DE102008062136A1 - Pharmaceutical composition based on peptide of camel milk - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft Peptide, die z.B. aus Kamelmilch isolierbar sind, und als Wirkstoff in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden können, insbesondere zur Verwendung bei medizinischen Indikationen, die durch Hemmung der humanen DPP4, CD26, zAAP und/oder DPP8 und/oder DPP9 therapiert werden können, insbesondere Diabetes mellitus Typ 2, Fettleibigkeit und/oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen, sowie Erkrankungen, die durch T-Zellen verursacht sind, bzw. die durch Beeinflussung von T-Zellen behandelbar sind, und insbesondere durch Hemmung von DPP4 bzw. dessen zellgebundener Form CD26 und/oder APN und/oder zAAP behandelbar sind, z.B. Autoimmunerkrankungen. Weiterhin betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei neuronalen Erkrankungen, die durch Hemmung der DPP4 bzw. von CD26 und/oder Hemmung von APN und/oder zAAP und/oder bei neuronalen Erkrankungen, durch Hemmung der DPP8 und/oder DPP9 behandelbar sind.The invention relates to peptides which are e.g. can be isolated from camel's milk, and can be used as an active ingredient in pharmaceutical compositions, in particular for use in medical indications which can be treated by inhibiting human DPP4, CD26, zAAP and / or DPP8 and / or DPP9, in particular type 2 diabetes mellitus, Obesity and / or cardiovascular diseases, as well as diseases caused by T cells, or which are treatable by influencing T cells, and in particular by inhibiting DPP4 or its cell-bound form CD26 and / or APN and / or zAAP are treatable, eg Autoimmune diseases. Furthermore, the invention relates to pharmaceutical compositions for use in neuronal diseases that are treatable by inhibiting DPP4 or CD26 and / or inhibiting APN and / or zAAP and / or in neuronal diseases, by inhibiting DPP8 and / or DPP9.
Description
Die Erfindung betrifft Peptide, die z. B. aus Kamelmilch isolierbar sind, und als Wirkstoff in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden können, insbesondere zur Verwendung bei medizinischen Indikationen, die durch Hemmung der humanen DPP4, CD26, zAAP und/oder DPP8 und/oder DPP9 therapiert werden können, insbesondere Diabetes mellitus Typ 2, Fettleibigkeit und/oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen, sowie Erkrankungen, die durch T-Zellen verursacht sind, bzw. die durch Beeinflussung von T-Zellen behandelbar sind, und insbesondere durch Hemmung von DPP4 bzw. dessen zellgebundener Form CD26 und/oder APN und/oder zAAP behandelbar sind, z. B. Autoimmunerkrankungen. Weiterhin betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei neuronalen Erkrankungen, die durch Hemmung der DPP4 bzw. von CD26 und/oder Hemmung von APN und/oder zAAP und/oder bei neuronalen Erkrankungen, durch Hemmung der DPP8 und/oder DPP9 behandelbar sind.The Invention relates to peptides, the z. B. isolatable from camel milk are, and used as an active ingredient in pharmaceutical compositions may be, especially for use in medical Indications caused by inhibition of human DPP4, CD26, zAAP and / or DPP8 and / or DPP9 can be treated, in particular Type 2 diabetes mellitus, obesity and / or cardiovascular disease, as well as Diseases caused by T cells or by Influence of T cells are treatable, and in particular by Inhibition of DPP4 or its cell-bound form CD26 and / or APN and / or zAAP are treatable, e.g. B. autoimmune diseases. Farther For example, the invention relates to pharmaceutical compositions for use in neuronal diseases caused by inhibition of DPP4 or of CD26 and / or inhibition of APN and / or zAAP and / or neuronal Diseases that are treatable by inhibiting DPP8 and / or DPP9.
Neben den Wirkstoffen betrifft die Erfindung auch die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen mit einem Gehalt an zumindest einem der Peptide als aktivem Inhaltsstoff in pharmazeutisch akzeptablen Formulierungen, die Verwendung der Peptide zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, sowie Verfahren zur Herstellung der Peptide für die pharmazeutische Verwendung.Next the active compounds, the invention also relates to the production of pharmaceutical Compositions containing at least one of the peptides as an active ingredient in pharmaceutically acceptable formulations, the use of the peptides for the preparation of pharmaceutical compositions, as well Process for the preparation of the peptides for the pharmaceutical Use.
Weiterhin
betrifft die Erfindung die Verwendung der Verbindungen mit hemmender
Wirkung gegenüber DPP4 zur Herstellung pharmazeutischer
Zusammensetzungen gegen medizinische Indikationen, die durch Hemmung
und/oder Inaktivierung der DPP4 und/oder der membrangebunden Form
von DPP4, CD26, beeinflussbar sind. Dies betrifft neben Diabetes
und Fettleibigkeit insbesondere immunologische Indikationen, z.
B. solche, die durch Chemokine, insbesondere der Gruppe RANTES (regulated
an activation, normal T-cell expressed and secreted) beeinflusst
werden, insbesondere aus der Gruppe von RANTES, die SDF-1α (stromal cell-derived
factor 1) (
Stand der TechnikState of the art
Traditionelle Heilverfahren im arabischen Raum und Afrika setzen Kamelmilch als Nahrungsmittel zur Bekämpfung von Herz-Kreislauf-Krankheiten und Diabetes ein.traditional Healing procedures in the Arab world and Africa put camel milk as Food for combating cardiovascular diseases and diabetes.
Deacon
(
Die
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Aufgabe der ErfindungObject of the invention
Gegenüber dem vorgenannten Stand der Technik ist es Aufgabe der Erfindung, einen alternativen Hemmstoff für die humane DPP4 bereitzustellen, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die den Hemmstoff gegen DPP4 bzw. CD26 und/oder DPP4-ähnliche bzw. CD26-ähnliche Enzyme als Wirkstoff enthalten. Eine bevorzugte Aufgabe liegt in der Bereitstellung eines Hemmstoffs der humanen DPP4 zur Verwendung bei der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen für die medizinische Anwendung bei Diabetes, insbesondere Diabetes mellitus (Typ 2 Diabetes), sowie zur Verwendung bei weiteren Indikationen, die durch Hemmung der proteolytischen Aktivität humaner DPP4 und DPP4-ählnicher Enzyme und/oder Hemmung der humanen APN behandelbar sind.Across from the aforementioned prior art, it is an object of the invention to provide an alternative inhibitor of human DPP4, and pharmaceutical compositions containing the inhibitor against DPP4 or CD26 and / or DPP4-like or CD26-like Contain enzymes as an active ingredient. A preferred task is in the provision of an inhibitor of human DPP4 for use in the manufacture of pharmaceutical compositions for the medical use in diabetes, especially diabetes mellitus (Type 2 diabetes), and for use in other indications, which are more human by inhibiting the proteolytic activity DPP4 and DPP4-free enzymes and / or inhibition of human APN are treatable.
Eine besonders bevorzugte Aufgabe liegt in der Bereitstellung eines Wirkstoffs zur Verwendung für die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, der sowohl die humane DPP4 inhibiert, als auch die humane Aminopeptidase N (APN, CD13-Aminopeptidase) und/oder die humane zAAP und/oder die humane DPP8 und/oder DPP9 inhibiert.A particularly preferred object is to provide an active ingredient for use in the manufacture of pharmaceutical compositions, which inhibits both human DPP4 and human aminopeptidase N (APN, CD13 aminopeptidase) and / or the human zAAP and / or the human DPP8 and / or DPP9 inhibited.
Allgemeine Beschreibung der ErfindungGeneral description of invention
Die Erfindung löst die vorgenannte Aufgabe durch pharmazeutische Zusammensetzungen mit Peptiden, die aus Kamelmilch isolierbar sind und N-terminal eine Aminosäuresequenz aufweisen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die VPQ, KPQ, QPT und EPK umfasst oder aus einem Peptid mit einer der Sequenzen besteht, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die VPQ, KPQ, QPT und EPK umfasst, oder Peptiden, die nach proteolytischer Spaltung eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweisen, die VPQ, KPQ, QPT oder EPK umfasst oder einem Peptid mit einer der Sequenzen VPQ, KPQ, QPT oder EPK besteht, zur medizinischen Verwendung zur Inhibierung der DPP4 und DPP4-analoger Peptidasen, vorzugsweise in Kombination mit der Inhibierung von APN, zAAP und/oder DPP8 und DPP9, insbesondere bei der medizinischen Indikation Diabetes mellitus, Fettleibigkeit und/oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen, sowie medizinische Indikationen, die durch Beeinflussung von T-Zellen behandelbar sind, insbesondere Indikationen, die durch Hemmung von CD26 und/oder von zAAP von T-Zellen behandelbar sind. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung von Peptiden, die N-terminal eine Aminosäuresequenz aufweisen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die VPQ, KPQ, QPT und EPK umfasst oder aus einer der Sequenzen besteht, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die VPQ, KPQ, QPT und EPK umfasst, oder Peptiden, die nach proteolytischer Spaltung eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweisen, die VPQ, KPQ, QPT oder EPK ist oder daraus besteht, zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, insbesondere zur Verwendung bei den vorgenannten medizinischen Indikationen.The Invention solves the above problem by pharmaceutical Compositions with peptides isolatable from camel's milk and N-terminal amino acid sequence consisting of of the group comprising VPQ, KPQ, QPT and EPK or consists of a peptide having one of the sequences selected from the Group comprising VPQ, KPQ, QPT and EPK, or peptides which, after proteolytic cleavage, have an N-terminal Have amino acid sequence, the VPQ, KPQ, QPT or EPK or a peptide having one of the sequences VPQ, KPQ, QPT or EPK, for medical use for inhibiting the DPP4 and DPP4-analogue peptidases, preferably in combination with the inhibition of APN, zAAP and / or DPP8 and DPP9, in particular in the medical indication diabetes mellitus, obesity and / or cardiovascular diseases, as well as medical indications, which are treatable by influencing T cells, in particular Indications due to inhibition of CD26 and / or zAAP of T cells are treatable. Furthermore, the invention relates to the use of peptides having an N-terminal amino acid sequence, which is selected from the group, the VPQ, KPQ, QPT and EPK comprises or consists of one of the sequences selected from the group which includes VPQ, KPQ, QPT and EPK, or Peptides which, after proteolytic cleavage, have an N-terminal amino acid sequence which is or consists of VPQ, KPQ, QPT or EPK Production of pharmaceutical compositions, in particular for use in the aforementioned medical indications.
Als DPP4-ähnliche Enzyme und Peptidasen oder, gleichbedeutend verwendet, DPP4-analoge Enzyme und Peptidasen, werden vorliegend insbesondere Peptidasen mit regulatorischer Funktion bezeichnet, die vorzugsweise eine mit der DPP4 ähnliche Aminosäuresequenz aufweisen, z. B. eine zu mindestens 80 bis 90% identische Sequenz umfassen oder daraus bestehen. DPP4-analoge Peptidasen wirken vorzugsweise in vivo auf die selben Substrate wie DPP4, und sind insbesondere solche Peptidasen, die in vivo GLP-1, GLP-2 und/oder GIP und/oder NPY und/oder PYY spalten. Besonders bevorzugt sind DPP4-analoge Peptidasen solche, bei denen die Hemmung ihrer proteolytischen Aktivität eine der erfindungsgemäßen medizinischen Indikationen positiv beeinflusst.As DPP4-like enzymes and peptidases or, equivalently, DPP4-analogous enzymes and peptidases, in the present case in particular peptidases are designated with regulatory function, which preferably have a similar to the DPP4 amino acid sequence, for. B. comprise or consist of at least 80 to 90% identical sequence. DPP4-analogous peptidases preferentially act in vivo on the same substrates as DPP4, and are particularly those peptidases which cleave in vivo GLP-1, GLP-2 and / or GIP and / or NPY and / or PYY. DPP4-analogous peptidases are particularly preferably those in which the inhibition of their proteolytic activity is one of the medical indications according to the invention positively influenced by cations.
Die Analyse und Identifikation einzelner Substanzen aus Kamelmilch hat überraschenderweise gezeigt, dass daraus isoliertes Lactophorin A und/oder Lactophorin B, sowie daraus abgeleitete Peptide mit bestimmter Aminosäuresequenz inhibitorische Wirkung gegen die humane DPP4 und DPP4-analoge Peptidasen, und vorzugsweise auch gegen die humane Aminopeptidase N (APN) und/oder gegen die humane zytosolische Alanylaminopeptidase (zAAP) und/oder gegen humane Dipeptidpeptidase 8 (DPP8) und/oder Dipeptidpeptidase 9 (DPP9) haben. Diese inhibitorische Wirkung gegenüber den vorgenannten Peptidasen, insbesondere gegenüber DPP4, wurde sowohl in in vitro Tests und in vitro in Zellkultur nachgewiesen, als auch im Versuchstier. Die pharmazeutische Wirksamkeit von Lactophorin A und Lactophorin B aus Kamelmilch und daraus abgeleiteten Peptiden, insbesondere solchen, die am N-Terminus eine Aminosäuresequenz aus der Gruppe aufweisen, die VPQ, KPQ, QPT und EPK umfasst, konnte im Tierversuch für die Indikationen Diabetes mellitus Typ 2 gezeigt werden, sowie für die Indikationen Fettleibigkeit und Herz-Kreislauf-Erkrankungen, insbesondere solchen, die gemeinsam mit Diabetes mellitus und/oder Fettleibigkeit auftreten, sowie bei Indikationen, die durch T-Zellen verursacht werden. Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen Peptide neben der Wirkung gegen DPP4 auch eine signifikante inhibitorische Wirkung gegen eine oder mehrere aus der Gruppe, die humane APN, humane zAAP, humane DPP8 und/oder DPP9 umfasst, so dass eine Verstärkung der pharmazeutischen Wirkung der Peptide durch deren Hemmung von mindestens zwei Peptidasen aus der vorgenannten Gruppe erzielt wird.The Analysis and identification of individual substances from camel milk has surprisingly demonstrated that isolated lactophorin A and / or lactophorin B, and derived peptides with a specific amino acid sequence inhibitory activity against the human DPP4 and DPP4 analog peptidases, and preferably also against the human aminopeptidase N (APN) and / or against the human cytosolic alanylaminopeptidase (zAAP) and / or against human dipeptide peptidase 8 (DPP8) and / or dipeptide peptidase 9 (DPP9). This inhibitory effect the abovementioned peptidases, in particular with respect to DPP4, was detected in in vitro tests and in vitro in cell culture, as well as in the experimental animal. The pharmaceutical efficacy of lactophorin A and lactophorin B from camel milk and derived peptides, especially those which have an amino acid sequence at the N-terminus from the group comprising VPQ, KPQ, QPT and EPK in animal experiments for the indications diabetes mellitus type 2, as well as for the indications obesity and cardiovascular diseases, especially those that are common with diabetes mellitus and / or obesity occur as well Indications caused by T cells. Preferably have the peptides of the invention in addition to the effect against DPP4 also a significant inhibitory activity against a or more from the group, human APN, human zAAP, human DPP8 and / or DPP9 so that amplification of the pharmaceutical effect of the peptides by their inhibition of at least two peptidases from the aforementioned group is achieved.
Insbesondere konnte im Tierversuch gezeigt werden, dass die erfindungsgemäßen Peptide auch bei oraler Verabreichung gegen den Aufbau von Speicherfettgewebe, z. B. gegen Fettleibigkeit wirksam sind.Especially could be shown in animal experiments that the invention Peptides even when administered orally against accumulation of storage fat tissue, z. B. are effective against obesity.
Es wird vermutet, dass die Wirksamkeit erfindungsgemäßer Peptide gegen Fettleibigkeit neben der Reduktion der Proteolyse von Insulin auch darauf beruht, dass Neuropeptid Y (NPY) und/oder Peptid YY (PYY) bei Hemmung der Aktivität von DPP4 und deren membrangebundener Formen weniger stark abgebaut werden bzw. länger vorliegen. Als Folge ist ein durch NPY und/oder PYY erzeugtes Sättigungsgefühl stärker oder bleibt langer erhalten.It it is assumed that the effectiveness of inventive Peptides against obesity in addition to the reduction of proteolysis Insulin is also based on the fact that neuropeptide Y (NPY) and / or Peptide YY (PYY) in inhibiting the activity of DPP4 and whose membrane-bound forms are less degraded or longer available. As a result, a by NPY and / or PYY increased satiety feeling stronger or stay longer.
Die Wirksamkeit erfindungsgemäßer Peptide gegen neuronale Erkrankungen beruht nach derzeitigem Kenntnisstand darauf, dass die Hemmung von DPP8 und/oder DPP9 Erkrankungen lindert, die durch die Aktivität von DPP8 und/oder DPP9 verursacht oder verstärkt werden. Zu diesen neuronalen Erkrankungen zählen insbesondere Angstzustände, Depressionen und Alzheimer.The Effectiveness of inventive peptides against neuronal Diseases is based on the current state of knowledge that inhibits the inhibition of DPP8 and / or DPP9 diseases by causes or enhances the activity of DPP8 and / or DPP9 become. These neuronal diseases include in particular Anxiety, depression and Alzheimer's.
Die erfindungsgemäßen Peptide können durch orale Verabreichung oder durch Verabreichung per Injektion, z. B. i. m. oder i. v., von Fusionspeptiden, insbesondere in pharmazeutisch akzeptabler Formulierung appliziert werden, wobei Fusionspeptide zumindest eine Aminosäuresequenz bzw. ein Tripeptid VPQ, KPQ, QPT und EPK am N-Terminus aufweisen oder daraus bestehen, oder die Fusionspeptide eine Aminosäuresequenz aufweisen, aus der durch proteolytische Spaltung zumindest ein Peptid erzeugt wird, das N-terminal eine Aminosäuresequenz bzw. eines der Tripeptide VPQ, KPQ, QPT und EPK aufweist oder daraus besteht. Die proteolytische Spaltung der Fusionspeptide nach deren oraler Verabreichung kann z. B. durch natürliche Verdauungsenzyme erfolgen. Ein bevorzugtes Fusionspeptid, dessen proteolytische Spaltung durch Verdauungsenzyme erfindungsgemäße Peptide mit inhibitorischer Wirkung zumindest gegen DPP4 erzeugt, ist Lactophorin A oder Lactophorin B, das z. B. durch heterologe Expression in Mikroorganismen oder eukaryotischen Zellen hergestellt ist, oder aus Kamelmilch isoliert ist.The Peptides according to the invention can by oral administration or by administration by injection, e.g. B. i. m. or I. v., of fusion peptides, especially in pharmaceutical acceptable formulation, with fusion peptides at least one amino acid sequence or a tripeptide VPQ, KPQ, QPT and EPK at the N-terminus, or consist of, or the fusion peptides have an amino acid sequence at least one peptide is generated by proteolytic cleavage, the N-terminal one amino acid sequence or one of the tripeptides VPQ, KPQ, QPT and EPK. The proteolytic Cleavage of the fusion peptides after their oral administration can z. B. done by natural digestive enzymes. A preferred one Fusion peptide whose proteolytic cleavage by digestive enzymes Peptides according to the invention having an inhibitory effect produced at least against DPP4, is lactophorin A or lactophorin B, the z. B. by heterologous expression in microorganisms or eukaryotic cells is produced, or isolated from camel milk is.
Auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Behandlung von Infektionen durch HIV beruhen auf der Hemmung der zellgebundenen DPP4, CD26 von T-Lymphozyten bildet. Denn CD26 bzw. DPP4 interagiert mit dem HIV1-Transaktivatorprotein Tat und dem HIV1-Hüllprotein GP120. Entsprechend können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, bzw. als Wirkstoff zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die durch Beeinflussung der T-Zell-vermittelten Immunantwort beeinflusst werden, z. B. gegen Autoimmunerkrankungen, insbesondere Psoriasis, sowie auch Asthma. Die Wirkung erfindungsgemäßer Peptide bei medizinischen Indikationen, die durch Reduktion von T-Zellen behandelbar sind, beruht nach derzeitigem Kenntnisstand auf der Beeinflussung von CD26 und/oder zAAP von T-Zellen. Diese Wirkung auf T-Zellen ist ebenso wie die Hemmung der proteolytischen Aktivität von DPP4, DPP4-ähnlichen Peptidasen, APN, zAAP und/oder DPP8 bzw. DPP9 in vivo zeitlich begrenzt, z. B. mit einer Halbwertszeit in vivo von bis zu ca. 4 h, so dass negative Nebenwirkungen der erfindungsgemäßen Peptide ebenfalls zeitlich begrenzt sind und daher nicht oder nicht signifikant auftreten, insbesondere die mögliche Steigerung der Metastasierung begrenzt sind, bzw. nicht oder nicht signifikant auftritt.Also the use of the compounds of the invention for the preparation of pharmaceutical compositions for treatment HIV infections are due to the inhibition of cell-bound DPP4, CD26 forms of T lymphocytes. Because CD26 or DPP4 interacts with the HIV1 transactivator protein Tat and the HIV1 envelope protein GP120. Accordingly, the inventive Compounds also for the preparation of pharmaceutical compositions, or used as an active ingredient for the treatment of diseases, influenced by influencing the T-cell-mediated immune response be, for. Against autoimmune diseases, especially psoriasis, as well as asthma. The effect of the invention Peptides in medical indications caused by reduction of T-cells are treatable, based on the current state of knowledge on the influence of CD26 and / or zAAP of T cells. These Effect on T cells is as well as the inhibition of proteolytic Activity of DPP4, DPP4-like peptidases, APN, zAAP and / or DPP8 or DPP9 limited in vivo, e.g. B. with a half-life in vivo of up to about 4 h, so that negative Side effects of the peptides of the invention also are temporary and therefore do not occur or do not significantly in particular the possible increase in metastasis are limited, or not or not significantly occurs.
Die erfindungsgemäßen Peptide, die deren Fusionspeptide einschließen können, sind gegenüber bekannten Inhibitoren der DPP4 deshalb vorteilhaft, weil ihre Wirkung im Organismus nach Verabreichung von begrenzter Dauer ist, z. B. auf eine Hauptwirkungsdauer von ca. 1 bis 4 h. Diese begrenzte bzw. im Vergleich zu z. B. Sitagliptinphosphat signifikant kürzere Hauptwirkungsdauer bzw. Halbwertszeit führt dazu, dass die unerwünschte Reduktion der natürlichen Zell-Zell-Adhäsion signifikant geringer bzw. vermindert ist. Daher wird die zeitlich begrenzte Hauptwirkungsdauer der erfindungsgemäßen Peptide als Inhibitoren der DPP4 derzeit als Grund dafür angesehen, dass die Nebenwirkung der erfindungsgemäßen Peptide zur Erzeugung von Neoplasmen und insbesondere die Nebenwirkung einer Verstärkung der Metastasierung bestehender Tumore signifikant geringer ist, als bei bekannten DPP4-Inhibitoren.The peptides according to the invention, their fusion peptides may be compared to known ones Inhibitors of DPP4 are therefore beneficial because their action in the organism after administration of limited duration, e.g. B. on a main duration of action from about 1 to 4 hours. This limited or compared to z. B. sitagliptin phosphate significantly shorter main duration of action or half-life causes the unwanted reduction of natural cell-cell adhesion significantly lower or diminished. Therefore, the time-limited main duration of effect becomes the peptides of the invention as inhibitors The DPP4 currently considered as a reason for the side effect the peptides according to the invention for the production of Neoplasms and in particular the side effect of reinforcement the metastasis of existing tumors is significantly lower, than with known DPP4 inhibitors.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen bzw. als Wirkstoff in pharmazeutischen Zusammensetzungen gegen Diabetes mellitus, Fettleibigkeit und damit zusammenhängende Herz-Kreislauf-Erkrankungen, neuronale Erkrankungen und/oder Erkrankungen durch HIV hat daher den Vorteil geringer Nebenwirkungen, insbesondere ein geringeres Risiko neoplastischer Neuerkrankungen und/oder insbesondere ein geringeres Risiko der Metastasierung bestehender Neoplasmen, z. B. bei endometrialem Adenokarzinom, Melanomen, Prostatakarzinom, hämatologischen Tumoren, z. B. akute lymphatischer Leukämie und Hogdekin-Syndrom, gastrointestinalem Karzinom, humanem hepatozellulären Karzinom, Lungen-Adenokarzinom, Schilddrüsenkarzinom, papillärem und follikulärem Schilddrüsenkarzinom und Ovarialkarzinom. Als Ursache für die geringe Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide zur Verstärkung bzw. Metastasierung von zumindest diesen Neoplasmen wird derzeit angenommen, dass die verminderte Expression von DPP4/CD26 auf neoplastischen Zellen durch Anwesenheit eines Inhibitors der DPP4 günstig beeinflusst wird. So führt z. B. die Anwesenheit erfindungsgemäßer Peptide zur Minderung der Aktivität zur Migration und Invasion, bzw. der Malignität neoplastischer Zellen im Vergleich zur Wirkung von z. B. Sitagliptinphosphat, da die Minderung der Zell-Zell-Adhäsion durch Inhibition der DPP4 durch erfindungsgemäße Peptide reduziert bzw. zeitlich begrenzt auftritt.The Use of the peptides according to the invention for the production of pharmaceutical compositions or as an active ingredient in pharmaceutical Compositions for diabetes mellitus, obesity and so on Connected cardiovascular diseases, neuronal Diseases and / or diseases caused by HIV therefore have the advantage low side effects, especially a lower risk of neoplastic New diseases and / or in particular a lower risk of Metastasis of existing neoplasms, e.g. In endometrial adenocarcinoma, Melanoma, prostate carcinoma, haematological tumors, e.g. B. acute lymphoblastic leukemia and Hogdekin syndrome, gastrointestinal Carcinoma, human hepatocellular carcinoma, lung adenocarcinoma, Thyroid carcinoma, papillary and follicular thyroid carcinoma and ovarian cancer. As a cause of the low impact the peptides according to the invention for amplification or metastasis of at least these neoplasms is currently believed that decreased expression of DPP4 / CD26 on neoplastic Cells favored by the presence of an inhibitor of DPP4 being affected. So z. B. the presence of the invention Peptides for reducing migration and invasion activity, or the malignancy of neoplastic cells in comparison to the effect of z. As sitagliptin phosphate, since the reduction of Cell-cell adhesion by inhibition of DPP4 by the invention Peptides reduced or occurs for a limited time.
Die zeitlich begrenzte Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide wird derzeit darauf zurückgeführt, dass die Wirkstoffe keine synthetischen Derivatisierungen aufweisen und vom Organismus abgebaut werden können. Daher sind unerwünschte Nebenwirkungen bei Verabreichung der Verbindungen zu medizinischen Zwecken auch an Menschen im wesentlichen nicht zu beobachten bzw. im Vergleich mit bekannten Hemmstoffen der DPP4 signifikant reduziert.The temporary effect of the invention Peptides are currently attributed to that the active ingredients have no synthetic derivatizations and can be degraded by the organism. Therefore are unwanted Side effects when administering the compounds for medical purposes essentially not observable in humans or in comparison Significantly reduced with known inhibitors of DPP4.
Die erfindungsgemäßen Peptide und Fusionspeptide, deren proteolytische Spaltprodukte erfindungsgemäße Peptide enthalten, können durch übliche Syntheseverfahren oder aus natürlichen Quellen, insbesondere aus Kamelmilch isoliert werden. Peptide, die nicht die vollständige Sequenz von Lactophorin A oder Lactophorin B umfassen, können z. B. durch proteolytische Spaltung von Lactophorin A oder Lactophorin B, optional mit anschließender Aufreinigung hergestellt werden. Als Syntheseverfahren können chemische Peptidsynthesen verwendet werden, oder die heterologe Expression der Peptide von einer diese kodierenden DNA-Sequenz, die z. B. aus der Aminosäuresequenz abgeleitet ist und funktional zwischen einem Promotor und einem Terminator als Expressionskassette angeordnet ist und in einem Wirtsorganismus exprimiert wird.The peptides and fusion peptides according to the invention, their proteolytic cleavage products according to the invention Peptides can be obtained by conventional synthetic methods or from natural sources, in particular from camel milk be isolated. Peptides that are not the complete sequence of lactophorin A or lactophorin B, e.g. By proteolytic cleavage of lactophorin A or lactophorin B, optionally prepared with subsequent purification become. Synthetic methods can be chemical peptide synthesis or the heterologous expression of the peptides of a DNA sequence encoding this, the z. B. from the amino acid sequence is derived and functional between a promoter and a Terminator is arranged as an expression cassette and in a host organism is expressed.
Vorzugsweise sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein erfindungsgemäßes Peptid als Wirkstoff enthalten, zur oralen Verabreichung formuliert, insbesondere als magensaftresistente Formulierung.Preferably are pharmaceutical compositions which are an inventive Containing peptide as an active ingredient, formulated for oral administration, in particular as an enteric-coated formulation.
Aminosäuresequenzen von Peptiden sind in dieser Anmeldung vom N-Terminus zum C-Terminus angegeben.amino acid sequences of peptides in this application are from the N-terminus to the C-terminus specified.
Genaue Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention
Grundlage der vorliegenden Erfindung ist, dass die menschliche GPP4 in vitro und in vivo durch Peptide gehemmt wird, die eines der Tripeptide VPQ (Seq.-ID Nr. 3), KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) am N-Terminus aufweisen oder daraus bestehen.basis The present invention is that the human GPP4 in vitro and inhibited in vivo by peptides that are one of the tripeptides VPQ (SEQ ID NO: 3), KPQ (SEQ ID NO: 4), QPT (SEQ ID NO: 5) or EPK (SEQ ID NO: 6) at the N-terminus or consist thereof.
Bevorzugte Fusionspeptide, die eines der Tripeptide enthalten und durch proteolytische Spaltung zu Peptiden umgesetzt werden, die eines der Tripeptide VPQ (Seq.-ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) am N-Terminus aufweisen oder daraus bestehen, weisen die Aminosäuresequenz von Lactophorin A MKFFAVLLLASLAATSLASLNEPKDEIYMESQPTDTSAQVIMSNHQVSSEDLSMEPSISREDLVSKDDVVIKSARRHQNQNPKLLHPVPQESSFRNTATQSEETKELTPGAATTLEGKLVELTHKIIKNLENTMRETMDFLKSLFPHASEVVKPQ (Seq.-ID Nr. 1) oder die Aminosäuresequenz von Lactophorin B MKFFAVLLLASLAATSLASLNAAQVIMSNHQVSSEDLSMEPSISREDLVSKDDVVIKSARRHQNQNPKLLHPVPQESSFRNTATQSEETKELTPGAATTLEGKLVELTHKIIKNLENTMRETMDFLKSLFPHASEVVKPQ (Seq.-ID Nr. 2) auf. Weitere erfindungsgemäße Fusionspeptide, die durch proteolytische Spaltung zu Peptiden umgesetzt werden, die eines der Tripeptide VPQ (Seq.-ID Nr. 3), KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) am N-Terminus aufweisen oder daraus bestehen, können z. B. N-terminal und/oder C-terminal an zumindest eines der Tripeptide VPQ (Seq.-ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) peptidisch gebundene Aminosäuresequenzen aufweisen, insbesondere unter Ausbildung einer Aminosäuresequenz, die von Peptidasen erkannt wird, z. B. Verdauungsenzymen, insbesondere von Trypsin, Chymotrypsin oder Pepsin.Preferred fusion peptides which contain one of the tripeptides and are converted by proteolytic cleavage to peptides containing one of the tripeptides VPQ (SEQ ID NO: 3) KPQ (SEQ ID NO: 4), QPT (SEQ ID NO: 3). comprise or 5) or EPC (SEQ ID NO. 6) at the N-terminus consist of, the amino acid sequence of lactophorin A MKFFAVLLLASLAATSLASLNEPKDEIYMESQPTDTSAQVIMSNHQVSSEDLSMEPSISREDLVSKDDVVIKSARRHQNQNPKLLHPVPQESSFRNTATQSEETKELTPGAATTLEGKLVELTHKIIKNLENTMRETMDFLKSLFPHASEVVKPQ have No. (SEQ ID. 1) or the amino acid sequence of lactophorin B MKFFAVLL LASLAATSLASLNAAQVIMSNHQVSSEDLSMEPSISREDLVSKDDVVIKSARRHQNQNPKLLHPVPQESSFRNTATQSEETKELTPGAATTLEGKLVELTHKIIKNLENTMRETMDFLKSLFPHASEVVKPQ (SEQ ID NO: 2). Further fusion peptides according to the invention, which are converted by proteolytic cleavage into peptides containing one of the tripeptides VPQ (SEQ ID NO: 3), KPQ (SEQ ID NO: 4), QPT (SEQ ID NO: 5) or EPC (SEQ ID NO. 6) at the N-terminus or consist thereof, z. B. N-terminal and / or C-terminal to at least one of the tripeptides VPQ (SEQ ID NO: 3) KPQ (SEQ ID NO: 4), QPT (SEQ ID NO: 5) or EPK ( SEQ ID NO: 6) have peptide-linked amino acid sequences, particularly to form an amino acid sequence recognized by peptidases, e.g. B. digestive enzymes, in particular trypsin, chymotrypsin or pepsin.
Erfindungsgemäße Peptide umfassen daher neben Lactophorin A und/oder Lactophorin B auch Fusionsproteine natürlicher oder künstlicher Aminosäuresequenz, die ohne Umsetzung oder nach proteolytischer Spaltung zumindest eines der Tripeptide VPQ (Seq.-ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) an ihrem N-Terminus aufweisen, um eine solche dreidimensionale Struktur anzunehmen, dass sie die proteolytische Aktivität von DPP4 signifikant inhibieren.invention Peptides therefore include Lactophorin A and / or Lactophorin B also fusion proteins natural or artificial Amino acid sequence, without reaction or after proteolytic cleavage at least one of the tripeptides VPQ (SEQ ID NO: 3) KPQ (Seq. ID No. 4), QPT (SEQ ID NO: 5) or EPK (SEQ ID NO: 6) at its N-terminus to assume such a three-dimensional structure that they significantly inhibit the proteolytic activity of DPP4.
Für das proteolytische Spaltprodukt von Lactophorin A wurde ebenfalls bei oraler Verabreichung eine inhibitorische Wirkung auf DPP4 gefunden. Dieses Spaltprodukt, das die Aminosäuresequenz EPKDEIYMESQPTDTS (Seq.-ID Nr. 7) hat und ein Abschnitt der Aminosäuresequenz von Lactophorin A mit dem N-terminalen Tripeptid EPK (Seq.-ID Nr. 6) ist, zeigt in vitro und in vivo eine inhibierende Wirkung gegenüber APN. Entsprechen weisen erfindungsgemäße Zusammensetzungen vorzugsweise ein Peptid mit N-terminalem Tripeptid EPK (Seq.-ID Nr. 6), z. B. die Seq.-ID Nr. 4, in Kombination mit einem Peptid auf, das das Tripeptid VPQ (Seq.-ID Nr. 3) N-terminal enthält oder daraus besteht.For the proteolytic cleavage product of lactophorin A also became when administered orally, an inhibitory effect on DPP4 was found. This cleavage product containing the amino acid sequence EPKDEIYMESQPTDTS (SEQ ID NO: 7) and a portion of the amino acid sequence of lactophorin A with the N-terminal tripeptide EPK (SEQ. ID. NO. 6) shows an inhibitory effect in vitro and in vivo APN. Correspond have compositions according to the invention preferably a peptide with N-terminal tripeptide EPK (Seq. ID No. 6), e.g. See SEQ ID NO: 4, in combination with a peptide containing the tripeptide VPQ (SEQ ID NO: 3) N-terminal or consists of.
Die erfindungsgemäßen Peptide umfassen auch solche Varianten und Abwandlungen ihrer Aminosäuresequenzen, die die inhibitorische Wirkung gegen DPP4 bzw. CD26 nicht signifikant beeinträchtigen. Insbesondere haben Varianten eine oder mehrere Austausche, Deletionen oder Insertionen von Aminosäuren, insbesondere konservative Austausche. Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen mit Bezug auf die Figuren näher erläutert, bei denenThe Peptides according to the invention also include such Variants and modifications of their amino acid sequences, the the inhibitory activity against DPP4 or CD26 was not significant affect. In particular, variants have one or several exchanges, deletions or insertions of amino acids, especially conservative exchanges. The invention will now be described of examples with reference to the figures explained in more detail, at them
Beispiel 1: Hemmung der DPP4 durch FusionspeptidExample 1: Inhibition of DPP4 by fusion peptide
Bei
der Fraktionierung von Peptiden aus Kamelmilch wurde für
Lactophorin A und B gefunden, dass sie eine inhibitorische Wirkung
auf die humane DPP4 haben. Ein erster in vitro Versuch, bei dem
aufgereinigte humane rekombinante DPP4, die nach Korom (
Generell wurden erfindungsgemäße Peptide in aufgereinigter Form in HEPES-Puffer (100 mM HEPES, pH 7,5) gelagert, vorzugsweise bei –20°C, was auch die Lagerstabilität der Peptide in Lösung bei Temperaturen unterhalb von 0°C, vorzugsweise bei –5 bis –70°C zeigt. Tests wurden bei 37°C durchgeführt. Die Messung der Hydrolyse von zugesetztem Substrat erfolgte nach Inkubation zusetzten Substrats für 2 min bei 37°C mit Enzym und Hemmstoff.As a general rule were inventive peptides in purified Form stored in HEPES buffer (100 mM HEPES, pH 7.5), preferably at -20 ° C, which also affects the storage stability the peptides in solution at temperatures below 0 ° C, preferably at -5 to -70 ° C shows. Tests were performed at 37 ° C. The measurement Hydrolysis of added substrate was done after incubation added substrate for 2 min at 37 ° C with enzyme and inhibitor.
Für
Lactophorin A wurden für das Substrat GlyPro-AMC in vitro
die folgenden Parameter bestimmt:
Der Ki-Wert wurde zu 1,235 × 10–3 mg/mL berechnet. Ähnliche Werte konnten für Lactophorin B bestimmt werden.The K i value was calculated to be 1.235 × 10 -3 mg / mL. Similar values could be determined for Lactophorin B.
Ein
Vergleich der inhibitorischen Wirkung von Lactophorin A auf isolierte
rekombinante humane DPP4 im in vitro Versuch ist in
Bei
Messung der inhibitorischen Wirkung von Lactophorin A mit dem Hydrolysesubstrat
Gly-Pro-Aminomethylcoumarin (GlyPro-AMC) wurde eine IC50 = 6,9 μM
für Lactophorin A gefunden, und von 0,39 μM für den
bekannten DPP4-Inhibitor Actinonin. Die Daten sind in
Durch proteolytische Fragmentierung von Lactophorin A und Lactophorin B erhaltene Peptide wurden ebenfalls auf die Inhibition von DPP4 analysiert. Dabei wurde gefunden, dass die inhibitorische Wirkung von Lactophorin im Wesentlichen durch Peptide ausgeübt wird, die N-terminal eine der Aminosäuresequenzen VPQ (Seq.-ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) aufweisen. Diese Peptide können als proteolytische Spaltprodukte aus Fusionspeptiden entstehen, die eine der Aminosäuresequenzen VPQ (Seq.-ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) enthalten.By proteolytic fragmentation of lactophorin A and lactophorin B obtained peptides were also on the inhibition of DPP4 analyzed. It was found that the inhibitory effect of lactophorin exerted essentially by peptides which is N-terminal one of the amino acid sequences VPQ (Seq. ID No. 3) KPQ (SEQ ID NO: 4), QPT (SEQ ID NO: 5) or EPK (SEQ. ID No. 6). These peptides may be considered proteolytic Cleavage products of fusion peptides arise which are one of the amino acid sequences VPQ (SEQ ID NO: 3) KPQ (SEQ ID NO: 4), QPT (SEQ ID NO: 5) or EPK (SEQ ID NO: 6).
Anhand
der folgenden isolierten Peptide konnte gezeigt werden, dass Peptide,
die eine der Aminosäuresequenzen VPQ (Seq.-ID Nr. 3), KPQ
(Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) N-terminal
enthalten, die erfindungsgemäße inhibitorische
Wirkung auf DPP4 und/oder Aminopeptidase N haben:
VPQ (Seq.-ID
Nr. 3) und das natürliche proteolytische Spaltprodukt aus
Lactophorin A mit N-terminaler Seq.-ID Nr. 6, nämlich Seq.-ID
Nr. 7.From the following isolated peptides it was possible to show that peptides having one of the amino acid sequences VPQ (SEQ ID NO: 3), KPQ (SEQ ID NO: 4), QPT (SEQ ID NO: 5) or EPK (SEQ ID NO: 6) N-terminal, have the inhibitory effect according to the invention on DPP4 and / or aminopeptidase N:
VPQ (SEQ ID NO: 3) and the natural proteolytic cleavage product of lactophorin A with N-terminal SEQ ID NO: 6, namely SEQ ID NO: 7.
Beispiel 2: Inhibierung von APN durch Lactophorin AExample 2: Inhibition of APN by Lactophorin A
Die Aktivität von Lactophorin A und B, sowie des Tripeptids der Seq.-ID Nr. 3 auf APN konnte im in vitro Test nachgewiesen werden.The Activity of lactophorin A and B, as well as the tripeptide SEQ ID NO: 3 on APN was detected in the in vitro test.
Humane
rekombinante APN, die nach
Die Werte zeigen, dass Lactophorin A die Aktivität von APN mit zunehmender Konzentration zunehmend inhibiert. Als Positivkontrolle für die Inhibierung wurde Actinonin verwendet.The Values show that lactophorin A affects the activity of APN increasingly inhibited with increasing concentration. As a positive control Actinonin was used for the inhibition.
Beispiel 3: Inhibierung von DPP8/DPP9 durch Lactophorin AExample 3: Inhibition of DPP8 / DPP9 by lactophore A
DPP8/DPP9
wurde aus Lebern von CD26-K.O.-Mäusen (Black6, nach
Die
Ergebnisse sind in
Die Hemmung von DPP8/DPP9 konnte auch für die Peptide der Seq.-ID Nrn. 3 bis 6 und erfindungsgemäße Fusionspeptide gezeigt werden, deren Aminosäuresequenz N-terminal eine Sequenz der Seq.-ID Nr. 3, Seq.-ID Nr. 4, Seq.-ID Nr. 5 oder Seq.-ID Nr. 6 aufwies.The Inhibition of DPP8 / DPP9 was also possible for the peptides of SEQ ID Nos. 3 to 6 and inventive fusion peptides whose amino acid sequence is N-terminal one Sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID No. 6 had.
Beispiel 4: Inhibierung von zAAP durch Lactophorin AExample 4: Inhibition of zAAP by Lactophorin A
zAAP wurde aus kultivierten Jurkat-Zellen aufgereinigt. zAAP wurde in HEPES-Puffer mit 0,25 mM DTT mit Lactophorin A bei 37°C für 2 h inkubiert. Anschließend wurde das Substrat Ala-Rhodamin110 (R110) zugesetzt und die Hydrolyse nach 60 min spektrometrisch bestimmt.zAAP was purified from cultured Jurkat cells. zAAP was in HEPES buffer with 0.25 mM DTT with lactophorin A at 37 ° C incubated for 2 h. Subsequently, the substrate became Ala-rhodamine 110 (R110) was added and the hydrolysis after 60 min spectrometrically certainly.
Die
Ergebnisse sind in
Die Hemmung von zAAP konnte auch für die Peptide der Seq.-ID Nrn 3 bis 6 und erfindungsgemäße Fusionspeptide gezeigt werden, deren Aminosäuresequenz N-terminal eine Sequenz der Seq.-ID Nr. 3, Seq.-ID Nr. 4, Seq.-ID Nr. 5 oder Seq.-ID Nr. 6 aufwies.The Inhibition of zAAP was also possible for the peptides of SEQ ID Nos. 3 to 6 and fusion peptides according to the invention whose amino acid sequence is N-terminal one Sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID No. 6 had.
Beispiel 5: Zytotoxizität von PeptidenExample 5: Cytotoxicity of peptides
Zur
Bestimmung der Zytotoxizität erfindungsgemäßer
Peptide wurde stellvertretend Lactophorin A in der Lebendfärbung
mit Trypanblau (Celltiter-Blue-Test) mit kultivierten U937-Zellen
eingesetzt. Die Ergebnisse sind in
Beispiel 6: inhibitorische Wirkung der Peptide auf DPP4 in vivoExample 6: Inhibitory effect of Peptides on DPP4 in vivo
Die
inhibitorische Wirkung erfindungsgemäßer Peptide
gegen DPP4 wurde in Blutplasma einer Ratte, der zuvor ein erfindungsgemäßes
Peptid verabreicht worden war, anhand der Hydrolyse eines Substrats
der DPP4 gemessen. Als Beispiel für erfindungsgemäße
Peptide wurde Lactophorin A in Salzlösung (0,154 M, 0,1%
RSA (Rinderserumalbumin)) verwendet. Blutplasma wurde aus einer
katheterisierten Ratte nach Fasten über Nacht injiziert
(Zeitpunkt 0). Zu den in
25
mg Lactophorin A wurden in 5 mL 0,1% RSA in der Salzlösung
gelöst und zu Aliquots von 500 μL bei –20°C
eingefroren. Von dieser Lösung von Lactophorin A wurden
10 μL (0,05 mg) zu den Plasmaproben (ca. 50 μL)
zugesetzt. Für den Test wurden 20 μL des mit Lactophorin
A versetzten Plasmas mit 80 μL HEPES-Puffer und dem Substrat
Gly-Pro-pNA versetzt und nach einer Inkubation von 2 min bei 30°C über
1 min bei 30°C spektrophotometrisch vermessen. Das Ergebnis
dieses Tests ist in
Die inhibitorische Wirkung erfindungsgemäßer Peptide konnte am Beispiel von Lactophorin A auch im Plasma eine gesunden Ratte nachgewiesen werden, wenn mit Citratpuffer stabilisiertem Plasma Lactophorin A und Substrat für die DPP4 zugesetzt wurde. Im Einzelnen wurden Blutproben von einer gesunden katheterisierten Ratte genommen, der noch kein erfindungsgemäßes Peptid verabreicht worden war. Aus den Proben wurde wie oben beschrieben Plasma hergestellt und mit Citratpuffer stabilisiert. Als Substrat für die DPP4-Aktivität wurde Gly-Pro-pNA in HEPES-Puffer eingesetzt. Zu einzelnen Serumproben wurde 0,05 mg Lactophorin A zugesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass Lactophorin A im Serum die Aktivität von DPP4 von etwa 11,4 mU/mL auf 3,51 mU/mL inhibierte.The inhibitory effect of peptides of the invention was able to use the example of lactophorin A also in plasma a healthy Rat are detected when stabilized with citrate buffer Plasma Lactophorin A and substrate added for the DPP4 has been. Specifically, blood samples were catheterized from a healthy one Rat taken who still no inventive Peptide was administered. From the samples was as described above Plasma prepared and stabilized with citrate buffer. As a substrate for the DPP4 activity, Gly-Pro-pNA was in HEPES buffer used. Individual serum samples were 0.05 mg lactophorin A added. It could be shown that lactophorin A in the serum the activity of DPP4 from about 11.4 mU / mL to 3.51 mU / mL inhibited.
Vergleichsversuche, bei denen nur Puffer zugesetzt wurde, oder Lactophorin A ohne Citratpuffer zeigten, dass die inhibierende Wirkung von Lactophorin A im Wesentlichen von den Puffersubstanzen unabhängig war.Comparative tests in which only buffer was added, or lactophorin A without citrate buffer showed that the inhibitory effect of Lactophorin A substantially was independent of the buffer substances.
In
der nachfolgenden Tabelle sind die Versuchsansätze im Einzelnen
gezeigt:
Dieser Versuch zeigt, dass erfindungsgemäße Peptide die Aktivität von DPP4 in Plasma von Säugern, denen kein DPP4-Inhibitor verabreicht wurde, inhibiert.This Experiment shows that peptides of the invention the Activity of DPP4 in mammalian plasma containing no DPP4 inhibitor was administered.
Beispiel 7: Wirkung der Peptide gegen Fettleibigkeit bei SäugernExample 7: Effect of peptides against Obesity in mammals
Die Wirkung von erfindungsgemäßen Peptiden gegen Fettleibigkeit von Säugern wurde am Beispiel von Lactophorin A gezeigt, das 6 von 12 Mäusen (Balb6) mit einem anfänglichen Gewicht von 20 g oral mit dem Futter verabreicht wurde. Die Mäuse wurden mit Standardfutter und Wasser ad libitum gefüttert. Eine Gewichtskontrolle der Mäuse vor dem Versuch und nach 3 Wochen zeigte, dass die orale Verabreichung von erfindungsgemäßem Peptid das Körpergewicht und vor allem den Teil an Körperfett reduzierte. Für den Versuch wurde 6 Tieren 0,5 mg/kg Lactophorin A pro Tag ins Futter gemischt, 6 Kontrolltiere erhielten keine weiteren Zusätze zum Futter.The Effect of peptides according to the invention against obesity of mammals was shown using the example of lactophorin A, the 6 out of 12 mice (Balb6) with an initial one Weight of 20 g was administered orally with the feed. The mice were fed standard food and water ad libitum. A weight control of the mice before and after the experiment 3 weeks showed that the oral administration of inventive Peptide the body weight and especially the part of body fat reduced. For the experiment, 6 animals were given 0.5 mg / kg lactophorin A mixed into the feed per day, 6 control animals received no further additives to the food.
Das
Ergebnis ist in
Die Verminderung der Gesamtgewichtszunahme bei mit erfindungsgemäßem Peptid behandelten Mäusen betrug im Vergleich zu unbehandelten Mäusen unter ansonsten gleichen Bedingungen betrug ca. jeweils 5 g. Anatomische Analysen zeigten, dass die mit erfindungsgemäßem Peptid behandelten Mäuse einen signifikant reduzierten Anteil an Speicherfett aufwiesen, während im übrigen keine wesentlichen anatomischen oder histologischen Veränderungen gegenüber unbehandelten Mäusen festzustellen waren. Eine detaillierte histologische Analyse der Versuchstiere ergab, dass die Verabreichung des erfindungsgemäßen Peptids keine Gewebsanomalien, insbesondere keine Neoplasmen zur Folge hatte.The Reduction of the total weight increase with inventive Peptide treated mice were compared to untreated ones Mice under otherwise identical conditions was approx. 5 g each. Anatomical analyzes showed that with the invention Peptide treated mice significantly reduced Share of storage grease, while the rest no significant anatomical or histological changes were observed in untreated mice. A detailed histological analysis of the experimental animals revealed in that the administration of the peptide according to the invention did not result in tissue abnormalities, especially neoplasms.
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