DE4308520A1

DE4308520A1 - Method for differentiating between homozygotes, heterozygotes and normal cells of an organism

Info

Publication number: DE4308520A1
Application number: DE19934308520
Authority: DE
Inventors: Fritz-Albert Dr Popp; Roeland Van Dr Wijk; Weiping Dr Mei; Hugo Dr Niggli-Schwizer
Original assignee: POPP FRITZ ALBERT DR
Current assignee: POPP FRITZ ALBERT DR
Priority date: 1993-03-17
Filing date: 1993-03-17
Publication date: 1994-09-22

Abstract

A method is specified for differentiating between homozygotes, heterozygotes and normal cells of an organism. It is characterised in that the cells to be investigated are irradiated with UV light and/or treated with a substance which partly damages the cells and the intensity of the photon emission of these cells is subsequently measured. The method is preferably used before X-ray diagnosis in which the risk of inducing a disease triggered by the radiation is to be no greater than the probability of early diagnosis of a disease.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Unterscheiden von homozygoten, heterozygoten und normalen Zellen eines Organismus.The invention relates to a method for distinguishing homozygous, heterozygous and normal cells of one Organism.

Für die Zellanalyse, zum Beispiel bei der Diagnose von strahlungsempfindlichem Gewebe, ist es in bestimmten Fällen wichtig, zwischen strahlungsunempfindlichen und stark strahlungsempfindlichen Zellen, die homozygot, heterozygot oder normal sein können, zu unterscheiden. Eine solche Unterscheidung kann zum Beispiel vor einer Röntgendiagnostik wichtig sein, bei der das Risiko, eine durch die Bestrahlung ausgelöste Erkrankung zu induzieren, nicht größer sein darf als die Chance, eine Erkrankung, beispielsweise einen Tumor, frühzeitig zu diagnostizieren.For cell analysis, for example in the diagnosis of radiation sensitive tissue, it is in certain cases important between radiation insensitive and strong radiation-sensitive cells that are homozygous, heterozygous or can be normal to distinguish. Such A distinction can be made, for example, before an X-ray diagnosis be important at risk of exposure to radiation induced disease must not be greater than the chance of a disease, such as a tumor, diagnose early.

Unter "homozygoten" Zellen sind hierbei solche Zellen zu verstehen, bei denen ein krankhaftes Erbmerkmal in den beiden homologen Chromosomensätzen in sich nicht unterscheidenden Genen angeordnet ist. Der Begriff "krankhaft" bedeutet hier beispielsweise die genetische Expression fehlerhafter Enzyme.Such cells are included under "homozygous" cells understand where a pathological inheritance in the two homologous sets of chromosomes in indistinguishable Genes is arranged. The term "pathological" means here for example the genetic expression of defective enzymes.

Unter "heterozygoten" Zellen sind hier solche Zellen zu verstehen, bei denen ein krankhaftes Erbmerkmal in den beiden homologen Chromosomensätzen in sich unterscheidenden Genen angeordnet ist.Such cells are included here under "heterozygous" cells understand where a pathological inheritance in the two homologous sets of chromosomes in different genes is arranged.

Unter "normalen" Zellen sind schließlich solche Zellen zu verstehen, die kein derartiges krankhaftes Erbmerkmal aufweisen.After all, such cells are closed under "normal" cells understand that no such pathological inheritance trait exhibit.

Um zwischen homozygoten, heterozygoten und normalen Zellen zu unterscheiden, mußte man bisher langwierige genetische Tests durchführen. Diese beruhen auf Abweichungen in den Enzymmustern, die von den betreffenden Genen transkribiert werden. Sorgfältige Vergleiche erlauben dann mit begrenzter Sicherheit eine Unterscheidung zwischen den drei Zelltypen. Derartige Verfahren gehören heute zu den Standardmethoden der Humangenetik und Biochemie. Hierzu wird beispielsweise auf "Basic Genetics", D. L. Hartl, D. Freifelder, L. A. Snyder, Jones & Barlett Publ., Boston (1988), und "An Introduction to Genetic Analysis", D. T. Suzuki, A. J. F. Griffith, J. H. Miller & R. C. Lewontin, W. H. Freeman, New York (1986), hingewiesen.To distinguish between homozygous, heterozygous and normal cells So far, one had to distinguish between lengthy genetic tests carry out. These are based on deviations in the Enzyme patterns transcribed by the genes in question become. Careful comparisons then allow with limited Security a distinction between the three cell types. Such methods are now one of the standard methods of Human genetics and biochemistry. For example, on "Basic Genetics", D.L. Hartl, D. Freifelder, L.A. Snyder, Jones & Barlett Publ., Boston (1988), and "An Introduction to Genetic Analysis ", D.T. Suzuki, A.J. F. Griffith, J.H. Miller & R.C. Lewontin, W.H. Freeman, New York (1986), pointed out.

Aus der DE 28 44 217 C2 ist ein Verfahren zur Diagnose der Malignität von menschlichem, tierischem oder pflanzlichem Gewebe durch Messen der ultraschwachen Photonenemission lebender Zellen mit Hilfe der sogenannten Single-Photon- Counting-Technik bekannt. Das Verfahren dient aber nur zur Feststellung, ob eine untersuchte Gewebeprobe Tumorzellen enthält oder nicht. Die Frage, ob es sich bei den Zellen der Gewebeprobe um homozygote, heterozygote oder normale Zellen im oben definierten Sinn handelt, spielt dabei aber keine Rolle und wird in der Druckschrift auch nicht berührt.DE 28 44 217 C2 describes a method for diagnosing the Malignancy of human, animal or vegetable Tissue by measuring the ultra weak photon emission living cells with the help of the so-called single photon Counting technique known. The procedure is only for Determine whether an examined tissue sample contains tumor cells contains or not. The question of whether the cells of the Tissue sample around homozygous, heterozygous or normal cells acts in the sense defined above, but does not play any part Role and is not touched in the publication.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein im Vergleich zu den bekannten Methoden einfaches und in sehr kurzer Zeit ausführbares Verfahren anzugeben, mit dem zwischen homozygoten, heterozygoten und normalen Zellen unterschieden werden kann.The invention has for its object a compared to the known methods simple and in a very short time specify the executable procedure between distinguish homozygous, heterozygous and normal cells can be.

Dementsprechend betrifft die Erfindung ein Verfahren gemäß dem Patentanspruch 1. In den Patentansprüchen 2 bis 7 sind bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens angegeben.Accordingly, the invention relates to a method according to claim 1. In claims 2 to 7 are preferred embodiments of the method according to the invention specified.

Es ist überraschend, daß sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Lösung der vorgenannten Aufgabe eignet, weil bisher die Meinung bestand, daß man bei einem Vergleich verschiedener Zellarten mittels der Photonenemissionsmessung nur zwischen Tumor- und Nicht-Tumorzellen unterscheiden könne (vgl. die DE 28 44 217 C2). Das erfindungsgemäße Verfahren hat darüber hinaus den Vorteil, daß es nicht-invasiv ist und sich uneingeschränkt auf jeden Zelltyp anwenden läßt.It is surprising that the inventive method suitable for solving the above task, because so far the There was an opinion that when comparing different Cell types using the photon emission measurement only between Differentiate between tumor and non-tumor cells (see DE 28 44 217 C2). The method according to the invention has this also the advantage that it is non-invasive and self can be applied without restriction to any cell type.

Unerwarteterweise werden die Unterschiede in den Photonenemissionen der verschiedenen Zellen dadurch verstärkt, daß die Zellen vor der Messung der Photonenemission mit UV-Licht bestrahlt werden. Das UV-Licht bewirkt eine Schädigung des Reparatursystems der Zellen.The differences in the Photon emissions from the various cells amplifies that the cells before measuring the Photon emission can be irradiated with UV light. The UV light causes damage to the cell repair system.

Dementsprechend können die Zellen anstelle des UV-Lichts auch mit einem Stoff behandelt werden, der sie teilweise schädigt. Solche Stoffe sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise eignen sich dafür Atrazin oder Homidiumbromid (Ethidiumbromid).Accordingly, the cells can instead of UV light be treated with a substance that partially damages them. Such substances are known to the person skilled in the art. For example atrazine or homidium bromide are suitable for this (Ethidium bromide).

Es ist auch beides gleichzeitig möglich, nämlich die Bestrahlung der Zellen mit UV-Licht und der Einsatz eines in gleicher Weise wirkenden Stoffes.It is also possible to do both at the same time, namely the Irradiation of the cells with UV light and the use of an in same acting substance.

Es hat sich gezeigt, daß sich die verschiedenen Zellen hinsichtlich Art und Ausmaß dieser Schädigung des Reparatursystems zum Teil sehr deutlich voneinander unterscheiden.It has been shown that the different cells regarding the nature and extent of this damage to the Repair system sometimes very clearly from each other differentiate.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird die Intensität der Biophotonenemission der Zellen gemessen. Bei dieser Art von Emission handelt es sich um das sogenannte "Selbstleuchten" der betreffenden Zellen. Unter normalen Bedingungen emittieren diese von sich aus Photonen, die trotz ihrer sehr geringen Anzahl meßtechnisch noch erfaßt werden können.According to a preferred embodiment of the method of Invention is the intensity of the biophoton emission of the Cells measured. This type of emission is the so-called "self-illuminating" of the cells in question. Under normal conditions, they emit on their own Photons, despite their very small number, are measured can still be detected.

Von der Biophotonenemission ist die Photonenemission nach externer Anregung der Zellen zu unterscheiden. Diese Emission entsteht, wenn die zu prüfenden Zellen während eines bestimmten Zeitraums, zum Beispiel während 1 bis 3 min, mit einer Lichtquelle bestrahlt werden. Deren Wellenlängenbereich liegt normalerweise im sichtbaren Bereich. Nach dem Abschalten der Lichtquelle emittieren die durch das Licht angeregten Zellen dann Photonen in höherer Anzahl und mit abklingender Intensität, verglichen mit der Biophotonenemission. In der Praxis wird dabei normalerweise die Fläche der Abklingkurve bestimmt.From the biophoton emission, the photon emission is after to distinguish external excitation of the cells. This emission arises when the cells to be tested during a certain period of time, for example for 1 to 3 minutes, with be irradiated by a light source. Their wavelength range is usually in the visible range. After this Turning off the light source emit through the light excited cells then photons in higher numbers and with decaying intensity compared to that Biophoton emission. In practice, this is usually determines the area of the decay curve.

Somit besteht eine vorteilhafte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens darin, daß nach dem Bestrahlen der Zellen mit UV-Licht eine weitere Bestrahlung mit Licht anderer Wellenlänge, vorzugsweise mit Licht größerer Wellenlänge als jener des UV-Lichts, insbesondere mit sichtbarem Licht, durchgeführt und dann der zeitliche Verlauf der Intensität der Photonenemission gemessen wird.There is thus an advantageous embodiment of the inventive method in that after irradiation the cells with UV light, further irradiation with light different wavelength, preferably with a larger light Wavelength than that of UV light, especially with visible light, and then the time course the intensity of the photon emission is measured.

Für die Bestrahlung der Zellen hat sich eine Wolframlampe, d. h. eine Glühlampe mit einem Glühfaden aus Wolfram, als besonders geeignet herausgestellt. Vorzugsweise hat diese Lampe eine Leistung von 150 W.A tungsten lamp has been used to irradiate the cells, d. H. a light bulb with a filament made of tungsten, as emphasized particularly suitable. Preferably this one Lamp has a power of 150 W.

Es ist zweckmäßig, die Messung der Intensität der Photonenemission in einem Wellenbereich von 200 bis 800 nm durchzuführen. In diesem Bereich sind die unterschiedlichen Emissionsintensitäten bei homozygoten, heterozygoten und normalen Zellen besonders deutlich.It is useful to measure the intensity of the Photon emission in a wavelength range from 200 to 800 nm perform. In this area there are different ones Emission intensities in homozygous, heterozygous and normal cells particularly clearly.

In manchen Fällen ist es vorteilhaft, den Zellen einen die Photonenemission verstärkenden Stoff zuzusetzen. Ein solcher Stoff ist vorzugsweise Luminol. Dies empfiehlt sich vor allem bei Zellen mit besonders schwacher Photonenemission.In some cases it is advantageous to unite the cells Add photon emission enhancing substance. Such a The substance is preferably luminol. This is especially recommended for cells with particularly weak photon emission.

Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren mit Nicht- Tumorzellen durchgeführt. Ein Grund hierfür liegt darin, daß es darauf ankommt, strahlungsempfindliche XP-Zellen, die keine Tumorzellen sind, von normalen Nicht-Tumorzellen, die nicht besonders strahlungsempfindlich sind, zu unterscheiden.The process according to the invention is preferably carried out with non- Tumor cells performed. One reason for this is that it depends on radiation sensitive XP cells that are not tumor cells, from normal non-tumor cells that are not particularly sensitive to radiation.

Eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde beispielsweise von Ruth in der Monographie "Electromagnetic Bio-Information", Verlag Urban und Schwarzenberg, 1978, S. 107 bis 122, beschrieben. Dabei wird die Photonenemission, die von einer in einer Quarzküvette eingeschlossenen und in einer Dunkelkammer befindlichen Probe der zu untersuchenden Zellen ausgeht, von einem Photomultiplier registriert, der im Wellenlängenbereich von 200 bis 800 nm empfindlich ist.A device for performing the invention The procedure was described, for example, by Ruth in the monograph "Electromagnetic Bio-Information", publisher Urban and Schwarzenberg, 1978, pp. 107 to 122. Doing so the photon emission from one in a quartz cuvette enclosed sample and located in a dark room of the cells to be examined starts from one Photomultiplier registered in the wavelength range of 200 to 800 nm is sensitive.

Die an den zu untersuchenden Zellen gemessene Photonenintensität wird mittels einer bekannten Auswertungsmethode, zum Beispiel mit Hilfe der Faktorenanalyse (vgl. Überla, Faktorenanalyse, Springer- Verlag, Berlin, 1968; CSS: Stat Soft, Inc., 2325 East 13th Street, Tulsa OK 74104, Factor Analysis, FAC 679-754), ausgewertet werden, wie es auch im nachfolgenden Ausführungsbeispiel erläutert ist. Es sind aber auch andere Auswertungsverfahren (z. B. multivariate Verfahren), die dem Fachmann bekannt sind, anwendbar.The measured on the cells to be examined Photon intensity is measured using a known Evaluation method, for example using the Factor analysis (see Überla, factor analysis, springer Verlag, Berlin, 1968; CSS: Stat Soft, Inc., 2325 East 13th Street, Tulsa OK 74104, Factor Analysis, FAC 679-754), be evaluated, as is also the case below Embodiment is explained. But there are also others Evaluation procedures (e.g. multivariate procedures) that the Are known to those skilled in the art.

Die Erfindung wird durch das nachfolgende Beispiel erläutert.The invention is illustrated by the following example.

example

Von menschlicher Haut wurden heterozygote XP-Zellen der Mutter, homozygote XP-Zellen des Sohnes und normale Fibroblasten des Typs P3VH89 kultiviert sowie mit einer jeweils gleichen Zellzahl von etwa 1,5 × 10⁵/ml unter genau gleichen Bedingungen (Temperatur 37°C, RPMI-Nährmedium) in Suspension jeweils in eine 10 ml-Quarzküvette eingebracht. Heterozygous XP cells from the mother, homozygous XP cells from the son and normal fibroblasts of the type P3VH89 were cultivated from human skin and with the same number of cells of about 1.5 × 10 ⁵ / ml under exactly the same conditions (temperature 37 ° C., RPMI nutrient medium) in suspension in each case in a 10 ml quartz cuvette.

An den drei Zelltypen wurde die Intensität der Photonenemission gemessen. Mit Ausnahme der UV-Bestrahlung entsprachen die Vorrichtung und der genaue Vorgang der Messung den Angaben von Ruth, Monographie "Electromagnetic Bio-Information", Verlag Urban und Schwarzenberg, 1978, S. 107 bis 122. Bei der UV-Bestrahlung wurden die Zellen jeweils in 10 ml Medium in einer Petrischale (Durchmesser 5,5 cm) in einem Abstand vom Fokus einer handelsüblichen 300 W-UV-Lampe (OSRAM-Vitalux) 10 min lang ohne Filter bestrahlt. Die anschließende Bestrahlung der Zellen mit Licht anderer Wellenlänge (kein UV-Licht) erfolgte mit einer 150 W- Wolframlampe und dauerte jeweils 1 min.The intensity of the Measured photon emission. With the exception of UV radiation corresponded to the device and the exact process of the Measurement of the information provided by Ruth, monograph "Electromagnetic Bio-Information ", Verlag Urban and Schwarzenberg, 1978, Pp. 107 to 122. The cells were exposed to UV radiation each in 10 ml medium in a petri dish (diameter 5.5 cm) at a distance from the focus of a commercially available 300 W UV lamp (OSRAM Vitalux) without filter for 10 minutes irradiated. The subsequent irradiation of the cells with light other wavelength (no UV light) was carried out with a 150 W Tungsten lamp and each took 1 min.

An den Zellen wurden folgende Photonenemissionen gemessen:The following photon emissions were measured on the cells:

1. Biophoton intensity before UV radiation (DAV);
2. Biophoton intensity immediately after (i.e. 1 to 2 min after) UV radiation (DAN);
3. Biophoton intensity, 15 min after UV irradiation (DAN 15);
4. Photon intensity before UV radiation, however immediately after exposure to the tungsten lamp (NBV);
5. Photon intensity after UV radiation and immediately following irradiation with the Tungsten lamp (NBN);
6. Photon intensity after UV radiation and The tungsten lamp was irradiated 15 minutes later (NBN15).

In der nachfolgenden Tabelle I sind die erhaltenen Meßwerte in Anzahl/ms für die drei Zelltypen angegeben. Zur Vereinfachung werden sie wie folgt numeriert:
normale Fibroblasten P3VH89 = 1
heterozygote XP-Zellen der Mutter = 2
homozygote XP-Zellen des Sohnes = 3Table I below gives the measured values obtained in number / ms for the three cell types. To simplify matters, they are numbered as follows:
normal fibroblasts P3VH89 = 1
heterozygous XP cells of the mother = 2
son's homozygous XP cells = 3

Tabelle I Table I

Die Werte in der Spalte "DAV" sind negativ, weil sie sich auf die stets vorhandene Biophotonenintensität beziehen und deshalb bei der Auswertung von den übrigen Meßwerten abgezogen werden. Diese negativen Werte kann man auch unberücksichtigt lassen.The values in the "DAV" column are negative because they are based on obtain the biophoton intensity that is always present and therefore when evaluating the other measured values subtracted from. You can also use these negative values ignored.

In der nachfolgenden Tabelle II sind die mittleren Abweichungen der gemessenen Intensitäten bei jeweils drei Meßreihen angegeben. In Table II below are the middle ones Deviations of the measured intensities in three Series of measurements indicated.

Tabelle II Table II

Bei der Auswertung der erhaltenen Daten zeigt sich,The evaluation of the data obtained shows that

a) that the three cell types in terms of Clearly distinguish photon emission from each other and
b) that each one in terms of properties Assign "homozygous", "heterozygous" and "normal" correctly can.

Für diese Auswertung wird die vorgenannte Faktorenanalyse angewandt. Dabei errechnen sich aus den Daten der Tabelle I die beiden Faktoren F1 und F2 mit den normierten Faktorladungen, wie sie in der nachfolgenden Tabelle III angegeben sind.The aforementioned factor analysis is used for this evaluation applied. It is calculated from the data in Table I the two factors F1 and F2 with the normalized Factor loads as shown in Table III below are specified.

Tabelle III Table III

Die Faktoren F1 und F2 sind etwa gleich stark an der Beschreibung der Eigenschaften der Zellen beteiligt (Verhältnis F1 : F2 = 3,6 : 2,4). Da im Faktor F2 die Messungen DAV und NBV gleichläufig korrelieren, erwartet man hier eine bestimmte Rangordnung der Zellen. Tatsächlich sind die Werte der Faktoren F1 und F2 so verteilt, wie es in der nachfolgenden Tabelle IV angegeben ist.The factors F1 and F2 are approximately equally strong on the Description of the properties of the cells involved (Ratio F1: F2 = 3.6: 2.4). Because in factor F2 the One would expect that DAV and NBV measurements correlate in the same way here a certain order of the cells. Are actually the values of the factors F1 and F2 are distributed as it is in the Table IV below is given.

Tabelle IV Table IV

Aufgrund dieses Ergebnisses lassen sich die beiden Zelltypen bereits durch das Vorzeichen der Werte der Faktoren F1 und F2 voneinander unterscheiden, wie dies in der nachfolgenden Tabelle V verdeutlicht ist.Based on this result, the two cell types can be by the sign of the values of the factors F1 and F2 differ from each other, as in the following Table V is clarified.

Tabelle V Table V

Der Faktor F1 beschreibt die nicht-lineare Reaktion auf die UV-Bestrahlung der Zellen, während der Faktor F2 die Zellen in gewisser Weise nach der "Qualität" ordnet. The factor F1 describes the non-linear response to that UV irradiation of the cells, while the factor F2 affects the cells sort of by "quality".

Am obigen Ergebnis ändert sich auch dann nichts, wenn die Meßwertstreuungen, wie sie aus der Tabelle II ersichtlich sind, den Meßwerten so hinzugefügt werden (also entweder addiert oder subtrahiert werden), daß die Unterschiede der dann sich ergebenden Werte möglichst gering sind (also möglichst ungünstig sind). Selbst in diesem Fall bleibt die Vorzeichenzuordnung gemäß der Tabelle IV unverändert. Das bedeutet, daß das erhaltene Ergebnis zuverlässig ist.Nothing changes in the above result even if the Variations in measured values, as can be seen from Table II are added to the measured values in this way (i.e. either be added or subtracted) that the differences of the then the resulting values are as low as possible (i.e. are as unfavorable as possible). Even in this case it remains Sign assignment according to Table IV unchanged. The means that the result obtained is reliable.

Claims

1. A method for distinguishing homozygous, heterozygous and normal cells of an organism, characterized in that the cells to be examined are irradiated with UV light and / or treated with a substance which partially damages the cells, and then the intensity of the photon emission thereof Cells is measured.

2. The method according to claim 1, characterized in that the intensity of the cell's biophoton emission is measured.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that after irradiating the cells with UV light further irradiation with light of a different wavelength carried out and then the temporal course of the Intensity of the photon emission is measured.

4. The method according to claim 3, characterized in that as a light source for irradiation with light from others Wavelength a tungsten lamp is used.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized characterized in that the measurement of the intensity of the Photon emission in a wavelength range from 200 to 800 nm is carried out.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized characterized in that the cells have a photon emission reinforcing substance is added.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized characterized in that it was performed with non-tumor cells becomes.