DE4026147A1 - Elektrochemischer biosensor und biosensorisches verfahren - Google Patents
Elektrochemischer biosensor und biosensorisches verfahrenInfo
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Description
Für die Bestimmung von Aromaten und Heteroaromaten in wässeri
gen Medien, insbesondere in Trink- oder Abwasser, stehen chro
matographische colorimetrische und elektrochemische Methoden
zur Verfügung (Change et al., J. Chrom. 361, 199-207 (1986),
Arai, Y. et al., J. Chrom. 400, 21-26 (1987)), die jedoch einen
hohen apparativen Aufwand erfordern und zeitaufwendig sind.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung und ein
Verfahren vorzuschlagen, mit denen sich Aromaten und Heteroaro
maten schnell und zuverlässig bestimmen lassen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch einen elektrochemi
schen Biosensor gelöst, der eine Gelöstsauerstoffelektrode um
faßt und dadurch gekennzeichnet ist, daß im Bereich der Elek
trode Mikroorganismen vorgesehen sind, die in Gegenwart von
Aromaten und/oder Heteroaromaten sowie deren chlorierten Deri
vaten, wie gegebenenfalls hydroxyliertes und/oder chloriertes
Dibenzofuran, gegebenenfalls hgdroxyliertes und/oder chlorier
tes Biphenyl und/oder 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, eine At
mungsänderung zeigen. Im vorliegenden Zusammenhang werden unter
Aromaten und Heteroaromaten nicht nur reine Aromaten und He
teroaromaten verstanden, sondern auch Verbindungen, die aroma
tische und/oder heteroaromatische Gruppen tragen. Beispiele da
für sind Dibenzofuran, hydroxyliertes Dibenzofuran, wie 2-Hy
droxydibenzofuran, alkoxyliertes Dibenzofuran, wie 2-Methoxydi
benzofuran, chloriertes Dibenzofuran, Biphenyl, hydroxyliertes
Biphenyl, wie 2,2′-Dihydroxybiphenyl und 2,3-Dihgdroxybiphengl,
chloriertes Biphenyl, Benzoesäure, Salicylsäure, Diben
zothiophen und 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure.
Es werden also Mikroorganismen eingesetzt, die in Gegenwart von
Aromaten und/oder Heteroaromaten eine Atmungsänderung zeigen.
Dieser Effekt macht es dem Fachmann möglich, sich aus natürli
chen oder käuflichen Quellen Mikroorganismen zu beschaffen und
auszuwählen, die sich für einen bestimmten Analyten eignen.
Beispielsweise kann es sich um Species oder Stämme von Pseudo
monas handelt, wie z. B. Stämme derjenigen Species, der P. HH 59
zugeordnet wird. Ferner kann es sich auch beispielsweise um
Species oder Stämme von Alcanigenes handeln, wie z. B. Stämme
von A. eutrophus.
Die Mikroorganismen können auf der Elektrode fixiert sein, bei
spielsweise mit Hilfe eines Trägers. So kann der Mikroorganis
mus mit Hilfe einer Membran über der (den) Elektrode(n) vorge
sehen sein. Ferner kann der Mikroorganismus gegenüber dem zu
vermessenden Medium unter einer Dialysemembran angeordnet sein.
Zur Lösung der der Erfindung zugrundeliegenden Aufgabe wird ein
Verfahren zur Bestimmung von Aromaten und/oder Heteroaromaten
sowie deren chlorierten Derivaten, wie gegebenenfalls hydroxy
liertes und/oder chloriertes Dibenzofuran, gegebenenfalls hy
droxyliertes und/oder chloriertes Biphenyl und/oder 2,4-Di
chlorphenoxyessigsäure, in Lösung vorgeschlagen, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß man die Lösung mit einem Gehalt an ei
nem oder mehreren Aromaten und/oder Heteroaromaten als Analyt
und gegebenenfalls ferner einem Puffer, einem Aktivator
und/oder einem Inhibitor mit einem elektrochemischen Biosensor,
der eine Gelöstsauerstoffelektrode umfaßt, in Berührung bringt,
wobei der Biosensor einen Mikroorganismus trägt, der in Gegen
wart des Analyten eine Atmungsänderung zeigt und zuvor mit dem
zu bestimmenden Aromaten bzw. Heteroaromaten inkubiert worden
ist, und in an sich bekannter Weise die Stromstärke bzw. Strom
stärkeänderung als Maß der Analytkonzentration ermittelt.
So kann man zur Bestimmung von gegebenenfalls hydroxyliertem
und/oder chloriertem Dibenzofuran einen Biosensor mit Species
oder Stämmen von Pseudomonas und/oder Alcanigenes verwenden.
Zur Bestimmung von gegebenenfalls hgdroxyliertem und/oder chlo
riertem Biphengl kann man einen Biosensor mit Species oder
Stämmen von Pseudomonas verwenden. Dabei ist es vorteilhaft,
wenn der Analyt in einem organischen Lösungsmittel, beispiels
weise in Dimethylsulfoxid gelöst vorliegt. Zur Bestimmung von
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure kann man Species oder Stämme von
Alcanigenes verwenden.
Zur technischen Ausstattung und zur Herstellung von Biosensoren
sei auf Riedel, K. et al., J. Chem. Tech. Biotechnol., 44
(1989) 85-106, sowie Scheller, F. and Schubert, F.: Biosenso
ren, Birkhäuser Verlag, Basel-Boston-Berlin (1989), verwiesen.
Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert.
Pseudomonas HH 69 wird in einem sgnthetischen Medium 24 h mit
Dibenzofuran aerob bei 30°C kultiviert, abzentrifugiert und
das Sediment in 0,1 mol Phosphatpuffer resuspendiert. Mittels
Spezialzentrifugenröhrchen (DD 2 32 443 (1986)) wird die Bio
masse auf einen Papierträger (Durchmesser 3 mm) zentrifugiert.
Die Zellbeladung beträgt 5 mg/cm2. Der Papierträger wird auf
die Polgethylenmembran einer Gelöstsauerstoffelektrode unmit
telbar über die Pt-Kathode gelegt und meßseitig durch eine
Dialysemembran abgeschlossen. Der Biosensor wird in eine auf
30°C temperierte Meßzelle geschraubt, die mit 2,5 ml 0,1 mol
Phosphatpuffer pH 6,8 gefüllt und gerührt wird. Zur Aktivierung
des Biosensors wird der Meßzelle 1 h 100 µl in Dimethglsulfoxid
gelöstes Dibenzofuran zugesetzt, so daß eine Konzentration von
4 mM erreicht wird. Mit Dibenzofuran in Dimethylsulfoxid wird
der Sensor kalibriert, indem jeweils 100 µl unterschiedlich
konzentrierter Kalibrierungslösung der in der Meßzelle enthal
tenden 2,5 ml 0,1 mol Phosphatpufferlösung zugesetzt werden
(Tabelle 1). Die zu untersuchenden Proben werden ebenfalls in
Dosen von 100 µl in die Meßzelle gegeben und die Stromänderung
pro min als Maß der Konzentration nach Kalibrierung gemessen.
Der Sensor ist besonders empfindlich gegenüber Biphenyl, Di
benzofuran, Benzoat, 2,3-Dihydroxybiphenyl, Acetat und Hydroxy
dibenzofuran (Tabelle 2). Glucose, Ethanol und das zur Lösung
der Biphenglether eingesetzte Lösungsmittel Dimethsulfoxid zei
gen keine Reaktion.
| Abhängigkeit des Biosensorsignals (nA/min) eines Pseudomonas-HH69-Biosensors von der Dibenzofurankonzentration | |
| Konzentration (mmol) | |
| Biosensorsignal (nA/min) | |
| 0,2 | |
| 107 | |
| 0,4 | 160 |
| 0,8 | 213 |
| 2,0 | 362 |
| 4,0 | 528 |
| Selektivität des Pseudomonas-HH69-Biosensors | |
| Substrat | |
| Aktivität (%) | |
| Dibenzofuran | |
| 100 | |
| Benzoat | 96 |
| 2-Hydroxydibenzofuran | 671 |
| 2-Methoxydibenzofuran | 34 |
| Biphenyl | 190 |
| 2,2′-Dihydroxybiphenyl | 34 |
| 2,3-Dihydroxybiphenyl | 629 |
| Dibenzothiophen | 55 |
| Salicylsäure | 82 |
| Azetat | 171 |
| Ethanol | 0 |
| Glukose | 2 |
| Dimethsuloxid | 0 |
Pseudomonas HH 69 Zellen werden wie im Beispiel 1 beschrieben
kultiviert, geerntet und in Phosphatpuffer resuspendiert. 500 µl
dieser Suspension werden mit 500 µl einer 10%igen Lösung von
Polyvinglalkohol gemischt, auf 10 cm2 ausgestrichen und bei
4°C getrocknet. Die erhaltenen mikrobilogischen Folien mit
5 mg Trockengewicht/cm2 werden zur Präparation der Biosensoren
eingesetzt. Die Meßtechnik entspricht der in Beispiel 1 be
schriebenen. Die erhaltenen Meßergebnisse sind denen des Bei
spiels 1 analog.
Alcanigenes eutrophus, beispielsweise IMP134, wird in einem
sgnthetischen Medium 24 h mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure
aerob bei 30°C kultiviert, abzentrifugiert und das Sediment in
0,1 mol Phosphatpuffer resuspendiert. Mittels
Spezialzentrifugenröhrchen (DD 2 32 443 (1986)) wird die Bio
masse auf einen Papierträger (Durchmesser 3 mm) zentrifugiert.
Die Zellbeladung beträgt 5 mg/cm2. Der Papierträger wird auf
die Polyethylenmembran einer Gelöstsauerstoffelektrode unmit
telbar über die Pt-Kathode gelegt und meßseitig durch eine
Dialysemembran abgeschlossen. Der Biosensor wird in eine auf
30°C temperierte Meßzelle geschraubt, die mit 2,5 ml 0,1 mol
Phosphatpuffer pH 6,8 gefüllt und gerührt wird. Zur Aktivierung
des Biosensors werden der Meßzelle 1 h 100 µl in Puffer pH 6,8
gelöste 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure zugesetzt, so daß eine
Konzentration von 4 mM erreicht wird. Mit 2,4-Dichlorphenoxy
essigsäure in Phosphatpuffer pH 6,8 wird der Sensor geeicht,
indem jeweils 100 µl unterschiedlich konzentrierter Kalibrie
rungslösung der in der Meßzelle enthaltenden 2,5 ml 0,1 mol
Phosphatpufferlösung zugesetzt werden (Tabelle 3). Die zu un
tersuchenden Proben werden ebenfalls in Dosen von 100 µl in die
Meßzelle gegeben und die Stromänderung pro min als Maß der Kon
zentration nach Kalibrierung gemessen. Der Sensor ist relativ
spezifisch gegen 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (Tabelle 4).
| Abhängigkeit des Biosensorsignals (nA/min) eines Alcanigenes-eutrophus-Biosensors von der Dibenzofurankonzentration | |
| Konzentration (mmol) | |
| Biosensorsignal (nA/min) | |
| 0,4 | |
| 76 | |
| 0,8 | 184 |
| 2,0 | 248 |
| 8,0 | 324 |
| Selektivität des Alcanigenes-eutrophus-Biosensors | |
| Substrat | |
| Aktivität (%) | |
| 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure | |
| 100 | |
| 3-Chlorphenoxyessigsäure | Hemmung |
| 2-Chlorphenoxysäure | Hemmung |
| Phenoxysäure | Hemmung |
| Acetat | 67 |
Alcanigenes eutrophus Zellen werden wie im Beispiel 3 beschrie
ben kultiviert, geerntet und in Phosphatpuffer resuspendiert.
500 µl dieser Suspension werden mit 500 µl einer 10%igen Lösung
von Polyvinylalkohol gemischt, auf 10 cm2 ausgestrichen und bei
4°C getrocknet. Die erhaltenen mikrobiologischen Folien mit
5 mg Trockengewicht/cm2 werden zur Präparation der Biosensoren
eingesetzt. Die Meßtechnik entspricht der in Beispiel 3 be
schriebenen. Die erhaltenen Meßergebnisse sind denen des Bei
spiels 3 adäquat.
Corynebacterium MB1 wird in einem sgnthetischen Medium 24 h mit
Biphenyl aerob bei 30°C kultiviert. Die Mikroorganismen werden
wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen. Danach wird ein Biosen
sor präpariert.
Zur Aktivierung des Biosensors wird der Meßzelle 2 h 100 µl in
Dimethylsulfoxid gelöstes Biphenyl zugesetzt, so daß eine
Konzentration von 4 mM erreicht wird. Mit Biphenyl in Dimethyl
sulfoxid wird der Sensor kalibriert. Der lineare Meßbereich
dieses Sensors reicht bis 0,4 mmol.
Alcanigenes H 850 wird in einem synthetischen Medium 24 h mit
Biphenyl aerob bei 30°C kultiviert. Die Mikroorganismen werden
wie im Beispiel 1 beschrieben gewonnen. Danach wird ein Biosen
sor präpariert.
Zur Aktivierung des Biosensors wird der Meßzelle 3 h 100 µl in
Dimethylsulfoxid gelöstes Biphenyl zugesetzt, so daß in der
Meßzelle eine Konzentration von 4 mM erreicht wird.
Die Kalibrierung wird mit in Dimethylsufoxid gelöstem Biphenyl
vorgenommen. Der lineare Meßbereich dieses Sensors reicht bis
80 µmol. Der Sensor ist besonders empfindlich gegenüber Biphe
nyl und 2,3-Dihgdroxy-biphenyl (200% im Vergleich zu Biphe
nyl). Chlorierte Biphenyle bewirken Signale in der Höhe von 10
bis 20% im Vergleich zu gleich konzentrierten Biphenylen.
Claims (13)
1. Elektrochemischer Biosensor, umfassend eine Gelöstsauer
stoffelektrode und dadurch gekennzeichnet, daß im Bereich der
Elektrode Mikroorganismen vorgesehen sind, die in Gegenwart von
Aromaten und/oder Heteroaromaten sowie deren chlorierten Deri
vaten, wie gegebenfalls hydroxyliertes und/oder chloriertes Di
benzofuran, gegebenenfalls hydroxyliertes und/oder chloriertes
Biphenyl und/oder 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, eine Atmungsän
derung zeigen.
2. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es
sich bei dem Mikroorganismus um Species oder Stämme von Pseudo
monas handelt, beispielsweise Stämme der Species, der P. HH 59
zugeordnet wird.
3. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es
sich bei dem Mikroorganismus um Species oder Stämme von
Alcanigenes handelt, beispielsweise Stämme von A. eutrophus.
4. Biosensoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es
sich bei den Mikroorganismen um Species der Stämme von
corynebacterium handelt, beispielsweise Stämme der Species, der
Corynebacterium MB1 zugeordnet wird.
5. Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen im Bereich der Elek
trode fixiert sind.
6. Biosensor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die
Mikroorganismen auf der (den) Elektrode(n) fixiert sind, bei
spielsweise mit Hilfe eines Trägers.
7. Biosensor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die
Mikroorganismen mit Hilfe einer Membran über der Elektrode vor
gesehen ist.
8. Biosensor nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet,
daß der Mikroorganismus gegenüber dem zu vermessenden Medium
unter einer Membran angeordnet ist.
9. Verfahren zur Bestimmung von Aromaten und/oder Heteroaroma
ten sowie deren chlorierten Derivaten, wie gegebenenfalls hy
droxyliertes und/oder chloriertes Dibenzofuran, gegebenenfalls
hydroxyliertes und/oder chloriertes Biphenyl und/oder 2,4-
Dichlorphenoxyessigsäure, in Lösung, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Lösung mit einem Gehalt an einem oder mehreren Aro
maten und/oder Heteroaromaten als Analyt und gegebenenfalls
ferner einem Puffer, einem Aktivator und/oder einem Inhibitor
mit einem elektrochemischen Biosensor, der eine Gelöstsauer
stoffelektrode umfaßt, in Berührung bringt, der Mikroorganismen
trägt, die in Gegenwart des Analyten eine Atmungsänderung zei
gen, und der zuvor mit dem zu bestimmenden Aromaten bzw. He
teroaromaten inkubiert worden ist, und in an sich bekannter
Weise die Stromstärke bzw. Stromstärkeänderung als Maß der
Analytkonzentration ermittelt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man
zur Bestimmung von gegebenenfalls hydroxyliertem und/oder chlo
riertem Dibenzofuran einen Biosensor mit Species oder Stämmen
von Pseudomonas und/oder Alcanigenes sowie Corynebacterium ver
wendet.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man
zur Bestimmung von gegebenenfalls hydroxyliertem und/oder chlo
riertem Biphenyl einen Biosensor mit Species oder Stämmen von
Pseudomonas verwendet.
12. Verfahren nach Anspruch 1, 9 oder 10, dadurch gekennzeich
net, daß der Analyt in organischen Lösungsmitteln beispiels
weise in Dimethylsulfoxid gelöst ist.
13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man
zur Bestimmung von 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure einen Biosensor
mit Species oder Stämmen von Alcanigenes verwendet.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19904026147 DE4026147A1 (de) | 1990-08-17 | 1990-08-17 | Elektrochemischer biosensor und biosensorisches verfahren |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19904026147 DE4026147A1 (de) | 1990-08-17 | 1990-08-17 | Elektrochemischer biosensor und biosensorisches verfahren |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE4026147A1 true DE4026147A1 (de) | 1992-02-20 |
Family
ID=6412463
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19904026147 Withdrawn DE4026147A1 (de) | 1990-08-17 | 1990-08-17 | Elektrochemischer biosensor und biosensorisches verfahren |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE4026147A1 (de) |
-
1990
- 1990-08-17 DE DE19904026147 patent/DE4026147A1/de not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NEUJAHR, H.Y.: Appl. Biochem. Biotechn. 7, 1982, S. 107-111 * |
| RIEDEL, K. et.al.: J. Chem. Tech. Biotechn. 44, 1989, S. 85-105 * |
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