DE4039415A1 - Recombinant proteins without N-terminal methionine gp. - which are G-CSF derivs. useful to treat cancer and in bone marrow transplants, etc. - Google Patents
Recombinant proteins without N-terminal methionine gp. - which are G-CSF derivs. useful to treat cancer and in bone marrow transplants, etc.Info
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung rekombi nanter Proteine bzw. Peptide in Prokaryonten und die an schließende Entfernung einer N-terminalen Sequenz.The invention relates to a method for producing recombi nanter proteins or peptides in prokaryotes and the closing removal of an N-terminal sequence.
Verschiedene pathogene Bakterienarten (z. B. Neisseria genorrhoea, Neisseria meningititis oder Haemophilus influenzae), die auf der menschlichen Schleimhaut wachsen, sekretieren eine Protease, die spezifisch für menschliches IgA1 sind. Dieses Immunglobulin ist eine wichtige Komponente der sekretorischen Immunantwort, die gegen Infektionen sol cher pathogener Organismen schützen soll (Übersicht: Kornfeld und Plaut, Rev. Infect. Dis. 3 (1981), 521-534). Die IgA- Protease spaltet folgende Erkennungssequenzen, wie z. B. bei Pohlner et al., (Nature 325 (1987), 458-462) beschrieben:Different pathogenic types of bacteria (e.g. Neisseria genorrhoea, Neisseria meningititis or Haemophilus influenzae) that grow on the human mucosa, secrete a protease that is specific for human IgA1 are. This immunoglobulin is an important component the secretory immune response against sol protect pathogenic organisms (overview: grain field and Plaut, Rev. Infect. Dis. 3: 521-534 (1981). The IgA Protease cleaves the following recognition sequences, such as. B. at Pohlner et al. (Nature 325 (1987), 458-462):
- 1. Pro-Ala-Pro ↓ Ser-Pro1. Pro-Ala-Pro ↓ Ser-Pro
- 2. Pro-Pro ↓ Ser-Pro2. Pro-Pro ↓ Ser-Pro
- 3. Pro-Pro ↓ Ala-Pro3. Pro-Pro ↓ Ala-Pro
- 4. Pro-Pro ↓ Thr-Pro4. Pro-Pro ↓ Thr-Pro
Dabei bedeutet der Pfeil jeweils die Schnittstelle durch die IgA-Protease. Die Klonierung der IgA-Protease ist z. B. bei Pohlner et al., 1987, supra beschrieben.The arrow means the interface through the IgA protease. The cloning of the IgA protease is e.g. B. at Pohlner et al., 1987, supra.
Bei der Herstellung von rekombinanten Proteinen in pro karyontischen Organismen ist die Klonierung einer DNA-Sequenz erforderlich, die ein AUG als Initiationscodon vor dem Beginn der eigentlichen DNA-Sequenz enthält. Als Folge davon wird in Prokaryonten wie z. B. E. coli ein rekombinantes Protein ex primiert, das einen Methioninrest an Aminosäureposition -1 enthält. In the production of recombinant proteins in pro caryotic organisms is the cloning of a DNA sequence required an AUG as an initiation codon before starting contains the actual DNA sequence. As a result, in Prokaryotes such as B. E. coli a recombinant protein ex that has a methionine residue at amino acid position -1 contains.
Die Bereitstellung von in Position 1 methioninfreien rekombi nanten Proteinen aus Prokaryonten kann z. B. über eine methio ninspezifische Peptidase erfolgen, die das N-terminale Methionin abspaltet. Dieses Verfahren ist jedoch sehr aufwen dig, da die Abspaltung nur über Proteinsequenzierung über prüft werden kann. Außerdem ist eine Trennung von in Position -1 methioninhaltigen und methioninfreiem Protein aufgrund des fast identischen Molekulargewichts sehr schwierig und kann damit nur unvollständig erreicht werden.The provision of recombi free of methionine in position 1 Proteins from prokaryotes may e.g. B. over a methio nin-specific peptidase take place, which is the N-terminal Cleaves methionine. However, this process is very expensive dig, since the cleavage only via protein sequencing can be checked. There is also a separation from in position -1 methionine and methionine free protein due to of almost identical molecular weight very difficult and can only be achieved incompletely.
Die PCT-Anmeldung WO 84/02351 offenbart die Abspaltung N-ter minaler Aminosäuren von einem Fusionsprotein. Dabei können mehrere Aminosäuren des Proteins vom N-Terminus her durch schrittweises Abspalten durch eine Exopeptidase, vorzugsweise Leucinpeptidase, bis zu einer Sequenz X-Pro entfernt werden. Die Sequenz X-Pro wird aus diesem Produkt entweder in zwei Schritten oder in einer 1-Schritt-Reaktion unter Verwendung von Postprolin-Dipeptidyl-Aminopeptidase (EC 3.4.14.) abge spalten. Dieses Verfahren besitzt jedoch den Nachteil, daß bedingt durch das schrittweise Abspalten der Aminosäuren vom N-Terminus des Proteins kein einheitliches Produkt, sondern immer ein Produktgemisch entstehen muß, das neben dem ge wünschten Produkt sowohl unvollständig als auch zu weit abge baute Proteine enthält.The PCT application WO 84/02351 discloses the split-off Nth mineral amino acids from a fusion protein. You can several amino acids of the protein from the N-terminus gradual cleavage by an exopeptidase, preferably Leucine peptidase, up to a sequence X-Pro can be removed. The sequence X-Pro is made from this product either in two Steps or in a 1-step reaction using from postproline dipeptidyl aminopeptidase (EC 3.4.14.) columns. However, this method has the disadvantage that due to the gradual cleavage of the amino acids from N-terminus of the protein is not a single product, but always a product mixture must arise, which in addition to the ge desired product both incomplete and too far contains built proteins.
Ein weiteres Verfahren zur enzymatischen Spaltung eines Fu sionsproteins ist aus dem europäischen Patent Nr. 00 20 290 bekannt. Bei diesem Verfahren wird das Enzym Collagenase zum Abspalten des Fusionsanteils eines Proteins von einer be stimmten Erkennungssequenz verwendet. Danach können weitere Aminosäuren des Fusionsanteils anschließend durch weitere enzymatische Behandlung entfernt werden. Es wurde jedoch festgestellt, daß Collagenase und auch andere Endopeptidasen nur eine geringe Spezifität besitzen (siehe Biochim. Biophys. Acta 271 (1972), 133-144). Überdies sind die Collagenasen nur bei Proteinen aktiv, die eine spezifische räumliche Struktur besitzen. Another method for enzymatic cleavage of a foot ion protein is from European Patent No. 00 20 290 known. In this process, the enzyme collagenase becomes Splitting the fusion portion of a protein from a be agreed recognition sequence used. After that, others can Amino acids of the fusion part subsequently by others enzymatic treatment can be removed. However, it was found that collagenase and other endopeptidases have only a low specificity (see Biochim. Biophys. Acta 271 (1972), 133-144). Moreover, the collagen noses are only active in proteins that have a specific spatial structure have.
Auch die Verwendung einer anderen Endopeptidase, der spezifi schen Protease Faktor Xa zur Abspaltung des Fusionsanteils von Proteinen bietet gewisse Nachteile, und zwar in der Art, daß möglicherweise auch interne Sequenzen des Proteins er kannt und gespalten werden, sowie darüber hinaus den Nachteil, daß Faktor Xa aus Rinderserum isoliert werden muß. Dies er fordert anschließend eine aufwendige Analytik, um eventuell vorhandene Pathogenitätsfaktoren bzw. Viren nachzuweisen.The use of another endopeptidase, the specifi Protease factor Xa to split off the fusion portion of proteins has certain disadvantages in that that he may also have internal sequences of the protein known and split, as well as the disadvantage, that factor Xa must be isolated from bovine serum. This he then requires complex analytics to possibly detect existing pathogenicity factors or viruses.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es somit, ein Verfah ren zur Herstellung rekombinanter Proteine ohne N-terminalen Methioninrest bereitzustellen, welches die obengenannten Nachteile nicht besitzt.The object of the present invention was therefore a method ren for the production of recombinant proteins without N-terminal To provide methionine residue, which the above Does not have disadvantages.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine bzw. Peptide ohne N-terminalen Methioninrest aus Proteinen bzw. Peptiden mit der Aminosäuresequenz Met-Y-X-Pro-A, worin X für Thr, Ala oder Ser steht, Y eine Aminosäuresequenz für mindestens 2 Aminosäuren bedeutet, die mit der Sequenz Pro-Pro endet oder auch, wenn X für Ser steht, mit der Sequenz Pro-Ala-Pro en den kann, und A eine beliebige Aminosäuresequenz bedeutet, bei dem manThe object of the invention is achieved by a method for the production of recombinant proteins or peptides without N-terminal methionine residue from proteins or peptides with the amino acid sequence Met-Y-X-Pro-A, where X is Thr, Ala or Ser, Y is an amino acid sequence for at least 2 Amino acids means that ends with the Pro-Pro sequence or even if X stands for Ser, with the sequence Pro-Ala-Pro en can, and A represents any amino acid sequence, where you
- (1) eine prokaryontische Zelle mit einem rekombinanten Vek tor transformiert, der mindestens eine Kopie eines Gens enthält, das für ein Protein bzw. Peptid mit der Aminosäure sequenz Met-Y-X-Pro-A kodiert, worin X, Y und A die obengenannten Bedeutungen besitzen,(1) a prokaryotic cell with a recombinant vek transforms at least one copy of a gene contains that for a protein or peptide with the amino acid sequence encoded Met-Y-X-Pro-A, where X, Y and A are the have the meanings mentioned above,
- (2) die transformierte Zelle in einem geeigneten Medium kultiviert,(2) the transformed cell in a suitable medium cultured,
- (3) das Expressionsprodukt mit der Aminosäuresequenz Met-Y- X-Pro-A aus dem Medium oder der Zelle gewinnt und(3) the expression product with the amino acid sequence Met-Y- X-Pro-A wins from the medium or the cell and
- (4) das Expressionsprodukt mit einer IgA-Protease spaltet und das resultierende erste Spaltprodukt mit der Aminosäure sequenz X-Pro-A ohne N-terminalen Methioninrest isoliert.(4) cleaves the expression product with an IgA protease and the resulting first cleavage product with the amino acid sequence X-Pro-A without N-terminal methionine residue isolated.
Unter dem Begriff "IgA-Protease" gemäß vorliegender Erfindung fallen Proteasen, welche spezifisch IgA spalten, die bei spielsweise in Rev. Infekt. Dis. 3 (1981) 521-534 beschrieben sind. Ebenso geeignet sind aber auch rekombinante IgA-Proteasen, wie sie beispielsweise in DE-A 36 22 221, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 7881-7885, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 2681-2685, Nature 325 (1987) 458-462 und EMBO Jour. 3 (1984) 1595-1601 beschrieben sind.Under the term "IgA protease" according to the present invention proteases, which specifically cleave IgA, fall for example in Rev. Infekt. Dis. 3 (1981) 521-534 are. Recombinant IgA proteases are also suitable, as for example in DE-A 36 22 221, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 7881-7885, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 2681-2685, Nature 325 (1987) 458-462 and EMBO Jour. 3 (1984) 1595-1601.
Die Behandlung mit IgA-Protease kann in der Kulturbrühe, nach Zellaufschluß oder am abgetrennten Protein erfolgen.Treatment with IgA protease can be done in the culture broth after Cell disruption or on the separated protein.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren lassen sich mit überra schend hoher Ausbeute und guter Spezifität in einem Schritt Proteine ohne N-terminalen Methioninrest gewinnen, welche die N-terminale Sequenz X-Pro besitzen, wobei X Thr, Ala oder Ser bedeutet.The method according to the invention can be used with supra very high yield and good specificity in one step Proteins without an N-terminal methionine residue, which the N-terminal sequence have X-Pro, where X Thr, Ala or Ser means.
Y bedeutet eine Aminosäuresequenz mit mindestens 2, vorzugs weise bis 100, besonders bevorzugt 2 bis 50 Aminosäuren, die mit einer von der IgA-Protease erkannten Spaltungssequenz endet. Steht X für die Aminosäure Serin, so endet Y vorzugs weise mit der Sequenz Pro-Ala-Pro oder Pro-Pro. Steht X für Thr oder Ala, so endet Y vorzugsweise mit Pro-Pro, mehr be vorzugt mit Arg-Pro-Pro, Pro-Arg-Pro-Pro oder Ala-Pro-Arg- Pro-Pro.Y means an amino acid sequence with at least 2, preferably up to 100, particularly preferably 2 to 50, amino acids with a cleavage sequence recognized by the IgA protease ends. If X stands for the amino acid serine, Y preferably ends wise with the sequence Pro-Ala-Pro or Pro-Pro. X stands for Thr or Ala, Y preferably ends with Pro-Pro, more be preferably with Arg-Pro-Pro, Pro-Arg-Pro-Pro or Ala-Pro-Arg- Pro-Pro.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform steht Y für mindestens 6 Aminosäuren mit der Sequenz Pro-Ala-Pro-Arg- Pro-Pro. Für das erfindungsgemäße Verfahren sind an sich alle von der IgA-Protease erkannten Spaltstellen geeignet.In a particularly preferred embodiment, Y stands for at least 6 amino acids with the sequence Pro-Ala-Pro-Arg- Pro-Pro. All are in themselves for the method according to the invention cleavage sites recognized by the IgA protease are suitable.
Die Sequenz Y kann daneben noch weitere an sich beliebige Aminosäuren, vorzugsweise bis 100, besonders bevorzugt bis 50 Aminosäuren enthalten. Vorzugsweise werden jedoch hierfür solche Aminosäurensequenzen verwendet, die auf DNA-Ebene die Expression des Proteins Met-Y-X-Pro-A verbessern oder/und auf Aminosäureebene seine Aufreinigung aus der Zelle erleich tern.The sequence Y can also be any other Amino acids, preferably up to 100, particularly preferably up to 50 Contain amino acids. However, this is preferred such amino acid sequences used at the DNA level Improve expression of the protein Met-Y-X-Pro-A or / and on Amino acid level facilitate its purification from the cell tern.
Die Expression des Proteins Met-Y-X-Pro-A auf DNA-Ebene kann beispielsweise durch Fusion mit Fragmenten des β-Galactosida segens verbessert werden, d. h. die Aminosäuresequenz Y umfaßt einen Teil des β-Galactosidase-Proteins. Andere Möglichkei ten, die Expression des Proteins Met-Y-X-Pro-A zu erhöhen, sind dem Fachmann bekannt. Durch Fusion mit anderen Polypep tiden, insbesondere mit hochgeladenen (z. B. poly(Lys, Arg)) oder an bestimmte Substanzen mit hoher Affinität bindenden (z. B. Streptavidin) Polypeptiden bzw. Proteinen kann die Reinigung und Abtrennung des Expressionsprodukts erleichtert werden (siehe z. B. EP-A 00 89 626, EP-A 03 06 610).Expression of the protein Met-Y-X-Pro-A at the DNA level can for example by fusion with fragments of the β-galactosida blessings are improved, d. H. includes the amino acid sequence Y. part of the β-galactosidase protein. Other options ten to increase the expression of the protein Met-Y-X-Pro-A, are known to the person skilled in the art. By fusion with other polyps tiden, especially with uploaded ones (e.g. poly (Lys, Arg)) or binding to certain substances with high affinity (e.g. streptavidin) polypeptides or proteins can Cleaning and separation of the expression product easier (see e.g. EP-A 00 89 626, EP-A 03 06 610).
Es ist bevorzugt zur Behandlung eines prokaryontischen Ex pressionsprodukts mit IgA-Protease dieses Enzym in an sich dem Fachmann bekannter Weise, beispielsweise wie in EP-B 01 41 223 oder EP-B 01 41 224 beschrieben, zu immobilisieren.It is preferred for the treatment of a prokaryotic ex expression product with IgA protease this enzyme in itself the person skilled in the art, for example as in EP-B 01 41 223 or EP-B 01 41 224 described to immobilize.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet weiterhin ein Protein bzw. Peptid mit der Aminosäuresequenz Met-Y-X-Pro-A, worin X für Thr, Ala oder Ser steht, Y eine Aminosäuresequenz mit mindestens 2 Aminosäuren bedeutet, die, wenn X für Thr oder Ala steht, mit der Sequenz Pro-Pro endet oder die, wenn X für Ser steht, mit der Sequenz Pro-Ala-Pro oder Pro-Pro endet, und A eine beliebige Aminosäuresequenz bedeutet. Ein derar tiges Protein bzw. Peptid wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durch Transformation einer prokaryontischen Zelle mit einem rekombinanten Vektor transformiert, der mindestens eine Kopie eines Gens enthält, das für ein derartiges Protein bzw. Peptid kodiert.The present invention further includes a protein or peptide with the amino acid sequence Met-Y-X-Pro-A, wherein X stands for Thr, Ala or Ser, Y with an amino acid sequence means at least 2 amino acids if X is for Thr or Ala stands for, the sequence Pro-Pro ends or if X for Ser stands with the sequence Pro-Ala-Pro or Pro-Pro ends, and A represents any amino acid sequence. A derar term protein or peptide is according to the invention Process by transformation of a prokaryotic cell transformed with a recombinant vector that at least contains a copy of a gene that is responsible for such a protein or peptide encoded.
Weiterhin Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine rekombinante DNA, die für ein erfindungsgemäßes Protein bzw. Peptid kodiert. The present invention furthermore relates to a recombinant DNA which is essential for a protein or Encoded peptide.
Weiterhin beinhaltet die vorliegende Erfindung einen rekombi nanten Vektor, der mindestens eine Kopie einer erfindungsge mäßen rekombinanten DNA enthält, die für ein Protein bzw. Peptid mit der Aminosäuresequenz Met-Y-X-Pro-A kodiert, worin X, Y und A die obengenannten Bedeutungen besitzen.The present invention further includes a recombi nanten vector, the at least one copy of a fictional contains recombinant DNA which is essential for a protein or Encoding peptide with the amino acid sequence Met-Y-X-Pro-A, wherein X, Y and A have the meanings given above.
Eine erfindungsgemäße rekombinante DNA ist auf eine dem Fach mann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannte Weise erhältlich. Üblicherweise wird hierzu ein Vektor, der eine für die Aminosäuresequenz A kodierende DNA-Sequenz enthält, mit Restriktions-Endonukleasen im Bereich des 5′-Ende dieses Gens gespalten und mit Oligonukleotiden, welche die gewünschte Sequenz enthalten, religiert. Das Oligonukleotid muß dabei eine Sequenz enthalten, die für eine Spaltstelle der IgA- Protease kodiert.A recombinant DNA according to the invention is on the subject well-known manner in the field of molecular biology available. Usually a vector is used for this, which is a contains DNA sequence coding for the amino acid sequence A, with restriction endonucleases in the region of the 5'-end of this Gene cleaved and with oligonucleotides, which the desired Sequence included, religated. The oligonucleotide must be used contain a sequence for a cleavage site of the IgA Protease encoded.
Weiterhin ein Gegenstand der Erfindung ist auch ein rekombi nanter Vektor, der mindestens eine Kopie einer erfindungsge mäßen rekombinanten DNA enthält. Die hierfür geeigneten Basisvektoren sind zur Proteinexpression in prokaryontischen Organismen geeignet und dem Fachmann bekannt. Der erfindungs gemäße Vektor kann sowohl extrachromosomal (z. B. Plasmid) als auch im Genom des Wirtsorganismus integriert (z. B. Bakterio phage Lambda) vorliegen. Vorzugsweise ist der erfindungsge mäße Vektor ein Plasmid. Geeignet sind beispielsweise kommer ziell erhältliche pUC- und pUR-Vektoren.Another object of the invention is a recombi nanter vector, the at least one copy of a fiction contains recombinant DNA. The suitable ones Base vectors are used for protein expression in prokaryotic Suitable organisms and known to the expert. The invention according vector can be both extrachromosomal (e.g. plasmid) also integrated in the genome of the host organism (e.g. bacterio phage lambda). Preferably, the fiction is vector according to a plasmid. Comers are suitable, for example currently available pUC and pUR vectors.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine prokaryonti sche Zelle, vorzugsweise eine E.-coli-Zelle, welche mit der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA oder/und einem erfin dungsgemäßen rekombinanten Vektor transformiert ist.Another object of the invention is a prokaryonti cal cell, preferably an E. coli cell, which with the recombinant DNA according to the invention and / or an invent recombinant vector according to the invention is transformed.
Die Sequenz A kann für eine beliebige Aminosäuresequenz ste hen. Günstigerweise befindet sich jedoch innerhalb dieser Aminosäuresequenz keine weitere Spaltstelle für die IgA-Protease. Sequence A can be for any amino acid sequence hen. Conveniently, however, is within this Amino acid sequence no further cleavage site for the IgA protease.
Beispiele für Proteine, welche die N-terminale Sequenz X-Pro besitzen, wobei X Thr, Ala oder Ser bedeutet, und die durch das erfindungsgemäße Verfahren in einem Schritt gewonnen werden können, etwa menschliches Erythropoietin, die β-Kette des menschlichen T-Zell-Rezeptors und insbesondere der menschliche granulozytenstimulierende Faktor (G-CSF).Examples of proteins which have the N-terminal sequence X-Pro have, where X is Thr, Ala or Ser, and by won the method according to the invention in one step such as human erythropoietin, the β chain of the human T cell receptor and in particular that human granulocyte stimulating factor (G-CSF).
G-CSF wird als Lymphokin von aktivierten Monozyten, Makropha gen sowie von einer Reihe anderer Zellinien synthetisiert. Lymphokine sind an der Reifung von Zellen des Immun- bzw. Blutzellensystems beteiligt. Sie stimulieren die Reifung von Knochenmark-Stammzellen zu ausdifferenzierten Zellen. So indu ziert G-CSF z. B. die Bildung von Neutrophilen und Granulozy ten.G-CSF is used as a lymphokine by activated monocytes, Makropha gene and synthesized by a number of other cell lines. Lymphokines are responsible for the maturation of cells of the immune or Blood cell system involved. They stimulate the maturation of Bone marrow stem cells to differentiated cells. So indu adorns G-CSF z. B. the formation of neutrophils and granulozy ten.
Da G-CSF in der Lage ist, die Population von neutrophilen Zellen innerhalb kurzer Frist erheblich zu steigern, ergeben sich für G-CSF beträchtliche therapeutische Anwendungsfelder. So könnte G-CSF z. B. nach Chemotherapie bei Krebs, bei der die Zellen des Immunsystems zerstört werden, eingesetzt wer den. Weiterhin könnte man G-CSF bei Knochenmark-Transplanta tionen, bei schweren Brandwunden, bei durch Immunschwäche bedingten opportunistischen Infektionen und bei Leukämie verwenden.Because G-CSF is capable of neutrophil population Cells to increase significantly within a short period of time significant therapeutic fields of application for G-CSF. For example, G-CSF B. after chemotherapy for cancer, in the the cells of the immune system are destroyed who used the. You could also use G-CSF on bone marrow transplant tion, in the case of severe burns, in the case of immune deficiency related opportunistic infections and leukemia use.
G-CSF ist ein sekretorisches Proteinmolekül. Das primäre Translationsprodukt enthält daher eine N-terminale Signalse quenz, die bei der Sekretion abgespalten wird, so daß die Sequenz von reifem G-CSF mit den Aminosäuren Thr(+1)-Pro(+2) (Aminosäurepositionen +1 und +2) beginnt. Bei der Produktion von G-CSF in Prokaryonten wird dieses Signalpeptid nur schlecht oder gar nicht abgespalten, so daß zur Bereitstel lung von G-CSF ohne Signalsequenz aus Prokaryonten ein ATG(Met) als Initiationscodon vor den Beginn der für reifen G-CSF kodierenden DNA-Sequenz, die auf Proteinebene mit Thr(+1)-Pro(+2) beginnt, kloniert werden muß. Als Folge davon wird in Prokaryonten, wie E. coli, ein G-CSF exprimiert, das ein Methionin an Aminosäureposition -1 enthält.G-CSF is a secretory protein molecule. The primary Translation product therefore contains an N-terminal signal quenz, which is split off at the secretion, so that the Sequence of mature G-CSF with the amino acids Thr (+1) -Pro (+2) (Amino acid positions +1 and +2) begins. At the production of G-CSF in prokaryotes this signal peptide only split off badly or not at all, so that ready development of G-CSF without a signal sequence from prokaryotes ATG (Met) as initiation codon before the start of for mature G-CSF-encoding DNA sequence at the protein level Thr (+1) -Pro (+2) begins, must be cloned. As a consequence of this is expressed in prokaryotes such as E. coli a G-CSF which contains a methionine at amino acid position -1.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann ein in Aminosäure position -1 methioninfreier G-CSF aus Prokaryonten, der mit den Aminosäuren Thr(+1)-Pro(+2) beginnt, auf einfache Weise hergestellt werden.With the method according to the invention, an amino acid position -1 methionine-free G-CSF from prokaryotes, which with the amino acids Thr (+1) -Pro (+2) begins in a simple way getting produced.
Dies geschieht, indem man ein Derivat eines G-CSF aus Prokaryonten gewinnt, welches in Position +1 und +2 der Aminosäure- Sequenz die Aminosäuren Thr(+1)-Pro(+2) und davor ab Position -1 der Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenz enthält, welche von IgA-Protease erkannt und von der Aminosäure sequenz des G-CSF, welche mit Thr(+1)-Pro(2+) beginnt, abgespalten werden kann.This is done by making a derivative of a G-CSF from prokaryotes wins, which is in positions +1 and +2 of the amino acid Sequence the amino acids Thr (+1) -Pro (+2) and before Position -1 of the amino acid sequence is an amino acid sequence contains which is recognized by IgA protease and by the amino acid sequence of the G-CSF starting with Thr (+1) -Pro (2+), can be split off.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Derivat in Position -1 und -2 je ein Pro, in Position -3 bis Position -1 die Aminosäuresequenz Arg-Pro-Pro, in Position -4 bis -1 der Aminosäuresequenz Pro-Arg-Pro-Pro oder in Position -5 bis Position -1 die Aminosäuresequenz Ala-Pro-Arg-Pro-Pro.In a preferred embodiment, the derivative contains in Position -1 and -2 each a pro, in position -3 to position -1 the amino acid sequence Arg-Pro-Pro, in position -4 to -1 the amino acid sequence Pro-Arg-Pro-Pro or in position -5 to Position -1 the amino acid sequence Ala-Pro-Arg-Pro-Pro.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das Derivat von Position -6 bis Position -1 die AminosäuresequenzIn a particularly preferred embodiment, this contains Derivative from position -6 to position -1 the amino acid sequence
Unter G-CSF im Sinne der Erfindung wird natürlich vorkommen des G-CSF, dessen Sequenz beispielsweise in Science 232 (1986) 61 offenbart ist, sowie davon abgeleitete Derivate mit granulozytenkolonienstimulierender Wirksamkeit, deren Amino säuresequenzen mit X(+1)-Pro(+2) beginnen, verstanden. X steht für Thr, Ser oder Ala, besonders bevorzugt für Thr. Of course, G-CSF in the sense of the invention will occur of the G-CSF, the sequence of which is described, for example, in Science 232 (1986) 61 and derivatives derived therefrom granulocyte colony stimulating activity, its amino start acid sequences with X (+1) -Pro (+2), understood. X stands for Thr, Ser or Ala, particularly preferably for Thr.
Das erfindungsgemäße G-CSF-Derivat kann nach Expression in Prokaryonten durch Behandlung mit IgA-Protease zwischen Posi tion +1 und -1 (zwischen Thr(+1) und Pro(-1)) gespalten wer den. Damit wird durch einen einzigen Hydrolyseschritt ein in Position -1 methioninfreier G-CSF erhalten, dessen Aminosäure sequenz N-terminal mit den Aminosäuren Thr(+1)-Pro(+2) des natürlich vorkommenden G-CSF beginnt.The G-CSF derivative according to the invention can be expressed in Prokaryotes by treatment with IgA protease between posi tion +1 and -1 (between Thr (+1) and Pro (-1)) who split the. This means that in a single hydrolysis step Position -1 methionine-free G-CSF obtained, its amino acid sequence N-terminal with the amino acids Thr (+1) -Pro (+2) des naturally occurring G-CSF begins.
Bei der Expression von G-CSF in Prokaryonten werden schwer lösliche Aggregate (refractile bodies) gebildet, die inaktiv sind. Bevor das Protein z. B. für therapeutische Zwecke ver wendet werden kann, muß es in seine aktive Form übergeführt werden. Bei den dem Fachmann geläufigen Verfahren (vgl. z. B. EP-A 02 19 874, EP-A 01 14 506, WO 84/03711) wird zunächst eine Solubilisierung durch Zugabe von Denaturierungsmitteln durchgeführt, an die sich eine Renaturierung und gegebenen falls weitere Reinigungsschritte anschließen. Die Behandlung des erfindungsgemäßen Proteins mit IgA-Protease kann vor Solubilisierung, nach Solubilisierung oder erst nach der Renaturierung erfolgen. Falls direkt nach Solubilisierung die Behandlung mit IgA-Protease durchgeführt werden soll, muß das Solubilisierungsmittel (z. B. Guanidin-Hydrochlorid oder Harn stoff) durch Dialyse vor Zugabe der IgA-Protease abgetrennt werden. Vorzugsweise wird die Behandlung mit IgA-Protease nach Renaturierung durchgeführt, da in diesem Fall die Aus beuten an G-CSF besonders hoch sind.When expressing G-CSF in prokaryotes become difficult soluble aggregates (refractile bodies) are formed which are inactive are. Before the protein z. B. ver for therapeutic purposes can be used, it must be converted into its active form will. In the processes familiar to the person skilled in the art (cf. e.g. EP-A 02 19 874, EP-A 01 14 506, WO 84/03711) is first solubilization by adding denaturants carried out to which a renaturation and given if further cleaning steps follow. The treatment of the protein according to the invention with IgA protease can Solubilization, after solubilization or only after the Renaturation. If immediately after solubilization Treatment with IgA protease should be carried out Solubilizing agents (e.g. guanidine hydrochloride or urine substance) separated by dialysis before adding the IgA protease will. Treatment with IgA protease is preferred carried out after renaturation, since in this case the Aus booties at G-CSF are particularly high.
Die Bedingungen für die Behandlung von G-CSF bzw. eines ande ren zu spaltenden Proteins mit IgA-Proteasen sind an sich unkritisch. Es ist jedoch bevorzugt, dabei G-CSF (bzw. ein anderes Protein) zu IgA-Protease im Gewichtsverhältnis 1 : 1 bis 1000 : 1 einzusetzen. Die Umsetzung erfolgt bevorzugt in gepufferter wäßriger Lösung von pH 6,5 bis 8,5. Die Puffer konzentration liegt vorzugsweise im Bereich zwischen 50 und 300 mmol/l, gegebenenfalls unter Zusatz von 20-100 mmol/l Natriumchlorid. Vorzugsweise erfolgt die Spaltung bei Raum temperatur über 20-60 Minuten. The conditions for the treatment of G-CSF or another proteins to be cleaved with IgA proteases are in themselves not critical. However, it is preferred to use G-CSF (or a other protein) to IgA protease in a weight ratio of 1: 1 up to 1000: 1. The implementation preferably takes place in buffered aqueous solution from pH 6.5 to 8.5. The buffers concentration is preferably in the range between 50 and 300 mmol / l, optionally with the addition of 20-100 mmol / l Sodium chloride. The splitting preferably takes place in space temperature over 20-60 minutes.
Nach Solubilisierung, Renaturierung und Spaltung mit IgA- Protease wird das so erhaltene Spaltprodukt vorzugsweise über Ionentauscher und Größenfraktionierung gereinigt.After solubilization, renaturation and cleavage with IgA The cleavage product thus obtained is preferably protease over Ion exchanger and size fractionation cleaned.
Die Verunreinigung des auf diese Weise hergestellten und in Position -1 methioninfreien G-CSF durch andere Proteine liegt unter 0,1%, vorzugsweise unter 10-3%.The contamination of the G-CSF produced in this way and in position -1 methionine-free by other proteins is less than 0.1%, preferably less than 10 -3 %.
In Position -1 methioninfreies G-CSF kann durch Spaltung mit IgA-Protease also praktisch quantitativ von dem Methionin enthaltenen Fusionsprotein getrennt bzw. gereinigt werden.In position -1 methionine-free G-CSF can be split by IgA protease practically quantitatively from the methionine contained fusion protein can be separated or purified.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann ein rekombinanter G-CSF aus Prokaryonten erhalten werden, der zu weniger als 0,1%, vorzugsweise zu weniger als 10-3% durch andere Proteine verunreinigt und quantitativ frei von einem G-CSF aus Prokaryonten ist, welcher in Position -1 ein Methionin enthält.A recombinant G-CSF from prokaryotes can be obtained by the method according to the invention which is contaminated to less than 0.1%, preferably less than 10 -3 % by other proteins and is quantitatively free of a G-CSF from prokaryotes which is in Position -1 contains a methionine.
Ein Gegenstand der Erfindung ist auch ein Arzneimittel auf Basis eines durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnenen G-CSF aus Prokaryonten als Wirkstoff, gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmazeutischen Träger-, Füll- und Hilfsstoffen. Ein solches Arzneimittel ist insbesondere für therapeutische Behandlungen, bei denen die Bildung insbesondere von Neutro philen angeregt werden soll, geeignet.The invention also relates to a medicament Basis of one obtained by the method according to the invention G-CSF from prokaryotes as an active ingredient, optionally together with usual pharmaceutical carriers, fillers and auxiliary substances. Such a drug is particularly useful for therapeutic Treatments in which the formation in particular of neutro should be stimulated.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate kommen vor zugsweise als Injektions- und Infusionslösungen zum Einsatz. Dies kann dadurch geschehen, daß eine bereits spritzfertige Lösung zur Verfügung gestellt wird, die die erfindungsgemäße Zusammensetzung besitzt. Es ist jedoch auch möglich, die pharmazeutischen Präparate in Form von Lyophilisaten zur Verfügung zu stellen. Diese werden dann mit an sich bekann ten, zu Injektionszwecken geeigneten Mitteln oder Lösungen rekonstituiert. Als Injektionsmedium kommt vorzugsweise Was ser zur Anwendung, welches die bei Injektionslösungen übli chen Zusätze wie Stabilisierungsmittel, Lösungsvermittler, Puffer und isotonische Zusätze, beispielsweise eine physiolo gische NaCl-Konzentration, enthält. Derartige Zusätze sind beispielsweise Mannit, Tartrat- oder Citrat-Puffer, Ethanol, Komplexbildner wie z. B. Ethylendiamintetraessigsäure und deren nicht-toxischen Salze, sowie hochmolekulare Polymere, wie flüssiges Polyethylenoxid zur Viskositätsregulierung. Flüssige Trägerstoffe für Injektionslösungen müssen steril sein und werden vorzugsweise in Ampullen abgefüllt.The pharmaceutical preparations according to the invention occur preferably used as injection and infusion solutions. This can be done in that an already ready to spray Solution is provided that the inventive Has composition. However, it is also possible that pharmaceutical preparations in the form of lyophilisates for To make available. These will then become known agents or solutions suitable for injections reconstituted. What is preferably used as the injection medium water for use, which is common with injection solutions Chen additives such as stabilizers, solubilizers, Buffers and isotonic additives, for example a physiolo nical NaCl concentration. Such additives are for example mannitol, tartrate or citrate buffer, ethanol, Complexing agents such. B. ethylenediaminetetraacetic acid and their non-toxic salts, as well as high molecular weight polymers, like liquid polyethylene oxide for viscosity regulation. Liquid carriers for injection solutions must be sterile and are preferably filled into ampoules.
Schließlich beinhaltet die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von in Position -1 methioninfreiem G-CSF aus Prokaryonten zur Herstellung von erfindungsgemäßen pharmazeuti schen Präparaten.Finally, the present invention also includes Use of methionine-free G-CSF from prokaryotes in position -1 for the production of pharmaceuticals according to the invention preparations.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann ein rekombinantes Protein bzw. Peptid ohne N-terminalen Methioninrest in einem Schritt aus Proteinen bzw. Peptiden mit der Aminosäuresequenz Met-Y-X-Pro-A gewonnen werden, worin Y für eine Aminosäuresequenz steht, an deren Ende sich ein Teil der IgA-Protease- Spaltstelle befindet, während X für Thr, Ala oder Ser steht. Durch Spaltung mit einer IgA-Protease wird aus dem Expres sionsprodukt Met-Y-X-Pro-A der prokaryontischen Zelle ein erstes Spaltprodukt mit der Aminosäuresequenz X-Pro-A erhal ten.A recombinant Protein or peptide without an N-terminal methionine residue in one Step from proteins or peptides with the amino acid sequence Met-Y-X-Pro-A can be obtained, where Y is for an amino acid sequence stands at the end of which part of the IgA protease Cleavage site, while X stands for Thr, Ala or Ser. By cleavage with an IgA protease, the expres ion product Met-Y-X-Pro-A of the prokaryotic cell first cleavage product with the amino acid sequence X-Pro-A obtained ten.
Mit einer Abwandlung dieses Verfahrens gelingt es nun, auch Proteine mit einer anderen N-terminalen Aminosäuresequenz aus Prokaryonten in Position -1 methioninfrei herzustellen. Dazu wird zunächst nach dem bereits beschriebenen erfindungsge mäßen Verfahren ein Fusionsprotein gewonnen, welches die Aminosäuresequenz Met-Y-X-Pro-A besitzt, wobei nun in diesem Falle die Aminosäuresequenz A ohne die beiden N-terminalen Aminosäuren X-Pro die gewünschte Sequenz des zu exprimieren den Proteins ist. With a modification of this method, it now works, too Proteins with a different N-terminal amino acid sequence To produce prokaryotes in position -1 methionine free. To is first according to the fiction, already described method obtained a fusion protein which the Amino acid sequence Met-Y-X-Pro-A has, now in this Fall the amino acid sequence A without the two N-terminal Amino acids X-Pro to express the desired sequence of the the protein.
Das Expressionsprodukt der prokaryontischen Zelle mit der Aminosäuresequenz Met-Y-X-Pro-A wird zunächst wie bereits beschrieben mit IgA-Protease gespalten, so daß das erste Spaltprodukt mit der Aminosäuresequenz X-Pro-A entsteht.The expression product of the prokaryotic cell with the Amino acid sequence Met-Y-X-Pro-A is initially as before described cleaved with IgA protease so that the first Fission product with the amino acid sequence X-Pro-A is formed.
Dieses Protein wird nun in einem weiteren Schritt mit einer Peptidylamino-Peptidase behandelt. Peptidylamino-Peptidase erkennt spezifisch die Sequenz X-Pro und spaltet hinter Pro. Somit entsteht ein zweites Spaltprodukt mit der an sich be liebigen Aminosäuresequenz A. Das erfindungsgemäße Verfahren erweist sich somit als äußerst nützlich zur Herstellung ver schiedenster Proteine ohne N-terminalen Methionin-Rest und ist nicht nur auf die Herstellung von Proteinen mit der N- terminalen Sequenz X-Pro beschränkt, wobei X für Ser, Thr oder Ala steht.This protein is now processed in a further step with a Peptidylamino peptidase treated. Peptidylamino peptidase specifically recognizes the X-Pro sequence and splits behind Pro. This creates a second fission product with the be Liebigen amino acid sequence A. The inventive method thus proves to be extremely useful for manufacturing various proteins without an N-terminal methionine residue and is not only for the production of proteins with the N- terminal sequence X-Pro, where X for Ser, Thr or Ala stands.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.The following examples further illustrate the invention.
Die Konstruktion wird unter Verwendung des Expressionsvektors pPZ07-mgllac (WO 88/09373) durchgeführt. Dazu wird der Ex pressionsvektor pPZ07-mgllac mit Nco I gespalten und die überstehenden Enden mit Mung bean Nuklease entfernt. An schließend wird der Vektor mit Bam H1 nachgespalten. Die IgA Erkennungssequenz wird auf DNA-Ebene über folgende Oligonu kleotide bereitgestellt.The construction is done using the expression vector pPZ07-mgllac (WO 88/09373). The Ex pressure vector pPZ07-mgllac with Nco I and split the protruding ends removed with mung bean nuclease. On the vector is then cleaved with Bam H1. The IgA Recognition sequence is at the DNA level via the following oligonu clothes provided.
Oligonukleotid 1A:
5′ AAT TCG GAG GAA AAA TTA ATG ACA CCA CTG CGA CCT CCT ACA
CCA CTG GGC CCT G 3′Oligonucleotide 1A:
5 ′ AAT TCG GAG GAA AAA TTA ATG ACA CCA CTG CGA CCT CCT ACA CCA CTG GGC CCT G 3 ′
Oligonukleotid 1B:
5′ GAT CC AGG GCC CAG TGG TGT AGG AGG TCG CAG TGG TGT CAT TAA
TTT TTC CTC CGA ATT 3′Oligonucleotide 1B:
5 ′ GAT CC AGG GCC CAG TGG TGT AGG AGG TCG CAG TGG TGT CAT TAA TTT TTC CTC CGA ATT 3 ′
Die beiden Oligonukleotide werden in äquimolaren Mengen zu sammengegeben und in ca. einem 100fachen Überschuß in den wie oben beschriebenen gespaltenen Vektor pPZ07-mgllac einge führt. Nach Religierung werden auf übliche Weise kompetent gemachte Zellen von E. coli K12 transformiert. Nach bekannten Methoden wird die DNA aus den Zellen isoliert und mit Apa I und Bam HI gespalten. Ein ca. 520 bp langes Fragment wird unter Verwendung der Restriktionsendonukleasen Apa I und BamHI aus der G-CSF-Sequenz (Science 232 (1986), 61-65) iso liert. Dieses Fragment wird in den ebenfalls mit ApaI und BamHI gespaltenen Vektor einlegiert.The two oligonucleotides are added in equimolar amounts collected and in about a 100-fold excess in the cleaved vector pPZ07-mgllac as described above leads. After religion, become competent in the usual way cells made from E. coli K12 transformed. According to known Methods, the DNA is isolated from the cells and Apa I and Bam HI split. An approximately 520 bp long fragment is using restriction endonucleases Apa I and BamHI from the G-CSF sequence (Science 232 (1986), 61-65) iso liert. This fragment is also in the ApaI and BamHI split vector alloyed.
Zusätzlich zu der IgA1-Erkennungssequenz kann das Fusi onsprotein auch noch Peptide als Reinigungshilfe enthalten. Diese können aus der DNA die Streptavidin kodiert bestehen. Dazu wird ein Streptavidin Gen (WO 89/03422) in das richtige Translationsraster vor die IgA-Protease Erkennungssequenz kloniert.In addition to the IgA1 recognition sequence, the Fusi onsprotein also contain peptides as a cleaning aid. These can consist of the DNA encoding streptavidin. For this, a streptavidin gene (WO 89/03422) is inserted into the correct one Translation grid in front of the IgA protease recognition sequence cloned.
Mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Plasmid werden E. coli K12-Zellen (ED 8654, DSM 2102) transformiert, auf den Anti biotikamarker (Ampicillin) selektioniert und das Plasmid durch Restriktionsanalyse charakterisiert. Ein solcher Klon wird zur Anzucht und Expression von G-CSF verwendet. Die Zellen werden einem Vollmedium angezogen. Dieses Medium ent hält pro Liter 16 g Bactotrypton (Difco), 10 g Hefe-Extrakt (Difco) und 5 g Natriumchlorid. Die Zellen werden bis zu einer OD 546 von 2,0 wachsen gelassen und dann mit 10-3 mol/l IPTG induziert. Nach weiteren 4 h werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, mit Lysozym/EDTA aufgeschlossen und das G-CSF als inclusion bodies (IB's, vgl. EP-A 02 19 874) isoliert.With the plasmid described in Example 1, E. coli K12 cells (ED 8654, DSM 2102) are transformed, selected for the antibiotic marker (ampicillin) and the plasmid is characterized by restriction analysis. Such a clone is used for the cultivation and expression of G-CSF. The cells are attracted to a complete medium. This medium contains 16 g of Bactotrypton (Difco), 10 g of yeast extract (Difco) and 5 g of sodium chloride per liter. The cells are grown to an OD 546 of 2.0 and then induced with 10 -3 mol / l IPTG. After a further 4 h the cells are harvested by centrifugation, digested with lysozyme / EDTA and the G-CSF isolated as inclusion bodies (IB's, cf. EP-A 02 19 874).
Die Denaturierung bzw. Renaturierung der isolierten unlösli chen G-CSF-Fusionspartikel wird, wie in EP-A 02 19 874 be schrieben, durchgeführt. Die Denaturierung erfolgt durch Dialyse gegen 6 mol/l Guanidin-Hydrochlorid. Es kann hier bereits ein Aliquot entnommen werden und nach Dialyse gegen 5 mmol/l Kaliumphosphatpuffer pH 7 für die Spaltung mit IgA- Protease (Bsp. 4) eingesetzt werden.The denaturation or renaturation of the isolated insoluble Chen G-CSF fusion particle is, as in EP-A 02 19 874 be wrote, performed. The denaturing is done by Dialysis against 6 mol / l guanidine hydrochloride. It can be here an aliquot can already be taken and after dialysis against 5 mmol / l potassium phosphate buffer pH 7 for the cleavage with IgA Protease (Ex. 4) can be used.
Alternativ erfolgt nach der Denaturierung in Guanidin-Hydro chlorid eine Dialyse gegen einen 5 mmol/l Kaliumphosphatpuf fer pH 7 der 1 mmol/l GSH und 3 mmol/l GSSG enthält. Nach Renaturierung erfolgt hier ebenfalls eine Dialyse gegen 5 mmol/l Kaliumphosphatpuffer pH 7.Alternatively, after the denaturation in guanidine hydro chloride dialysis against a 5 mmol / l potassium phosphate buffer fer pH 7 containing 1 mmol / l GSH and 3 mmol / l GSSG. To Renaturation is also carried out against dialysis 5 mmol / l potassium phosphate buffer pH 7.
IgA1-Protease wird wie in EMBO Jour. 3 (1984), 1595-1601 beschrieben isoliert. Zu 10 µg nach Beispiel 3 denaturiertem und renaturiertem G-CSF werden 2-5 µg IgA-Protease gegeben und 30 min bei Raumtemperatur in Pufferlösung (50 mmol/l Natriumphosphat, 150 mmol/l NaCl, pH 7,5) inkubiert. Über verschiedene Ionenaustauschersäulen wie Mono-Q oder Mono-S kann das methioninfreie G-CSF isoliert werden. Proteinsequenzierung des aminoterminalen Endes ergibt, daß das gereinigte G-CSF mit der korrekten Aminosäurefolge Thr(+1)-Pro(+2) be ginnt.IgA1 protease is described in EMBO Jour. 3: 1595-1601 (1984) described isolated. Denatured to 10 µg according to Example 3 and renatured G-CSF are given 2-5 µg IgA protease and 30 min at room temperature in buffer solution (50 mmol / l Sodium phosphate, 150 mmol / l NaCl, pH 7.5). over various ion exchange columns such as Mono-Q or Mono-S the methionine-free G-CSF can be isolated. Protein sequencing of the amino terminal end shows that the cleaned G-CSF with the correct amino acid sequence Thr (+1) -Pro (+2) be starts.
Claims (18)
X für Thr, Ala oder Ser steht,
Y eine Aminosäuresequenz mit mindestens 2 Aminosäuren bedeutet, die mit der Sequenz Pro-Pro endet oder, wenn X für Ser steht, auch mit der Sequenz Pro-Ala-Pro enden kann, und
A eine beliebige Aminosäuresequenz bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man
- (1) eine prokaryontische Zelle mit einer rekombinanten DNA oder/und einem rekombinanten Vektor transfor miert, wobei die DNA bzw. der Vektor mindestens eine Kopie eines Gens enthält, das für ein Protein bzw. Peptid mit der Aminosäuresequenz Met-Y-X-Pro-Akodiert, worin X, Y und Y die obengenannten Bedeu tungen besitzen,
- (2) die transformierte Zelle in einem geeigneten Medium kultiviert,
- (3) das Expressionsprodukt mit der Aminosäuresequenz Met-Y-X-Pro-A aus dem Medium oder der Zelle ge winnt, und
- (4) das Expressionsprodukt mit einer IgA-Protease spal tet und das resultierende erste Spaltprodukt mit der Aminosäuresequenz X-Pro-A ohne N-terminalen Methioninrest isoliert.
X stands for Thr, Ala or Ser,
Y represents an amino acid sequence with at least 2 amino acids, which ends with the Pro-Pro sequence or, if X stands for Ser, can also end with the Pro-Ala-Pro sequence, and
A denotes any amino acid sequence, characterized in that
- (1) transforming a prokaryotic cell with a recombinant DNA or / and a recombinant vector, the DNA or the vector containing at least one copy of a gene which codes for a protein or peptide with the amino acid sequence Met-YX-Pro where X, Y and Y have the meanings given above,
- (2) culturing the transformed cell in a suitable medium,
- (3) the expression product with the amino acid sequence Met-YX-Pro-A is obtained from the medium or the cell, and
- (4) the expression product is cleaved with an IgA protease and the resulting first cleavage product with the amino acid sequence X-Pro-A is isolated without an N-terminal methionine residue.
X für Thr, Ala oder Ser steht,
Y eine Aminosäuresequenz mit mindestens 2 Aminosäuren bedeutet, die, wenn X für Thr oder Ala steht, mit der Sequenz Pro-Pro endet oder die, wenn X für Ser steht, mit der Sequenz Pro-Ala-Pro oder Pro-Pro endet.6. Recombinant protein or peptide from prokaryotes with the amino acid sequence Met-YX-Pro-Aworin
X stands for Thr, Ala or Ser,
Y represents an amino acid sequence with at least 2 amino acids, which ends if the X stands for Thr or Ala, with the sequence Pro-Pro or, if X stands for Ser, ends with the sequence Pro-Ala-Pro or Pro-Pro.
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