DE4104783A1 - Verfahren zur erzeugung strukturierter enzymmembranen - Google Patents

Description

Die meisten gebräuchlichen Biosensoren arbeiten mit dem Prinzip der elektrochemischen Detektion. Es sind Anwendungen für die Bestimmung einer Vielzahl von Analyten beschrieben worden. (F. Scheller/F. Schubert: "Biosensoren"; Akademie Verlag; Berlin; 1989)

Die bioaktive Substanz wird durch geeignete Techniken auf dem Sensor immobilisiert. Die angewandten Grundtechniken hierbei sind (G. G. Guilbault: "Analytical uses of immobilized enzymes"; Marcel Dekker; New York; 1984):

• 1. Bindung an einen Träger:
  - kovalente Bindung
  - adsorptive Bindung
• 2. Vernetzung durch bifunktionelle Reagenzien zu makroskopischen Partikeln
• 3. Einschlußmethoden
  - Makroverkapselung
  - Einschluß in eine Polymermatrix

Es werden auch Kombinationen dieser Techniken genutzt.

Aufgrund der zunehmenden Miniaturisierung der Sensoren (ISFET, Mikroelektroden), der Forderung nach Multisensoren und der immer breiteren Anwendung der Fertigungsprinzipien der Mikroelektronik sind Verfahren zur Immobilisierung der bioaktiven Substanz gefragt, die in die Produktionszyklen der Halbleiterindustrie integriert werden können und eine Strukturierung der Enzymmembranen ermöglichen.

Hierfür bieten sich u. a. photolithographische Techniken an. Aus der Literatur sind verschiedene Verfahrensweisen bekannt:

Zum einen nutzt man wasserlösliche Negativ-Photopolymersysteme. Das Enzym wird in der Photopolymerlösung gelöst, die danach auf die Sensoroberfläche gebracht, getrocknet und durch eine Maske mit UV- Licht bestrahlt wird.

Bekannt ist hier die Anwendung eines Polyvinylalkohols (PVA), der durch Einführung von Stilbazoliumgruppen photosensitiv gemacht wurde. (K. Ichimura; J. of Polymer Sci., Polym. Chem. Edit. 22 (1984) 2817)

Über diese Gruppen werden die PVA-Ketten bei Belichtung vernetzt. Allerdings treten bei der Entwicklung in Wasser Haftprobleme auf. Desweiteren ist die mechanische Stabilität im wäßrigen Medium nicht ausreichend. Die Empfindlichkeit des PVA auch im langwelligen Bereich (Sonnenlicht) schränkt seine Handhabbarkeit ein.

Eine indirekte Strukturierung wird dadurch erreicht, daß mit Hilfe eines handelsüblichen Photoresists z. B. auf einem ISFET Mikropools erzeugt werden, in die dann mit Mikrospritzen die Immobilisierungslösung hineindosiert wird. Danach wird die UV-Bestrahlung durchgeführt. (Y. Miyahara/T. Moriizumi/K. Ichimura: Sensors and Actuators 7 (1985) 1)

Es sind also viele Einzelschritte notwendig. In einer anderen Variante mit Mikropools werden Membranen durch Enzymvernetzung mit einem bifunktionellen Reagenz (z. B. Glutaraldehyd) erzeugt. (T. Kuriyama/S. Nakamoto/Y. Kawana/J. Kimura: Proc. 2nd Int. Meet. on Chem. Sensors; Bordeaux; France; 1986; pp. 568-571) Problematisch sind auch hier die Haftung und die mechanische Stabilität der Enzymmembranen.

Ein anderes beschriebenes Photopolymersystem besteht aus einer wäßrigen Lösung von Polyvinylpyrrolidon (PVP), Glucoseoxidase, Albumin und eines Bisazides. Dieses Bisazid spaltet bei UV-Bestrahlung Stickstoff ab und es entsteht ein reaktives Bisnitren, das die PVP- Ketten vernetzt. (Y. Hanazato/M. Nakako/M. Maeda/S. Shiono; Anal. Chim. Acta 193 (1987) 87)

Bei Entwicklung in Wasser lösten sich die entstandenen Membranen vom Untergrund (Siliziumdioxid). Dies wurde durch Verwendung einer 1- 3%igen wäßrigen Glutaraldehydlösung als Entwickler verhindert. Die Enzymmembranen weisen im wäßrigen Medium eine eingeschränkte mechanische Stabilität auf.

Weiterhin bekannt ist die lift-off-Methode. Hier wurde die Halbleiteroberfläche mit einem Positiv-Resist beschichtet, durch eine Maske belichtet und die sensitiven Gebiete freigelegt. Anschließend ist ein Haftvermittler aufgebracht worden. Durch spin-coating wurde darauf eine wäßrige Lösung von Urease, Albumin und Glutaraldehyd aufgetragen und getrocknet. Bei Behandlung in Aceton mit Ultraschall werden alle Schichten mit dem Photoresist abgehoben. Die Enzymmembran bleibt durch den Haftvermittler auf dem vorher freigelegten sensitiven Gebiet. (T. Kuriyama/S. Nakamoto/Y. Kawana/J. Kimura; Proc. 2nd Int. Meet. on Chem. Sensors; Bordeaux; France; 1986; pp. 568-571)

Nachteilig sind die der Vernetzungsmethode immanenten Aktivitätsverluste und die geringe mechanische Beanspruchbarkeit der Enzymmembranen.

Der Erfindung liegt die technische Aufgabe zugrunde, selektiv auf elektrochemischen Sensoren fest haftende, enzymhaltige, mikrostukturierte Polymermembranen aufzubringen, die eine hohe Retention für das immobilisierte Enzym bei geringer Diffusionsbarriere für Analyt und Produkte aufweisen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß eine enzymhaltige Photopolymermischung hergestellt wird, die mindestens ein ethylenisch ungesättigtes Monomer mit vorzugsweise mindestens zwei radikalisch polymerisierbaren Gruppen im Molekül, die einen radialbildenden Photoinitiator oder Initiatorsystem, ein polymeres Bindemittel, mindestens ein Enzym, ein Tensid sowie ein geeignetes Lösungsmittel enthält.

Derivate der Acrylsäure und der Methacrylsäure eignen sich besonders als Monomere. Vorzugsweise wird Bisphenol-A-bis(2-hydroxypropylmethacrylat) verwendet.

Als radikalbildende Photoinitiatoren können aus der Literatur bekannte Verbindungen wie z. B. MICHLERS Keton/Benzophenon, Benzoinether u. a. verwendet werden. (H.-J. Timpe/H. Baumann; "Photopolymere - Prinzipien und Anwendungen"; Deutscher Verlag für Grundstoffindustrie; Leipzig; 1988)

Polymethylmethacrylat mit freien Säuregruppen (Herstellung siehe DD 2 03 321) diente als polymeres Bindemittel, das aufgrund der Wechselwirkung dieser Restsäuregruppen mit Hydroxylgruppen auf der Sensoroberfläche günstige Hafteigenschaften aufweist. Es besitzt eine gute chemische Beständigkeit und mechanische Stabilität.

Die Photopolymermischung wurde im allgemeinen in Chloroform gelöst. Es können aber auch andere Lösungsmittel verwendet werden, wenn sie die Enzymaktivität nicht beeinträchtigen.

Das Enzym (vorzugsweise Glucoseoxidase) wurde durch Behandlung mit Ultraschall in der Lösung suspendiert. Das der Lösung zugesetzte Tensid dient hier der Stabilisierung der Suspension. Es wurde im allgemeinen mit Dodecyltrimethylammoniumchlorid gearbeitet.

Diese Suspension wird durch Auftropf-, Tauch-, Schleuder- oder andere dem Fachmann bekannte Techniken auf die Sensoroberfläche aufgetragen.

Nach Verdampfen des Lösungsmittels erfolgt die Belichtung und Strukturierung des Photopolymers. Es sind alle Stahlungsquellen geeignet, durch deren Strahlung eine Polymerisation und Vernetzung des Photopolymers hervorgerufen wird. Zu hohe thermische Belastung des Enzyms kann z. B. durch den Einsatz von Wärmeschutzküvetten vermieden werden. Die Zusammensetzung des Gemisches gewährleistet, daß nach der Aushärtung der Schicht das Enzym in einer mechanisch und chemisch stabilen Polymermembran eingeschlossen ist.

Die zur Entwicklung eingesetzten Lösungsmittel sollen das vernetzte Polymere möglichst wenig anquellen. Ein Beispiel dafür ist Methylethylketon.

Es konnten Strichbreiten bis zu 150 µm entwickelt werden. Bei kleineren Strukturen stört die Streustrahlung an den Enzympartikeln. Bei der Konditionierung der Membranen im Phosphatpuffer erfolgt ein teilweises Herauslösen des Tensides aus der Membran, was deren Permeabilität erhöht. Damit ist neben der Suspensionsstabilisierung ein weiterer Vorteil des Tensideinsatzes gegeben. Es ist über den eingesetzten Tensidanteil möglich, die Durchlässigkeit der Membran zu beeinflussen und damit z. B. die Empfindlichkeit eines amperometrischen Enzymsensors bei konstanter Membrandicke einzustellen.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

In einer Lösung aus 35 mg Polymethylmethacrylat (Säurezahl 62 mg/g), 15 mg Bisphenol-A-bis(2-hydroxypropylmethacrylat), 0.5 mg MICHLERS Keton, 10 mg Benzophenon, 20 mg Dodecyltrimethylammoniumchlorid in 0.5 ml Chloroform wurden durch Ultraschallbehandlung (5 Minuten) 20 mg Glucoseoxidase suspendiert. Die Suspension wurde auf eine Dünnfilmplatinelektrode so aufgetropft, daß nach Verdampfen des Lösungsmittels eine zirka 20 µm dicke Schicht vorlag. Diese wurde durch eine aufliegende Negativmaske mit einer Quecksilberniederdrucklampe 2 Minuten lang bestrahlt und anschließend 30 Sekunden in Methylethylketon entwickelt.

Nach einer Konditionierungszeit von 2 Stunden in neutralem 0,1 M Phosphatpuffer (Herauslösen des Tensides) kann der Sensor eingesetzt werden. Es wurde eine scheinbare spezifische Aktivität von 0.3 U/cm² bestimmt.

Beispiel 2

35 mg Polymermethacrylat, 15 mg Bisphenol-A-bis(2- hydroxypropylmethacrylat), 35 mg β-Hydroxyethylacrylat, 0.5 mg MICHLERS Keton, 5 mg Benzophenon und 20 mg Dodecyltrimethylammoniumchlorid wurden in 0.5 ml Chloroform gelöst. 40 mg Glucoseoxidase wurden in dieser Lösung durch Ultraschallbehandlung (5 Minuten) suspendiert. Die Suspension wurde auf den Träger so aufgebracht, daß eine zirka 20 µm dicke Schicht nahe dem Verdampfen des Lösungsmittels vorlag. Anschließend wurde durch eine Strichmaske sechs Minuten lang mit einer Quecksilberhöchstdrucklampe HBO 200 (NARVA Berlin) belichtet und 30 Sekunden lang in Methylethylketon entwickelt. Die minimal erzeugbare Strichbreite betrug 150 µm.

Die Messungen mit einer so beschichteten Platinelektrode (Fläche ca. 7 mm²) wurde im Bereich von 0.05 bis 3.5 mmol/l Glucose eine Empfindlichkeit von 0.315 µA/(mmol/l) erzielt.

Beispiel 3

35 mg Polymethylmethacrylat, 10 mg Pentaerythryttetraarylat, 0.5 mg MICHLERS Keton, 10 mg Benzophenon und 10 mg Dodecyltrimethylammoniumchlorid wurden in 0.5 ml Chloroform gelöst. 40 mg Glucoseoxidase wurden durch Ultraschallbehandlung (5 Minuten) in dieser Lösung suspendiert. Die Suspension wurde auf den Träger so aufgebracht, daß nach Verdampfen des Lösungsmittels eine zirka 20 µm dicke Schicht resultierte. Anschließend wurde durch eine aufliegende Strichmaske mit einer Quecksilberniederdrucklampe belichtet. Es wurde mit Methylethylketon entwickelt (30 Sekunden). Die kleinste abgebildete Strichbreite war 150 µm.

Beispiel 4

In einer Lösung aus 35 mg Polymethylmethacrylat, 15 mg Bisphenol-A- bis(2-hydrocypropylmethacrylat), 2.5 mg Benzoinisopropylether, 20 mg Dodecyltrimethylammoniumchlorid in 0.5 ml Chloroform wurden durch fünfminütige Ultraschallbehandlung 40 mg Glucoseoxidase suspendiert. Die Suspension wurde auf eine Dünnfilmplatinelektrode so aufgetropft, daß nach dem Verdampfen des Lösungsmittels eine zirka 20 µm dicke Schicht vorlag. Durch eine Negativmakse wurde mit einer Quecksilberhöchstdrucklampe HBO 200 belichtet (5 Minuten). Nach der Entwicklung in Methylethylketon wurde die Elektrode in neutralem 0.1 M Phosphatpuffer 2 Stunden lang konditioniert. Es wurde eine scheinbare spezifische Aktivität von 0.25 U/cm² bestimmt.

Claims (1)

1. Verfahren zur Erzeugung strukturierter Enzymmembranen für Biosensoren mit gezielt einstellbarer Permeabilität durch ein Photopolymersystem, das mindestens ein ethylenisch ungesättigtes Monomer mit mindestens zwei radikalisch polymerisierbaren Gruppen, einen radikalbildenden Photoinitiator oder Initiatorsystem und ein polymers Bindemittel enthält, gekennzeichnet dadurch, daß dem Gemisch ein Tensid, mindestens ein Enzym sowie ein geeignetes Lösungsmittel zugesetzt werden, daß das Gemisch auf den Sensor aufgebracht wird, daß nach der bildmäßigen Belichtung und Entwicklung das Enzym im Polymersystem eingeschlossen ist und das Tensid mit Wasser aus der polymeren Membran herausgelöst wird.