DE4024528A1 - Verfahren und mittel zur bestimmung eines analyts - Google Patents

Verfahren und mittel zur bestimmung eines analyts

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DE4024528A1 DE19904024528 DE4024528A DE4024528A1 DE 4024528 A1 DE4024528 A1 DE 4024528A1 DE 19904024528 DE19904024528 DE 19904024528 DE 4024528 A DE4024528 A DE 4024528A DE 4024528 A1 DE4024528 A1 DE 4024528A1
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Gerhard Dr Gunzer
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Mittel zur Bestimmung eines Analyts in einer Probe mit Hilfe eines homogenen Enzymimmunoassays.
Homogene Enzymimmunoassays vereinigen in sich die hohe Spezifität einer Antigen/Antikörper-Wechselwirkung mit der bekannten hohen Sensitivität einer enzymatischen Reaktion. Sie stellen mithin das Mittel der Wahl zur schnellen und automatisierbaren Bestimmung selektiver Analyte in niedrigen Konzentrationen dar. Beispiele für kommerziell vertriebene homogene Immunoassays sind die EMIT®-Tests (Syva), die CEDIA®-Tests (Microgenics) und die AEST-Tests (Iatron). Diese Verfahren nutzen entweder die Inhibierung bzw. Aktivierung von Markerenzymen durch Analyt/Antikörper-Wechselwirkung (sterische Blockade), die Nicht-Inhibierung des Markerenzyms durch zur Aggregation befähigte Enzym/Antikörper-Konjugate oder die Reassoziationshinderung von Enzymfragmenten durch Analyt/Antikörper-Wechselwirkung aus. Allen Verfahren gemeinsam ist ein relativ aufwendig herzustellendes Reagenz.
In der EP-PS 84 807 ist ein homogener Immunoassay beschrieben, bei dem eine Aggregationsreaktion zwischen einem Analyt und einem Enzym-markierten Rezeptor mit spezifischer Bindungsaktivität gegenüber dem Analyt durchgeführt wird. Aus der enzymatischen Reaktion zwischen dem Enzym und einem Substrat, das im Überschuß vorliegt, wird der Analyt quantitativ bestimmt. Das Prinzip der Reaktion beruht darauf, daß das überschüssige Substrat die Aktivität des freien Enzyms inhibiert; die Aktivität des Aggregats steigt je nach dem Grad der immunologischen Aggregation.
Der Nachteil der Verfahren nach dem Stand der Technik liegt insbesondere darin, daß die direkte Bestimmung von hochmolekularen Analyten, die nur über eine einzige spezifische Antikörperbindungsstelle verfügen, mit diesen Verfahren nicht möglich ist.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen homogenen Enzymimmunoassay zur Verfügung zu stellen, mit dem auch hochmolekulare Analyte mit einer einzigen spezifischen Antikörperbindungsstelle quantitativ bestimmt werden können.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyts in einer Probe, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Analyt mit einem nicht-aggregationsfähigen Enzym-Rezeptor-Komplex und anschließend mit einem aggregationsfähigen Rezeptor umsetzt und die Messung der von der Konzentration des Analyts abhängigen enzymatischen Aktivität in Gegenwart eines Elektronendonors und eines Überschusses an Substrat durchführt. Der nicht-aggregationsfähige Enzym-Rezeptor-Komplex wird durch Kopplung des Enzyms an einen Rezeptor zu einem 1 : 1-Konjugat hergestellt. Der Rezeptor ist ein Antikörper-Fragment oder ein monoklonaler Antikörper, vorzugsweise ein Antikörper-Fragment. Als aggregationsfähige Rezeptoren sind polyklonale Antikörper, Gemische mehrerer monoklonaler Antikörper oder sogenannte Hybridantikörper geeignet. Diese aggregationsfähigen Rezeptoren können sowohl intakte Antikörper als auch deren vernetzungsfähige Fragmente sein.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel zur Bestimmung eines Analyts in einer Probe, enthaltend einen nicht-aggregationsfähigen Enzym-Rezeptor-Komplex, einen aggregationsfähigen Rezeptor und eine Substratlösung.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß 1 : 1-Konjugate aus einem Enzym und einem Analyt-spezifischen Rezeptor nach Reaktion mit dem zu bestimmenden Analyt und einem aggregationsfähigen Rezeptor in Gegenwart bestimmter Substratmischungen eine von der Konzentration des Analyts abhängige Modulation der enzymatischen Aktivität zeigen. Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß es die Bestimmung von Analyten ermöglicht, die nur über eine einzige spezifische Antikörperbindungsstelle verfügen.
Geeignete Enzyme im Sinne der Erfindung sind prokaryotische und eukariotische Peroxidasen, z. B. Peroxidase aus Meerrettich (=HPR) oder aus Mikroorganismen wie Streptomyces spec., Botrytis cinerea, Mucor spec., Myrothecium verrucaria, Phanerochaete chrysosporium, Collybia velutipes, Pleurotus ostreotuc, Fornitropsis pinicola, Coniotyrium ribis, Aspergillus niger, Staphylococcus saprohyticus, vorzugsweise Peroxidase aus Meerrettich. Die Analyt-spezifischen Rezeptoren, die mit dem Enzym das 1 : 1-Konjugat bilden, sind Antikörperfragmente, die sogenannten Fab′-Fragmente.
Die bevorzugten Enzym-Rezeptor-Komplexe nach der Erfindung sind die 1 : 1-Konjugate aus Meerrettich-Peroxidase und monoklonalen Fab′-Fragmenten.
Die zur Nachvernetzung dienenden aggregationsfähigen Rezeptoren sind vorzugsweise polyklonale Antikörper oder Gemische aus mehreren monoklonalen Antikörpern (IgG bzw. F(ab′)₂-Fragmente).
Die enzymatische Nachweisreaktion beruht auf der bekannten Inhibierung der Meerrettich-Peroxidase in Gegenwart eines Überschusses an Substrat, d. h. hoher Konzentrationen an Wasserstoffperoxid. Diese Inhibierung des Enzyms tritt nach Vernetzung des Analyt/Meerrettich-Peroxidase-Fab′-Komplexes mit Analyt-spezifischen Antikörpern bei Verwendung bestimmter Elektronendonoren in geringerem Ausmaß auf. Die entsprechend gesteigerte enzymatische Aktivität ist proportional der Konzentration des nachzuweisenden Analyts.
Geeignete Elektronendonoren sind z. B. Phenol und substituierte Phenole wie 2-Chlorphenol, 4-Chlorphenol, m-Kresol, 3-Aminophenyl, 4-Bromphenol, 4-Fluorphenol, 2,4-Dichlorphenol, 3-Isopropylphenol, 4-Chlor-2-methylphenol, 4-Chlor-3-methylphenol, 4-Jodphenol, vorzugsweise Phenol, 4-Chlorphenol und 2,4-Dichlorphenol.
Die Herstellung des Enzym-Rezeptor-Komplexes erfolgt durch Umsetzung des Enzyms mit einem molaren Überschuß eines üblichen Heterocrosslinkers (z. B. Glutaraldehyd, Carbodiimid, Bismaleimid), und chromatographischer Isolierung des 1 : 1-Produkts. Das so erhaltene Produkt wird mit einer etwa äquimolaren Menge eines Analyt-bindenden Fab′-Fragments umgesetzt und das erhaltene 1 : 1-Konjugat des Enzym-Rezeptor-Komplexes chromatographisch isoliert.
Zur Bestimmung des Analyts werden die Probe und das Enzym-Fab′-Konjugat gemischt und 5-20 Minuten bei 18-40°C inkubiert. Anschließend werden Analyt-quervernetzende IgGs oder F(ab′)₂-Fragmente hinzugegeben und erneut 5-20 Minuten bei 18-40°C inkubiert. Nach Zugabe einer Substratlösung für das Enzym und einer entsprechenden Inkubationszeit wird eine Stopplösung (z. B. Formaldehydlösung) zugegeben und die Absorption bei einer bestimmten Wellenlänge gemessen. Die ermittelte enzymatische Aktivität ist proportional der Konzentration des nachzuweisenden Analyts.
Ein bevorzugtes Mittel nach der Erfindung enthält z. B. einen Komplex aus Peroxidase-Maleimid und anti-human PMN-Elastase-Antikörper Fab′, einen anti-human α₁-Proteinaseinhibitor IgG oder einen anti-human PMN-Elastase-Antikörper F(ab′)₂ und eine Farbsubstratlösung. Ein weiteres Mittel enthält z. B. einen Komplex aus Peroxidase-Maleimid und anti-human CK-MM-Antikörper Fab′, einen anti-human CK-BB-Antikörper IgG und eine Farbsubstratlösung.
Beispiel 1 Bestimmung des humanen Inhibitorkomplexes PMN-Elastase/α₁-Proteinaseinhibitor unter Verwendung polyklonaler Antikörper Herstellung der Reagenzien a) HRP-Maleimid
10 mg Meerrettich-Peroxidase werden in 1 ml bidest. Wasser gelöst und mit 75 µl einer Lösung von 4 mg Succinimidyl-4-(maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat in 1 ml Dioxan gemischt. Die Reaktionslösung wird 1 Std. bei 30°C unter Rühren inkubiert. Überschüssiger Crosslinker wird anschließend gelchromatographisch über Sephadex® G-25 (Pharmacia-LKB) abgetrennt. Eine Bestimmung der Anzahl gebundener Maleimidgruppen zeigt, daß durchschnittlich eine Maleimidgruppe pro Enzymmolekül eingeführt wurde.
b) Anti-human PMN-Elastase Fab′
Antikörper vom Schaf gegen humane PMN-Elastase werden affinitätschromatographisch gereinigt und nach bekannten Verfahren mit Pepsin proteolytisch gespalten. 1 ml der F(ab′)₂-Lösung (5 mg/ml) wird mit Essigsäure auf pH 5,0 eingestellt, mit Argongas überschichtet und unter Inertgasatmosphäre mit 30 µl einer Lösung von 114 mg Cysteaminhydrochlorid in 1 ml bidest. Wasser versetzt. Die Reaktionslösung wird 2 Std. bei 37°C inkubiert. Im Anschluß wird überschüssiges Cysteaminhydrochlorid durch Chromatographie über Sephadex® G-25 (Pharmacia-LKB) abgetrennt. Die resultierende Lösung von Fab′-Fragmenten wird mit Argongas überschichtet.
c) Konjugat aus HRP-Maleimid und anti-human PMN-Elastase Fab′
3,78 mg HRP-Maleimid in 0,63 ml bidest. Wasser werden mit einer Lösung von 3,78 mg anti-human PMN-Elastase Fab′-Fragmenten in 1,45 ml PBS-Puffer (150 mM KCl, 20 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0) unter Argongasatmosphäre versetzt und über Nacht bei 30°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird HPLC-analytisch untersucht und anschließend über Sephacryl® S-200 HR (Pharmacia-LKB) gelchromatographisch gereinigt. Die Fraktionen 23-27 (Konjugat aus HRP-Maleimid und anti-human PMN-Elastase Fab′) werden zusammengefaßt. Der Pool wird mit 1 g Saccharose, 0,1 g Sol-U-Pro (Dynagel Inc.) und 20 µl Kathon® CG (Rohm & Haas) versetzt. Für die Bestimmung wird der Pool 1+5 mit PBS-Puffer verdünnt.
d) Anti-human α₁-Proteinaseinhibitor IgG
Antikörper vom Schaf gegen den humanen α₁-Proteinaseinhibitor werden affinitätschromatographisch gereinigt. Die im Test verwendete Lösung hat eine Konzentration von 5 mg/ml IgG.
e) Farbsubstratlösung
Als Farbsubstrat wird eine Lösung von 0,75 mM 4-Aminophenazon, 40 mM Wasserstoffperoxid und 25 mM Phenol in 5 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0, verwendet.
f) Stopplösung
Als Stopplösung wird eine 1,85%ige Formaldehydlösung eingesetzt.
Testdurchführung
Für den Test wird folgendes Pipettierschema gewählt:
50 µl Probe (Lösungen bekannten Gehalts an PMN-Elastase/α₁-Proteinaseinhibitor)
+ 100 µl HRP-Fab′-Konjugat
mischen, 5 min bei 37°C inkubieren
+ 50 µl anti-human α₁-Proteinaseinhibitor IgG
mischen, 5 min bei 37°C inkubieren
+ 500 µl Farbsubstratlösung
mischen, 10 min bei 37°C inkubieren
+ 2000 µl Stopplösung
mischen, Absorption bei 500 nm messen.
In Abb. 1 ist die so erhaltene Kalibrationskurve dargestellt.
Steigende Konzentrationen an PMN-Elastase/α₁-Proteinaseinhibitor ergeben zunehmende Absorptionen. Die Kalibrationskurve weist den für Immunoassays häufig beobachteten sigmoiden Verlauf auf. Proben unbekannter Konzentrationen an PMN-Elastase/α₁-Proteaseinhibitor können anhand diese Kalibrationskurve bestimmt werden. Aufgrund der großen Signaldifferenz lassen sich auch niedrige Konzentrationen präzise bestimmen.
Beispiel 2 Bestimmung humaner PMN-Elastase unter Verwendung eines monoklonalen Antikörper-Enzymkonjugats und vernetzender polyklonaler Antikörper Herstellung der Reagenzien a) HRP-Maleimid
Die Darstellung erfolgt analog Beispiel 1.
b) Monoklonale anti-human PMN-Elastase Fab′-Fragmente
Monoklonale Antikörper (balb-c) gegen humane PMN-Elastase werden nach bekannten Verfahren mit Pepsin proteolytisch gespalten. 1 ml der resultierenden F(ab′)₂-Lösung (4,6 mg/ml) wird mit Essigsäure auf pH 5,0 eingestellt, mit Argongas überschichtet und unter Inertgasatmosphäre mit 28 µl einer Lösung von 114 mg Cysteaminhydrochlorid in 1 ml bidest. Wasser versetzt. Die Reaktionslösung wird 2 Std. bei 37°C inkubiert. Anschließend wird überschüssiges Cysteaminhydrochlorid durch Chromatographie über Sephadex® G-25 (Pharmacia-LKB) abgetrennt. Die resultierende Lösung von Fab′-Fragmenten wird mit Argongas überschichtet.
c) Konjugat aus HRP-Maleimid und anti-human PMN-Elastase Fab′
2,97 mg HRP-Maleimid in 0,55 ml bidest. Wasser werden mit einer Lösung von 2,97 mg monoklonalen anti-human PMN-Elastase Fab′-Fragmenten in 1,4 ml PBS-Puffer unter Argongasatmosphäre versetzt und über Nacht bei 30°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird HPLC-analytisch untersucht und anschließend über Sephacryl® S-200 HR (Fa. Pharmacia-LKB) gelchromatographisch gereinigt. Die Fraktionen 30-32 (Konjugat aus HRP-Maleimid und monoklonalen anti-human PMN-Elastase Fab′-Fragmenten) werden zusammengefaßt. Der Pool wird mit 1 g Saccharose, 0,1 g Sol-U-Pro (Dynagel Inc.) und 20 µl Kathon® CG (Rohm & Haas) versetzt. Für die Bestimmung wird der Pool 1+10 mit PBS-Puffer verdünnt.
d) Anti-human PMN-Elastase F(ab′)₂
IgG-Antikörper vom Schaf gegen humane PMN-Elastase werden analog Beispiel 1 proteolytisch gespalten und die resultierenden F(ab′)₂-Fragmente affinitätschromatographisch gereinigt. Die im Test verwendete Lösung hat eine Konzentration von 0,1 mg/ml F(ab′)₂.
e) Farbsubstratlösung
Als Farbsubstrat wird eine Lösung von 0,75 mM 4-Aminophenazon, 40 mM Wasserstoffperoxid und 25 mM Phenol in 5 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0, verwendet.
f) Stopplösung
Als Stopplösung wird eine 1,85%ige Formaldehydlösung eingesetzt.
Testdurchführung
Für den Test wird folgendes Pipettierschema gewählt:
50 µl Probe (Lösungen bekannten Gehalts an PMN-Elastase)
+ 200 µl HRP-Fab′-Konjugat
mischen, 10 min bei 37°C inkubieren
+ 100 µl anti-human PMN-Elastase (F(ab′-₂-Fragmente)
mischen, 10 min bei 37°C inkubieren + 500 µl Farbsubstratlösung
mischen, 10 min bei 37°C inkubieren
+ 2000 µl Stopplösung
mischen, Absorption bei 500 nm messen.
In Abb. 2 ist die so erhaltene Kalibrationskurve dargestellt. Der Bereich der Kalibrationskurve ist stark abhängig von dem relativen Konzentrationsverhältnis Probe : Konjugat : F(ab′)₂. In Abb. 2a ist der Einfluß der Konzentration des vernetzenden F(ab′)₂-Fragments dargestellt, wobei eine konstante Konzentration von 60 mg/l PMN-Elastase verwendet wird. Die optimale Konzentration des vernetzenden F(ab′)₂-Fragments liegt im Bereich von 40-100 mg/l. Deutlich höhere Konzentrationen am F(ab′)₂-Fragmenten führen durch verminderte Vernetzung zu niedrigeren Meßsignalen.
Beispiel 3 Bestimmung des humanen Isoenzyms CK-MB unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen humane CK-MM und CK-BB Herstellung der Reagenzien a) HRP-Maleimid
Die Darstellung erfolgt analog Beispiel 1.
b) Anti-human CK-MM Fab′-Fragmente
Antikörper von der Ziege gegen das humane Isoenzym CK-MM werden nach bekannten Verfahren mit Pepsin proteolytisch gespalten. 1 ml der resultierenden F(ab′)₂-Lösung (4,0 mg/ml) wird mit Essigsäure auf pH 5,0 eingestellt, mit Argongas überschichtet und unter Inertgasatmosphäre mit 25 µl einer Lösung von 114 mg Cysteaminhydrochlorid in 1 ml bidest. Wasser versetzt. Die Reaktionslösung wurde 2 Std. bei 37°C inkubiert. Anschließend wird überschüssiges Cysteaminhydrochlorid durch Chromatographie über Sephadex® G-25 (Pharmacia-LKB) abgetrennt. Die resultierende Lösung von Fab′-Fragmenten wird mit Argongas überschichtet.
c) Konjugat aus HRP-Maleimid und anti-human CK-MM Fab′
2,99 mg HRP-Maleimid in 0,61 ml bidest. Wasser werden mit einer Lösung von 2,99 mg monoklonalen anti-human CK-MM Fab′-Fragmenten in 1,45 ml PBS-Puffer unter Argongasatmosphäre versetzt und über Nacht bei 30°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird HPLC-analytisch untersucht und anschließend über Sephacryl® S-200 HR (Pharmacia-LKB) gelchromatographisch gereinigt. Die Fraktionen 27-30 (Konjugat aus HRP-Maleimid und anti-human CK-MM Fab′-Fragmenten) werden zusammengefaßt. Der Pool wird mit 1 g Saccharose, 0,1 g Sol-U-Pro (Dynagel Inc.) und 20 µl Kathon® CG (Rohm & Haas) versetzt. Für die Bestimmung wird der Pool 1+10 mit PBS-Puffer verdünnt.
d) anti-human CK-BB IgG
IgG-Antikörper von der Ziege gegen das humane Isoenzym Ck-BB werden ohne weitere affinitätschromatographische Reinigung verwendet. Die IgG-Lösung zeigt einen Titer von ca. 2 mg/ml spezifischer Antikörper. Im Test wird diese Lösung unverdünnt eingesetzt.
e) Farbsubstratlösung
Als Farbsubstrat wird eine Lösung von 0,75 mM 4-Aminophenazon, 40 mM Wasserstoffperoxid und 25 mM Phenol in 5 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0, verwendet.
f) Stopplösung
Als Stopplösung wird eine 1,85%ige Formaldehydlösung eingesetzt.
Testdurchführung
Für den Test wurde folgendes Pipettierschema gewählt:
50 µl Probe (Lösungen bekannten Gehalts an CK-MB Isoenzym
+ 100 µl HRP-Fab′-Konjugat
mischen, 10 min bei 37°C inkubieren
+ 500 µl anti-human CK-BB IgG
mischen, 10 min bei 37°C inkubieren
+ 500 µl Farbsubstratlösung
mischen, 10 min bei 37°C inkubieren
+ 2000 µl Stopplösung
mischen, Absorption bei 500 nm messen.
In Abb. 3 ist die so erhaltene Kalibrationskurve dargestellt. Der sigmoide Charakter ist wieder deutlich erkennbar. Mit Hilfe der Kalibrationskurve lassen sich Proben unbekannten Gehalts an CK-MB bestimmen.

Claims (8)

1. Verfahren zur Bestimmung eines Analyts in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man den Analyt mit einem nicht-aggregationsfähigen Enzym-Rezeptor-Komplex und anschließend mit einem aggregationsfähigen Rezeptor umsetzt und die Messung der von der Konzentration des Analyts abhängigen enzymatischen Aktivität in Gegenwart eines Elektronendonors und eines Überschusses an Substrat duchführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der nicht-aggregationsfähige Enzym-Rezeptor-Komplex durch Kopplung des Enzyms an einen Rezeptor zu einem 1 : 1-Konjugat hergestellt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor ein Antikörper-Fragment oder ein monoklonaler Antikörper und das Enzym eine Peroxidase ist.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplung mit Hilfe eines Crosslinkers vorgenommen wird.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als aggregationsfähige Rezeptoren polyklonale Antikörper, Gemische mehrerer monoklonaler Antikörper oder sogenannte Hybridantikörper verwendet werden.
6. Mittel zur Bestimmung eines Analyts in einer Probe, enthaltend einen nicht-aggregationsfähigen Enzym-Rezeptor-Komplex, einen aggregationsfähigen Rezeptor und eine Substratlösung.
7. Mittel nach Anspruch 6, enthaltend einen Komplex aus Peroxidase-Maleimid und anti-Human PMN-Elastase-Antikörper Fab′, einen anti-human α₁-Proteinaseinhibitor IgG oder einen anti-human PMN-Elastase-Antikörper F(ab′)₂ und eine Farbsubstratlösung.
8. Mittel nach Anspruch 6, enthaltend einen Komplex aus Peroxidase-Maleimid und anti-human CK-MM-Antikörper Fab′, einen anti-human CK-BB-Antikörper IgG und eine Farbsubstratlösung.
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WO1993017339A1 (fr) * 1992-02-28 1993-09-02 Thomson-Csf Capteur moleculaire

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