiebedingungen sind dieselben wie in Anwendungs­ beispiel A beschrieben.
Im Gegensatz zu dem Anwendungsbeispiel B werden die vier Proteine nicht vollständig getrennt.

Claims (5)

1. Trennmaterialien für die hydrophobe Chromatographie auf der Grund­ lage von hydroxylgruppenhaltigen Basisträgern, auf deren Oberflächen Polymere kovalent gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) der Basisträger aliphatische Hydroxylgruppen enthält,
  • b) die kovalentgebundenen Polymeren über eine endständige Monomereinheit an den Basisträger gebunden sind,
  • c) die Polymeren Monomereinheiten der Formel IIa und/oder IIb enthalten,
  • d) die Monomereinheiten linear verknüpft sind,
worin
R¹, R² und R³ unabhängig voneinander H oder CH₃,
R⁴ H, C₁-C₅-Alkyl oder C₆-C₁2-Aryl,
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5,
Z O oder NH
und
R⁵ C₁-C₂₀-Alkyl, C₆-C₂₅-Aryl, C₇-C₂₅-Alkylaryl oder C₇-C₂₅-Arylalkyl, die auch einfach oder mehrfach mit Nitril oder C₁-C₅-Alkoxy derivatisiert sein können, wobei auch eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen durch NH oder O oder auch eine oder mehrere CH-Gruppen durch N ersetzt sein können,
oder R⁵ -[(CH₂)m-O-]o-R⁶worin
m 2 oder 3,
o eine ganze Zahl zwischen 1 und 200
und
R⁶ H oder C₁-C₅-Alkyl
bedeuten.
2. Verwendung von Trennmaterialien mit den Merkmalen des Anspruch 1 für die chromatographische Trennung von Gemischen mindestens zweier Substanzen.
3. Verfahren zur Herstellung von Trennmaterialien für die hydrophobe Interaktionschromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß aktivierte Trägermaterialien, die aus einem hydroxylgruppenhaltigen Basisträger bestehen, auf den oxiranderivatisierte Poly(meth)acrylate aufgepfropft sind, mit Alkoholen oder Phenolen der Formel III R⁵-OH (III)oder mit Aminen der Formel IVR⁵-NH₂ (IV)umgesetzt werden, worin R⁵ die in Anspruch 1 genannten Bedeutungen besitzt.
4. Verfahren zur chromatographischen Trennung von Geinischen minde­ stens zweier Substanzen unter Verwendung von Trennmaterialien nach Anspruch 1.
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