DE3834876A1

DE3834876A1 - Saccharides, process for their preparation and their use

Info

Publication number: DE3834876A1
Application number: DE19883834876
Authority: DE
Inventors: Hans Dr Loibner; Dieter Dr Scholz
Original assignee: Sandoz AG; Sandoz Patent GmbH
Current assignee: Sandoz AG; Sandoz Patent GmbH
Priority date: 1988-10-13
Filing date: 1988-10-13
Publication date: 1990-04-26

Abstract

The invention relates to saccharides of the formula <IMAGE> in which R1, R2, R3 and R4 are identical or different and each represent an optionally substituted acyl group, in free form or in the form of their acid addition salts, to a process for their preparation and to their use.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Saccharide, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende pharmazeutische Zubereitungen und ihre Verwendung als Pharmazeutika.The present invention relates to new saccharides, processes for their preparation, and containing them pharmaceutical preparations and their use as pharmaceuticals.

Die Erfindung betrifft insbesondere neue Saccharide der FormelThe invention particularly relates to new saccharides of the formula

worin R₁, R₂, R₃ und R₄ gleich oder verschieden sind und jeweils für eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen, in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.wherein R₁, R₂, R₃ and R₄ are the same or different and each for one if appropriate Substituted acyl group, in free form or in the form of their acid addition salts, are processes for their manufacture and their use.

Erfindungsgemäß gelangt man zu den Verbindungen der Formel in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze, indem man eine Verbindung der FormelAccording to the invention, the compounds of the formula are obtained in free form or in form their acid addition salts by using a compound of formula

R₃ und R₄ obige Bedeutung besitzen und U für Uridin steht, mit einer VerbindungR₃ and R₄ have the above meaning and U represents uridine, with a compound

worin R₁ und R₂ obige Bedeutung besitzen, enzymatisch kondensiert und die so erhaltenen Verbindungen in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze gewinnt.wherein R₁ and R₂ have the above meaning, condensed enzymatically and the thus obtained Compounds in free form or in the form of their acid addition salts wins.

Die enzymatische Kondensation wird beispielsweise in einem gepufferten System, z. B. im Tris-Puffer bei pH 7, und bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur, z. B. bei 30°C, durchgeführt. Als Enzymextrakt kann eine aus gramnegativen Bakterien, vorzugsweise aus E. coli-Stämmen (Raetz, J. Biol. Chem. 259/4852 [1984] erhaltene Präparation eingesetzt werden. Bevorzugt sind Stämme, die durch genetische Manipulation zur Überproduktion des gewünschten Enzyms angeregt wurden. Aus dem Reaktionsgemisch können die Endprodukte nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden.The enzymatic condensation is carried out, for example, in a buffered system, e.g. B. in Tris buffer at pH 7, and at room temperature or elevated temperature, e.g. B. at 30 ° C, carried out. The enzyme extract can be one of Gram-negative bacteria, preferably E. coli strains (Raetz, J. Biol. Chem. 259/4852 [1984] preparation used will. Preference is given to strains which are overproduced by genetic manipulation desired enzyme were stimulated. From the reaction mixture End products are isolated and, if necessary, purified by methods known per se.

R₁, R₂, R₃ und R₄ sind gleich oder verschieden, vorzugsweise gleich, und bedeuten eine Acylgruppe mit beispielsweise 4 bis 20, vorzugsweise 12 bis 16 und insbesondere 14 Kohlenstoffatomen, die in der 3-Position durch OH oder eine Acyloxygruppe, wie sie oben definiert ist, substituiert sein kann, wobei das C-3-Atom R- oder S-konfiguiert ist. In den Verbindungen der Formel I können daher R₁, R₂, R₃ und R₄ in achiraler Form, in R-, S- oder racemischer Form vorliegen. Dies gilt auch für die Verbindungen der Formeln II und III. Bei den in der Erfindung beschriebenen Reaktionen bleibt die Konfiguration während des Reaktionsablaufs unverändert, d. h., ausgehend von R- bzw. S- oder racemischen Ausgangsprodukten erhält man die entsprechenden R- bzw. S- oder racemischen Endverbindungen.R₁, R₂, R₃ and R₄ are the same or different, preferably the same, and mean one Acyl group with for example 4 to 20, preferably 12 to 16 and in particular 14 carbon atoms, those in the 3-position by OH or an acyloxy group as above is defined, can be substituted, wherein the C-3 atom is R- or S-configured. In the Compounds of formula I can therefore R₁, R₂, R₃ and R₄ in achiral form, in R-, S- or racemic form. This also applies to the compounds of formulas II and III. At In the reactions described in the invention, the configuration remains during the course of the reaction unchanged, d. that is, starting from R or S or racemic starting materials the corresponding R or S or racemic end compounds are obtained.

Die Verbindungen der Formel I werden bevorzugt als Säureadditionssalze gewonnen, wobei als Gegenion zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit bevorzugt hydrophile basische Verbindungen, beispielsweise Tris(hydroxymethyl)aminomethan oder L-Lysin, verwendet werden.The compounds of formula I are preferably obtained as acid addition salts, where as a counter ion to increase water solubility, preferably hydrophilic basic compounds, for example, tris (hydroxymethyl) aminomethane or L-lysine can be used.

Die Verbindungen der Formel III sind neu und können nach folgenden Reaktionsschema erhalten werden:The compounds of formula III are new and can according to the following reaction scheme will be obtained:

Als Schutzgruppen können die in der Saccharidchemie allgemein üblichen Schutzgruppen verwendet werden, beispielsweise die Benzyliden- oder die Isopropylidengruppe.The protective groups which are generally customary in saccharide chemistry can be used as protective groups are used, for example the benzylidene or the isopropylidene group.

Die Verbindungen der Formel I zeigen eine Beeinflussung der unspezifischen antimikrobiellen Resistenz. Diese Wirkung kann beispielsweise mit folgenden Testmethode gezeigt werden:The compounds of the formula I show an influence on the non-specific antimicrobial Resistance. This effect can be demonstrated using the following test method, for example:

1. Determination of endotoxic activity using Limulus amebocyte lysate tests

Endotoxin katalysiert die Aktivierung eines Proenzyms im Limulus-Amoebozytenlysat. Gemessen wird die Abspaltung von p-Nitroanilin aus einem farblosen Substrat. Das Ausmaß dieser Abspaltung wird photometrisch erfaßt, wobei die Korrelation zwischen Absorption und Endotoxinkonzentration (bzw. -Aktivität bei Analoga) im Bereich von 0,01-0,1 ng/ml Endotoxin linear ist (Vergleich mit den Absorptionswerten eines Standard-Endotoxins). Von jeder Probe (gelöst in pyrogenfreiem Aqua bidestillata sterilis) wird eine Verdünnungsreihe 1 : 10 hergestellt. Bei jeder Bestimmungsreihe wird zusätzlich eine Leerprobe mitgeführt. 100 µl Probe bzw. Standard oder Leerwert werden mit 100 µl Limulus-Amoebozytenlysat versetzt. Die Reaktion wird nach 10 Minuten Inkubation bei 37°C mit 200 µl Substrat versetzt. Nach weiteren 3 Minuten Inkubation wird die Reaktion mit 200 µl 50% Essigsäure gestoppt. Nach Aufschütteln der Probe wird in einem Spektralphotometer bei 405 nm die Absorption gegen einen Leerwert gemessen. Die Ermittlung des Endotoxingehaltes (der Endotoxinaktivität) der Probe als Endotoxin-Units (E. U.) erfolgt durch Berechnung einer linearen Regression mit den Werten des Standardendotoxins.Endotoxin catalyzes the activation of a proenzyme in Limulus amebocyte lysate. The elimination of p-nitroaniline from a colorless substrate is measured. The extent this cleavage is recorded photometrically, the correlation between absorption and Endotoxin concentration (or activity with analogs) in the range of 0.01-0.1 ng / ml endotoxin is linear (comparison with the absorption values of a standard endotoxin). From Each sample (dissolved in pyrogen-free Aqua bidestillata sterilis) is diluted 1:10 manufactured. An empty sample is also carried along with each series of determinations. 100 µl sample or standard or blank are mixed with 100 µl Limulus amebocyte lysate transferred. After 10 minutes of incubation at 37 ° C., the reaction is mixed with 200 μl of substrate. After a further 3 minutes of incubation, the reaction with 200 ul 50% acetic acid stopped. After shaking the sample in a spectrophotometer at 405 nm Absorbance measured against a blank. The determination of the endotoxin content (endotoxin activity) the sample as endotoxin units (E.U.) is calculated by calculating one linear regression with the values of the standard endotoxin.

2. Endotoxin shock induction in the mouse

Der Test erfaßt die Erzeugung eines Endotoxinschocks bzw. eines klinisch ähnlichen Zustandes mit letalem Ausgang durch LPS-ähnliche Substanzen in Galactosamin-(GalN)-sensibilisierten Mäusen. Männliche C57 bl.-Mäuse (6 Tiere pro Kollektiv) erhalten simultan i.p. 8 mg GalN, gelöst in 0,5 ml PBS, und 0,1 µg LPS aus Salmonella abortus equi (Sigma), gelöst in 0,2 ml physiologischer Kochsalzlösung. Diese Behandlung führt zum Tod aller Tiere innerhalb von 6-12 Stunden (C. Galanos, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76 (1979) 5939-5943). Anstelle des LPS im Standardverfahren werden Prüfsubstanzen in verschiedenen Dosierungen simultan mit GalN bzw. auch vor oder nach der GalN-Behandlung einmal parenteral oder oral verabreicht. Die Beurteilung des Ergebnisses erfolgt anhand eines Vergleiches der geringsten Dosis, die zum Tod aller Tiere einer Gruppe führt, oder durch Berechnung einer LD₅₀ mittels der Spearman-Kärber-Methode.The test detects the generation of an endotoxin shock or a clinically similar condition with lethal outcome sensitized by LPS-like substances in galactosamine (GalN) Mice. Male C57 bl. Mice (6 animals per group) receive i.p. 8 mg GalN, dissolved in 0.5 ml PBS, and 0.1 µg LPS from Salmonella abortus equi (Sigma), dissolved in 0.2 ml of physiological saline. This treatment leads to the death of all animals within 6-12 hours (C. Galanos, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76 (1979) 5939-5943). Instead of the LPS in the standard procedure, test substances are used in different doses simultaneously with GalN or before or after the GalN treatment administered once parenterally or orally. The result is assessed based on a comparison of the lowest dose that leads to the death of all animals in a group, or by calculating an LD₅₀ using the Spearman-Kärber method.

3. Microbial septicemia in the neutropenic mouse

Dieses Modell gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung in mikrobiell infizierten, neutropenischen Mäusen. Zur Erzeugung einer Neutropenie erhalten je 20 weibliche B₆D₂F₁-Mäuse 1×200 mg/kg Körpergewicht Cyclophosphamid in 0,2 ml Aqua dest. gelöst, s.c. am Tag 0 verabreicht. Am Tag 3 wird die Prüfsubstanz, soweit möglich, in physiologischer NaCl-Lösung, ansonsten jedoch auch in anderer Weise gelöst (0,3 ml) parenteral (vorrangig i.p.) oder auch peroral verabreicht. Die Infektion erfolgt am Tag 4 durch i.v. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,2 ml (Keimzahl pro Maus, z. B. Pseudomonas aeruginosa Δ 12: 1×10⁵, E. coli Δ 120: 2×10⁶, Staph. aureus Δ 113: 1×10⁶, Candida albicans Δ 124: 1×10⁴). Die Versuchstiere werden bis zum 10.Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die auftretenden Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zu Standards werden folgende Parameter ausgewertet:This model allows the examination of a substance-related defense increase in microbially infected, neutropenic mice. To produce neutropenia, 20 female B₆D₂F₁ mice each receive 1 × 200 mg / kg body weight of cyclophosphamide in 0.2 ml of distilled water. dissolved, administered sc on day 0. On day 3, if possible, the test substance is administered in physiological NaCl solution, but otherwise also dissolved in another way (0.3 ml) parenterally (primarily ip) or even orally. Infection occurs on day 4 by iv administration of the respective inoculum in a volume of 0.2 ml (number of bacteria per mouse, e.g. Pseudomonas aeruginosa Δ 12: 1 × 10⁵, E. coli Δ 120: 2 × 10⁶, Staph. aureus Δ 113: 1 × 10⁶, Candida albicans Δ 124: 1 × 10⁴). The experimental animals are observed until the 10th day after the infection and the deaths that occur are recorded daily. In comparison to infection control or standards, the following parameters are evaluated:

a) Average survival
b) survival rate

Die Verbindungen der Formel I zeigen sowohl in den experimentellen Infektionen durch gramnegative Keime (z. B. Pseudomonas und E. coli) wie auch bei Infektionen durch grampositive Keime z. B. Staph. aureus) bzw. Hefen (z. B. Candida albicans) nach parenteraler Verabreichung hinsichtlich Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.The compounds of formula I show both in the experimental infections gram-negative germs (e.g. Pseudomonas and E. coli) as well as infections caused by gram-positive bacteria Germs e.g. B. Staph. aureus) or yeasts (e.g. Candida albicans) parenterally Administration significant improvements in survival and survival rate, compared to the untreated infection control.

4. Activation of human blood neutrophil oxidation metabolism

Neutrophile (mindestens 95% Reinheit) werden mit der Prüfsubstanz in drei verschiedenen Konzentrationen für 1 bis 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Freisetzung von Superoxidanionen durch die Zellen als Index für die Aktivierung wird dann als Superoxid Dismutase- inhibierbare Reduktion von Cytochrom C gemessen. 1×10⁶ Neutrophile, mit Testsubstanz vorbehandelt oder nicht, werden dem Cytochrom C (80 µMol) zugesetzt, das Formylmethionylleucylphenylalanin (10-⁶ M) enthält. Die Kontrollen enthalten zusätzlich 50 µg Superoxiddismutase. Nach 15 Minuten Inkubation bei 37°C wird die Reaktion durch Einbringen der Teströhrchen in ein Eisbad beendet. Sie werden dann schnell bei 400×g für 5 Minuten zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen. Die Reduktion von Cytochrom C, die proportional der Menge an freigesetztem Superoxidanion ist, wird photometrisch bei 550 nm gemessen. Die Hemmwirkung der Prüfsubstanzen bei der PMN-Aktivierung durch LPS wird wie beschrieben gemessen mit der Maßgabe, daß nach der Vorinkubation der Leukozyten die Zellen weiterhin mit einer stimulierenden Konzentration von LPS inkubiert werden.Neutrophils (at least 95% purity) are mixed with the test substance in three different ways Concentrations incubated for 1 to 2 hours at 37 ° C. The release of superoxide anions through the cells as an index for activation is then called superoxide dismutase inhibitable reduction of cytochrome C measured. 1 × 10⁶ neutrophils, with Test substance pretreated or not, are added to the cytochrome C (80 µmol) Formylmethionylleucylphenylalanin (10-⁶ M) contains. The controls include additional 50 µg superoxide dismutase. After 15 minutes of incubation at 37 ° C, the reaction is complete Inserted the test tubes into an ice bath. You will then quickly at 400 × g for Centrifuged for 5 minutes to separate the cells. The reduction of cytochrome C that is proportional to the amount of superoxide anion released, is measured photometrically at 550 nm measured. The inhibitory effect of the test substances in the PMN activation by LPS is measured as described with the proviso that after preincubation of the leukocytes the cells continue to be incubated with a stimulating concentration of LPS.

5. Carbon Clearance Test

Das Prinzip des Tests beruht darauf, daß Partikel in einer Größenordnung von 200-250 A (z. B. Kohlepartikel) aus dem Organismus nur durch Phagozytose durch Makrophagen eliminiert werden können. Bei intravenöser Verabreichung von Kohlepartikeln werden diese durch Phagozytose der Makrophagen in Leber (Kupffer'sche Sternzellen) und Milz aus dem Blutstrom eliminiert. Die Prüfung der RES-Aktivierung einer Substanz erfolgt durch einmalige oder wiederholte Verabreichung als wäßrige Lösung oder als Suspension. Die für die Behandlung vorgesehene Substanzmenge wird entweder in 4 täglichen Einzeldosen oder einmal 24 Stunden vor Testbeginn i.p. oder s.c. appliziert. Tuschesuspension mit einem 10%igen Gehalt an Gasruß wird mit einer 1%igen Gelatine-NaCl-Lösung auf einen Gehalt von 16 mg Kohle/ml verdünnt. Jede Maus erhält 0,2 ml/20 g KG intravenös verabreicht. 3, 6, 9, 12 und 15 Minuten nach der intravenösen Verabreichung werden durch Punktion des Orbital plexus 25 µl Blut entnommen. Das Blut wird in 2 ml dest. Wasser hämolysiert. Die Kohlekonzentration wird photometrisch bestimmt. Anschließend werden die Tiere getötet und Leber und Milzgewichte bestimmt.The principle of the test is based on the fact that particles in the order of 200-250 A (e.g. carbon particles) from the organism only through phagocytosis by macrophages can be eliminated. With intravenous administration of carbon particles, these are by phagocytosis of the macrophages in the liver (Kupffer 's star cells) and spleen from the Blood flow eliminated. The RES activation of a substance is checked once or repeated administration as an aqueous solution or as a suspension. The one for treatment The intended amount of substance is given either in 4 daily single doses or once 24 hours before the start of the test i.p. or s.c. applied. Ink suspension with one 10% content of gas black with a 1% gelatin-NaCl solution to a content diluted by 16 mg coal / ml. Each mouse receives 0.2 ml / 20 g body weight administered intravenously. 3, 6, At 9, 12 and 15 minutes after intravenous administration, puncture of the Orbital plexus 25 µl blood drawn. The blood is distilled in 2 ml. Hemolyzed water. The Coal concentration is determined photometrically. The animals are then killed and liver and spleen weights.

6. Herpes infection of the mouse

Das Modell der intrakutanen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen. Der Krankheitsverlauf ist prolongiert und ermöglicht die Beobachtung des sequentiellen Auftretens mehrerer Parameter. Es treten herpetische Läsionen an der Infektionsstelle auf, diese ulcerieren, das nächstgelegene Bein wird gelähmt und die Paralyse schreitet fort bis zum Tode. Immunkompetente haarlose Mäuse werden am Tag 0 durch intrakutane Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,025 ml (z. B. 1×10⁶ Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1/Maus) intrakutan infiziert. Die Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, (0,1 ml) i.p. verabreicht.The model of intracutaneous herpes infection allows the examination of a substance-related one Defense increase in mice infected with herpes viruses. The course of the disease is prolonged and enables the observation of the sequential occurrence of several parameters. It If herpes lesions occur at the site of infection, ulcerate them the nearest leg is paralyzed and the paralysis continues until death. Immune competent Hairless mice are given on day 0 by intracutaneous administration of each Inoculum in a volume of 0.025 ml (e.g. 1 × 10⁶ plaque-forming units of herpes simplex type 1 / mouse) infected intracutaneously. The test substance is in solution, for example in physiological NaCl, (0.1 ml) i.p. administered.

Die Versuchstiere werden bis zum 20.Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die auftretenden Läsionen, Paralysen und Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zum Standard werden folgende Parameter ausgewertet:The experimental animals are observed until the 20th day after the infection and the daily occurring lesions, paralyses and deaths. Compared to infection control or as standard, the following parameters are evaluated:

a) Number of mice with lesions (cumulative)
b) Number of mice with paralysis (cumulative)
c) Average survival
d) survival rate.

Die Verbindungen der Formel I zeigten bei einmaliger Gabe zwischen Tag 0 bzw. -1 und +6 in der experimentellen HSV-1-Infektion nach i.p. bzw. subkutaner Verabreichung hinsichtlich Krankheitsverlauf, Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserung, verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.When administered once, the compounds of the formula I showed between day 0 or -1 and +6 in the experimental HSV-1 infection after i.p. or subcutaneous administration with regard to Course of disease, survival and survival rate significant improvement, compared to the untreated infection control.

7. Induction of CSF (colony stimulating factor)

CSFs sind Mediatoren, die im Organismus infolge von Infektionen oder Toxineinwirkungen produziert werden. Ihre biologischen Funktionen sind vielseitig, der Nachweis wird über die Stimulation der Proliferation des haemopoietischen Systems, insbesondere der Knochenmarkszellen, geführt. B₆D₂F₁ Mäusen werden die Prüfsubstanzen ein- oder mehrmals bis zu einer Dosierung von 50 mg/kg parenteral oder oral verabreicht. In variablen Zeitabständen danach wird von den Versuchstieren Serum gewonnen. Der Gehalt des Serums an CSF-Aktivität wird in einem Zellkulturassay anhand der Proliferationsraten von Knochenmarkszellen aus B₆D₂F₁ Mäusen gemessen [D. Metcalf, The hemopoietic colony stimulating factors, 1984, Elsevier; T. Mosmann, J. Immunol. Methods 65, 55-63 (1983); L. M. Green et al., J. Immunol. Methods 70, 257-268 (1984)]. Verbindungen der Formel I induzieren in unterschiedlich starkem Ausmaß CSFs in Mäusen, wobei auch zeitkinetische Unterschiede der CSF-Aktivitäten beobachtet werden, die bei therapeutischen Einsatz vorteilhaft sein können.CSFs are mediators that occur in the organism as a result of infections or toxins to be produced. Their biological functions are versatile, the proof is about the Stimulation of the proliferation of the haemopoietic system, especially the bone marrow cells, guided. B₆D₂F₁ mice the test substances one or more times up to a dose of 50 mg / kg administered parenterally or orally. At variable intervals then serum is obtained from the experimental animals. The serum content of CSF activity is carried out in a cell culture assay based on the proliferation rates of bone marrow cells measured from B₆D₂F₁ mice [D. Metcalf, The hemopoietic colony stimulating factors, 1984, Elsevier; T. Mosmann, J. Immunol. Methods 65, 55-63 (1983); L.M. Green et al., J. Immunol. Methods 70: 257-268 (1984)]. Compounds of the formula I induce in different ways strong CSFs in mice, with time kinetic differences in the CSF activities are observed that are beneficial in therapeutic use can.

8. Induction of Interleukin-1 (IL-1)

Der Nachweis, ob Substanzen Zellen zur IL-1-Produktion stimulieren können, wird primär in Zellkulturassays geführt. Zunächst werden adhärente Makrophagen von Mäuse gewonnen, sowohl residente als auch mit Thioglycolat "elicited macrophages". Diese werden in RPMI- Medium bei verschiedenen zu prüfenden Substanzkonzentrationen 48 Stunden inkubiert und die Zellüberstände gewonnen. Diese Überstände werden in Thymozytenkulturen von C₃H/ HeJ Mäusen auf IL-1-Aktivität geprüft. Enthalten die Überstände von Makrophagen produziertes IL-1, werden die Thymozyten während einer Inkubation von 72 Stunden zur Proliferation angeregt, die durch Einbau von 3H-Thymidin im Szintillationszähler gemessen wird [J. Gery et. al., J. Exp. Med. 136, 128-142 (1972); J. Oppenheim et. al., Cellular Immunol. 50, 71-81 (1980)]. Substanzen der Formel I besitzen in unterschiedlichem Maße (konzentrationsbezogen 0,1-50 µg/ml) die Fähigkeit, IL-1-Produktion in Makrophagen zu induzieren.The proof of whether substances can stimulate cells for IL-1 production is primarily in Cell culture assays performed. First, adherent macrophages are obtained from mice, both resident and with thioglycolate "elicited macrophages". These are in RPMI Incubated medium at different substance concentrations to be tested for 48 hours and won the cell supernatants. These supernatants are in thymocyte cultures of C₃H / HeJ mice tested for IL-1 activity. Contain the supernatants from macrophages produced IL-1, the thymocytes become during an incubation of 72 hours Proliferation stimulated, measured by incorporation of 3H-thymidine in the scintillation counter will [J. Gery et. al., J. Exp. Med. 136, 128-142 (1972); J. Oppenheim et. al., Cellular Immunol. 50: 71-81 (1980)]. Substances of formula I have different degrees (concentration-related 0.1-50 µg / ml) the ability to produce IL-1 in macrophages induce.

9. Induction of LPS (endotoxin) tolerance (lethality tolerance)

Durch ein- bis dreimalige tägliche parenterale Verabreichung von LPS an Mäusen kann eine sogenannte Toleranz erzeugt werden, die die Tiere gegen die nach Galactosamin-Gabe letalen Effekte des LPS schützt (s. auch Endotoxinschock-Induktion in der Maus).One or three times daily parenteral administration of LPS to mice can cause one So-called tolerance is generated, which the animals against after galactosamine administration protects lethal effects of the LPS (see also endotoxin shock induction in the mouse).

Weiters besitzen die Verbindungen der Formel I auch antiinflammatorische Wirkung, insbesondere bei nichtspezifischen Entzündungen, bei immunologisch induzierten Entzündungen, bei hypersensitiv induzierten Entzündungen und bei allergischen Reaktionen. Diese Wirkung konnte durch verschiedene Testmethoden nachgewiesen werden, beispielsweise durch Untersuchungen der Beeinflussung der Prostaglandinsynthese in vitro und in vivo. In vitro wurde die Hemmung der LPS- und Zymosan-induzierten PGE₂- und PGF₁α-Freisetzung untersucht. Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-MΦ aus der NMRI-Maus wurden 24 Stunden mit LPS bzw. Versuchssubstanz inkubiert. Nach Wechsel des Mediums und dreifachem Waschen der Zellen wurden sie 2 Stunden mit LPS bzw. 1 Stunde mit Zymosan stimuliert. In diesen Überständen wurden PGE₂ und PGF₁α nachgewiesen. Dabei zeigte sich eine Inhibierung sowohl der durch LPS als auch der durch Zymosan stimulierten PGE₂-Produktion der Zellen. In vivo wurde die Hemmung der LPS-induzierten PGE₂-Freisetzung von Maus-MΦ nach Vorbehandlung mit Prüfsubstanzen getestet. Jeweils 3 NMRI-Mäuse wurden am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz i.p. behandelt. Am Tag 4 erhielten diese Tiere und eine Kontrollgruppe 1,5 ml Thioglycolat i.p., am Tag 7 wurden Peritoneal-MΦ gewonnen und mit LPS stimuliert. Es wurde eine deutliche Reduktion der PGE₂-Freisetzung im Vergleich zur Kontrolle gefunden.Furthermore, the compounds of the formula I also have anti-inflammatory activity, in particular in the case of non-specific inflammations, in the case of immunologically induced inflammations, in the case of hypersensitively induced inflammations and in the case of allergic reactions. This effect could be demonstrated by various test methods, for example by examining the influence of prostaglandin synthesis in vitro and in vivo. In vitro, the inhibition of LPS and zymosan-induced PGE₂ and PGF₁ α release was examined. Thioglycolate-stimulated peritoneal M Φ from the NMRI mouse were incubated for 24 hours with LPS or test substance. After changing the medium and washing the cells three times, they were stimulated for 2 hours with LPS or 1 hour with Zymosan. In these supernatants, PGE₂ and PGF₁ α were detected. This showed an inhibition of both the LPS and the zymosan-stimulated PGE₂ production of the cells. In vivo, the inhibition of LPS-induced PGE₂ release from mouse M Φ was tested after pretreatment with test substances. 3 NMRI mice in each case were treated with LPS or test substance ip on day 1, 2 and 3. On day 4, these animals and a control group received 1.5 ml of thioglycolate ip, on day 7 peritoneal M Φ was obtained and stimulated with LPS. A significant reduction in PGE₂ release compared to the control was found.

In einem weiteren Test wird die Beeinflussung der "procoagulant activity" (PCA) untersucht. Nach Stimulation mit LPS synthetisieren humane Endothelzellen PCA, gemessen als Verkürzung der Gerinnungszeit von Plasma. Ebenso verkürzten MΦ nach LPS-Behandlung sowie Peritonealleukozyten (gewonnen von Kaninchen) nach Auslösen der generellen Shwartzman-Reaktion der Gerinnungszeit von recalzifiziertem Plasma. Zur Untersuchung der Beeinflussung der durch LPS generierten PCA in vitro wurden Thioglycolat-stimulierte Peritoneal- MΦ von B₆D₂F₁-Mäusen in einem Versuchsdesign a über Nacht mit LPS allein bzw. mit LPS und Prüfsubstanz in DMEM Medium ohne fötales Kälberserum (FCS) behandelt. Im Versuchsdesign b wurden ebensolche Maus-MΦ 24 Stunden lang mit LPS bzw. Prüfsubstanz behandelt und nach Mediumwechsel über Nacht mit LPS stimuliert. Die Gerinnungszeit von recalzifiziertem humanen Kontrollplasma nach Zugabe der mehrfach eingefrorenen und ultrabeschallten MΦ-Suspension wurde mittels Häkchenmethode gemessen. Zugabe von Prüfsubstanz reduziert die durch LPS ausgelöste PCA unter jene des Kontrollwertes (Verlängerung der Gerinnungszeit). Ebenso führt Vorbehandlung mit Prüfsubstanz zu einer Reduzierung der PCA.In another test, the influence on the "procoagulant activity" (PCA) is examined. After stimulation with LPS, human endothelial cells synthesize PCA, measured as a reduction in the clotting time of plasma. M Φ after LPS treatment and peritoneal leukocytes (obtained from rabbits) also reduced the clotting time of recalcified plasma after triggering the general Shwartzman reaction. To investigate the influence of PCA generated by LPS in vitro, thioglycolate-stimulated peritoneal M Φ of B₆D₂F₁ mice were treated overnight in a test design a with LPS alone or with LPS and test substance in DMEM medium without fetal calf serum (FCS). In experimental design b, such mouse M Φ were treated with LPS or test substance for 24 hours and stimulated with LPS after changing the medium overnight. The clotting time of recalcified human control plasma after the addition of the multiply frozen and ultrasonically exposed M Φ suspension was measured using the checkmark method. Addition of test substance reduces the PCA triggered by LPS below that of the control value (extension of the clotting time). Pretreatment with test substance also leads to a reduction in PCA.

In vivo konnte die Beeinflussung der LPS-induzierten PCA von Maus-Peritonealleukozyten nach Vorbehandlung der Tiere mit Prüfsubstanz folgendermaßen gezeigt werden: B₆D₂F₁-Mäuse wurden am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz, intraperitoneal verabreicht, behandelt. Zusätzlich erhielten alle Tiere am Tag 3 1,5 ml Thioglycolat i.p. Am Tag 6 wurden Peritoneal-MΦ gewonnen, die Probe jedes Tieres auf 1×10⁶ ml Zellen eingestellt und 24 Stunden lang mit LPS in DMEM Medium ohne FCS stimuliert. Die PCA dieser Zellen wurde, wie oben beschrieben, bestimmt. Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz erbringt eine deutlich verringerte PCA. Ein ähnlicher Befund konnte bei Vorversuchen mit Kaninchen erhoben werden. Auch die PCA von peritonealen Kaninchenleukozyten nach Auslösen der generellen Shwartzman-Reaktion konnte durch Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz verringert werden.In vivo, the influence on the LPS-induced PCA of mouse peritoneal leukocytes after pretreatment of the animals with test substance could be shown as follows: B₆D₂F₁ mice were treated on day 1, 2 and 3 with LPS or test substance administered intraperitoneally. In addition, all animals received 1.5 ml of thioglycolate ip on day 3. Peritoneal M Φ was obtained on day 6, the sample of each animal was adjusted to 1 × 10⁶ ml cells and stimulated with LPS in DMEM medium without FCS for 24 hours. The PCA of these cells was determined as described above. Pretreatment with LPS or with test substance results in a significantly reduced PCA. A similar finding was found in preliminary experiments with rabbits. The PCA of peritoneal rabbit leukocytes after triggering the general Shwartzman reaction could also be reduced by pretreatment with LPS or with test substance.

Weiters besitzen die Verbindungen der Formel I auch Wirkung gegen Tumore, wie in den folgenden Modellversuchen nachgewiesen werden konnte:Furthermore, the compounds of formula I also have activity against tumors, as in the following model tests could be demonstrated:

1. Investigation of the induction of tumor necrosis factor (TNF)

Zur Stimulierung von Mäuse-Knochenmarksmakrophagen werden Knochenmarkszellen von BDF₁ Mäusen (ca. 10-13 Tage alt, mit CSF induziert) auf 1×10⁶ Zellen/ml in Medium [RPMI 1640+1% Pen/Strep (5000 U/ml)+1% Glutamin] verdünnt und in flachen Mikrotiterplatten mit den Substanzlösungen im Konzentrationsbereich 100 µg bis 0,1 µg/ml Endkonzentration (1 : 10 Verdünnungsstufen) 4 Stunden bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Nach Filtration durch 0,45 µm Filter werden die Überstände bis zur Durchführung des TNF-Tests bei -70°C eingefroren.To stimulate mouse bone marrow macrophages, bone marrow cells from BDF₁ mice (about 10-13 days old, induced with CSF) on 1 × 10⁶ cells / ml in medium [RPMI 1640 + 1% pen / strep (5000 U / ml) + 1% glutamine] diluted and in flat microtiter plates with the substance solutions in the concentration range 100 µg to 0.1 µg / ml Final concentration (1:10 dilution stages) incubated for 4 hours at 37 ° C / 5% CO₂. To The supernatants are filtered through a 0.45 µm filter until the TNF test is carried out frozen at -70 ° C.

In Mikrotiterplatten werden L 929 Zellen zu 3×10⁴ Zellen/Näpfchen/100 µl über Nacht vorkultiviert (37°C/5% CO₂), mit 100 µl der jeweiligen Probe versetzt und in Serie in 1 : 2 Stufen weiter verdünnt. Nach Zugabe von 100 µl Actinomycin D (8 µg/ml Medium) in jedes Näpfchen wird weitere 18 Stunden bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Nach Entfernen der Überstände wird der verbliebene Zellrasen mit Giemsa-Lösung gefärbt und die Absorption bei 620 nm am Titertek Multiskan Autoreader (Flow) gemessen. Eine Einheit TNF ist definiert als jene Aktivität, welche eine 50%ige Lyse der L 929 Targetzellen hervorruft.L 929 cells are pre-cultured in microtiter plates at 3 × 10⁴ cells / well / 100 μl overnight (37 ° C / 5% CO₂), mixed with 100 µl of the respective sample and in series in 1: 2 steps further diluted. After adding 100 µl actinomycin D (8 µg / ml medium) to each Cup is incubated for a further 18 hours at 37 ° C / 5% CO₂. After removing the The remaining cell lawn is stained with Giemsa solution and the absorption measured at 620 nm on the Titertek Multiskan Autoreader (Flow). A unit TNF is defined as the activity that causes 50% lysis of the L 929 target cells.

2. B16F1 melanoma test

B16F1 Melanom Zellen werden 5 Tage in vitro gezüchtet. Einen Tag vor dem Versuch werden die Zellen durch Aufbrechen der Monolayer in einzelne Zellen, unter Verwendung von EDTA Trypsin, und Rückführung der Gesamtmenge in die gleiche Flasche mit neuem Medium synchronisiert. Die Zellen werden gezählt und auf 10⁶/ml Medium eingestellt. 0,1 ml Zellsuspension (10⁵ Zellen) werden intravenös in die Schwanzvene injiziert. 21 Tage danach werden die Mäuse getötet und die Anzahl der Tumore in der Lunge bestimmt. Für diesen Test werden B₆D₂F₁ Mäuse eingesetzt. Die Prüfsubstanz wird gelöst und an den Tagen -6, -4 und -1 intraperitoneal injiziert. Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Substanzen der Formel I immunoprophylaktische Wirkung besitzen, die Anzahl der B16F1 Melanommetastasen in der Lunge wurde verringert. Zur Überprüfung der therapeutischen Aktivität wurden die Mäuse am 3., 6., 8., 10., 13. und 15.Tag nach der Tumorzelleninokulation behandelt. Auch hier zeigte sich eine deutliche Reduktion der Metastasenbildung.B16F1 melanoma cells are grown in vitro for 5 days. Be a day before trying the cells by breaking up the monolayer into individual cells, using EDTA trypsin, and return the total amount to the same bottle with new medium synchronized. The cells are counted and adjusted to 10⁶ / ml medium. 0.1 ml Cell suspension (10⁵ cells) are injected intravenously into the tail vein. 21 days after the mice are sacrificed and the number of tumors in the lungs is determined. For this Test B₆D₂F₁ mice are used. The test substance is dissolved and on days -6, -4 and -1 injected intraperitoneally. It has been shown that the substances according to the invention of formula I have immunoprophylactic activity, the number of B16F1 melanoma metastases was reduced in the lungs. To check the therapeutic activity mice on the 3rd, 6th, 8th, 10th, 13th and 15th day after tumor cell inoculation treated. Here, too, there was a clear reduction in metastasis.

Die Verbindungen der Formel I können daher als Modulatoren der unspezifischen antimikrobiellen Resistenz eingesetzt werden, zur systemischen Steigerung der Immunantwort und zur Steigerung der unspezifischen Immunität. Verbindungen der Formel I sind somit indiziert, z. B. für die Behandlung oder supportive Behandlung (d. h. zusammen mit anderen spezifischen oder supportiven Therapieformen) von Zuständen bei herabgesetzter Immunantwort, insbesondere bei herabgesetzter humoraler Immunantwort und/oder herabgesetzter Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ und zur Behandlung von Zuständen, bei welchen in sonstiger Weise eine Modulation der Immunantwort wünschenswert ist. Im speziellen sind Verbindungen der Formel I indiziert zur Behandlung oder supportiven Behandlung von Krankheitszuständen aufgrund idiopathischer Immundefizienzen oder Immundefizienzen von der Art, wie sie bei geriatrischen Patienten auftreten, oder bei Patienten mit schweren Verbrennungen oder generalisierten Infektionen. Die Verbindungen der Formel I sind gleichfalls indiziert für die Behandlung oder supportive Behandlung viraler Erkrankungen (wie disseminierten Herpes, progressive Pockenerkrankungen und disseminierte Varizellenerkrankungen) sowie auch von Morbus Hodgkin und anderen malignen Tumoren. Außerdem eignen sich die Verbindungen der Formel I für die Prophylaxe des Endotoxinschocks, z. B. bei Unfällen, Verbrennungen und chirurgischen Eingriffen sowie als antiinflammatorische Mittel.The compounds of the formula I can therefore act as modulators of the non-specific antimicrobial Resistance can be used to systemically increase the immune response and to increase non-specific immunity. Compounds of the formula I are thus indicated e.g. For treatment or supportive treatment (i.e. together with other specific or supportive forms of therapy) of conditions with a reduced immune response, especially with a reduced humoral immune response and / or a reduced Delayed-type hypersensitivity reaction and for the treatment of conditions which is otherwise desirable to modulate the immune response. in the In particular, compounds of the formula I are indicated for treatment or supportive treatment of disease states due to idiopathic immunodeficiencies or immunodeficiencies the way they occur in geriatric patients or in patients with severe burns or generalized infections. The compounds of formula I. are also indicated for the treatment or supportive treatment of viral diseases (such as disseminated herpes, progressive pox and disseminated varicella) as well as Hodgkin's disease and other malignant tumors. Furthermore the compounds of the formula I are suitable for the prophylaxis of endotoxin shock, e.g. B. in accidents, burns and surgery as well as an anti-inflammatory agent.

Für die genannten Anwendungen ist die indizierte parenterale Dosis zwischen ca. 0,1 mg und ca. 70 mg, einmal verabreicht zur Erzielung eines Adjuvanseffektes, z. B. bei supportiver Behandlung, oder täglich, wobei im letzteren Fall die Dosis auf 2 bis 4 Verabreichungen pro Tag aufgeteilt oder in Retardform gegeben wird. Indizierte Dosiseinheiten für die Verabreichung enthalten daher zwischen ca. 0,025 und ca. 35 mg Substanz der Formel I, wenn tägliche Verabreichung, oder bis zu 70 mg Substanz der Formel I, wenn eine einzelne, adjuvante Behandlung gewünscht wird.For the applications mentioned, the indicated parenteral dose is between approx. 0.1 mg and about 70 mg, administered once to achieve an adjuvant effect, e.g. B. at supportiver Treatment, or daily, in the latter case the dose to 2 to 4 administrations divided per day or given in extended release. Indicated dose units for the Administration therefore contain between approximately 0.025 and approximately 35 mg of substance of the formula I, if daily administration, or up to 70 mg substance of formula I if a single, adjuvant treatment is desired.

Aufgrund ihrer immunmodulierenden Aktivität eignen sich Verbindungen der Formel I auch als Adjuvantien für Vakzine. Für diese Verwendungsart ist eine indizierte Dosis zwischen 0,5 und 100 mg, vorzugsweise ca. 70 mg, verabreicht am Tage der Impfung mit einer möglichen Wiederholung bei gleicher Dosis 2 bis 4 Wochen später.Because of their immunomodulating activity, compounds of the formula I are also suitable as adjuvants for vaccines. For this type of use, an indicated dose is between 0.5 and 100 mg, preferably about 70 mg, administered on the day of vaccination with a possible repetition at the same dose 2 to 4 weeks later.

Pharmazeutische Bereitungen, enthaltend die Verbindungen der Formel I, können gemäß galenischen Standardverfahren, z. B. durch Vermischen mit konventionellen, pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln oder Trägersubstanzen hergestellt werden. Solche Bereitungen können beispielsweise in Form von injizierbaren Lösungen hergestellt werden und bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.Pharmaceutical preparations containing the compounds of formula I can according to galenic standard procedures, e.g. B. by mixing with conventional, pharmaceutical harmless diluents or carriers. Such preparations can be made, for example, in the form of injectable solutions are and also form part of the invention.

Die Erfindung betrifft daher auch eine Methode zur Bekämpfung von Erkrankungen und Infektionen, wie sie oben beschrieben sind, durch Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I oder eines chemotherapeutisch verträglichen Salzes davon an den Kranken, sowie die Verbindungen der Formel I zur Verwendung als chemotherapeutisches Mittel, insbesondere als Immunmodulatoren, als antivirale Mittel und als antiinflammatorische Mittel.The invention therefore also relates to a method for combating diseases and infections, as described above, by administering an effective amount of one Compound of formula I or a chemotherapeutically acceptable salt thereof to the Sick, as well as the compounds of formula I for use as a chemotherapeutic Agents, in particular as immunomodulators, as antiviral agents and as anti-inflammatory agents Medium.

In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, ihren Umfang jedoch in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden, EDTA bedeutet Ethylendiamintetraessigsäure, DTE steht für 1,4-Dithioerythrit, UDP für Uridinsphosphat und Tris für Tris(hydroxymethyl)aminomethan. In the following examples, which explain the invention in more detail, however, its scope in should not restrict in any way, all temperatures are given in degrees Celsius, EDTA means ethylenediaminetetraacetic acid, DTE stands for 1,4-dithioerythritol, UDP for Uridine phosphate and tris for tris (hydroxymethyl) aminomethane.

Example 1 6-O- [2-deoxy-3-O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] -2 - [(R) -3-hydroxytetrad-ecanoylamido] - β -D-glucopyranosyl] -2-deoxy-3- O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] -2- [(R) -3-hydroxytetradecanoylamido] - α -D-glucopyranosylphosphonic acid

20 Volumenteile einer 5 mM Lösung von 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2- [(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-α-D-glycopyranosylphosphonsäure in 10 mM Tris/ HCl-Puffer (pH=7) mit 0,2 mM EDTA und 0,2 mM DET, 20 Volumensteile einer 5 mM Lösung von UDP-2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetrade-canoylamido]- 1-O-phosphono-α-D-glucopyranose im gleichen Puffer und 20 Volumensteile eines 100 mM Tris/HCl-Puffers (pH=7) mit 2 mM EDTA, 0,2 mM DTE werden mit 40 Volumensteilen einer Enzympräparation in 10 mM Tris/HCl-Puffer (pH=7) mit 2 mM EDTA, 2 mM DTE und 0,1% Triton X-100 bei 30° 8 Stunden umgesetzt, wobei die Endkonzentration an Triton X-100 auf 0,1% eingestellt wird.20 volumes of a 5 mM solution of 2-deoxy-3-O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] -2- [(R) -3-hydroxytetradecanoylamido] - α -D-glycopyranosylphosphonic acid in 10 mM Tris / HCl buffer (pH = 7) with 0.2 mM EDTA and 0.2 mM DET, 20 parts by volume of a 5 mM solution of UDP-2-deoxy-3-O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] -2 - [(R. ) -3-hydroxytetrade-canoylamido] - 1-O-phosphono- α- D-glucopyranose in the same buffer and 20 parts by volume of a 100 mM Tris / HCl buffer (pH = 7) with 2 mM EDTA, 0.2 mM DTE with 40 parts by volume of an enzyme preparation in 10 mM Tris / HCl buffer (pH = 7) with 2 mM EDTA, 2 mM DTE and 0.1% Triton X-100 at 30 ° for 8 hours, the final concentration of Triton X-100 is set to 0.1%.

Dieser Enzymextrakt kann folgendermaßen erhalten werden:
E. coli JP1104 wird in L-Broth angezüchtet (Vorkultur+10 µg Ampicillin/ml bei 30° über Nacht; Hauptkultur bei 30°C im Schüttelinkubator, ausgehend von OD₅₅₀ nm=0,1 bis OD₅₅₀ nm =1). Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 10 800 g geerntet (10 Minuten/4°), das Pellet in 10 mM Tris-Puffer, pH 7,0+0,2 mM EDTA und 0,2 mM DTE suspendiert und erneut zentrifugiert (6000 g, 10 Minuten/4°). Anschließend wird das Pellet im obigen Puffer resuspendiert und mit Ultraschall aufgeschlossen (5×20 Sekunden/30 Sekunden Pause mit 120 Watt). Nach Zentrifugation (12 000 g, 10 Minuten/4°) zum Abtrennen der Zellreste wird ultrazentrifugiert (150 000 g, 90 Minuten/7°). Die oberen 2/3 des Überstandes werden gewonnen. Diese Fraktion wird einer fraktionierten Ammonsulfatfällung unterzogen. Als Enzympräparation verwendet wird der Bereich von 10-40% Ammonsulfat. Das so gewonnene Pellet wird im obigen Puffer aufgenommen.This enzyme extract can be obtained as follows:
E. coli JP1104 is grown in L-Broth (preculture + 10 µg ampicillin / ml at 30 ° overnight; main culture at 30 ° C in a shaking incubator, starting from OD₅₅₀ nm = 0.1 to OD₅₅₀ nm = 1). The cells are harvested by centrifugation at 10,800 g (10 minutes / 4 °), the pellet suspended in 10 mM Tris buffer, pH 7.0 + 0.2 mM EDTA and 0.2 mM DTE and centrifuged again (6000 g , 10 minutes / 4 °). The pellet is then resuspended in the above buffer and disrupted with ultrasound (5 × 20 seconds / 30 seconds pause with 120 watts). After centrifugation (12,000 g, 10 minutes / 4 °) to separate the cell residues, ultracentrifugation (150,000 g, 90 minutes / 7 °). The top 2/3 of the supernatant are obtained. This fraction is subjected to a fractional ammonium sulfate precipitation. The range of 10-40% ammonium sulfate is used as the enzyme preparation. The pellet obtained in this way is taken up in the above buffer.

Der Reaktionsansatz wird lyophilisiert und in ca. 1/3 des Ausgangsvolumens im Laufmittel für nachfolgende Chromatographie auf Molekulargewichtstrennung (Sephadex LH 20 von Pharmacia) gelöst (Laufmittel: 98% Pyridin, 1% Eisessig, 1% Wasser) und filtriert. Das Volumen der verwendeten Säule ist ca. 200mal so groß wie das Proben-Auftragsvolumen. Die reinen Produktfraktionen werden gepoolt, im Vakuum eingeengt, in pyrogenarmem Wasser suspendiert und lyophilisiert. Nach der Lyophilisation wird Triton X-100 durch Digerieren mti Diethylether entfernt. Nach Zentrifugation wird das Pellet in einem 1 : 1-Gemisch von Chloroform und Methanol gelöst und die Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Zur wäßrigen Suspension dieses Pellets wird die stöchiometrisch berechnete Menge L-Lysin (freie Base) zur Gewinnung des Mono-L-Lysin-Salzes in Form einer wäßrigen 100 mM Lösung zugegeben.The reaction mixture is lyophilized and in about 1/3 of the initial volume in the eluent for subsequent chromatography on molecular weight separation (Sephadex LH 20 from Pharmacia) dissolved (eluent: 98% pyridine, 1% glacial acetic acid, 1% water) and filtered. The The volume of the column used is approximately 200 times the sample order volume. The pure product fractions are pooled, concentrated in vacuo, in low-pyrogen Suspended water and lyophilized. After lyophilization, Triton X-100 is run through Digest with diethyl ether. After centrifugation, the pellet is in one 1: 1 mixture of chloroform and methanol dissolved and the solvent in vacuo away. The stoichiometric calculation of the aqueous suspension of this pellet is carried out Amount of L-lysine (free base) to obtain the mono-L-lysine salt in the form of a aqueous 100 mM solution added.

Rf (in Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser=65/25/5/5)=0,53.Rf (in chloroform / methanol / acetic acid / water = 65/25/5/5) = 0.53.

Analog wie in Beispiel 1 beschrieben, können auch die folgenden Verbindungen der Formel I erhalten werden (Rf-Werte in obigem Lösungsmittel):Analogously to that described in Example 1, the following compounds of the formula I are obtained (Rf values in the above solvent):

Example 2 6-O- [2-deoxy-3-O - [(S) -3-hydroxytetradecanoyl] -2 - [(S) -3-hydroxytetrad-ecanoylamido] - β -D-glucopyranosyl] -2-deoxy-3- O - [(S) -3-hydroxytetradecanoyl] -2- [(R) -3-hydroxytetradecanoylamido] - α -D-glucopyranosylphosphonic acid

Rf=0,53 Rf = 0.53

Example 3 6-O- [2,3-Di-O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] - β -D-glucopyranosyl] -2-decoxy- 3-O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] -2- [(R) -3-hydroxytetradecanoylamido] - α -D-glucopyranosylphosphonic acid

Rf=0,54Rf = 0.54

Example 4 6-O- [2-Deoxy-3-O-tetradecanoyl-2-tetradecanoylamido- β- D-glucopyranosyl] -2-deoxy-3-O - [(R) -hydroxytetradecanoyl] -2 - [(R) -3 -hydroxytetradecanoyl-amido] - a -D-glucopyranosylphosphonic acid

Rf=0,58Rf = 0.58

Example 5 6-O- [2-deoxy-3-O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] -2 - [(S) -3-hydroxytetrad-ecanoylamido] - β -D-glucopyranosyl] -2-deoxy-3- O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] -2- [(R) -3-hydroxytetradecanoylamido] - α -D-glucopyranosylphosphonic acid

Rf=0,53Rf = 0.53

Example 6 6-O- [2,3-deoxy-2,3-di - [(R) -3-hydroxytetradecanoylamido] - β -D-glucopyranosyl] - 2-deoxy-3-O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl ] -2 - [(R) -3-hydroxytetradecano-ylamido] - α -D-glucopyranosylphosphonic acid

Die als Ausgangsprodukte benötigte 2-Deoxy-3-O-[(R)-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3- hydroxytetradecanoylamido]-α-D-glucopyranosylphosphonsäure kann folgendermaßen erhalten werden:The 2-deoxy-3-O - [(R) -hydroxytetradecanoyl] -2 - [(R) -3-hydroxytetradecanoylamido] - α -D-glucopyranosylphosphonic acid required as starting products can be obtained as follows:

a) 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-deoxy- α -D-glucopyranosylphosphonic acid dimethyl ester

Eine Lösung von 1,2 g O-(3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-deoxy-α-D-glucopyranosyl) trichloracetimidat in 36 ml absolutem Dichlormethan wird bei 0° unter Stickstoff mit 600 µl Trifluormethansulfonsäuremethylsilylester versetzt. Dann läßt man 1 Stunde unter Stickstoff bei Raumtemperatur rühren. Das Gemisch wird mit ca. 50 ml Dichlormethan verdünnt und mit gesättigter NaHCO₃-Lösung, dann mit gesättigter NaCl-Lösung extrahiert. Die organische Phase wird über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum eingedampft. Flash- Chromatographie des Rückstandes (Hexan/Ethylacetat=1/3) ergibt die Titelverbindung, die aus Diethylether kristallisiert wird. Fp: 74-75°.A solution of 1.2 g of O- (3,4,6-tri-O-acetyl-2-azido-2-deoxy- α- D-glucopyranosyl) trichloroacetimidate in 36 ml of absolute dichloromethane is at 0 ° under nitrogen with 600 µl trifluoromethanesulfonic acid methyl silyl ester added. Then allowed to stir for 1 hour under nitrogen at room temperature. The mixture is diluted with about 50 ml of dichloromethane and extracted with saturated NaHCO₃ solution, then with saturated NaCl solution. The organic phase is dried over MgSO₄ and evaporated in vacuo. Flash chromatography of the residue (hexane / ethyl acetate = 1/3) gives the title compound, which is crystallized from diethyl ether. Mp: 74-75 °.

Rf (Hexan-Ethylacetat=1/3)=0,20
=+52,8° (c=1,06, Chloroform).Rf (hexane-ethyl acetate = 1/3) = 0.20
= + 52.8 ° (c = 1.06, chloroform).

¹H-NMR (200 MHz, C₆D₈): 6.12 (dd, J=10.1, 9.6, H-C(3)); 5.11 (dd, J=9.9, 9.0, H-C(4)); 4.6-4.4 (m, H-C(5)); 4.27 (dd, J=4.9, 12.4, H_A-C(6)); 4.09 (dd, J=2.3, 12.4, H_B-C(6)); 3.97 (dd, J (1, P)=11.9, J=7.1, H-C(1)); 3.45 (d, J (H, P)=10.7, POCH₃); 3.41 (d, H (H, P)=11.0, POCH₃); 3.30 (ddd, J (2, P)=31.6, J=7.1, 10.1, H-C(2)); 1.75 (s, CH₃CO); 1.72 (s, CH₃CO); 1,64 (s, CH₃CO).1 H NMR (200 MHz, C₆D₈): 6.12 (dd, J = 10.1, 9.6, HC (3)); 5.11 (dd, J = 9.9, 9.0, HC (4)); 4.6-4.4 (m, HC (5)); 4.27 (dd, J = 4.9, 12.4, H _A -C (6)); 4.09 (dd, J = 2.3, 12.4, H _B -C (6)); 3.97 (dd, J (1, P) = 11.9, J = 7.1, HC (1)); 3.45 (d, J (H, P) = 10.7, POCH₃); 3.41 (d, H (H, P) = 11.0, POCH₃); 3.30 (ddd, J (2, P) = 31.6, J = 7.1, 10.1, HC (2)); 1.75 (s, CH₃CO); 1.72 (s, CH₃CO); 1.64 (s, CH₃CO).

b) 2-Azido-2-deoxy- α -D-glucopyranosyllphosphonsäuredimethylester

Eine Lösung von 1,15 g 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-deoxy-α-D-glucopyranosylphosphonsäuredimethylester in 20 ml absolutem Methanol wird unter Rühren bei Raumtemperatur mit 0,3 ml einer 0,4 M Natriummethylatlösung in Methanol versetzt. Nach 1 Stunde wird das Gemisch bei 0°C mit 2 N Salzsäure neutralisiert und im Vakuum eingedampft. Flash- Chromatographie (Ethylacetat/Methanol=9/1) liefert die Titelverbindung als farbloses Öl, das nach Ankratzen aus Ethylacetat kristallisiert. Fp: 125°.A solution of 1.15 g of 3,4,6-tri-O-acetyl-2-azido-2-deoxy- α- D-glucopyranosylphosphonic acid dimethylester in 20 ml of absolute methanol is stirred with 0.3 ml of an 0, 4 M sodium methylate solution in methanol was added. After 1 hour the mixture is neutralized at 0 ° C. with 2 N hydrochloric acid and evaporated in vacuo. Flash chromatography (ethyl acetate / methanol = 9/1) provides the title compound as a colorless oil which crystallizes from ethyl acetate after being scratched. Mp: 125 °.

Rf (Ethylacetat/Methanol=9/1)=0,20.
=+69,7° (c=1,01 Chloroform).Rf (ethyl acetate / methanol = 9/1) = 0.20.
= + 69.7 ° (c = 1.01 chloroform).

¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD): 4.53 (dd, J (1, P)=11.2, J=7.2, H-C(1)); 4.04 (t, J=9.4, H-C(3)); 3.85 (d, J (H, P)=10.8, POCH₃); 3,82 (d, J (H, P)=10.9, POCH₃); 3.9-3.8 (m, H_A-C(6)); 3,79 (ddd, J (2, P)=34.5; J=7.3; 10.0, H-C(2)); 3.71-3.68 (m, H-C(5)); 3.63 (dd, J=5.4 12.0, H_B-C(66); 3.33-3.28 (m, H-C(4)).1 H-NMR (400 MHz, CD₃OD): 4.53 (dd, J (1, P) = 11.2, J = 7.2, HC (1)); 4.04 (t, J = 9.4, HC (3)); 3.85 (d, J (H, P) = 10.8, POCH₃); 3.82 (d, J (H, P) = 10.9, POCH₃); 3.9-3.8 (m, H _A -C (6)); 3.79 (ddd, J (2, P) = 34.5; J = 7.3; 10.0, HC (2)); 3.71-3.68 (m, HC (5)); 3.63 (dd, J = 5.4 12.0, H _B -C (66); 3.33-3.28 (m, HC (4)).

c) 2-Azido-4,6-O-benzylidene-2-deoxy- α- D-glucopyranosylphosphonic acid dimethyl ester

Zu einem Gemisch von 615 mg fein zerriebenem und im Exsikkator über P₂O₅ getrocknetem 2-Azido-2-deoxy-α-D-glucopyranosylphosphonsäuredimethylester und 300 mg frisch geschmolzenem ZnCl₂ werden 12 ml Benzaldehyd gegeben und dann bei Raumtemperatur heftig gerührt. Nach 3 Stunden wird die Lösung im Hochvakuum eingedampft. Flash- Chromatographie des Rückstandes (je 200 ml Hexan/Ethylacetat=1/1, 2/3, 1/2) ergibt die Titelverbindung.12 ml of benzaldehyde are added to a mixture of 615 mg of finely ground and dried in a desiccator over P₂O₅ 2-azido-2-deoxy- α- D-glucopyranosylphosphonic acid dimethyl ester and 300 mg of freshly melted ZnCl₂ and then stirred vigorously at room temperature. After 3 hours the solution is evaporated in a high vacuum. Flash chromatography of the residue (200 ml each of hexane / ethyl acetate = 1/1, 2/3, 1/2) gives the title compound.

Rf (Hexan/Ethylacetat=1/2)=0,28.
=+18,1° (c=1,05, Chloroform).Rf (hexane / ethyl acetate = 1/2) = 0.28.
= + 18.1 ° (c = 1.05, chloroform).

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): 7.48-7.42 (m, 2 arom. H); 7.36-7.33 (m, 3 arom. H); 5.50 (s, HC-Ph); 4,48 (t, J=9.4, H-C(3)); 4.37 (dd, J (1, P)=11.9, J=7.4, H-C(1)); 4.27 (dd, J= 5.0, 10,4, H_eq-C(6)); 4.03-3.97 (m, H-C(5)); 3.93 (ddd, J (2, P)=33.8, J=7.4, 9.6, H-C(H 2)); 3,83 (d, J (H, P)=10.8, POCH₃); 3.82 (d, J (H, P)=10.7, POCH₃); 3.62 (t, J= 10.2, H_ax-C(6)); 3.48 (t, J=9.4; H-C(4)).1 H-NMR (400 MHz, CDCl₃): 7.48-7.42 (m, 2 arom. H); 7.36-7.33 (m, 3 aroma H); 5.50 (s, HC-Ph); 4.48 (t, J = 9.4, HC (3)); 4.37 (dd, J (1, P) = 11.9, J = 7.4, HC (1)); 4.27 (dd, J = 5.0, 10.4, _Heq -C (6)); 4.03-3.97 (m, HC (5)); 3.93 (ddd, J (2, P) = 33.8, J = 7.4, 9.6, HC (H 2)); 3.83 (d, J (H, P) = 10.8, POCH₃); 3.82 (d, J (H, P) = 10.7, POCH₃); 3.62 (t, J = 10.2, H _ax -C (6)); 3.48 (t, J = 9.4; HC (4)).

d) 2-Amino-4,6-O-benzylidene-2-deoxy- α- D-glucopyranosylphosphonic acid dimethyl ester

Zu 300 mg 2-Azido-4,6-O-benzyliden-2-deoxy-α-D-glucopyranosylphosphonsäuredimethylester in 40 ml einer ethanolischen NiCl₂-Lösung (40 g NiCl₂, 6H₂O und 20 g H₃BO₃ in 1000 ml Ethanol) werden während 1 Stunde bei Raumtemperatur 90 mg NaBH₄ gegeben. Nach 20 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird das Gemisch über Celite filtriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 200 ml Dichlormethan aufgenommen und dreimal mit Wasser ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen der organischen Phase über MgSO₄ und Eindampfen im Vakuum wird die Titelverbindung als weißer Schaum erhalten, der ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt wird. Rf (Ethylacetat/Methanol=4/1)=0,18.To 300 mg of 2-azido-4,6-O-benzylidene-2-deoxy- α- D-glucopyranosylphosphonic acid dimethyl ester in 40 ml of an ethanolic NiCl₂ solution (40 g NiCl₂, 6H₂O and 20 g H₃BO₃ in 1000 ml ethanol) are during 1 Given 90 mg NaBH₄ at room temperature. After stirring for 20 hours at room temperature, the mixture is filtered through Celite and the filtrate is evaporated in vacuo. The residue is taken up in 200 ml of dichloromethane and extracted three times with water. After drying the organic phase over MgSO₄ and evaporation in vacuo, the title compound is obtained as a white foam, which is used in the next step without further purification. Rf (ethyl acetate / methanol = 4/1) = 0.18.

e) 4,6-O-Benzylidene-3-O - [(R) -3-benzyloxytetradecanoyl] -2 - [(R) -3-benzylo-xytetradecanoylamido] -2-deoxy- α -D-glucopyranosylphosphonic acid dimethyl ester

Eine Lösung von 600 mg 2-Amino-4,6-O-benzyliden-2-deoxy-α-D-glucopyranosylphosphonsäuredimethylester, 1,177 g (R)-3-Benzyloxytetradecansäure und 27 mg 4-Dimethylaminopyridin in 20 ml absolutem Dichlormethan wird mit einem Eis-NaCl- Gemisch auf -15° gekühlt und unter Rühren mit 726 mg N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nachher läßt man das Gemisch in einem Eis-Wasser-Bad langsam auf 0° erwärmen und rührt 4 Stunden lang. Dann wird über Celite filtriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Eine Lösung des Rückstandes in Toluol/Ethylacetat (3/1) wird nochmals über Celite filtriert und schließlich durch Flash-Chromatographie (150 ml Toluol/Ethylacetat=3/1, dann Toluol/Ethylacetat=2/1) gereinigt.A solution of 600 mg of 2-amino-4,6-O-benzylidene-2-deoxy- α- D-glucopyranosylphosphonic acid dimethyl ester, 1.177 g of (R) -3-benzyloxytetradecanoic acid and 27 mg of 4-dimethylaminopyridine in 20 ml of absolute dichloromethane is mixed with a Ice-NaCl mixture cooled to -15 ° and 726 mg of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide were added with stirring. The mixture is then slowly warmed to 0 ° in an ice-water bath and stirred for 4 hours. Then it is filtered through Celite and the filtrate is evaporated in vacuo. A solution of the residue in toluene / ethyl acetate (3/1) is filtered through Celite again and finally purified by flash chromatography (150 ml toluene / ethyl acetate = 3/1, then toluene / ethyl acetate = 2/1).

=+29,3° (c=1,03, Chloroform).= + 29.3 ° (c = 1.03, chloroform).

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃)(Die Nummern der C-Atome der beiden Acylketten sind mit einem bzw. zwei Strichen versehen): 7.4-7.2 (m, 15 arom. H); 6,76 (d, J (NH, 2)=7.7, N-H); 5.72 (t, J=9.9, H-C(3)); 5.46 (s, HC-Ph); 4.67 (dd, J (1, P)=9.9, J=7.3, H-C(1)); 4.65-4.48 (m, H-C(2)); 4.57 und 4.52 (AB, J=11.7, H₂C-Ph); 4.48 und 4.37 (AB, J= 11.6, H₂C-Ph); 4.32 (dd, J=4.9, 10.4, H_eq-C(6)); 4.05-3.95 (m, H-C(5)); 3,.85-3.77 (m, H-C(3′), H-C(3′′); 3.75 (d, J (H, P)=10.7, POCH₃); 3.69 (t, J=10.2, H_ax-C(6)); 3.68 (t, J=9.4, H-C(4)); 3.62 (d, J (H, P)=10.9, POCH₃); 2.65 (dd, J=15.1, 6.3, H_A-C(2′)); 2.43 (dd, J=15.1, 5.9; H_B-C(2′)); 2.37 (d, J=5.6, H_A-C(2′′)), H_B-C(2′′); 1.57-1.39 (m, 4H); 1.30-1.19 (m, 36H); 0.88 (dd, J=6.1, 6.9, 2 CH₃).1 H-NMR (400 MHz, CDCl₃) (The numbers of the C atoms of the two acyl chains are provided with one or two dashes): 7.4-7.2 (m, 15 arom. H); 6.76 (d, J (NH, 2) = 7.7, NH); 5.72 (t, J = 9.9, HC (3)); 5.46 (s, HC-Ph); 4.67 (dd, J (1, P) = 9.9, J = 7.3, HC (1)); 4.65-4.48 (m, HC (2)); 4.57 and 4.52 (AB, J = 11.7, H₂C-Ph); 4.48 and 4.37 (AB, J = 11.6, H₂C-Ph); 4.32 (dd, J = 4.9, 10.4, _Heq -C (6)); 4.05-3.95 (m, HC (5)); 3, .85-3.77 (m, HC (3 ′), HC (3 ′ ′); 3.75 (d, J (H, P) = 10.7, POCH₃); 3.69 (t, J = 10.2, H _ax -C (6)); 3.68 (t, J = 9.4, HC (4)); 3.62 (d, J (H, P) = 10.9, POCH₃); 2.65 (dd, J = 15.1, 6.3, H _A -C ( 2 ′)); 2.43 (dd, J = 15.1, 5.9; H _B -C (2 ′)); 2.37 (d, J = 5.6, H _A -C (2 ′ ′)), H _B -C (2 ′ ′); 1.57-1.39 (m, 4H); 1.30-1.19 (m, 36H); 0.88 (dd, J = 6.1, 6.9, 2 CH₃).

f) 2-Deoxy-3-O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl-yamido] - α - D-glucopyranosylphosphonic acid dimethyl ester

Eine Lösung von 110 mg 4,6-O-Benzyliden-3-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]- 2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-α-D-glucopyranosylphosphonsäuredimethylester in 11 ml absolutem Methanol wird mit 100 mg 10% Pd(OH)₂/C unter einem H₂-Druck von 4 bar bei Raumtemperatur hydriert. Nach 3 Stunden wird über Celite filtriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Flash-Chromatographie (Chloroform/Methanol =20/1, dann 10/1) liefert die Titelverbindung, die aus heißem Dichlormethan kristallisiert wird. Fp: 130-133°.A solution of 110 mg of 4,6-O-benzylidene-3-O - [(R) -3-benzyloxytetradecanoyl] - 2 - [(R) -3-benzyloxytetradecanoylamido] -2-deoxy- α -D-glucopyranosylphosphonic acid dimethyl ester in 11 ml of absolute methanol is hydrogenated with 100 mg of 10% Pd (OH) ₂ / C under an H₂ pressure of 4 bar at room temperature. After 3 hours the mixture is filtered through Celite and the filtrate is evaporated in vacuo. Flash chromatography (chloroform / methanol = 20/1, then 10/1) provides the title compound, which is crystallized from hot dichloromethane. Mp: 130-133 °.

Rf (Ethylacetat/Methanol=9/1)=0.28.
=+52,8° (c=1,06, Chloroform).Rf (ethyl acetate / methanol = 9/1) = 0.28.
= + 52.8 ° (c = 1.06, chloroform).

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): 7.19 (d, J (NH, 2)=7.5, N-H); 5.61 (dd, J=10.5, 9.3 H-C(3)): 4.75 (dd, J (1, P)=10.7, J=7.4, H-C(1)); 4.72-4.65 (m, 1H); 4.46 (ddt, J (2, P)=34.1, J=7.4, 10.8 H-C(2)); 4.24-4.15 (s, br, H); 4.0-3.5 (m, 8H); 3.87 (d, J (H, P)=10.7, POCH₃); 3.73 (d, J (H, P)=10.9, POCH₃); 2.57 (dd, J=14.1, 2.6, H_A-C(2′′)); 2.44 (dd, J=14.6, 2.4, H_A-C(2′′)); 2.40 (dd, J=14.0, 10.0, H_B-C(2′)); 2.23 (dd, J=14.6, 8.7, H_B-C(2′′)); 1.5-1.4 (m, 4H); 1.26 (s, br, 36H); 0.88 (t, J=6.8, 2 CH₃).1 H-NMR (400 MHz, CDCl₃): 7.19 (d, J (NH, 2) = 7.5, NH); 5.61 (dd, J = 10.5, 9.3 HC (3)): 4.75 (dd, J (1, P) = 10.7, J = 7.4, HC (1)); 4.72-4.65 (m, 1H); 4.46 (ddt, J (2, P) = 34.1, J = 7.4, 10.8 HC (2)); 4.24-4.15 (s, br, H); 4.0-3.5 (m, 8H); 3.87 (d, J (H, P) = 10.7, POCH₃); 3.73 (d, J (H, P) = 10.9, POCH₃); 2.57 (dd, J = 14.1, 2.6, H _A -C (2 ′ ′)); 2.44 (dd, J = 14.6, 2.4, H _A -C (2 ′ ′)); 2.40 (dd, J = 14.0, 10.0, H _B -C (2 ′)); 2.23 (dd, J = 14.6, 8.7, H _B -C (2 ′ ′)); 1.5-1.4 (m, 4H); 1.26 (s, br, 36H); 0.88 (t, J = 6.8, 2 CH₃).

g) 2-Amino-2-deoxy-2-N, 3-O-bis - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] - α -D-glucopyranosylphosphonic acid

Unter Stickstoff werden 400 µl Bromtrimethylsilan tropfenweise über 10 Minuten zu einer Lösung von 100 mg 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl-amido]- α-D-glucopyranosylphosponsäuredimethylester in 10 ml absolutem Dichlormethan bei 0° gegeben. Nach 8 1/2 Stunden wird das Gemisch mit ca. 2 ml Methanol verdünnt und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit bidestilliertem Wasser versetzt, was sofort zu einer weißen Fällung führt. Nach Lyophilisation der Suspension wird die Titelverbindung als freie Säure erhalten. Kristallisation des Rohprodukts aus Ethanol mit 2 Äquivalenten Tris führt zum reinen Produkt in Form des Bis-Tris-Salzes.400 μl of bromotrimethylsilane are added dropwise over 10 minutes to a solution of 100 mg of 2-deoxy-3-O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl-amido] - α -D- added dimethyl glucopyranosylphosphonate in 10 ml of absolute dichloromethane at 0 °. After 8 1/2 hours, the mixture is diluted with about 2 ml of methanol and evaporated in vacuo. The residue is mixed with bidistilled water, which immediately leads to a white precipitation. After lyophilization of the suspension, the title compound is obtained as the free acid. Crystallization of the crude product from ethanol with 2 equivalents of tris leads to the pure product in the form of the bis-tris salt.

Rf (Chloroform/Methanol/Wasser/25% Ammoniak=20/15/2/1=0,35.Rf (chloroform / methanol / water / 25% ammonia = 20/15/2/1 = 0.35.

¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) vom Bis-Tris-Salz: 5.67 (dd, J=10.3, 8.8, H-C(3)); 4.29 (ddd, J (2, P)=26.7, J=6.8, 10.4, H-C(2)); 4.20-4.14 (m, H-C(5)); 4.13 (dd, J (1, P)= 11.3, J=6.8, H-C(1)); 4.00-3.97 (m, 1H); 3.94-3.91 (m, 1H); 3.87 (dd, J=11.8, 2.0, H- C(6)); 3.47 (t, J=9.2, H-C(4)); 2.52 (dd, J=15.2, 5.0, H_A-C(2′′)); 2.45 (dd, J=15.2, 7.9, H_B-C(2′)); 2.33 (dd, J=14.2, 4.0, H_A-C(2′′)); 2.26 (dd, J=14.3, 8.7, H_B-C(2′′)); 1.5-1.4 (m, 36H); 1.31 (s, br, 4H); 0.91 (t, J=6.8, 2 CH₃).1 H-NMR (400 MHz, CD₃OD) of the bis-tris salt: 5.67 (dd, J = 10.3, 8.8, HC (3)); 4.29 (ddd, J (2, P) = 26.7, J = 6.8, 10.4, HC (2)); 4.20-4.14 (m, HC (5)); 4.13 (dd, J (1, P) = 11.3, J = 6.8, HC (1)); 4.00-3.97 (m, 1H); 3.94-3.91 (m, 1H); 3.87 (dd, J = 11.8, 2.0, HC (6)); 3.47 (t, J = 9.2, HC (4)); 2.52 (dd, J = 15.2, 5.0, H _A -C (2 ′ ′)); 2.45 (dd, J = 15.2, 7.9, H _B -C (2 ′)); 2.33 (dd, J = 14.2, 4.0, H _A -C (2 ′ ′)); 2.26 (dd, J = 14.3, 8.7, H _B -C (2 ′ ′)); 1.5-1.4 (m, 36H); 1.31 (s, br, 4H); 0.91 (t, J = 6.8, 2 CH₃).

Claims

1. New saccharides of the formula wherein R₁, R₂, R₃ and R₄ are the same or different and each represents an optionally substituted acyl group, in free form or in the form of their acid addition salts.

2. Process for the preparation of new saccharides of the formula wherein R₁, R₂, R₃ and R₄ are the same or different and each represent an optionally substituted acyl group, in free form or in the form of their acid addition salts, characterized in that a compound of the formula wherein R₃ and R₄ have the above meaning and U is uridine, with a compound of formula wherein R₁ and R₂ have the above meaning, enzymatically condensed and the compounds thus obtained in free form or in the form of their acid addition salts.