DE3907930C2 - Puffer- und Reagenzsystem für die Trennung von Aminosäuren - Google Patents
Puffer- und Reagenzsystem für die Trennung von AminosäurenInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Puffer- und Reagenzsystem für
die Elution und Trennung von primären und sekundären Aminosäuren
und anderen ninhydrinpositiven Verbindungen am Kationenaustauscher
mit Lithium-, Natrium- oder Kalium- sowie Phosphat-,
Azetat-, Borat- und/oder Formiationen enthaltenden Pufferlösungen,
die sich im pH-Wert und der Molarität unterscheiden und
auf ein ninhydrinhaltiges Reagenz für die Nachsäulenreaktion.
Es eignet sich für die Trennung von Hydrolysat- und physiologischen
Aminosäuren, für verschiedene Amine und Polyamine
und ihre qualitative und quantitative Bestimmung.
1958 veröffentlichte Stein und Moore eine Methode zur Trennung
von Aminosäuren am Kationenaustauscher auf Polystyrolbasis
(S. Moore, D. H. Spackman and W. H. Stein, Anal. Chem., 30,
1185-1206, 1958). Diese Methode ist heute noch gültig:
Eine Aminosäurenprobe wird über ein Probenaufgabesystem der
Kationenaustauschersäule zugeführt. Durch Natrium- oder Lithiumpuffer,
die Citrat-, Formiat-, Azetat-, Borat- oder
Phosphatanionen enthalten (Thomas N. Ferraro and Theodore A.
Hare, Anal. Biochem., 143, 82-94, 1984; LeMaster, David M.,
Richard S., Frederic M., Anal. Biochem., 122(2), 223-227, 1982;
US-35 37 821; DE-OS 22 00 882),
im pH von 2,2 bis 10,5 ansteigend und mit zunehmender Normalität,
können die in der Probe befindlichen Aminosäuren auf der Säule
getrennt werden. Eine anschließende Reaktion mit Ninhydrinreagenz
im Nachsäulenreaktor (auch Coil oder nur Reaktor genannt), damals
ein 30 m langer, im Wasserbad bei 100°C befindlicher, spiralig
aufgewickelter Plastikschlauch, führt zu blau bis braun
aussehenden Verbindungen, die in einem Detektor
bei Wellenlängen von 570 nm und 440 nm quantitativ erfaßt werden.
Die sekundären Aminosäuren bilden braune Reaktionsprodukte, die
bei 440 nm absorbieren während primäre Aminosäuren bei 570 nm
absorbieren. Nach einer Analyse wird die Trennsäule mit einer
stark alkalischen Hydroxidlösung regeneriert.
Um Hydrolysataminosäuren zu trennen, benutzt man ein Natriumpuffersystem.
Physiologische Aminosäuren lassen sich nur mit einem
Lithiumpuffersystem erfolgreich auftrennen.
Viele verschiedene Analysatorsysteme sind beschrieben worden
(US-33 73 872; US-36 49 203).
Ein Funktionsschema zeigt die Abb. 1. Der Aufbau eines
heutigen Aminosäurenanalysators wird in der Abb. 2
wiedergegeben.
Für die Reaktion mit Aminosäuren ist das Reagenz Ninhydrin
bis heute noch im giftigen Methylcellusolve (Ethylenglykolmonomethylether)
gelöst (US-35 37 821), das mit
einem Natrium- oder Lithiumazetatpuffer hoher Molarität im
Verhältnis 2 : 1 bis 3 : 1 gemischt wird. Der Reagenzpuffer mit
pH 5,5 und seiner hohen Molarität soll den sauren oder den
alkalischen pH der für die Trennung benötigten Lösungen auf
pH 5,5 puffern. Der Reagenzpuffer sorgt für den optimalen
pH-Wert der Reaktion mit Ninhydrin.
Zusätzlich wird dem Reagenz eine reduzierende Verbindung
zugemischt, früher Zinn-II-chlorid, heute meistens Titan-III-chlorid,
die das für die Reaktion mit primären und sekundären
Aminogruppen notwendige Verhältnis von reduziertem zu oxidiertem
Ninhydrin einstellt.
Dieses Puffer- und Reagenzsystem wird bis heute in unseren
modernen Aminosäurenanalysatoren in kaum abgewandelter Form
verwendet.
Schwierigkeiten treten dann auf, wenn im Aminosäurenanalysator
Edelstahlteile benutzt werden, wie sie z. B. für Pulsationsdämpfer,
Pumpenköpfe, Drucksensoren, Kapillarverbindungen, Probenaufgabeventile,
Säulenkörper und Rückdruckregler verwendet werden.
Die chlorid- und citrathaltigen Puffer können sehr schnell,
besonders in der Wärme, Edelstahlteile korrodieren und damit
ihre Funktion beeinträchtigen. Die Puffer lösen dabei Schwermetalle
heraus, die den Kationenaustauscher der Trennsäule vergiften.
Das in seiner bisherigen Form recht giftige und unbeständige
Reagenz neigt während der Derivatisierungsreaktion zu Ausfällungen,
die als Oxidschlamm oder schlecht lösliche Produkte den
Reaktor blockieren und die dem Reaktor folgenden Baugruppen
verunreinigen können. Empfindliche quantitative Messungen werden
dadurch eingeschränkt oder unmöglich gemacht.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein nicht aggressives Puffersystem,
das kein Stahl oder Schwermetalle angreift, und ein auf das
Puffersystem abgestimmtes beständiges, weniger giftiges und ohne
störende Rückstände derivatisierendes Nachsäulenreagenz bereitzustellen,
wobei das System in der abgestimmten Kombination die Teile
des Analysators nicht schädigen oder in der Funktion beeinträchtigen.
Die Aufgabe wird im wesentlichen dadurch gelöst, daß die Pufferlösungen
citrat- und chloridfrei sind und das Reagenz in kalium
azetathaltigem, phenolischem Ethylenglykol gelöst ist.
Die Anionen der Puffer greifen Stahlteile nicht an und erhöhen
beträchtlich die Wirkung und Lebensdauer der Stahltrennsäulen und
anderer Stahl- oder Metallteile des Aminosäurenanalysators.
Das erfindungsgemäße Reagenz enthält weniger giftiges Ethylenglykol
und ein Kaliumazetatpuffer, der eine bessere Löslichkeit für
organische Verbindungen zeigt. Phenol als organischer Zusatz
erhöht die Stabilität des Reagenzes und zusätzlich die Löslichkeit
der bei der Derivatisierung gebildeten Produkte. Das eingangs
erwähnte Problem einer möglichen Verstopfung des Reaktors
und der Verunreinigung der Photometerküvette, sowie deren
nachfolgende Teile ist damit gelöst.
Die Erfindung wird im folgenden näher erläutert.
Die Tabelle 1 zeigt als ein Beispiel die Zusammensetzung der
Puffer und des Reagenzes. Die Puffer A bis C sind für die
Trennung von Hydrolysataminosäuren geeignet. Puffer, die physiologische
Aminosäuren am Kationenaustauscher trennen, sind in der
Molarität und im pH-Wert anders eingestellt.
Im folgenden sind die Vorteile und die Wirkung der Erfindung
erklärt.
Die erfindungsgemäßen Puffer setzen sich je nach Anwendungszweck
zusammen aus Formiat-, Azetat- und Phosphatpuffern. Sie besitzen
alle Eigenschaften der üblichen Citratpuffer. Sie sind im pH-Bereich
von pH 2,2 bis 12 einstellbar. Um eine optimale Pufferung
zu erhalten, kommen im Bereich 2,2 bis 3,5 Formiatpuffer, im Bereich
zwischen 3,5 und 5,5 pH Azetatpuffer und im Bereich von
5,5 bis 12 pH Phosphatpuffer zur Anwendung. Der pH-Wert dieser
Puffer wird mit Ameisensäure, Essigsäure, Schwefelsäure,
Phosphorsäure oder je nach Bedarf aus einem Gemisch der genannten
Säuren eingestellt. Es werden keine Chlorid- oder Citratanionen
verwendet. Gegen mikrobielles Wachstum werden die Puffer
geschützt mit Natriumazid oder Octansäure.
Abb. 3 zeigt ein Chromatogramm nach Einsatz des
beanspruchten Puffers.
Benutzt man ein Lithiumpuffersystem, so muß im pH-Bereich zwischen
5,5 und 12 mit Boratazetatpuffern gearbeitet werden, da
Lithiumphosphat schwer löslich ist. Die einzustellenden pH-Werte
der Puffer hängen ab von der Trennaufgabe und den verwendeten
Trennharzen.
Alle für die Aminosäurenanalytik verwendeten erfindungsgemäßen
Puffer enthalten kein Citrat und keine Halogenidionen. Es sind
milde Puffer, die Edelstahlteile des Aminosäurenanalysators nicht
angreifen und nur in unbedeutender Menge Schwermetalle lösen.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil dieser Puffer und des Reagenzes
liegt darin, daß beide in Kombination auch für
Hochdruckflüssigkeitschromatographiekomponenten (HPLC) eingesetzt
werden können, die vorwiegend aus Edelstahlteilen aufgebaut
und mit Edelstahlkapillaren verbunden sind.
Es ist sogar möglich, für den Nachsäulenreaktor eine gewickelte
Edelstahlkapillare zu verwenden, die gegenüber Kunststoffkapillaren
eine wesentlich bessere Wärmeübertragung gewährleistet.
Durch den schnellen Wärmeaustausch kann zudem die Kapillarlänge
verkürzt werden. Das führt zu geringerer Bandenverbreiterung der
von der Kationenaustauschersäule eluierten Aminosäurepeaks. Die
Peaks werden spitzer und höher. Die Nachweisempfindlichkeit z. B.
für Aminosäuren wird dadurch gesteigert. Ein derartiger Reaktor
befindet sich seit zwölf Monaten im Test.
Mit den erfindungsgemäßen Puffern besteht die Möglichkeit
"Puffersprünge" (sprunghaftes Ansteigen der Basislinie),
zwischen zwei unterschiedlich molaren Puffern durch das Verhältnis
Ameisensäure zu Essigsäure im Puffer auszugleichen. Puffersprünge
erschweren die Auswertung eines Aminosäurenchromatogramms
durch den Rechner. Die mit Ameisensäure versetzten Puffer haben
einen unterschiedlichen Brechungsindex zu den mit Essigsäure versetzten
Puffern und die meisten UV-VIS-Detektoren reagieren auf
unterschiedliche Brechungsindizes der die Küvette durchströmenden
Medien. Mehr freie Ameisensäure im Puffer erhöht die Basislinie,
mehr freie Essigsäure erniedrigt die Basislinie. Diese
Ausgleichsmöglichkeit ist bei Anwendung der bisher verwendeten
Citratpuffer nicht gegeben. Das erfindungsgemäße Ninhydrinreagenz
setzt sich zusammen aus 40-50% Kaliumazetatpuffer, 50-40%
Ethylenglykol und 10% Phenol. Der 4N Kaliumazetatpuffer mit pH
5,5 neigt in der Kälte weniger zum Auskristallisieren als der
bisher verwendete Natriumazetatpuffer. Er hat bessere Lösungseigenschaften
für die während der Ninhydrinreaktion gebildeten
organische Stoffe (das Kaliumion hat eine schwächere und leichter
verschiebbare Hydrathülle als das Lithium- oder Natriumion). Das
oben angegebene Mischungsverhältnis zwischen Kaliumazetatpuffer
und Ethylenglykol führt zu einer stärkeren Pufferung bei Zusatz
von Regenierlauge. Der pH des Reagenzes ändert sich nur wenig.
Dadurch bilden sich keine rotbraune oder ähnliche Ausfällungen,
die das Coil verstopfen könnten.
Das für das Reagenz verwendete, ungiftige Ethylenglykol enthält
weniger, bzw. keine Peroxide, die die Haltbarkeit des Reagenzes
einschränken. Die Bildung von viskosen Verbindungen in der Hitze
wie sie mit Methylcellusolve im Reaktor entstehen können, bleiben
aus. Das Ninhydrinreagenz kann über eine längere Zeit im Reaktor
verbleiben, ohne daß Störungen auftreten: ein wesentlicher Vorteil
gegenüber handelsüblichen Ninhydrinreagenzien.
Die Langzeitversuche wurden mit dem Aminosäurenanalysator LC 5001
und LC 3000 über mehrere Tage durchgeführt.
Der Phenolzusatz bewirkt eine bessere Löslichkeit für aromatische
Verbindungen, z. B. für das mit Ninhydrin und Aminosäuren gebildete
blaue Reaktionsprodukt. Eine Überladung der Trennsäule mit ninhydrinpositiven
Verbindungen und deren anschließenden starken
Reaktion mit Reagenz führen nicht mehr zu Ausfällungen der
Reaktionsprodukte im Coil. Reaktor und die Küvette des Photometers
bleiben sauber.
Hydrindantin als Reduktionsmittel führt bei Oxidation des Reagenzes
durch Sauerstoff oder Peroxide nicht zu schwerlöslichen
Oxiden, wie bei Zusatz von Zinn-II-chlorid oder Titan-III-chlorid.
Es wird kein Oxidschlamm gebildet. Reagenzleitungen,
Reaktorcoil und Photometerküvette bleiben sauber.
Geringe Mengen von Hydrazinsulfat stabilisieren das Reagenz und
erhöhen die Haltbarkeit. In verschlossenen Braunglasflaschen ist
das sauerstofffreie Reagenz monatelang haltbar.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß die Erfindung ein
citrat- und chloridfreies Puffer- und Reagenzsystem für die
Trennung von Aminosäuren und anderen ninhydridpositiven
Komponenten am Kationenaustauscher betrifft.
Die Puffer enthalten Formiat-, Azetat- oder Phosphatanionen sowie
deren freie Säuren. Sie enthalten keine Chlorid- oder
Citratanionen. Das Reagenz setzt sich zusammen aus einem
Kaliumazetatpuffer, Ninhydrin, Hydrindantin
und Phenol. Als Lösungsmittel wird Ethylenglykol verwendet.
Das erfindungsgemäße Puffer- und Reagenzsystem erhöht die Lebensdauer
von Aminosäurenanalysatoren dadurch, daß Edelstahlteile
nicht korridieren, in Stahlsäulen gepackte Trennharze nicht vergiftet
und eine Überladung des Reaktors mit Aminosäurenderivaten
wesentlich besser vertragen werden. Ventile sowie Reaktoren
werden durch Oxidschlamm nicht blockiert und die Photometerküvette
sowie die nachfolgenden Bauteile nicht durch Ausfällungen
verschmutzt. Aufgrund dieser Eigenschaften ist das Puffer- und
Reagenzsystem besonders für herkömmliche HPLC-Anlagen geeignet.
| Reagenzzusammensetzungen | |
| 1. Hyd. in EG lösen bei 50°C, ∼1 h | |
| 20 g Ninhydrin | |
| 2. Nin in EG lösen bei 50°C, ∼1 h | 0,6 g Hydrindantin |
| 3. KAc dazu, durch G4 filtrieren | 50 ml Phenol |
| 4. 12 Std. reifen lassen, RT, i. Dunk. | 600 ml Ethylenglykol |
| 5. Phenol dazu, N₂ begasen, bei 4°C im Dunklen lagern | 400 ml Kaliumazetatpuffer |
Alle Lösungen sind durch eine D4-Glasfritte zu filtrieren.
| Abkürzungen: | |
| Na | |
| Natrium | |
| Na₃PO₄ | tert. Natriumphosphat |
| H₃PO₄ | Phosphorsäure |
| Hyd. | Hydrintantin |
| EG | Ethylenglykol |
| KAc | Kaliumazetat |
| RT | Raumtemperatur |
| N₂ | Stickstoff |
Claims (4)
1. Puffer- und Reagenzsystem für die Elution und Trennung von
primären und sekundären Aminosäuren und anderen ninhydrinpositiven
Verbindungen am Kationenaustauscher mit Lithium-,
Natrium- oder Kalium- sowie Phosphat-, Azetat-, Borat-, und/oder
Formiationen enthaltenden Pufferlösungen, die sich im pH-Wert
und der Normalität unterscheiden, und für die anschließende
Nachsäulenreaktion mit einem ninhydrinhaltigen Reagenz,
dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösungen citrat- und
chloridionen frei sind und daß das Reagenz in kaliumazetathaltigem
phenolischem Ethylenglykol gelöst ist.
2. Puffer- und Reagenzsystem nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Pufferlösungen mit Ameisensäure,
Essigsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure oder mit einem
Gemisch der genannten Säuren im pH-Wert eingestellt sind.
3. Puffer- und Reagenzsystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die Pufferlösungen gegen Pilz- und
Bakterienwachstum mit Natriumazid oder Octansäure geschützt
sind.
4. Puffer- und Reagenzsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Reagenzlösung mit einer hydrazinhaltigen
Verbindung gegen Oxidation stabilisiert ist.
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
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