DE4123365A1

DE4123365A1 - New acyl:amino:pentanoic acid derivs. with immuno:modulating activity - useful for treating herpes infection, Hodgkin's disease, tumours, endotoxin shock, inflammation etc.

Info

Publication number: DE4123365A1
Application number: DE19914123365
Authority: DE
Inventors: Hermann Dr Radzyner-Vyplel
Original assignee: Sandoz AG; Sandoz Patent GmbH
Current assignee: Sandoz AG; Sandoz Patent GmbH
Priority date: 1991-07-15
Filing date: 1991-07-15
Publication date: 1993-01-21

Abstract

Acylaminopentanoic acid derivs. of formula R2OCH2CH(NHR1)CH2CH2 COOH (I) where R1 and R2 are each opt. substd. acyl. USE/ADVANTAGE - (I) are immunomodulators with an influence on unspecific antimicrobial resistance and can be used for the systemic increase of the immune response and to increase unspecific immunity. (I) can be used in the treatment or supportive treatment of diseases resulting from idopathic immune deficiency or from immune deficiencies such as arise in geriatric patients or in patients with severe burns or generalised infections. (I) can also be used in the treatment or supportive treatment of viral diseases (such as disseminated herpes, progressive pox diseases ad disseminated varicella diseases) and Morbus Hodgkin and other malign tumours. (I) can also be used in the prophylaxis of endotoxin shock, e.g., in accidents, burns and surgical operations and as antiinflammatories. Suitable doses are 0.1-70mg i.p. used once to achieve an adjuvant effect, e.g., in supportive treatment or daily, divided into 2-4 unit doses per day or in retard form.

Description

Die Erfindung betrifft Acylaminopentansäurederivate der FormelThe invention relates to acylaminopentanoic acid derivatives of the formula

worin R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und jeweils für eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen, in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.wherein R ₁ and R _{2 are the} same or different and each represent an optionally substituted acyl group, in free form or in the form of their acid addition salts, process for their preparation and their use.

Erfindungsgemäß gelangt man zu den Verbindungen der Formel I, indem man aus Verbindun gen der FormelAccording to the invention, the compounds of the formula I are obtained by starting from compounds against the formula

worin R₁′ und R₂′ die gleiche Bedeutung wie R₁ und R₂ besitzen, wobei jedoch gegebenenfalls vorhandene Hydroxygruppen durch eine Schutzgruppe geschützt sind, und R₃ für eine Carbo xyschutzgruppe steht, die Schutzgruppen nach bekannten Methoden abspaltet.wherein R ₁ 'and R ₂ ' have the same meaning as R ₁ and R ₂ , but any hydroxyl groups which may be present are protected by a protective group, and R _{3 is} a carboxy protecting group which cleaves off protective groups by known methods.

Als Schutzgruppen können allgemein übliche Schutzgruppen verwendet werden, beispielswei se die Triphenylmethyl-, die tert.Butoxycarbonyl- oder die Benzylgruppe. Die Abspaltung der vorhandenen Schutzgruppen kann nach an sich bekannten Verfahren durchgeführt werden; beispielsweise kann die Benzylgruppe durch Hydrieren in Gegenwart eines Katalysators ent fernt werden.Commonly used protective groups can be used as protective groups, for example se the triphenylmethyl, tert-butoxycarbonyl or benzyl group. The spin-off of the existing protective groups can be carried out according to methods known per se; for example, the benzyl group can be ent by hydrogenation in the presence of a catalyst be removed.

Die Verbindungen der Formel II können nach folgendem Formelschema erhalten werden:The compounds of the formula II can be obtained according to the following formula:

In diesem Formelschema besitzen R₁, R₂, R₃, R₁′ und R₂′ obige Bedeutung, R₄ steht für eine Aminoschutzgruppe.In this formula, R₁, R₂, R₃, R₁ 'and R₂' have the above meaning, R₄ stands for Amino protecting group.

Die Acylierung kann beispielsweise ausgeführt werden,indem man eine entsprechende Aus gangsverbindung in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel, z. B. in einem Halogenkohlenwasserstoff, wie Methylenchlorid, gemeinsam mit dem Acylierungsmit tel, gegebenenfalls unter Zusatz von Dicyclohexylcarbodiimid und 4-Dimethylaminopyridin, löst und bei tiefen Temperaturen, z. B. bei etwa 4°C, reagieren läßt. Aus dem Reaktionsge misch kann das Reaktionsprodukt nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenen falls gereinigt werden.The acylation can be carried out, for example, by an appropriate off Gang connection in a solvent inert under the reaction conditions, for. B. in a halogenated hydrocarbon such as methylene chloride together with the acylating agent tel, optionally with the addition of dicyclohexylcarbodiimide and 4-dimethylaminopyridine, dissolves and at low temperatures, e.g. B. at about 4 ° C, can react. From the reaction ge The reaction product can be mixed and isolated according to methods known per se if cleaned.

R₁ und R₂ sind gleich oder verschieden und bedeuten eine Acylgruppe, vorzugsweise eine Alkylcarbonylgruppe, mit beispielsweise 4 bis 20, vorzugsweise 12 bis 16 und insbesondere 14 Kohlenstoffatomen, die in der 3-Position durch OH oder eine Acyloxygruppe, wie sie oben definiert ist, monosubstituiert sein kann, wobei das C-3-Atom R- oder S-konfiguriert ist. In den Verbindungen der Formel I können daher R₁ und R₂ in achiraler Form, in R-, S- oder racemi scher Form vorliegen. Bei den in der Erfindung beschriebenen Reaktionen bleibt die Konfigura tion während des Reaktionsablaufs unverändert, d. h., ausgehend von R-, bzw. S- oder race mischen Ausgangsprodukten erholt man die entsprechenden R-, bzw. S- oder racemischen Endverbindungen. R ₁ and R ₂ are the same or different and mean an acyl group, preferably an alkylcarbonyl group, having for example 4 to 20, preferably 12 to 16 and in particular 14 carbon atoms, which is in the 3-position by OH or an acyloxy group as defined above , may be monosubstituted, the C-3 atom being R or S configured. In the compounds of the formula I, R ₁ and R ₂ can therefore be present in achiral form, in R, S or racemic form. In the reactions described in the invention, the configuration remains unchanged during the course of the reaction, ie starting from R- or S- or race-mixed starting products, the corresponding R- or S- or racemic end compounds are recovered.

Die Verbindungen der Formel I werden bevorzugt als Säureadditionssalze gewonnen, wobei als Gegenion zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit bevorzugt hydrophile basische Verbindungen, beispielsweise Tris(hydroxymethyl)aminomethan oder L-Lysin, verwendet werden.The compounds of formula I are preferably obtained as acid addition salts, where as Counter ion to increase water solubility, preferably hydrophilic basic compounds, for example, tris (hydroxymethyl) aminomethane or L-lysine can be used.

Die weiteren Ausgangsprodukte sind bekannt oder nach bekannten Methoden bzw. analog zu bekannten Methoden oder analog wie in den Beispielen beschrieben herstellbar.The other starting products are known or by known methods or analogously to known methods or analogously as described in the examples.

Die Verbindungen der Formel I zeigen eine Beeinflussung der unspezifischen antimikrobiellen Resistenz. Diese Wirkung kann beispielsweise mit folgenden Testmethoden gezeigt werden:The compounds of the formula I show an influence on the non-specific antimicrobial Resistance. This effect can be demonstrated, for example, with the following test methods:

1. Determination of the endotoxic activity using the Limulus amebocyte lysate test

Endotoxin katalysiert die Aktivierung eines Proenzyms im Limulus-Amoebozytenlysat. Gemes sen wird die Abspaltung von p-Nitroanilin aus einem farblosen Substrat. Das Ausmaß dieser Abspaltung wird photometrisch erfaßt, wobei die Korrelation zwischen Absorption und Endoto xinkonzentration (bzw. -aktivität bei Analoga) im Bereich von 0,01-0,1 ng/ml Endotoxin linear ist (Vergleich mit den Absorptionswerten eines Standard Endotoxins). Von jeder Probe (gelöst in pyrogenfreiem Aqua bidestillata sterilis.) wird eine Verdünnungsreihe 1 : 10 hergestellt. Bei jeder Bestimmungsreihe wird zusätzlich eine Leerprobe mitgeführt. 100 µl Probe bzw. Stan dard oder Leerwert werden mit 100 µl Limulus-Amoebozytenlysat versetzt. Die Reaktion wird nach 10 Minuten Inkubation bei 37°C mit 200 µl Substrat versetzt. Nach weiteren 3 Minuten Inkubation wird die Reaktion mit 200 µl 50% Essigsäure gestoppt. Nach Aufschütteln der Probe wird in einem Spektralphotometer bei 405 nm die Absorption gegen einen Leerwert gemessen. Die Ermittlung des Endotoxingehaltes (der Endotoxinaktivltät) der Probe als Endotoxin-Units (E U.) erfolgt durch Berechnung einer linearen Regression mit den Werten des Standardendo toxins.Endotoxin catalyzes the activation of a proenzyme in Limulus amebocyte lysate. Measured cleavage of p-nitroaniline from a colorless substrate. The extent of this Cleavage is recorded photometrically, the correlation between absorption and endoto xin concentration (or activity with analogs) in the range of 0.01-0.1 ng / ml endotoxin linear (comparison with the absorption values of a standard endotoxin). From each sample (solved in pyrogen-free Aqua bidestillata sterilis.) a 1:10 dilution series is prepared. At an empty sample is also carried along with each series of determinations. 100 µl sample or Stan 100 µl Limulus amebocyte lysate are added to the default or blank value. The reaction is after 10 minutes incubation at 37 ° C with 200 ul substrate. After another 3 minutes Incubation, the reaction is stopped with 200 ul 50% acetic acid. After shaking the sample the absorption is measured against a blank value in a spectrophotometer at 405 nm. The determination of the endotoxin content (the endotoxin activity) of the sample as endotoxin units (E U.) is done by calculating a linear regression using the values of the Standardendo toxins.

2. Endotoxin shock induction in the mouse

Der Test erfaßt die Erzeugung eines Endotoxinschocks bzw. eines klinisch ähnlichen Zustandes mit letalem Ausgang durch LPS oder LPS-ähnliche Substanzen in Galactosamin- (GaIN) -sensi bilisierten Mäusen. Männliche C57 bl -Mäuse (6 Tiere pro Kollektiv) erhalten simultan i.p. 8 mg GaIN, gelöst in 0,5 ml PBS, und 0,1 µg LPS aus Salmonella abortus equi (Sigma), gelöst in 0,2 ml physiologischer Kochsalzlösung. Diese Behandlung führt zum Tod aller Tiere innerhalb von 6-12 Stunden (C. Galanos et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76(1979) 5939-5943). Anstelle des LPS im Standardverfahren werden Prüfsubstanzen in verschiedenen Dosierungen simultan mit GaIN bzw. auch vor oder nach der GaIN-Behandlung einmal parenteral verab reicht. Die Beurteilung des Ergebnisses erfolgt anhand eines Vergleiches der geringsten Dosis, die zum Tod aller Tiere einer Gruppe führt, oder durch Berechnung einer LD₅₀ mittels der Spearman-Kärber-Methode. Für die erfindungsgemäßen Verbindungen ergab sich eine LD₅₀ von etwa 50 bis 400µg/kg.The test detects the generation of an endotoxin shock or a clinically similar state with a lethal outcome by LPS or LPS-like substances in galactosamine (GaIN) -sensitized mice. Male C57 bl mice (6 animals per group) simultaneously receive ip 8 mg GaIN, dissolved in 0.5 ml PBS, and 0.1 µg LPS from Salmonella abortus equi (Sigma), dissolved in 0.2 ml physiological saline. This treatment leads to the death of all animals within 6-12 hours (C. Galanos et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76 (1979) 5939-5943). Instead of the LPS in the standard procedure, test substances are administered in different doses simultaneously with GaIN or once parenterally before or after the GaIN treatment. The result is assessed by comparing the lowest dose that leads to the death of all animals in a group or by calculating an LD ₅₀ using the Spearman-Kärber method. An LD ₅₀ of about 50 to 400 μg / kg was found for the compounds according to the invention.

3. Increase in non-specific resistance to microbial septicemia in the neutropenic mouse

Dieses Modell gestattet die Prüfung einer substanzbedingten unspezifischen Abwehrsteigerung in mikrobiell infizierten, neutropenischen Mäusen. Zur Erzeugung einer Neutropenie erhalten je 20 weibliche B₆D₂F₁-Mäuse 1 · 200 mg/kg Körpergewicht Cyclophosphamid in 0,2 ml Aqua dest. gelöst, s.c. am Tag 0 verabreicht. Am Tag 3 wird die Prüfsubstanz, soweit möglich, in physiologischer NaCl-Lösung, ansonsten jedoch auch in anderer Weise gelöst (0,3 ml) paren teral (vorranging i.p.) oder auch peroral verabreicht. Die Infektion erfolgt am Tag 4 durch i.v. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,2 ml (Keimzahl pro Maus z. B. Pseudomonasaeruginosa Δ12: ca. 3·10⁵, E. coli Δ120: ca. 2·10⁶, Staph. aureus Δ113: ca. 2 · 10⁶, Candida albicans Δ124: ca. 2·10⁴). Die Versuchstiere werden bis zum 10. Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die auftretenden Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zu Standards wird die Überlebensrate am Tag 5 nach Infektion als Parameter ausgewertet:
Die Verbindungen der Formel I zeigten sowohl in den experimentellen Infektionen durch gram negative Keime (z. B. Pseudomonas und E. coli) wie auch bei Infektionen durch grampositive Keime (z. B. Staph. aureus) bzw. Hefen (z. B. Candida albicans) nach parenteraler Verabrei chung hinsichtlich Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.This model allows the testing of a substance-related non-specific defense increase in microbially infected, neutropenic mice. To produce neutropenia, 20 female B ₆ D ₂ F ₁ mice were given 1 · 200 mg / kg body weight of cyclophosphamide in 0.2 ml of distilled water. dissolved, administered sc on day 0. On day 3, the test substance is, as far as possible, in physiological NaCl solution, but otherwise also dissolved in another way (0.3 ml) parenterally (primarily ip) or even orally. The infection occurs on day 4 by iv administration of the respective inoculum in a volume of 0.2 ml (number of bacteria per mouse, e.g. Pseudomonasaeruginosa Δ12: approx. 3 × 10 ⁵ , E. coli Δ120: approx. 2 · 10 ⁶ , Staph. Aureus Δ113: approx. 2 · 10⁶, Candida albicans Δ124: approx. 2 · 10 ⁴ ). The experimental animals are observed until the 10th day after infection and the deaths that occur are recorded daily. In comparison to infection control or standards, the survival rate on day 5 after infection is evaluated as a parameter:
The compounds of the formula I showed both in the experimental infections by gram-negative germs (e.g. Pseudomonas and E. coli) and in infections by gram-positive germs (e.g. Staph. Aureus) or yeasts (e.g. Candida albicans) after parenteral administration in terms of survival and survival rate significant improvements compared to the untreated infection control.

4. Activation of human blood neutrophil metabolism

Neutrophile (mindestens 95% Reinheit) werden mit der Prüfsubstanz in drei verschiedenen Konzentrationen für 1 bis 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Freisetzung von Superoxidanionen durch die Zellen als Index für die Aktivierung wird dann als Superoxid Dismutase-inhibierbare Reduktion von Cytochrom C gemessen. 1·10⁶ Neutrophile, mit Testsubstanz vorbehandelt oder nicht, werden dem Cytochrom C (80 µMol) zugesetzt, das Formylmethionyl leucylphenylalanin (10-⁶M) enthält. Die Kontrollen enthalten zusätzlich 50 µg Superoxiddismu tase. Nach 15 Minuten Inkubation bei 37°C wird die Reaktion durch Einbringen der Teströhr chen in ein Eisbad beendet. Sie werden dann schnell bei 400 xg für 5 Minuten zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen. Die Reduktion von Cytochrom C, die proportional der Menge an freige setztem Superoxidanion ist, wird photometrisch bei 550 nm gemessen. Die Hemmwirkung der Prüfsubstanzen bei der PMN-Aktivierung durch LPS wird wie beschrieben gemessen, mit der Maßgabe, daß nach der Vorinkubation der Leukocyten die Zellen weiterhin mit einer stimulie renden Konzentration von LPS inkubiert werden.Neutrophils (at least 95% purity) are incubated with the test substance in three different concentrations for 1 to 2 hours at 37 ° C. The release of superoxide anions by the cells as an index for the activation is then measured as a superoxide dismutase-inhibitable reduction of cytochrome C. 1 · 10 ⁶ neutrophils, pretreated with test substance or not, are added to the cytochrome C (80 μmol), which contains formylmethionyl leucylphenylalanine (10- ⁶ M). The controls additionally contain 50 µg superoxide dismutase. After 15 minutes of incubation at 37 ° C, the reaction is terminated by placing the test tubes in an ice bath. They are then centrifuged rapidly at 400 xg for 5 minutes to separate the cells. The reduction of cytochrome C, which is proportional to the amount of superoxide anion released, is measured photometrically at 550 nm. The inhibitory effect of the test substances in the PMN activation by LPS is measured as described, with the proviso that after the preincubation of the leukocytes, the cells continue to be incubated with a stimulating concentration of LPS.

5. Carbon Clearance Test

Das Prinzip des Tests beruht darauf, daß Partikel in einer Größenordnung von 200-250 A (z. B. Kohlepartikel) aus dem Organismus nur durch Phagozytose der Markophagen eliminiert wer den können. Bei intravenöser Verabreichung von Kohlepartikeln werden diese durch Phagozy tose der Makrophagen in Leber (Kupffer′sche Sternzellen) und Milz aus dem Blutstrom elimi niert. Die Prüfung der RES-Aktivierung einer Substanz erfolgt durch einmalige oder wiederholte Verabreichung als wäßrige Lösung oder als Suspension. Die für die Behandlung vorgesehene Substanzmenge wird entweder in 4 täglichen Einzeldosen oder einmal 24 Stunden vor Testbe ginn i. p. oder s. c. appliziert. Tuschesuspension mit einem 10%igem Gehalt an Gasruß wird mit einer 1%igen Gelatine-NaCl-Lösung auf einen Gehalt von 16 mg Kohle/ml verdünnt. Jede Maus erhält 0,2 ml/20 g Körpergewicht intravenös verabreicht. 3, 6, 9,12 und 15 Minuten nach der intravenösen Verabreichung werden durch Punktion des Orbital plexus 25µl Blut entnommen. Das Blut wird in 2 ml dest. Wasser hämolysiert. Die Kohlekonzentration wird photometrisch bestimmt. Anschließend werden die Tiere getötet und Leber und Milzgewichte bestimmt.The principle of the test is based on the fact that particles in the range of 200-250 A (e.g. Carbon particles) from the organism only by phagocytosis of the markophages who that can. When intravenous administration of carbon particles, these are phagocytically macrophages in the liver (Kupffer's stellate cells) and spleens from the elimi bloodstream kidney. The RES activation of a substance is checked once or repeatedly Administration as an aqueous solution or as a suspension. The one intended for treatment The amount of substance is given either in 4 daily single doses or once 24 hours before the test ginn i. p. or S. c. applied. Ink suspension with a 10% gas black content is included diluted with a 1% gelatin-NaCl solution to a content of 16 mg coal / ml. Every mouse receives 0.2 ml / 20 g body weight administered intravenously. 3, 6, 9, 12 and 15 minutes after the intravenous administration is taken by puncturing the orbital plexus 25µl blood. The blood is distilled in 2 ml. Hemolyzed water. The coal concentration becomes photometric certainly. The animals are then sacrificed and the liver and spleen weights determined.

6. Herpes infection of the mouse

Das Modell der intrakutanen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen. Der Krankheitsverlauf ist prolongiert und ermöglicht die Beobachtung des sequentiellen Auftretens mehrerer Parameter. Es treten herpetische Läsionen an der Infektionsstelle auf, diese ulcerieren, das nächstgelegene Bein wird gelähmt und die Paralyse schreitet fort bis zum Tode. Immunkompetente haarlose Mäuse werden am Tag 0 durch intrakutane Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,025 ml (z. B. 1 · 10⁶ Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1/Maus) intrakutan infiziert. Die Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, (0,1 ml) i.p. verabreicht.The model of intracutaneous herpes infection allows testing of a substance-related defense increase in mice infected with herpes viruses. The course of the disease is prolonged and enables the observation of the sequential occurrence of several parameters. Herpetic lesions appear at the site of infection, ulcerate them, the nearest leg is paralyzed and the paralysis continues until death. Immune-competent hairless mice are infected intracutaneously on day 0 by intracutaneous administration of the respective inoculum in a volume of 0.025 ml (for example 1 × 10 ⁶ plaque-forming units herpes simplex type 1 / mouse). The test substance is administered ip in solution, for example in physiological NaCl (0.1 ml).

Das Modell der systemischen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen. Immunkompetente NMRI-Mäuse werden am Tag 0 durch i.p. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0, 1 ml (z. B. 1,3 · 1⁵ Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1/Maus) infiziert. Die Prüfsub stanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, subkutan verabreicht.The systemic herpes infection model allows testing of a substance-related defense increase in mice infected with herpes viruses. Immunocompetent NMRI mice are infected on day 0 by ip administration of the respective inoculum in a volume of 0.1 ml (for example 1.3 × 15 ⁵ plaque-forming units herpes simplex type 1 / mouse). The test substance is administered subcutaneously in solution, for example in physiological NaCl.

Die Versuchstiere werden bis zum 20. Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die auftre tenden Läsionen, Paralysen und Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zum Standard werden folgende Parameter ausgewertet:The experimental animals are observed up to the 20th day after infection and the daily occurrence tendency lesions, paralyses and deaths. Compared to infection control or the following parameters are evaluated as standard:

a) number of mice with lesions (cumulative),
b) number of mice with paralysis (cumulative),
c) average survival,
d) survival rate.

Die Verbindungen der Formel I zeigten bei einmaliger Gabe zwischen Tag 0 bzw. -1 und +6 in der experimentellen HSV-1-Infektion nach i.p. bzw. subkutaner Verabreichung hinsichtlich Krankheitsverlauf, Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, vergli chen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.When administered once, the compounds of the formula I showed between day 0 or -1 and +6 in the experimental HSV-1 infection after i.p. or subcutaneous administration with regard to Course of disease, survival and survival rate significant improvements, compare with the untreated infection control.

7. Induction of CSF (colony stimulating factor)

CSFs sind Mediatoren, die im Organismus für die Aufrechterhaltung der Haemopoese verant wortlich sind und darüber hinaus vielseitige biologische Funktionen im Netzwerk der Immunab wehrreaktionen besitzen. Die biologische Eigenschaft von Substanzen, CSFs zu induzieren, wird als mögliches therapeutisches Potential angesehen, das zur Behandlung von Patienten zur Steigerung der zellulären Immunabwehr oder zur beschleunigten Rekonstitution des Blutes nach immunsuppressiver Behandlung eingesetzt werden kann. Zur experimentellen Prüfung von CSF induzierenden Eigenschaften werden die Substanzen parenteral (i.p., i.v.) in Dosie rungen von 0,2-50 mg/kg Körpergewicht an B₈D₂F₁-Mäuse appliziert. 4-6 Stunden nach der Therapie werden die Tiere entblutet, das Serum gewonnen und auf CSF-Aktivität untersucht. Der Gehalt des Serums an CSF-Aktivität wird in einem Zellkulturassay bestimmt, bei dem Maus-Knochenmarkszellen aus B₈D₂F₁-Mäusen mit verschiedenen Serumkonzentrationen für 7 Tage inkubiert und anschließend die Proliferationsraten der Zellen im Vergleich zu Negativ kontrollen bestimmt werden (D. Metcalf, The haemopoietic colony stimulating factors, 1984, Elsevier; L.M. Green et al., J. Immunoi. Methods 70, 257-268 (1984)).CSFs are mediators that are responsible for the maintenance of hemopoiesis in the organism and also have versatile biological functions in the network of immune defense reactions. The biological property of substances to induce CSFs is seen as a potential therapeutic potential that can be used to treat patients to increase cellular immune defense or to accelerate the reconstitution of the blood after immunosuppressive treatment. For the experimental testing of CSF-inducing properties, the substances are administered parenterally (ip, iv) in doses of 0.2-50 mg / kg body weight to B ₈ D ₂ F ₁ mice. 4-6 hours after the therapy, the animals are exsanguinated, the serum obtained and examined for CSF activity. The serum content of CSF activity is determined in a cell culture assay in which mouse bone marrow cells from B ₈ D ₂ F ₁ mice with different serum concentrations are incubated for 7 days and then the proliferation rates of the cells compared to negative controls are determined (D. Metcalf, The haemopoietic colony stimulating factors, 1984, Elsevier; LM Green et al., J. Immunoi. Methods 70, 257-268 (1984)).

Verbindungen der Formel I zeigen nach parenteraler Verabreichung in Dosierungen von 0,2 bis 50 mg/kg Körpergewicht nach ein- oder mehrmaliger Applikation Induktion hoher CSF-Aktivitä ten in Mäusen.Compounds of formula I show after parenteral administration in doses from 0.2 to 50 mg / kg body weight after single or repeated application induction of high CSF activity in mice.

8. Induction of Interleukin-1 (IL-1)

Der Nachweis, ob Substanzen Zellen zur IL-1 -Produktion stimulieren können, wird primär in Zellkulturassays geführt. Zunächst werden adhärente Makrophagen von Mäusen gewonnen, sowohl residente als auch mit Thioglycolat "elicited macrophages". Diese werden in RPMI-Me dium bei verschiedenen zu prüfenden Substanzkonzentrationen 24-48 Stunden inkubiert und die Zellüberstände gewonnen. Diese Überstände werden in Thymozytenkulturen von C₃H/HeJ Mäusen auf IL-1 -Aktivität geprüft. Enthalten die Überstände von Makrophagen produziertes IL-1, werden die Thymozyten während einer Inkubation von 72 Stunden zur Proliferation ange regt, die durch Einbau von 3H-Thymidin im Szintillationszähler gemessen wird (J. Gery et al., J. Exp. Med. 136, 128-142(1972); J. Oppenheim et. al., Cellular Immunol. 50, 71-81(1980)). Substanzen der Formel I besitzen in unterschiedlichem Maße (konzentrationsbezogen 0,1-50 µg/ml) die Fähigkeit, IL-1-Produktion in Makrophagen zu induzieren.The proof of whether substances can stimulate cells for IL-1 production is primarily carried out in cell culture assays. Adherent macrophages are first obtained from mice, both resident and with thioglycolate "elicited macrophages". These are incubated in RPMI medium at various substance concentrations to be tested for 24-48 hours and the cell supernatants obtained. These supernatants are tested in thymocyte cultures of C ₃ H / HeJ mice for IL-1 activity. If the supernatants of macrophages contain IL-1 produced, the thymocytes are stimulated to proliferate during an incubation of 72 hours, which is measured by incorporating 3H-thymidine in the scintillation counter (J. Gery et al., J. Exp. Med. 136 , 128-142 (1972); J. Oppenheim et al., Cellular Immunol. 50, 71-81 (1980)). Substances of the formula I have the ability to induce IL-1 production in macrophages to different degrees (concentration-related 0.1-50 µg / ml).

9. Induction of LPS (endotoxin) tolerance (lethality tolerance)

Durch ein- bis dreimalige parenterale Verabreichung von LPS an Mäuse kann eine sogenannte Toleranz erzeugt werden, die die Tiere gegen die nach Galactosamin-Gabe letalen Effekte des LPS schützt (siehe auch Endotoxinschock-Induktion in der Maus).By so-called parenteral administration of LPS to mice one to three times, a so-called Tolerance are generated, which the animals against the lethal effects after the galactosamine administration LPS protects (see also endotoxin shock induction in the mouse).

Mit den Verbindungen der Formel I konnte bereits nach einmaliger i.p. Verabreichung von je 0,25 mg/Maus eine derartige Toleranz ausgelöst werden. Vorbehandelte (tolerante) Mäuse wurden zu verschiedenen Zeiten nach letzter Behandlung (1 Tag bis 3 Wochen) einem LPS- Challenge in einer Dosis von 0,01 µg LPS + 8 mg Galactosamin/Maus i.p. unterworfen. Es überlebten insbesondere nach dreimaliger Verabreichung (täglich eine Verabreichung) ein höherer Prozentsatz der Tiere diese LPS-Belastung im Vergleich zu der unvorbehandelten Challenge-Kontrolle.With the compounds of the formula I, it was possible to use the i.p. Administration of each 0.25 mg / mouse such a tolerance can be triggered. Pretreated (tolerant) mice were given an LPS at different times after the last treatment (1 day to 3 weeks) Challenge in a dose of 0.01 µg LPS + 8 mg galactosamine / mouse i.p. subject. It survived especially after three doses (one daily dosing) higher percentage of animals this LPS exposure compared to the untreated Challenge control.

Weiteres besitzen die Verbindungen der Formel I auch antiinflammatorische Wirkung, insbeson dere bei nichtspezifischen Entzündungen, bei immunologisch induzierten Entzündungen, bei hypersensitiv induzierten Entzündungen und bei allergischen Reaktionen. Diese Wirkung konn te durch verschiedene Testmethoden nachgewiesen werden, beispielsweise durch Untersu chungen der Beeinflussung der Prostaglandinsynthese in vitro und in vivo. In vitro wurde die Hemmung der LPS- und Zymosan-induzierten PGE₂- und PGF₁ α-Freisetzung untersucht. Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-M(⌀) aus der NMRI-Maus wurden 24 Stunden mit LPS bzw. Versuchssubstanz inkubiert. Nach Wechsel des Mediums und dreifachem Waschen der Zellen wurden sie 2 Stunden mit LPS bzw. 1 Stunde mit Zymosan stimuliert. In diesen Überständen wurden PGE₂ und PGF₁ α nachgewiesen. Dabei zeigte sich eine Inhibierung sowohl der durch LPS als auch der durch Zymosan stimulierten PGE₂-Produktion der Zellen. In vivo wurde die Hemmung der LPS-induzierten PGE₂-Freisetzung von Maus-M⌀ nach Vorbehandlung mit Prüfsubstanzen getestet. Jeweils 3 NMRI-Mäuse wurden am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüf substanz i.p. behandelt. Am Tag 4 erhielten diese Tiere und eine Kontrollgruppe 1,5 ml Thiogly colat i.p., am Tag 7 wurden Peritoneal-M⌀ gewonnen und mit LPS stimuliert. Es wurde eine deutliche Reduktion der PGE₂-Freisetzung im Vergleich zur Kontrolle gefunden.Furthermore, the compounds of formula I also have anti-inflammatory activity, in particular in the case of nonspecific inflammation, in immunologically induced inflammation, in hypersensitively induced inflammation and in allergic reactions. This effect could be demonstrated by various test methods, for example by examining the influence of prostaglandin synthesis in vitro and in vivo. The inhibition of LPS and zymosan-induced PGE ₂ and PGF ₁ α release was investigated in vitro. Thioglycolate-stimulated peritoneal M (⌀) from the NMRI mouse was incubated for 24 hours with LPS or test substance. After changing the medium and washing the cells three times, they were stimulated for 2 hours with LPS or 1 hour with Zymosan. PGE ₂ and PGF ₁ α were detected in these supernatants. An inhibition of both LPS and zymosan-stimulated PGE ₂ production of the cells was shown. The inhibition of LPS-induced PGE ₂ release from mouse M⌀ was tested in vivo after pretreatment with test substances. 3 NMRI mice in each case were treated with LPS or test substance ip on day 1, 2 and 3. On day 4 these animals and a control group received 1.5 ml of Thiogly colat ip, on day 7 peritoneal M⌀ were obtained and stimulated with LPS. A significant reduction in PGE ₂ release compared to the control was found.

In einem weiteren Test wird die Beeinflussung der "procoagulant activity" (PCA) untersucht. Nach Stimulation mit LPS synthetisieren humane Endothelzellen PCA, gemessen als Verkür zung der Gerinnungszeit von Plasma. Ebenso verkürzen M⌀ nach LPS-Behandlung sowie Peri tonealleukozyten (gewonnen von Kaninchen) nach Auslösen der generellen Shwartzman- Reaktion die Gerinnungszeit von recalzifiziertem Plasma. Zur Untersuchung der Beeinflussung der durch LPS generierten PCA in vitro wurden Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-M⌀ von B₆D₂F₁-Mäusen in einem Versuchsdesign (a) über Nacht mit LPS allein bzw. mit LPS und Prüf substanz in DMEM Medium ohne fötales Kälberserum (FCS) behandelt. Im Versuchsdesign (b) wurden ebensolche Maus-M⌀ 24 Stunden lang mit LPS bzw. Prüfsubstanz behandelt und nach Mediumwechsel über Nacht mit LPS stimuliert. Die Gerinnungszeit von recalzifiziertem huma nen Kontrollplasma nach Zugabe der mehrfach eingefrorenen und ultrabeschallten M⌀-Su spension wurde mittels Häkchenmethode gemessen. Zugabe von Prüfsubstanz reduziert die durch LPS ausgelöste PCA unter jene des Kontrollwertes (Verlängerung der Gerinnungszeit). Ebenso führt Vorbehandlung mit Prüfsubstanz zu einer Reduzierung der PCA.In another test, the influence on the "procoagulant activity" (PCA) is examined. After stimulation with LPS, human endothelial cells synthesize PCA, measured as a reduction in the clotting time of plasma. M⌀ after LPS treatment and peritoneal leukocytes (obtained from rabbits) also shorten the clotting time of recalcified plasma after triggering the general Shwartzman reaction. To investigate the influence of the PCA generated by LPS in vitro, thioglycolate-stimulated peritoneal M⌀ of B ₆ D ₂ F ₁ mice were tested overnight in a test design (a) with LPS alone or with LPS and test substance in DMEM medium without fetal calf serum (FCS) treated. In the experimental design (b), such mouse M⌀ were treated with LPS or test substance for 24 hours and stimulated with LPS overnight after changing the medium. The clotting time of recalcified human control plasma after the addition of the multiply frozen and ultrasonically exposed M⌀ suspension was measured using the tick method. Addition of test substance reduces the PCA triggered by LPS below that of the control value (extension of the clotting time). Pretreatment with test substance also leads to a reduction in PCA.

In vivo konnte die Beeinflussung der LPS-induzierten PCA von Maus-Peritonealleukozyten nach Vorbehandlung der Tiere mit Prüfsubstanz folgendermaßen gezeigt werden: B₆D₂F₁-Mäuse wurden am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz, intraperitoneal verabreicht, behandelt. Zusätzlich erhielten alle Tiere am Tag 3 1,5 ml Thioglycolat i p. Am Tag 6 wurden Peritoneal- M⌀ gewonnen, die Probe jedes Tieres auf 1 · 10⁶/ml Zellen eingestellt und 24 Stunden lang mit LPS in DMEM Medium ohne FCS stimuliert. Die PCA dieser Zellen wurde, wie oben beschrie ben, bestimmt. Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz erbringt eine deutlich verringer te PCA. Ein ähnlicher Befund konnte bei Vorversuchen mit Kaninchen erhoben werden. Auch die PCA von peritonealen Kaninchenleukozyten nach Auslösen der generellen Shwartzman- Reaktion konnte durch Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz verringert werden.In vivo, the influence on the LPS-induced PCA of mouse peritoneal leukocytes after pretreatment of the animals with test substance could be shown as follows: B ₆ D ₂ F ₁ mice were treated on day 1, 2 and 3 with LPS or test substance, administered intraperitoneally . In addition, all animals received 1.5 ml of thioglycolate i p on day 3. Peritoneal M Per were obtained on day 6, the sample of each animal was adjusted to 1 × 10 ⁶ / ml cells and stimulated for 24 hours with LPS in DMEM medium without FCS. The PCA of these cells was determined as described above. Pretreatment with LPS or with test substance results in a significantly reduced PCA. A similar finding was found in preliminary experiments with rabbits. The PCA of peritoneal rabbit leukocytes after triggering the general Shwartzman reaction could also be reduced by pretreatment with LPS or with test substance.

Weiters besitzen die Verbindungen der Formel I auch Wirkung gegen Tumore, wie in den fol genden Modellversuchen nachgewiesen werden konnte:Furthermore, the compounds of formula I also have activity against tumors, as in the fol The following model tests could be demonstrated:

1. Investigation of the induction of tumor necrosis factor (TNF)

Die TNF-Induktion wurde in Maus-Knochenmark-Zellkulturen untersucht. Hierfür wurden Kno chenmarkszellen von BDF₁ Mäusen für 8-10 Tage in Teflonsäckchen in Proliferationsmedium (DMEM H21 +10% FCS +5% Pferdeserum +15% L 929 Zellüberstand = CSF + Penicillin 10 Units/ml und Streptomycin 100 µg/ml) kultiviert. Durch Zentrifugationsschritte wurden die Zellen anschließend gewaschen und im Induktionsmedium (RPMI 1640+5% FCS + Penicillin 10 U/ml+Streptomycin 100 µg/ml + 1% Glutamin) auf 1·10⁶ Zellen/ml verdünnt, je 1 ml/Vertie fung in Costarplatten mit 24 Vertiefungen aufgeteilt und 24 Stunden mit und ohne rm Interferon gamma (100 units/ml) bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Die Zellkulturen wurden jetzt mit Induktions medium ohne FCS 2 · gewaschen und für 4 Stunden mit den im gleichen Medium verdünnten Substanzen im Konzentrationsbereich von 0,1-100 µg/ml (1 : 10 Verdünnungsstufen) inkubiert. TNF induction was examined in mouse bone marrow cell cultures. For this, bone marrow cells from BDF ₁ mice were cultivated for 8-10 days in Teflon bags in proliferation medium (DMEM H21 + 10% FCS + 5% horse serum + 15% L 929 cell supernatant = CSF + penicillin 10 units / ml and streptomycin 100 µg / ml) . The cells were then washed by centrifugation and diluted to 1 × 10 ⁶ cells / ml in the induction medium (RPMI 1640 + 5% FCS + penicillin 10 U / ml + streptomycin 100 µg / ml + 1% glutamine), each 1 ml / well divided into 24-well Costar plates and incubated for 24 hours with and without rm interferon gamma (100 units / ml) at 37 ° C / 5% CO ₂ . The cell cultures were now washed with induction medium without FCS 2 × and incubated for 4 hours with the substances diluted in the same medium in the concentration range from 0.1-100 µg / ml (1:10 dilution levels).

Die Überstände werden geerntet und bei -70°C eingefroren oder direkt auf TNF-Aktivität un tersucht (Sayers, T.J. et al., J. Immunol. 136, 2935-2940 (1987)).The supernatants are harvested and frozen at -70 ° C or directly for TNF activity (Sayers, T.J. et al., J. Immunol. 136, 2935-2940 (1987)).

Die Substanzen der Formel I zeigen im Vergleich zu Lipopolysaccharid (LPS) von Salmonella abortus equi relativ hohe TNF-α Induktion, was auf ein relativ hohes endotoxisches Potential schließen läßt aber auch eine hohe Aktivierung der Makrophagen für die Immunabwehr anzeigt.The substances of formula I show compared to Salmonella lipopolysaccharide (LPS) abortus equi relatively high TNF-α induction, indicating a relatively high endotoxic potential also suggests a high activation of the macrophages for the immune defense indicates.

Zur Stimulierung von Mäuse-Knochenmarksmakrophagen werden Knochenmarkszellen von BDF₁ Mäusen (ca. 10-13 Tage alt, mit CSF induziert) auf 1·10⁶ Zellen/ml in Medium (RPMI 1640+1% Pen/Strep (5000 U/lm)+1% Glutamin) verdünnt und in flachen Mikrotiterplatten mit den Substanzlösungen im Konzentrationsbereich 100 µg bis 0,1 µg/ml Endkonzentration (1 : 10 Verdünnungsstufen) 4 Stunden bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Nach Filtration durch 0,45 µm Filter werden die Überstände bis zur Durchführung des TNF-Tests bei -70°C eingefroren.Bone marrow cells from BDF ₁ mice (approx. 10-13 days old, induced with CSF) are stimulated to 1 × 10 ⁶ cells / ml in medium (RPMI 1640 + 1% pen / strep (5000 U / lm) to stimulate mouse bone marrow macrophages. + 1% glutamine) and diluted in flat microtiter plates with the substance solutions in the concentration range 100 µg to 0.1 µg / ml final concentration (1:10 dilution levels) for 4 hours at 37 ° C / 5% CO ₂ . After filtration through a 0.45 µm filter, the supernatants are frozen at -70 ° C until the TNF test is carried out.

In Mikrotiterplatten werden L929 Zellen zu 3 · 1⁴ Zellen/Näpfchen/100 µl über Nacht vorkulti viert (37°C/5% CO₂), mit 100 µl der jeweiligen Probe versetzt und in Serie in 1 : 2 Stufen weiter verdünnt. Nach Zugabe von 100 µl Actinomycin D (1 µg/ml Medium) in jedes Näpfchen wird weitere 18 Stunden bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Nach Entfernen der Überstände wird der ver bliebene Zellrasen mit Giemsa-Lösung gefärbt und die Absorption bei 620 nm am Titertek Multiskan Autoreader (Flow) gemessen. Eine Einheit TNF ist definiert als jene Aktivität, welche eine 50%ige Lyse der L929 Targetzellen hervorruft. Als positive Kontrolle wird in jedem Assay ein TNF-Standard (rec. murine TNF from Genzyme) mit einer Ausgangskonzentration von 1000 units TNF/ml mitgeführt. Angaben in internalen Unit TNF human beziehen sich auf Vergleiche mit TNF-human (rec. DNA) code number 86/659 from W.H.O. international Laborstory for bio logical standards, Herdfordshire, EN6 3QG.L929 cells are precultivated to 3 × 1 ⁴ cells / well / 100 μl in microtiter plates (37 ° C./5% CO ₂ ), mixed with 100 μl of the respective sample and further diluted in series in 1: 2 steps. After adding 100 µl actinomycin D (1 µg / ml medium) to each well, incubation is continued at 37 ° C / 5% CO _{2 for} 18 hours. After removing the supernatants, the remaining cell lawn is stained with Giemsa solution and the absorption at 620 nm is measured on the Titertek Multiskan Autoreader (Flow). One unit of TNF is defined as the activity that causes 50% lysis of the L929 target cells. A TNF standard (rec. Murine TNF from Genzyme) with an initial concentration of 1000 units TNF / ml is carried as a positive control in each assay. Figures in the internal unit TNF human refer to comparisons with TNF-human (rec. DNA) code number 86/659 from WHO international Labor story for bio logical standards, Herdfordshire, EN6 3QG.

2. B16Ft melanoma test

B16F1 Melanom Zellen werden 5 Tage in vitro gezüchtet. Einen Tag vor dem Versuch werden die Zellen durch Aufbrechen der Monolayer in einzelne Zellen, unter Verwendung von EDTA Trypsin, und Rückführung der Gesamtmenge in die gleiche Flasche mit neuem Medium syn chronisiert. Die Zellen werden gezählt und auf 10⁶/ml Medium eingestellt. 0,1 ml Zellsuspen sion (105 Zellen) werden intravenös in die Schwanzvene injiziert. 21 Tage danach werden die Mäuse getötet und die Anzahl der Tumore in der Lunge bestimmt. Für diesen Test werden B₈D₂F₁ Mäuse eingesetzt. Die Prüfsubstanz wird gelöst und an den Tagen -6,-4 und -1 intra perltoneal injiziert. Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Substanzen der Formel immunoprophylaktische Wirkung besitzen, die Anzahl der B16F1 Melanommetastasen in der Lunge wurde verringert. Zur Überprüfung der therapeutischen Aktivität wurden die Mäuse am 3., 6., 8., 10., 13. und 15. Tag nach der Tumorzelleninokulation behandelt. Auch hier zeigte sich eine deutliche Reduktion der Metastasenbildung.B16F1 melanoma cells are grown in vitro for 5 days. One day before the experiment, the cells are synchronized by breaking up the monolayer into individual cells using EDTA trypsin and returning the total amount to the same bottle with new medium. The cells are counted and adjusted to 10 ⁶ / ml medium. 0.1 ml of cell suspension (105 cells) are injected intravenously into the tail vein. The mice are sacrificed 21 days later and the number of tumors in the lungs is determined. B ₈ D ₂ F ₁ mice are used for this test. The test substance is dissolved and injected intra pearl tone on days -6, -4 and -1. It has been shown that the substances of the formula according to the invention have immunoprophylactic activity, the number of B16F1 melanoma metastases in the lungs has been reduced. To check the therapeutic activity, the mice were treated on the 3rd, 6th, 8th, 10th, 13th and 15th day after tumor cell inoculation. Here, too, there was a clear reduction in metastasis.

Die Verbindungen der Formel I können daher als Modulatoren der unspezifischen antimikrobiel len Resistenz eingesetzt werden, zur systemischen Steigerung der Immunantwort und zur Stei gerung der unspezifischen Immunität. Verbindungen der Formel I sind somit indiziert, z. B. für die Behandlung oder supportive Behandlung (d h. zusammen mit anderen spezifisichen oder supportiven Therapieformen) von Zuständen bei herabgesetzter Immunantwort, insbesondere bei herabgesetzter humoraler Immunantwort und/oder herabgesetzter Überempfindlichkeits reaktion vom verzögerten Typ und zur Behandlung von Zuständen, bei welchen in sonstiger Weise eine Modulation der Immunantwort wünschenswert ist. Im speziellen sind Verbindungen der Formel I indiziert zur Behandlung oder supportiven Behandlung von Krankheitszuständen aufgrund idiopathischer Immundefizienzen oder Immundefizienzen von der Art, wie sie bei ge riatrischen Patienten auftreten, oder bei Patienten mit schweren Verbrennungen oder general isierten Infektionen. Die Verbindungen der Formel I sind gleichfalls indiziert für die Behandlung oder supportive Behandlung viraler Erkrankungen (wie disseminierten Herpes, progressive Pockenerkrankungen und disseminierte Varizellenerkrankungen) sowie auch von Morbus Hodgkin und anderen malignen Tumoren. Außerdem eignen sich die Verbindungen der Formel für die Prophylaxe des Endotoxinschocks, z. B. bei Unfällen, Verbrennungen und chirurgischen Eingriffen, sowie als antiinflammatorische Mittel.The compounds of the formula I can therefore act as modulators of the non-specific antimicrobial Resistance can be used to systemically increase the immune response and to increase the resistance increase in non-specific immunity. Compounds of formula I are thus indicated, e.g. B. for the treatment or supportive treatment (i.e. together with other specific or supportive forms of therapy) of conditions with reduced immune response, in particular with a reduced humoral immune response and / or reduced hypersensitivity reaction of the delayed type and for the treatment of conditions in which in other Modulation of the immune response is desirable. Connections in particular of formula I indicated for the treatment or supportive treatment of disease states due to idiopathic immunodeficiencies or immunodeficiencies of the type as in ge riatric patients occur, or in patients with severe burns or general infections. The compounds of formula I are also indicated for the treatment or supportive treatment of viral diseases (such as disseminated herpes, progressive Smallpox and disseminated varicella) and also from disease Hodgkin and other malignant tumors. The compounds of the formula are also suitable for the prophylaxis of endotoxin shock, e.g. B. in accidents, burns and surgical Interventions, as well as anti-inflammatory agents.

Für die genannten Anwendungen ist die indizierte parenterale Dosis zwischen ca. 0,1 mg und ca. 70 mg, einmal verabreicht zur Erzielung eines Adjuvanseffektes, z. B. bei supportiver Be handlung, oder täglich, wobei im letzteren Fall die Dosis auf 2 bis 4 Verabreichungen pro Tag aufgeteilt oder in Retardform gegeben wird. Indizierte Dosiseinheiten für die Verabreichung enthalten daher zwischen ca. 0,025 und ca. 35 mg Substanz der Formel 1, wenn tägliche Verabreichung, oder bis zu 70 mg Substanz der Formel I, wenn eine einzelne, adjuvante Be handlung gewünscht wird.For the applications mentioned, the indicated parenteral dose is between approx. 0.1 mg and approx. 70 mg, administered once to achieve an adjuvant effect, e.g. B. with supportive loading action, or daily, in the latter case the dose to 2 to 4 administrations per day divided or given in extended release. Indicated dose units for administration therefore contain between approx. 0.025 and approx. 35 mg substance of formula 1, if daily Administration, or up to 70 mg of substance of formula I if a single, adjuvant Be action is desired.

Aufgrund ihrer immunmodulierenden Aktivität eignen sich Verbindungen der Formel I auch als Adjuvantien für Vakzine. Für diese Verwendungsart ist eine indizierte Dosis zwischen 0,5 und 100 mg, vorzugsweise ca. 70 mg, verabreicht am Tage der Impfung mit einer möglichen Wie derholung bei gleicher Dosis 2 bis 4 Wochen später.Because of their immunomodulating activity, compounds of the formula I are also suitable as Adjuvants for vaccines. For this type of use an indicated dose is between 0.5 and 100 mg, preferably about 70 mg, administered on the day of vaccination with a possible how repeat at the same dose 2 to 4 weeks later.

Insbesondere bevorzugt für die oben angeführten Verwendungsarten ist die 4(S)-[3(R)-Hy droxytetradecanoylamido]-5-[3(R)-tetradecanoyloxytetradecanoyloxy] pentansäure.4 (S) - [3 (R) -Hy is particularly preferred for the types of use mentioned above droxytetradecanoylamido] -5- [3 (R) -tetradecanoyloxytetradecanoyloxy] pentanoic acid.

Pharmazeutische Bereitungen, enthaltend die Verbindungen der Formel 1, können gemäß gale nischen Standardverfahren, z. B. durch Vermischen mit konventionellen. pharmazeutisch un bedenklichen Verdünnungsmitteln oder Trägersubstanzen, hergestellt werden. Solche Berei tungen können beispielsweise in Form von injizierbaren Lösungen hergestellt werden und bil den ebenfalls einen Teil der Erfindung.Pharmaceutical preparations containing the compounds of formula 1 can according to gale African standard procedures, e.g. B. by mixing with conventional. pharmaceutical un questionable diluents or carriers. Such area lines can be prepared, for example, in the form of injectable solutions and bil also part of the invention.

Die Erfindung betrifft daher auch eine Methode zur Bekämpfung von Erkrankungen und Infektio nen, wie sie oben beschrieben sind, durch Verabreichung einer wirksamen Menge einer Ver bindung der Formel I oder eines chemotherapeutisch verträglichen Salzes davon an den Kran ken, sowie die Verbindungen der Formel I zur Verwendung als chemotherapeutische Mittel, insbesondere als Immunmodulatoren, als antivirale Mittel und als antiinflammatorische Mittel.The invention therefore also relates to a method for combating diseases and infection as described above by administering an effective amount of a ver binding of formula I or a chemotherapeutically acceptable salt thereof to the crane ken, and the compounds of the formula I for use as chemotherapeutic agents, in particular as immunomodulators, as antiviral agents and as anti-inflammatory agents.

In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, ihren Umfang jedoch in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.In the following examples, which explain the invention in more detail, however, its scope in should not restrict in any way, all temperatures are given in degrees Celsius.

example 1 4 (S) - [3 (R) -hydroxytetradecanoylamido] -5- [3 (R) -tetradecanoyloxytetrad-e canoyloxy] pentanoic acid

1,77 g 4(S)-[3(R)-Benzyloxytetradecanoylamido]-5-[3(R)-tetradecanoyloxytetr-adecanoyl oxy]pentansäurebenzylester werden in 400 ml Tetrahydrofuran über 500 mg Palladium-Aktivkohle (10%) über Nacht hydriert. Zur Reinigung wird chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol/Eisessig/Wasser = 93/7/0,5/0,5).1.77 g of 4 (S) - [3 (R) -benzyloxytetradecanoylamido] -5- [3 (R) -tetradecanoyloxytetr-adecanoyl benzyl oxy] pentanoate are in 400 ml of tetrahydrofuran over 500 mg of palladium-activated carbon (10%) hydrogenated overnight. For purification, it is chromatographed (methylene chloride / methanol / glacial acetic acid / water = 93/7 / 0.5 / 0.5).

Rf (Chloroform/Methanol/Eisessig/Wasser = 80/8/1/1) = 0,47
¹H-NMR (CDCl₃(CD₃OD = 1/1): 5,23 (m, 1 H, CHOCO); 4,1 (m, 1 H, Hα); 3,95 (m, 1 H, CHOH); 0,89 (t, 9 H, 3×CH₃).Rf (chloroform / methanol / glacial acetic acid / water = 80/8/1/1) = 0.47
1 H-NMR (CDCl₃ (CD₃OD = 1/1): 5.23 (m, 1 H, CHOCO); 4.1 (m, 1 H, Hα); 3.95 (m, 1 H, CHOH); 0 , 89 (t, 9H, 3 × CH₃).

Example 2 4 (S) - [3 (R) -hydroxytetradecanoylamido] -5- [3 (R) - (3 (R) -hydroxytetradeca-noyl oxy) tetradecanoyloxy] pentanoic acid

250 mg 4(S)-[3(R)-Benzyloxytetradecanoylamido]-5-[3(R)-(3(R)-benzyloxytetra-decanoyl oxy)tetradecanoyloxy]pentansäure werden in 50 ml Tetrahydrofuran/Wasser (9/1) über 80 mg Palladium-Aktivkohle (10%) über Nacht hydriert. Zur Reinigung wird chromatographiert (Chloroform/Methanol/Eisessig/Wasser = 80/8/1/1).250 mg of 4 (S) - [3 (R) -benzyloxytetradecanoylamido] -5- [3 (R) - (3 (R) -benzyloxytetra-decanoyl oxy) tetradecanoyloxy] pentanoic acid in 50 ml of tetrahydrofuran / water (9/1) over 80 mg palladium-activated carbon (10%) hydrogenated overnight. Chromatograph for cleaning (Chloroform / methanol / glacial acetic acid / water = 80/8/1/1).

Rf (Chloroform/Methanol/Eisessig/Wasser = 80/8/1/1) = 0,50
¹H-NMR (CDCl₃/CD₃OD = 1/1): 5,28 (m, 1 H, CHOCO); 4,15 (m, 1 H, Hα); 4,05 (m, 1 H, CHOH); 0,90 (t, 9 H, 3×CH₃).Rf (chloroform / methanol / glacial acetic acid / water = 80/8/1/1) = 0.50
1 H NMR (CDCl₃ / CD₃OD = 1/1): 5.28 (m, 1 H, CHOCO); 4.15 (m, 1H, Hα); 4.05 (m, 1H, CHOH); 0.90 (t, 9H, 3 × CH₃).

Example 3 4 (R) - [3 (R) -hydroxytetradecanoylamido] -5- [3 (R) - (3 (R) -hydroxytetradeca-noyl oxy) tetradecanoyloxy] pentanoic acid

240 mg 4(R)-[3(R)-Benzyloxytetradecanoylamido]-5-[3(R)-(3(R)-benzyloxytetra-decanoyl oxy)tetradecanoyloxy]pentansäure werden in 80 ml Tetrahydrofuran/Wasser (9/1) über 80 mg Palladium-Aktivkohle (10%) über Nacht hydriert. Zur Reinigung wird chromatographiert (Chloroform/Methanol/Eisessig/Wasser = 80/8/1/1).240 mg 4 (R) - [3 (R) -benzyloxytetradecanoylamido] -5- [3 (R) - (3 (R) -benzyloxytetra-decanoyl oxy) tetradecanoyloxy] pentanoic acid in 80 ml of tetrahydrofuran / water (9/1) over 80 mg palladium-activated carbon (10%) hydrogenated overnight. Chromatograph for cleaning (Chloroform / methanol / glacial acetic acid / water = 80/8/1/1).

Rf (Chloroform/Methanol/Eisessig/Wasser = 80/8/1/1) = 0,55
¹H-NMR (CDCl₃/CD₃OD = 1/1): 5,30 (m, 1 H, CHOCO); 4,15 (m, 1 H, Hα); 4,0 (m, 1 H, CHOH); 0,89 (t, 9 H, 3×CH₃).Rf (chloroform / methanol / glacial acetic acid / water = 80/8/1/1) = 0.55
1 H-NMR (CDCl₃ / CD₃OD = 1/1): 5.30 (m, 1 H, CHOCO); 4.15 (m, 1H, Hα); 4.0 (m, 1H, CHOH); 0.89 (t, 9H, 3xCH₃).

Die als Ausgangsprodukt benötigten Verbindungen können folgendermaßen erhalten werden:The compounds required as the starting product can be obtained as follows:

A) 4 (S) - [3 (R) -benzyloxytetradecanoylamido] -5- [3 (R) -tetradecanoyloxytetr-adecanoyl oxy] benzyl pentanoate a) 4 (S) -tert.-butoxycarbonylamino-5- [3 (R) -tetradecanoyloxytetradecanoyl-oxy] pentanoic acid vine cell ester

970 mg 4(S)-tert.-Butoxycarbonylamino-5-hydroxypentansäurebenzylester und 1,46 g 3(R)-Tetradecanoyloxytetradecansäure, gelöst in 40 ml trockenem Methylenchlorid, werden bei 0° mit 660 mg N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid und einer Spatelspitze 4-Dimethylaminopyridin versetzt. Nach 2 Stunden entfernt man die Kühlung und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Man filtriert, dampft ein und chromatographiert (Toluol/Essigester = 9/1).970 mg of 4 (S) -tert.-butoxycarbonylamino-5-hydroxypentanoic acid benzyl ester and 1.46 g 3 (R) -tetradecanoyloxytetradecanoic acid, dissolved in 40 ml of dry methylene chloride at 0 ° with 660 mg N, N'-dicyclohexylcarbodiimide and a spatula tip 4-dimethylaminopyridine transferred. After 2 hours, the cooling is removed and the mixture is stirred overnight at room temperature. It is filtered, evaporated and chromatographed (toluene / ethyl acetate = 9/1).

Rf (Toluol/Essigester = 4/1) = 0,6
¹H-NMR (CDCl₃): 7,3 (m, 5 H, H_arom); 5,2 (m, 1 H, HCOCO); 5,13 (s, 2 H, COOCH₂Ph); 4,68 (d, 1 H, NH); 4,08 (m, 1 H, Hα); 3,87 (m, 1 H, OCH₂Bn); 1,44 (s, 9 H, tert.-Bu); 0,89 (t, 6 H, 2×CH₃).Rf (toluene / ethyl acetate = 4/1) = 0.6
1 H-NMR (CDCl₃): 7.3 (m, 5 H, H _aroma ); 5.2 (m, 1H, HCOCO); 5.13 (s, 2H, COOCH₂Ph); 4.68 (d, 1H, NH); 4.08 (m, 1H, Hα); 3.87 (m, 1H, OCH₂Bn); 1.44 (s, 9H, tert-Bu); 0.89 (t, 6H, 2x CH₃).

b) 4 (S) -Amino-5- [3 (R) -tetradecanoyloxytetradecanoyloxy] pentanoic acid benzyl ester

Eine Lösung von 2,2 g 4(S)-tert.-Butoxycarbonylamino-5-[3(R)-tetradecanoyloxytetradecanoyl-oxy]pentansäurebenzylester und 5 ml Trifluoressigsäure in 100 ml Methylenchlorid wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend eingedampft. Das Rohprodukt wird ohne Reinigung sofort weiter umgesetzt.A solution of 2.2 g of 4 (S) -tert.-butoxycarbonylamino-5- [3 (R) -tetradecanoyloxytetradecanoyl-oxy] pentanoic acid benzyl ester and 5 ml of trifluoroacetic acid in 100 ml of methylene chloride Stirred for 2 hours at room temperature and then evaporated. The raw product is immediately implemented without cleaning.

Rf (Chloroform/Methanol = 15/1) = 0,34Rf (chloroform / methanol = 15/1) = 0.34

c) 4 (S) - [3 (R) -benzyloxytetradecanoylamido] -5- [3 (R) -tetradecanoyloxytetr-adecanoylo xy] benzyl pentanoate

Eine Lösung von 2,1 g (4(S)-Amino-5-[3(R)-tetradecanoyloxytetradecanoyloxy]pentansäurebenz-ylester (Rohprodukt), 1,24 g 3(R)-Benzyloxytetradecansäurehydroxysuccinimidester und 0,6 ml N-Ethyldiisopropylamin in 15 ml trockenem Dimethylformamid wird 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Eindampfen chromatographiert man (Toluol/Essigester = 14/1).A solution of 2.1 g (4 (S) -amino-5- [3 (R) -tetradecanoyloxytetradecanoyloxy] benzyl pentanoate (Crude product), 1.24 g of 3 (R) -benzyloxytetradecanoic acid hydroxysuccinimide ester and 0.6 ml of N-ethyldiisopropylamine in 15 ml of dry dimethylformamide is added for 18 hours Room temperature stirred. After evaporation, chromatograph (toluene / ethyl acetate = 14/1).

Rf (Toluol/Essigester = 4/1) = 0,48
¹H-NMR (CDCl₃): 7,3 (m, 10 H, H_arom); 6,39 (d, 1 H, NH); 5,19 (m, 1 H, HCOCO); 5,1 (s, 2 H, COOCH₂Ph); 4,53 (d, 2 H, OCH₂Ph); 4,22 (m, 1 H, Hα); 3,84 (m, 1 H, CHOBn); 0,89 (t, 9 H, 3×CH₃).Rf (toluene / ethyl acetate = 4/1) = 0.48
1 H-NMR (CDCl₃): 7.3 (m, 10 H, H _aroma ); 6.39 (d, 1H, NH); 5.19 (m, 1H, HCOCO); 5.1 (s, 2H, COOCH₂Ph); 4.53 (d, 2H, OCH₂Ph); 4.22 (m, 1H, Hα); 3.84 (m, 1H, CHOBn); 0.89 (t, 9H, 3xCH₃).

B) 4 (S) - [3 (R) -benzyloxytetradecanoylamido] -5- [3 (R) - (3 (R) -benzyloxytetra-decanoylo xy) tetradecanoyloxy] pentanoic acid a) 4 (S) -tert.-Butoxycarbonylamino-5- [3 (R) - (3 (R) -benzyloxytetradecanoylo-xy) tetradeca noyloxy] benzyl pentanoate

Unter Verwendung von 323 mg 4(S)-tert.-Butoxycarbonylamino-5-[3(R)-tetradecanoyloxyte tradecanoyloxy]pentansäurebenzylester und 590 mg 3(R)-[3(R)-Benzyloxytetradecanoyloxy]tetradecansäure verfährt man analog wie unter A/a) beschrieben.Using 323 mg of 4 (S) tert-butoxycarbonylamino-5- [3 (R) tetradecanoyloxyte tradecanoyloxy] benzyl pentanoate and 590 mg 3 (R) - [3 (R) -benzyloxytetradecanoyloxy] tetradecanoic acid the procedure is analogous to that described under A / a).

Rf (Toluol/Essigester = 4/1) = 0,67
¹H-NMR (CDCl₃): 7,3 (m, 10 H, H_arom); 5,23 (m, 1 H, HCOCO); 5,13 (s, 2 H, COOCH₂Ph); 4,66 (d, 1 H, NH); 4,54 (d, 2 H, OCH₂Ph); 4,08 (m, 1 H, Hα); 3,87 (m, 1 H, CHOBn); 1,44 (s, 9 H, tert.-Bu); 0,89 (t, 6 H, 2×CH₃).Rf (toluene / ethyl acetate = 4/1) = 0.67
1 H-NMR (CDCl₃): 7.3 (m, 10 H, H _aroma ); 5.23 (m, 1H, HCOCO); 5.13 (s, 2H, COOCH₂Ph); 4.66 (d, 1H, NH); 4.54 (d, 2H, OCH₂Ph); 4.08 (m, 1H, Hα); 3.87 (m, 1H, CHOBn); 1.44 (s, 9H, tert-Bu); 0.89 (t, 6H, 2x CH₃).

b) 4 (S) -Amino-5- [3 (R) - (3 (R) -benzyloxytetradecanoyloxy) tetradecanoyloxy] pentanoic acid benzyl ester

Man verfährt analog wie unter A/b) beschrieben.The procedure is analogous to that described under A / b).

Rf (Chloroform/Methanol = 15/1) = 0,47Rf (chloroform / methanol = 15/1) = 0.47

c) 4 (S) - [3 (R) -benzyloxytetradecanoylamido] -5- [3 (R) -3 (R) -benzyloxytetrad-ecanoyl oxy) tetradecanoyloxy] pentanoic acid

Man verfährt analog wie unter A/c) beschrieben.The procedure is analogous to that described under A / c).

Rf (Toluol/Essigester = 4/1 ) = 0,42
¹H-NMR (CDCl₃): 7,3 (m, 15 H, H_arom); 6,3 (d, 1 H, NH); 5,2 (m, 1 H, HCOCO); 5,09 (s, 2 H, COOCH₂Ph); 4,53 (2×d, 4 H, 2×OCH₂Ph); 4,2 (m, 1 H, Hα); 3,85 (m, 1 H, CHOBn); 0,88 (t, 9 H, 3×CH₃).Rf (toluene / ethyl acetate = 4/1) = 0.42
1 H NMR (CDCl₃): 7.3 (m, 15 H, H _aroma ); 6.3 (d, 1H, NH); 5.2 (m, 1H, HCOCO); 5.09 (s, 2H, COOCH₂Ph); 4.53 (2 x d, 4 H, 2 x OCH₂Ph); 4.2 (m, 1H, Hα); 3.85 (m, 1H, CHOBn); 0.88 (t, 9H, 3xCH₃).

C) 4 (R) - [3 (R) -benzyloxytetradecanoylamido] -5- [3 (R) - (3 (R) -benzyloxytetra-decanoyl oxy) tetradecanoyloxy] pentanoic acid a) 4 (R) -tert.-butoxycarbonylamino-5- [3 (R) - (3 (R) -benzyloxytetradecanoylo-xy) tetradeca noyloxy] benzyl pentanoate

Unter Einsatz von 323 mg 4(R)-tert.-Butoxycarbonylamino-5-[3(R)-tetradecanoyloxytetradecanoyl-oxy]pentansäurebenzylester und 590 mg 3(R)-[3(R)-Benzyloxytetradecanoyloxy]tetradecansäure verfährt man analog wie unter A/a) beschrieben.Using 323 mg of 4 (R) -tert.-butoxycarbonylamino-5- [3 (R) -tetradecanoyloxytetradecanoyl-oxy] pentanoic acid benzyl ester and 590 mg of 3 (R) - [3 (R) -benzyloxytetradecanoyloxy] tetradecanoic acid the procedure is analogous to that described under A / a).

Rf (Toluol/Essigester = 4/1) = 0,68
¹H-NMR (CDCl₃): 7,3 (m, 10 H, H_arom); 5,28 (m, 1 H, HCOCO); 5,13 (s, 2 H, COOCH₂Ph); 4,78 (d, 1 H, NH); 4,54 (d, 2 H, OCH₂Ph); 4,02 (m, 1 H, Hα); 3,87 (m, 1 H, CHOBn); 1,44 (s, 9 H, tert.-Bu); 0,89 (t, 9 H, 2×CH₃).Rf (toluene / ethyl acetate = 4/1) = 0.68
1 H-NMR (CDCl₃): 7.3 (m, 10 H, H _aroma ); 5.28 (m, 1H, HCOCO); 5.13 (s, 2H, COOCH₂Ph); 4.78 (d, 1H, NH); 4.54 (d, 2H, OCH₂Ph); 4.02 (m, 1H, Hα); 3.87 (m, 1H, CHOBn); 1.44 (s, 9H, tert-Bu); 0.89 (t, 9H, 2x CH₃).

b) 4 (R) -amino-5- [3 (R) - (3 (R) -benzyloxytetradecanoyloxy) tetradecanoyloxy] pentanoic acid vine cell ester

Man verfährt wie unter A/b) beschrieben.The procedure is as described under A / b).

Rf (Chloroform/Methanol = 15/1) = 0,39Rf (chloroform / methanol = 15/1) = 0.39

c) 4 (R) - [3 (R) -benzyloxytetradecanoylamido] -5- [3 (R) - (3 (R) -benzyloxytetra-decanoyl oxy) tetradecanoyloxy] pentanoic acid

Rf (Toluol/Essigester = 4/1) = 0,45
¹H-NMR (CDCl₃): 7,3 (m, 15 H, H_arom); 6,41 (d, 1 H, NH); 5,27 (m, 1 H, HCOCO); 5,11 (s, 2 H, COOCH₂Ph); 4,5 (2×d, 4 H, 2×OCH₂Ph); 4,2 (m, 1 H, Hα); 3,85 (m, 2 H, 2×CHOBn); 0,88 (t, 9 H, 3×CH₃).Rf (toluene / ethyl acetate = 4/1) = 0.45
1 H NMR (CDCl₃): 7.3 (m, 15 H, H _aroma ); 6.41 (d, 1H, NH); 5.27 (m, 1H, HCOCO); 5.11 (s, 2H, COOCH₂Ph); 4.5 (2 x d, 4 H, 2 x OCH₂Ph); 4.2 (m, 1H, Hα); 3.85 (m, 2H, 2x CHOBn); 0.88 (t, 9H, 3xCH₃).

Claims

1. Acylaminopentanoic acid derivatives of the formula wherein R ₁ and R _{2 are the} same or different and each represent an optionally substituted acyl group, in free form or in the form of their acid addition salts.

2. Process for the preparation of acylaminopentanoic acid derivatives of the formula wherein R ₁ and R _{2 are the} same or different and each represent an optionally substituted acyl group, in free form or in the form of their acid addition salts, characterized in that compounds of the formula wherein R ₁ 'and R ₂ ' have the same meaning as R ₁ and R ₂ , but any hydroxyl groups which may be present are protected by a protective group, and R _{3 is} a carboxy protecting group which splits off protective groups by known methods.