DE3887233T2 - Hemmung von Mineralabsetzung mit Hilfe von polyanionischen/hydrophobischen Peptiden und deren Derivaten. - Google Patents

Hemmung von Mineralabsetzung mit Hilfe von polyanionischen/hydrophobischen Peptiden und deren Derivaten.

Info

Publication number
DE3887233T2
DE3887233T2 DE3887233T DE3887233T DE3887233T2 DE 3887233 T2 DE3887233 T2 DE 3887233T2 DE 3887233 T DE3887233 T DE 3887233T DE 3887233 T DE3887233 T DE 3887233T DE 3887233 T2 DE3887233 T2 DE 3887233T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
ala
compound
compound according
asp
residues
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE3887233T
Other languages
English (en)
Other versions
DE3887233D1 (de
Inventor
Steven C C O Department Sikes
A P Wheeler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of South Alabama
Original Assignee
University of South Alabama
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of South Alabama filed Critical University of South Alabama
Publication of DE3887233D1 publication Critical patent/DE3887233D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3887233T2 publication Critical patent/DE3887233T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/84—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds obtained by reactions otherwise than those involving only carbon-carbon unsaturated bonds
    • A61K8/88—Polyamides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F1/00—Treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F1/50—Treatment of water, waste water, or sewage by addition or application of a germicide or by oligodynamic treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F5/00—Softening water; Preventing scale; Adding scale preventatives or scale removers to water, e.g. adding sequestering agents
    • C02F5/08—Treatment of water with complexing chemicals or other solubilising agents for softening, scale prevention or scale removal, e.g. adding sequestering agents
    • C02F5/10—Treatment of water with complexing chemicals or other solubilising agents for softening, scale prevention or scale removal, e.g. adding sequestering agents using organic substances
    • C02F5/12—Treatment of water with complexing chemicals or other solubilising agents for softening, scale prevention or scale removal, e.g. adding sequestering agents using organic substances containing nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F5/00—Softening water; Preventing scale; Adding scale preventatives or scale removers to water, e.g. adding sequestering agents
    • C02F5/08—Treatment of water with complexing chemicals or other solubilising agents for softening, scale prevention or scale removal, e.g. adding sequestering agents
    • C02F5/10—Treatment of water with complexing chemicals or other solubilising agents for softening, scale prevention or scale removal, e.g. adding sequestering agents using organic substances
    • C02F5/14—Treatment of water with complexing chemicals or other solubilising agents for softening, scale prevention or scale removal, e.g. adding sequestering agents using organic substances containing phosphorus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/02—Treatment of implants to prevent calcification or mineralisation in vivo
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/29—Polyamino acid or polypeptide with an uninterrupted series of peptide repeating units

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Confectionery (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Dental Preparations (AREA)

Description

  • Die Arbeit an der vorliegenden Erfindung wurde teilweise durch Zuschüsse des Alabama Resaerch Institute, der National Science Foundation und der National Oceanic and Atmospheric Administration (Sea Grant) unterstützt.
    • Technisches Gebiet
  • Die Erfindung betrifft neue Peptide und Polypeptide, die als wirkungsvolle Inhibitoren der Mineralbildung, zum Beispiel, der Kristallisation von Calciumcarbonat, Calciumphosphat, Calciumsulfat und anderen fungieren. Diese Materialien sind ebenfalls beim Schutz metallischer Oberflächen vor einer Korrosion nützlich.
    • Technischer Hintergrund
  • Biologische Mineralisation ist in der Natur ein grundlegender Prozeß. Die Bildung von Knochen und Zähnen aus Calciumphosphat und die Bildung von Schalen und Riffen aus Calciumcarbonat sind nur zwei Beispiele dieses Prozesses.
  • Unglücklicherweise treten Mineralablagerungen auch dann auf, wenn sie nicht erwünscht sind. Im Körper können Mineralablagerungen zu Zahnbelag, Verhärtung der Arterien, verschiedenen Organsteinen und dem Versagen prothetischer Vorrichtungen, wie implantierte Herzventile, führen. In Meeresumgebung können die Biomineralstrukturen Probleme verursachen, wie im Falle des Wachstums der Entenmuscheln (barnacles) auf den Rümpfen der Schiffe, die zu einer Extramasse bzw. einem Extravolumen führen und einen Strömungswiderstand erzeugen. In der Industrie bildet sich Wasser- bzw. Kesselstein auf den Oberflächen von Kühltürmen und anderen Vorrichtungen, der deren korrekten Betrieb als Wärmeaustauscher verhindert und oft die lokale Korrosion fördert.
  • Wegen der mit der unerwünschten Mineralablagerung verbundenen Probleme wurde der Suche nach Mineralisations- Inhibitoren, die zur Verhinderung schädlicher Mineralbildung verwendet werden können, große Anstrengungen gewidmet, insbesondere in der Industrie.
  • Moleküle zur Verhinderung der Mineralablagerung reichen von einfachen Ionen wie Mg&spplus;² (Pytkowicz, R.M., J. Geol. 73, 196 - 199 (1965)) und PO&sub4;³&supmin; oder Pyrophosphat (Simkiss, K., Biol. Rev. 39, 487 - 505 (1964)) bis zu komplexeren organischen Materialien. Die Inhibition mittels einfacher Ionen beruht auf der Fähigkeit dieser Ionen, die geordnete Bildung eines Kristallgitters des Minerals, wie CaCO&sub3;, zu beinträchtigen. Außerdem weisen Phosphat und Polyphoshate die Eigenschaft auf, durch Bildung sehr dünner Filme, die die Potentialstellen der Korrosion auf den Oberflächen bedecken, die metallischen Oberflächen zu schützen.
  • Phosphonate wurden gegen Ende der sechziger Jahre dieses Jahrhunderts eingeführt (Ralston, U.S. Patent 3.336.221 (1967)). Es handelt sich dabei um kleine organische Moleküle mit PO&sub3;-Gruppen, die direkt über einer kovalenten Bindung zu dem Phosphor an ein zentrales C-Atom angebracht sind. Die Phosphonate sind sehr wirkungsvolle Inhibitoren der Kristallisation, deren Funktion auf der Adsorption an die Kristalloberflächen beruht. Hydroxyethylidendiphosphonat (HEDP) ist vielleicht das am weitest verbreitete Phosphonat unter den bekannten, stärksten Inhibitoren für die CaCO&sub3;-Bildung Die Verwendung von Phosphonaten ist dennoch mit einigen Nachteilen verbunden. Zum Beispiel können Phosphonate während der Chlorierung zersetzt werden, was zu einer Erhöhung an Phosphat und damit verbundenen Phosphatablagerungen führen kann. Phosphonate können sich auch selbst unter den üblichen Betriebsbedingungen abscheiden. HEDP ist ein außergewöhnlich wirksamer Inhibitor der Kristallkeimbildung auf Gewichtsbasis, wie durch seine Wirkung der Verlängerung der Induktionsdauer vor dem Kristallwachstum gezeigt wird, aber er ist bei der Inhibierung des Kristallwachstums nach dessen Beginn überhaupt nicht mehr wirksam (Sikes und Wheeler, CHEMTECH, im Druck (1987)).
  • In letzter Zeit wurden als Ergebnis kontinuierlicher Anstrengungen zur Identifizierung besserer Inhibitoren Polyacrylate und andere polyanionische Materialien identifiziert (Rohm und Haas Company, Technical Bulletin CS-513A (1985), Fong and Kowalski, U.S. Patent 4.546.156 (1985)). In den achtziger Jahren dieses Jahrhunderts beruhte die Anti-Verkrustungs- bzw. Anti-Kesselsteinbildungs- und Anti-Korrosionstechnologie zunehmend auf der Verwendung synthetischer Polymere unter alkalischen Bedingungen. Der gegenwärtige Trend bei der Wasserbehandlung mit synthetischen Polymeren geht dahin, statistische Copolymere oder -Terpolymere mit alternierenden COO&supmin;-Seitengruppen mit Gruppen wie OH, CH&sub3;, PO&sub3;²&supmin;, SO&sub3;²&supmin; und ähnliches zu verwenden.
  • Ein neuer Ansatz zur Identifizierung von Mineralisations- Inhibitoren wurde von Sikes und Wheeler U.S. Patente 4.534.881 (1985), 4.585.560 (1986) und 4.603.006 (1986) und Wheeler und Sikes, U.S. Patent 4.603.006 (1986) beschrieben. In diesen Patenten wurde beschrieben, daß aus biologischen Mineralien, wie Austernschalen, extrahierte Proteine und Polysaccharide starke Kristallisationsinhibitoren sind. Durch das Studium der Struktur der natürlichen Moleküle, insbesondere der Proteine, wurden Anhaltspunkte bezüglich der chemischen Natur, wie sie für eine Aktivität synthetischer Polyaminosäuren erforderlich ist, erhalten. Darauf aufbauend wurden bestimmte polyanionische Polyaminosäuren, einschließlich statistische Copolymere mit negativ geladenen und nichtionischen Resten als nützliche Inhibitoren identifiziert.
  • Einige andere Patente, die sich auf diese Erfindung beziehen sind die nachstehenden:
  • Gaffar, U.S. Patent 4.339.431 beschreibt Copolymere aus Glutaminsäure und Alanin, die als Anticalculusmittel in Zahnputz- bzw. Zahnreinigungsmitteln oder Mundwassern verwendet werden. Die darin beschriebenen Copolymere sind statistische Copolymere.
  • Segrest et al, U.S. Patent 4.643.988 beschreiben Polypeptide mit einer clusterfreien Anordnung anionischer und hydrophober Aminosäuren, die zur Behandlung von Atherosklerose (vielleicht durch die Verhinderung der Ablagerung bestimmter Mineralien) verwendet werden.
  • Buck, U.S. Patent 4.362.713 beschäftigt sich mit Zusammensetzungen und Verfahren zur Verhinderung der Festsetzung von Zahnbelag auf die Oberfläche von Zähnen durch die Verwendung von Salzen bestimmter Maleinsäure-Copolymere.
  • Trotz der vorstehenden Ansätze das Problem der unerwünschten Mineralablagerung zu lösen, existiert eine große Nachfrage nach neuen und wirkungsvolleren Inhibitoren für die Mineralablagerung, die im Körper, im Meeresbereich oder in der Industrie angewandt werden können.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 Festphasen-Peptidsynthese, anwendbar auf die Herstellung der beanspruchten Peptide und Polypeptide.
  • Fig. 2 Aus einem pH-Drift-Kristallisations-Test erhaltene Daten.
  • Fig. 3 Aus einem Calciumphosphatkristallisations-Test erhaltene Daten.
  • Fig. 4 Aus einem pH-stat-Test (pH-stat assay) erhaltene Daten.
  • Fig. 5 Aus einem CaCO&sub3;-Kristallisation-, Konstantzusammensetzungs-Test erhaltene Daten.
  • Fig. 6 Die Wirkungen der synthetischen Peptide auf die CaCO&sub3;-Kristallisation (CaCO&sub3;-pH-Drift-Test).
  • Fig. 7 Inhibition des CaCO&sub3;-Kristallwachstums mittels synthetischer Peptide; Konstantzusammensetzungs-Impfkristall- Test.
    • Beschreibung der Erfindung
  • Infolgedessen ist es eine Aufgabe der Erfindung neue und verbesserte Materialien zur Inhibierung der Mineralablagerung zur Verfügung zu stellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung Materialien zur Verhinderung der Bildung von Steinen oder Plaque auf den Zähnen zur Verfügung zu stellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung Materialien zur Verfügung zu stellen, die die Mineralisation in einer Meeresumgebung, wie durch die Unterbindung einer Anhäufung von Entenmuscheln, verhindern können.
  • Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung Materialien zur Verfügung zu stellen, die wirksam die Mineralisation auf prothetischen, in den Körper implantierten Vorrichtungen verhindern können.
  • Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung Materialien zur Verhinderung der Mineralisation in Arterien, verbunden mit Arteriosklerose oder Atherosklerose, zur Verfügung zu stellen.
  • Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung Materialien zur Verfügung zu stellen, die die Mineralisation in industriellen Apparaturen, wie die Bildung von Verkrustungen bzw. Kesselstein in Wasseraufbereitungsanlagen, verhindern können.
  • Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung Materialien zur Verfügung zu stellen, die die Korrosion metallischer Oberflächen verhindern können.
  • Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung Verfahren zur Verhinderung der vorstehend erwähnten Typen der Mineralisation zur Verfügung zu stellen.
  • Diese und andere Aufgaben der Erfindung, die nachstehend deutlicher werden, wurden durch die Bereitstellung neuer Polypeptidmaterialien, die an einem Molekülende polyanionisch und am anderen Ende hydrophob sind, gelöst. Diese Materialien weisen die nachstehende allgemeine Formel auf:
  • Poly (X)n poly (Y)m
  • wobei jedes X unabhängig Asparaginsäure, Glutaminsäure, Phosphoserin, Phosphohomoserin, Phosphotyrosin und Phosphothreonin darstellt,
  • und wobei jedes Y unabhängig Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin oder andere nichtpolaren Aminosäurereste darstellt,
  • wobei
  • n 2 bis 60 ist,
  • m 2 bis 60 ist, und
  • n + m ≥ 5 ist,
  • und wobei Poly (X)n bis zu 10% Y-Reste und Poly (Y)m bis zu 10% X-Reste enthalten kann, und Salze davon.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen, die diese Materialien enthalten, wie Zahnputzbzw. -reinigungsmittel und Mundwasser für die orale Anwendung.
  • Eine vollständigere Würdigung der Erfindung und vieler mit ihr verbundener Vorteile ergibt sich einfach durch die Bezugnahme auf die nachstehende detaillierte Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsbeispiele.
    • Beste Art der Ausführung der Erfindung
  • Das Interesse, die chemischen Anforderungen für eine Aktivität als Inhibitor für die Mineralisation besser zu verstehen, veranlaßte die Erfinder neue chemische Strukturen von Polypeptiden zu identifizieren, die auf überraschende Weise die inhibitorische Aktivität vergrößerten. Als Grundlage für diese Arbeit ermittelten die Erfinder ferner die chemische Struktur von Austernschalenproteinen. Sie berücksichtigten auch die Struktur bestimmter Proteine im Speichel, die die Kristallisation inhibierten (Hay, D. I. et al, Inorg. Persp. Biol. Med. 2, 271-285 (1979) und Calcif. Tiss. Int. 40, 125- 132 (1987)).
  • Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind synthetische Polypeptide, die an einem Molekülende in Clusterform vorliegende, polyanionische Aminosäuren und am anderen Ende des Moleküls in Clusterform vorliegende, nichtionische, teilweise hydrophobe Aminosäuren aufweisen. Bevorzugt befinden sich die anionischen Aminosäuren am C-Terminus, wohingegen die nichtionischen Aminosäuren sich am N-Terminus befinden, obwohl eine entgegengesetzte Anordnung ebenfalls in Betracht gezogen wird. Bis zu dieser Erfindung wurde von niemanden bemerkt, daß synthetische Polypeptide mit solch einer Struktur wirkungsvolle Inhibitoren der Mineralisation sein können.
  • Mit der Absicht mit einer Hypothes bezüglich des Mechanismus der Wirkung der beanspruchten Polypeptide keinerlei Einschränkung einzugehen, wird nachstehend ein möglicher Mechanismus ihrer Wirkung gegeben. Die polyanionischen Bereiche könnten sich an Kristallflächen anheften und dort das Wachstum blockieren, während die hydrophoben Bereiche sich von der Oberfläche erstrecken und die Diffusion von Gitterionen zu anderen Wachstumsstellen stören könnten. Auf diese Hypothese wird als die PH- oder Polyanion/hydrophobe-Hypothese Bezug genommen. Sie ist neu vom Standpunkt des Gedankens, daß die Kristallbildung im allgemeinen nicht durch die Diffusion, sondern durch die Geschwindigkeit der Oberflächenreaktionen, in denen die adsorbierten Ionen in die Kristallwachstumsstellen eingebaut werden, begrenzt wird (Nancollas, G. H. und M. M. Reddy, J. Coll. Inter. Sci. 37, 824-830 (1971); Nancollas, G. H., Adv. Coll. Inter. Sci. 10, 215-252 (1979)). Dieser Schluß beruht auf der berechneten Aktivierungsenergie für die CaCO&sub3;- Kristallisation von 11,0 kcal/mol, die für einen diffusionskontrollierten Mechanismus als zu hoch angesehen wird (Howard, J. R. et al, Trans. Faraday Soc. 56.278 (1960)), und auf der beobachteten mangelnden Wirkung der Rührgeschwindigkeit auf die Geschwindigkeit des Wachstums von Impfkristallen (seeded crystalls). Obwohl dies unter bestimmten Bedingungen der Fall sein kann, beobachteten die Erfinder in vielen Kristallisations-Tests, daß das Rühren ziemlich wichtig ist und tatsächlich sorgfältig geregelt werden muß, um eine Reproduzierbarkeit zu erreichen. Sie schlagen vor, daß die Diffusion geschwindigkeitsbeschränkend sein kann. Außerdem legten Studien bezüglich der Wirkung von Polyacrylaten auf die Inhibition der Kristallisation nahe, daß Polymere mit niedrigem Molekulargewicht die größte Wirkung auf Gewichtsbasis aufweisen (Rohm und Haas, vorst. zitiert).
  • Basierend auf der vorstehenden Information stellten die Erfinder die Hypothese auf, daß Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (z. B. 500 - 5000 dalton) mit einer polyanionischen/hydrophoben Anordnung nützliche Eigenschaften als Mineralisationsinhibitoren aufweisen könnten.
  • Von Polypeptiden mit höherem Molekulargewicht (z. B. 5000
  • - 10.000 dalton) mit der vorstehend beschriebenen polyanionischen Cluster-/hydrophoben Clusterstruktur (clustered polyanionic /clustered hydrophobic structure) der Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht wird ebenfalls eine inhibitorische Mineralisations-Aktivität erwartet und daß sie sich mindestens zu einigen der Verwendungszwecke der Polypeptide mit niedrigerem Molekulargewicht eignen. Die für den Zweck der Erfindung aktivsten Materialien sind jedoch, auf Gewichtsbasis, die hier beschriebenen Polypeptide mit niedrigerem Molekulargewicht.
  • Die allgemeine Struktur der Polypeptide der Erfindung ist die nachstehende:
  • Poly (X)n poly (Y)m
  • wobei jedes X unabhängig Asparaginsäure, Glutaminsäure, Phosphoserin, Phosphohomoserin, Phosphotyrosin und Phosphothreonin darstellt,
  • und wobei jedes Y unabhängig Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin oder andere nichtpolaren Aminosäurereste darstellt,
  • wobei
  • n 2 bis 60, bevorzugt 15 - 50,
  • bevorzugter 30 - 50 ist,
  • m 2 bis 60, bevorzugt 3 - 15, bevorzugter 4
  • - 10 ist,
  • n + m ≥ 5, bevorzugt n + m 15 - 80, bevorzugter 15 - 40 ist,
  • und Salze davon.
  • Wie aus der allgemeinen Formel ersichtlich ist, liegen die anionischen Aminosäuren an einem Ende der Aminosäurenkette in Clusterform vor, während die nichtpolaren Aminosäuren an dem anderen Ende in Clusterform vorliegen. Somit sind diese Polypeptide keine statistischen Copolymere, wie sie in einigen der vorstehend diskutierten Quellen vom Stand der Technik beschrieben wurden. In der Formel kann die X-Aminosäure entweder am C-Terminus oder am N-Terminus auftreten. Mit anderen Worten, die Asparaginsäure, Glutaminsäure und weitere Reste können am N-Terminus oder am C-Terminus abgegrenzt sein.
  • Die X-Aminosäuren können entweder gänzlich aus einer aus der X-Gruppe bestehen oder aus einer Kombination der Mitglieder der Gruppe. Gleichermaßen können die Y-Aminosäuren gänzlich aus einer aus der Y-Gruppe bestehen oder aus einer Kombination der Mitglieder der Gruppe. Poly (X) könnte zum Beispiel gänzlich aus phosphorylierten Aminosäuren hergestellt sein.
  • Salze aus einem der vorstehend dargestellten Säurereste, insbesondere Natrium und Kaliumsalze, liegen ebenfalls im Geltungsbereich der Erfindung. Wenn phosphorylierte Aminosäuren in die Verbindungen eingebaut werden, können sie als Salze vorliegen, z. B. Ca&spplus;², Mg&spplus;², di-Na&spplus;, di-K&spplus; und ähnliches. Ferner werden auch Salze der Aminogruppen, wie p- Toluolsulfonat, Acetat und ähnliches, ebenfalls in Betracht gezogen.
  • Peptide, in denen bis zu 10% der (anionischen) X-Reste durch (unpolare) Y-Reste ersetzt sind und umgekehrt liegen ebenfalls innerhalb des Geltungsbereiches der Erfindung. Um diese Möglichkeit aufzuzeigen wird das nachstehende Peptid betrachtet:
  • H&sub2;N-(Ala)&sub1;&sub0;-(Asp)&sub1;&sub0;-OH
  • Die Y-Reste bestehen aus zehn Alaninen. Einer dieser Reste (10%) könnte durch einen anionischen Rest (z. B. Asparagin- oder Glutaminsäure) ersetzt sein. Gleichermaßen bestehen die X-Reste aus zehn Asparaginsäureresten. Einer davon könnte durch eine unpolare Aminosäure (z. B. Alanin, Glycin, Valin etc.) ersetzt sein. Natürlich sind beim Ersetzen der Aminosäuren nur ganze Zahlen möglich.
  • Spezielle bevorzugte Beispiele von Formeln von erfindungsgemäßen Polypeptiden sind die nachstehenden:
  • H&sub2;N-(Asp)n-(Ala)m-OH
  • H&sub2;N-(Ala)m-(Ala)n-OH
  • H&sub2;N-(pSer)n-(Ala)m-OH
  • H&sub2;N-(Ala)m-(pSer)n-OH
  • H&sub2;N-(Glu)n-(Ala)m-OH
  • H&sub2;N-(Ala)m-(Glu)n-OH
  • H&sub2;N-(Ala)m-(Asp)n-(pSer)x-OH
  • H&sub2;N-(Ala)m-(Glu)n-(pSer)x-OH
  • wobei:
  • n = 10 - 60, bevorzugt 15 - 50,
  • m = 2 - 10, bevorzugt 3 - 8,
  • x = 2 - 5, bevorzugt 2 - 3.
  • [pSer = Phosphoserin, das heißt Serin, das an dem Seitenkettenhydroxyl phosphoryliert wurde.
  • In jeder der vorstehenden Formel können einige oder alle Alaninreste durch andere unpolare Aminosäuren, wie Leucin, Isoleucin, Valin und Glycin ersetzt sein. In gleicher Weise können einige oder alle der Asparaginsäurereste durch andere anionische Aminosäuren, wie Glutaminsäure, ersetzt sein, und umgekehrt. Ferner können einige der Glutaminsäure- oder Asparaginsäurereste durch Phosphoserin, Phosphohomoserin, Phosphotyrosin, Phosphothreonin oder andere phosphorylierte Aminosäuren ersetzt sein. Im allgemeinen können Aminosäuren, die eine freie Hydroxylgruppe besitzen an der Hydroxylgruppe phosphoryliert sein. Die Phosphoserine können auch Phosphohomoserine, Phosphotyrosin oder Phosphothreonin sein.
  • Einige spezielle bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind die nachstehenden Verbindungen:
  • H&sub2;N-(Ala)&sub5;-(Asp)&sub1;&sub8;-(p-Ser)&sub2;-OH
  • H&sub2;N-(Ala)&sub5;-(Asp)&sub1;&sub5;-OH
  • H&sub2;N-(Ala)&sub8;-(Asp)&sub4;&sub0;-OH
  • Wie aus der vorstehenden Beschreibung der beanspruchten Verbindungen deutlich wird, fällt eine große Zahl an Polypeptiden unter den Geltungsbereich der Erfindung. Jedem davon ist jedoch das strukturelle Merkmal gemeinsam, daß hydrophobe oder unpolare Aminosäuren in Clusterform an einem Ende des Polypeptids und anionische Aminosäuren in Clusterform an dem anderen Ende des Polypeptids auftreten. Es sind im allgemeinen auch kleine Polypeptide mit 10 - 80 Aminosäureresten, bevorzugt 10 - 60 Aminosäureresten, bevorzugter 20
  • - 50 Aminosäureresten.
    • Herstellungsverfahren
  • Die Produkte der Erfindung können durch beliebig viele der nun verfügbaren Synthesetechniken für einfache und komplexe Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht synthetisiert werden. Allgemein gesprochen schließen diese Techniken eine stufenweise Synthese mittels aufeinanderfolgender Additionen von Aminosäuren unter Herstellung fortschreitend größerer Moleküle ein. Die Aminosäuren werden durch Kondensation zwischen einer Carboxylgruppe einer Aminosäure und der Aminogruppe der anderen Aminosäure unter Bildung einer Peptidbindung miteinander verbunden. Um diese Reaktionen zu steuern, ist es notwendig die Aminogruppe einer Aminosäure und die Carboxylgruppe der anderen zu blockieren. Die Blockierungsgruppen sollten im Hinblick auf ein leichtes Entfernen, ohne Beeinträchtigung der Polypeptide, weder durch Racemisierung noch durch Hydrolyse der gebildeten Peptidbindungen, ausgesucht sein. Bestimmte Aminosäuren weisen zusätzliche funktionelle Gruppen auf, wie die Carboxylgruppen der Asparaginsäure und der Glutaminsäure und die Hydroxylgruppen des Serins, Homoserins und Tyrosins. Es ist üblicherweise notwendig, diese zusätzlichen Gruppen mit einem leicht zu entfernenden Blockierungsmittel zu blockieren, so daß sie die gewünschte Kondensation zur Bildung der Peptidbindungen nicht beeinträchtigen.
  • Es existiert eine große Vielfalt an Verfahren zur Synthese von Polypeptiden, und es wurde ebenfalls eine große Vielfalt an Blockierungsmitteln entworfen. Die meisten dieser Verfahren können auf die Peptide der Erfindung angewandt werden. Das bevorzugte Verfahren zur Synthesse der Peptide ist eine Festphasen-Technik. In diesem Verfahren wird eine Aminosäure an ein Harzteilchen gebunden und das Peptid wird stufenweise durch aufeinanderfolgende Additionen geschützter Aminosäuren an die wachsende Kette erzeugt. Das allgemeine Verfahren ist gut bekannt und wurde in vielen Veröffentlichungen beschrieben, zum Beispiel: Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc. 96, 2986 - 2993, 1964.
  • Ein bevorzugtes Festphasenverfahren wird hier nachstehend beschrieben.
  • Die Peptide wurden unter Verwendung einer automatisierten, wie in Fig. 1 dargestellten, Festphasen-Peptidsynthese hergestellt. Die carboxyterminale Aminosäure wurde mittels eines organischen Verknüpfungsmittels (linker) (PAM, 4-Oxymethylphenylacetamidomethyl), das kovalent an ein unlösliches, mit Divinylbenzol vernetztes Polystyrolharz gebunden war, vorgeladen (preloaded).
  • In diesem bevorzugten Ausführungsbeispiel bestand der C-Terminus der Polypeptide aus Aspartat und der C-terminale Bereich war polyanionisch, mit hydrophoben Resten, die an dem N-Terminus zu den PH-Polypeptiden addiert wurden. Diese Struktur ist das Gegenteil der Struktur verwandter natürlicher Protein-Inhibitoren. Der Grund für diese Orientierung liegt darin, daß eine Aspartat-PAM-Bindung im Vergleich zu den hydrophoben Aminosäuren-PAM-Bindungen einfacher am Ende der Synthese zu spalten ist, was zu höheren Ausbeuten führt. Es ist nicht sehr wahrscheinlich, daß die Positionierung der polyanionischen oder hydrophoben Bereiche an dem C- anstelle des N-Terminus in Bezug auf die Reaktivität etwas ausmacht.
  • Es wurde die t-Boc-Strategie des Schutzes des terminalen Amins angewandt. Die carboxylgruppen-Seitenkette-des Aspartats und das OH des Serins wurden beide mittels O-Benzylgruppen geschützt. Die endgültige Abspaltung des Peptids von dem Harz und die endgültige R-Gruppen-Entschützung wurde unter Verwendung von Flußsäure (HF) oder Trifluormethylsulfonsäure (TFMSA) gemäß eingeführten Verfahren (Bergot, B.J. und S.N. McCurdy, Applied Biosystems Bulletin (1987)) erreicht. Eine automatisierte Peptid-Synthetisiervorrichtung (Applied Biosystems, Modell 430-A) wurde verwendet. Mittels einer Routinesynthese wurden 0,5 mmol Peptid-Harz hergestellt. Die Ausbeute nach der Spaltung und Reinigung betrug ungefähr 60 bis 70%.
  • Die Reinigung erfolgte durch Umkristallisierung der Peptide aus einem organischen Lösungsmittel wie Methylbutylether, anschließendem Lösen der Kristalle in einer kleinen Menge (z. B. 5,0 ml) destillierten Wassers in einem Dialysierschlauch (Grenz- bzw. cut-off-MG 500 dalton), einer Dialyse zur Entfernung der restlichen Lösungsmittel und Lyophilisation. Die Reinheit der Peptide wurde durch Umkehrphasen-Flüssigchromatographie (Varian 5560) unter Verwendung einer C-18 Kolonne und von 0,1%-iger Trifluoressigsäure und Acetonitril als Lösungsmittel, oder durch Gelpermeation unter Verwendung einer Säule für Trennungen zwischen 1000 und 30.000 dalton mit 0,05 M Trishydroxymethylaminomethan (pH 8,0) als der mobilen Phase, geprüft. Dieser Ansatz ergab Peptide mit einer genau bekannten Sequenz und Molekülgröße.
  • Oder aber es können polyanionische/hydrophobe Peptide mit einer ungefähr bekannten Sequenz und Größe mittels der üblichen thermischen Polymerisation des polyanionischen Bereichs und der hydrophoben Bereiche getrennt unter Verwendung R-Gruppen geschützter Aminosäuren hergestellt werden (Melius, P. und J.Y.P. Sheng, Bioorg. Chem. 4, 385 (1975)). Dann können die polyanionischen und hydrophoben Bereiche thermisch verknüpft werden, gefolgt von einer Entschützung der R-Gruppen unter Verwendung von Mitteln zur Abspaltung. Es gibt einige Anhaltspunkte dafür, daß sich ein polyanionisches/hydrophobes Peptid unter thermischen Polymerisationsbedingungen natürlich vereinigen (assemble) kann, ohne die Notwendigkeit einer getrennten Synthese und der folgenden Bindung der beiden Bereiche (Phillips, R.D. und P. Melius, Int. J. Peptide Protein Res. 6, 309 - 319 (1974)).
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Peptidinhibitoren schließt die Einarbeitung von 2 oder mehr Phosphoserinresten an einer beliebigen Stelle in dem polyanionischen Bereich des Moleküls ein. Diese Idee ist mit der bekannten Aktivität einfacher Phosphate und Polyphosphate als Inhibitoren der Kristallisation und der ähnlichen Aktivität der Phosphonate vereinbar. Außerdem legt die Arbeit der Erfinder und neuere Berichte (Hay, D.I et al, Calcif. Tissue Int. 40, 126 - 132 (1987)) nahe, daß die Gegenwart von Phosphoserinresten in natürlichen Proteinen in bedeutender Weise die inhibitorische Aktivität erhöht. Also wurden phosphoserinhaltige Peptide nach dem Verfahren von Riley et al., J. Am. Chem. Soc. 1957, 1373 - 1379 hergestellt.
  • Dieses Verfahren schließt die 2-stündige Derivatisierung von Serinresten nach der Peptidsynthese unter Verwendung von Diphenylphosphochloridat im Verhältnis von X Mol Serin zu X + 1 Mol des Phosphochloridats bei Raumtemperatur und mit Dimethylformamid als Lösungsmittel ein. Es wird so ein Diphenylphosphatester plus ein Polypeptid hergestellt, das aus Ether umkristallisiert werden kann. Der Phosphopeptidester wird dann in 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3; gelöst und die Phenylgruppen durch Reduktion mit einsprudelndem H&sub2;-Gas in Gegenwart eines Platin- oder Palladiumoxidkatalysators entfernt. Das Phosphopeptid wird dann umkristallisiert und gereinigt. Andere nützliche Derivate, zum Beispiel sulfatierte, phosphonierte und sulfonierte Peptide werden ebenfalls in Betracht gezogen. In jedem Fall könnte ein Phosphatanteil bzw. eine -Komponente durch eine Sulfat-, Phosphonat- oder Sulfonatgruppe ersetzt sein.
    • Tests der Aktivität
  • Um die Eignung der erfindungsgemäßen Peptide zur Inhibierung der Mineralisation zu prüfen, wurde eine Anzahl an Tests durchgeführt. Diese Tests schließen die nachstehenden Tests ein:
  • 1. pH-Drift-Test - CaCO&sub3;
  • 2. pH-Drift-Test Calciumphosphat.
  • 3. pH-stat-Test - CaCO&sub3;
  • 4. Konstantzusammensetzungs-Test - CaCO&sub3;.
  • Die nachstehenden Beispiele beschreiben wie diese verschiedenen Tests angewandt wurden, um die Fähigkeit der Polypeptide zur Hemmung der Mineralisation zu messen.
    • BEISPIEL 1: Die pH-Drift-Test - Calciumcarbonat
  • Eine in Bezug auf CaCO&sub3; übersättigte Lösung wird durch getrenntes Pipettieren von 0,3 ml 1,0 M CaCl&sub2;-Dihydrat und 0,6 ml 0,5 M NaHCO&sub3; in 29,1 ml künstliches Meerwasser (0,5 NaCl, 0,011 M KCl) hergestellt. Der Reaktionsbehälter ist ein 50 ml 3-Halsrundkolben, der teilweise in ein thermostatisiertes Wasserbad bei 20ºC eintaucht. Der Reaktionsbehälter ist gegenüber der Atmosphäre verschlossen, um den CO&sub2;-Austausch zu minimieren. Die Reaktion wird durch aufwärtiges Einstellen des pH-Wertes mittels Titration von ul-Mengen an NaOH mit einer Digitalpipette auf einen Wert von 8,3 gestartet. Die Ausgangskonzentrationen betragen jeweils 10 mM an Ca²&spplus; und gelöstem anorganischen Kohlenstoff (DIC). Die Reaktion wird mittels einer pH-Elektrode überwacht und mittels eines Bandstreifens aufgezeichnet.
  • Nach einer Periode mit einem stabilen pH-Wert, während der sich Kristallkeime bilden, beginnt der pH-Wert solange abzusinken bis die Reaktion aufgrund der Verarmung an Reaktanten und wegen des sinkenden pH-Wertes aufhört. Die Reaktion kann durch Berechnungen, die auf dem DIC- Gleichgewicht basieren, quantifiziert werden, um so die Menge der Ablagerung in Bezug auf die Zeit zu ergeben. Aus Fig. 2 ist ersichtlich, daß eine Veränderung des pH-Wertes in einem pH-Bereich von 8,3 bis 7,7 direkt proportional zu einer Veränderung des DIC ist, aber unterhalb eines pH-Werts von 7,7 führt die Pufferwirkung des DIC-Systems zu größeren Änderungen in DIC pro pH-Einheit.
    • BEISPIEL 2: Der pH-Drift-Test - Calciumphosphat
  • Eine in Bezug auf Calciumphosphat übersättigte Lösung wird durch getrenntes Pipettieren von 0,1 ml 1,32 M CaCl&sub2;- Dihydrat und 0,1 ml 0,90 M NaH&sub2;PO&sub4; in 29,8 ml destilliertes Wasser hergestellt. Es werden so Anfangskonzentrationen von 4,4 mM Ca²&spplus; und 3,0 mM gelöstem anorganischen Phosphor (DIP) erhalten. Der Reaktionsbehälter ist ein 50 ml 3-Halsrundkolben, der teilweise in ein thermostatisiertes Wasserbad bei 20ºC eintaucht. Der Reaktionsbehälter ist gegenüber der Atmosphäre verschlossen. Die Reaktion beginnt mit dem Mischen der Reaktanten bei einem Anfangs-pH-Wert von 7,4.
  • Fig. 3 zeigt die aus dieser Testart erhaltenen Daten. Amorphes Calciumphosphat (ACP) bildet sofort Kristallkeime und setzt, wie durch eine leichte Abnahme des pH-Wertes während in etwa der ersten 30 Minuten des Tests angezeigt wird, sein Wachstum langsam fort. Daran anschließend, beginnt sich ACP in Calciumhydroxylapatit (HAP), Ca&sub1;&sub0;(PO&sub4;)&sub6;(OH)&sub2;, wie durch eine ausgeprägte Beschleunigung der abwärtsgerichteten pH-Drift angezeigt wird, umzuwandeln. Die Reaktion hört auf, wenn die Reaktanten verbraucht sind und der pH-Wert abgesunken ist.
    • BEISPIEL 3: Der pH-stat-Test
  • Der nachstehende Test bezieht sich auf Fig. 4.
  • A. Die Wirkung verschiedener mit EDTA aus Austernschalen extrahierter Konzentrationen an löslicher Matrix auf die CaCO&sub3;-Kristallisation wurde in dem pH-stat-Test verglichen. Das Medium bestand aus 25 ml 0,5 M NaCl, 0,01 M KCl und 10 mM DIC mit einem auf 8,5 eingestellten Anfangs-pH-Wert. Der Reaktionsbehälter wurde bei 25ºC thermostatisiert. Um das Kristallwachstum zu starten, wurde CaCl&sub2; bis zu einer Endkonzentration von 10 mM (erster Pfeil) zugegeben. Nach einer anfänglichen Abnahme des pH-Wertes auf 8,3, wahrscheinlich aufgrund von Ionenpaarung, und einer Induktionsperiode von ungefähr 2 Minuten erschienen in der Lösung Kristalle.
  • Das Kristallwachstum ist der Menge an 0,5 M NaOH- Titranten proportional, die erforderlich ist, um während der Gesamtreaktion Ca²&spplus; + HCO&sub3;&supmin; → CaCO&sub3; + H&spplus; einen konstanten pH-Wert aufrechtzuerhalten. Der pH-Wert wurde durch Autotitration konstant gehalten.
  • B. Nachdem die Kristalle einem Äquivalent von 25 umol des Titranten entsprechend gewachsen waren, wurden verschiedene Mengen an Matrix (zweiter Pfeil) zugegeben, die im Bereich von 0,5 ug/ml (a) bis zu einer Endkonzentration von 1,5 ug/ml (d) lagen. Es sei angemerkt, daß die Geschwindigkeit des Kristallwachstums nach der Zugabe der Matrix relativ zu der Kontrollgeschwindigkeit abnahm, wenn die Matrixkonzentration anwuchs, und das Wachstum wurde bei 1,5 ug/ml beendet.
  • C. Um verschiedene Inhibitoren zu vergleichen (zum Beispiel in Tabelle 1) wird die Wachstumsgeschwindigkeit, die unmittelbar auf die Zugabe des Inhibitors folgte, als Prozent der Wachstumsgeschwindigkeit der Kristalle vor der Zugabe des Inhibitors berechnet. Aus der Untersuchung der Wirkungen einer Serie von Konzentrationen kann die Menge an Inhibitor graphisch bestimmt werden, die zur Reduzierung der Kontrollgeschwindigkeit des Kristallwachstums um 50% erforderlich ist.
    • BEISPIEL 4: Der Konstantzusammensetzungs-Test: Die Wirkung von Austernschalenmatrix, Polyaspartat und HEDP auf die Geschwindigkeit des CaCO&sub3;-Kristallwachstums
  • Eine 50 ml-Lösung aus 10 mM CaCl&sub2; und 10 mM gelöstem anorganischen Kohlenstoff (DIC) wurde mittels Digitalpipettierens mit ul-Mengen 1 N NaOH auf einen pH-Wert von 8,34 eingestellt. Die Temperatur wurde bei 20ºC unter Verwendung eines wassergekühlten Reaktionsbehälters und eines thermostatisierten Bades konstant gehalten. Nach einer Zeitdauer von ungefähr 6 Minuten, in der es zur CaCO&sub3;-Kristallkeimbildung kam, begann der pH-Wert nach unten abzusinken, da die Ca²&spplus;- und CO&sub3;&supmin;-Ionen als Festkristalle aus der Lösung entfernt werden. Bei einem pH-Wert von 8,30 wurden Inhibitoren zugegeben, die die pH-Wertdrift für eine bestimmte Zeitdauer stabilisierten. Die Konzentrationen an in den Experimenten verwendeten Inhibitoren wurden wie in Fig. 5 gezeigt so angepaßt, daß die Summe an Stabilisierung oder Inhibierung der Kristallkeimbildung gleich blieb, in diesem Fall ungefähr 2 Stunden. Die für diese Wirkung erforderliche Dosen lagen in Abhängigkeit vom Typ im Bereich von 0,1 bis 0,5 ug/ml an Inhibitor. Wenn die Kristallisation erneut begann, würde der pH-Wert absinken. Er wurde jedoch mittels automatischer Titration von 0,5 M CaCl&sub2; und 0,5 M NaCO&sub3;, aus getrennten, über einer pH-Elektrode mit einem computergestützten Titrimeter verbundene Büretten, auf einen pH-Wert von 8,30 + 0,02 gehalten.
  • Es sei auf die dramatische Beschleunigung der Kristallisationsgeschwindigkeit in Gegenwart von Hydroxyethylidendiphosphonat (HEDP), dem vielleicht am meisten verwendeten CaCO&sub3;-Inhibitor zur Wasseraufbereitung, in Fig. 5 hingewiesen. Diese Wirkung wurde in Gegenwart der Matrix oder des Matrixanalogen während der untersuchten Zeitdauer nicht beobachtet. Diese Ergebnisse weisen auf ziemlich unterschiedliche Wirkungsmechanismen der beiden Klassen von Kristallisationsinhibitoren hin.
    • BEISPIEL 5: Die Wirkungen der synthetischen Peptide auf die CaCO&sub3;-Kristallisation
  • Der Calciumcarbonat-pH-Drift-Test wurde zum Test von drei Peptiden, Peptid 1, 2 und 3 verwendet. Peptid 1 = Poly (Asp)&sub2;&sub0;, Peptid 2 = Poly (Asp-Gly)&sub7;(Ala)&sub6; und Peptid 3 = Poly (Asp)&sub1;&sub5;(Ala)&sub5;. Die Bedingungen des Tests waren: 10 ml Ca, 10 ml gelöster anorganischer Kohlenstoff, 20ºC und 30 ml künstliches Meerwasser (0,5 m NaCl, 0,01 M KCl). Die Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt.
  • Peptid 3, ein PH-Peptid wies eine deutlich erhöhte Inhibition der Kristallkeimbildung, der Bildung neuer Kristalle in Lösung auf. Die Wirkung auf die Kristallkeimbildung zeigt sich an der verlängerten Dauer der Induktionsperiode eines stabilen pH-Wertes vor der Periode des Kristallwachstums, wenn der pH-Wert absinkt. Es wurde in diesem Test keine Wirkung auf das Kristallwachstum (die Größenzunahme der bereits existierenden Kristalle) beobachtet, wie sich durch die Neigung der Schreibspur während der Phase des Kristallwachstums zeigte. Die Aktivität des PH-Peptids wurde mit der eines Polyaspartats mit äquivalenter Kettenlänge (Peptid 1) bei gleicher Dosierung verglichen. Es war ebenfalls interessant, festzustellen, daß ein geordnetes Copolymer aus Aspartat-Glycin mit einem hydrophoben Schwanz aus Alaninresten (Peptid 2) in Bezug zu der Kontrollkurve sehr wenig Aktivität aufweist.
  • Die sich wiederholende Asp-Gly-Anordnung entspricht der Struktur, die basierend auf veröffentlichte Berichte für saure Proteine aus den Schalen von Mollusken vorhergesagt wurde (z. B. Weiner, S., Biochemistry 22, 4139-4145 (1983)).
    • BEISPIEL 6: Inhibition der CaCO&sub3;-Kristallisation durch synthetische Peptide: pH-Drift-Test
  • Ein detaillierterer Vergleich der Wirkungen, wie sie in Beispiel 5 zu sehen waren, wird in Tabelle 1 gegeben. Das PH- Peptid H-(Ala)&sub5;-(Asp)&sub1;&sub5;-OH zeigte die größte Inhibition der Kristallkeimbildung. Unter Verwendung dieses Tests zeigte sich erneut keine deutliche Wirkung auf das Kristallwachstum. Die relative Längen der polyanionischen und hydrophoben Bereiche sind für die inhibitorische Aktivität wichtig, wie durch die gesunkene Aktivität des PH-Peptids H-(Ala)&sub1;&sub0;-(Asp)&sub1;&sub0;-OH gezeigt wird.
  • Die Länge des polyanionischen Bereichs, der die größte Affinität zu den Kristalloberflächen lieferet, fällt in den Bereich von (Asp oder Glu)&sub1;&sub5; bis (Asp oder Glu)&sub6;&sub0;, mit bevorzugten Längen im Bereich (Asp oder Glu)&sub3;&sub0; bis (Asp oder Glu)&sub5;&sub0;. Die bevorzugte Länge des hydrophoben Bereichs fällt in den Bereich von 3 bis 8, z. B. (Ala)&sub3; bis (Ala)&sub8;.
  • Peptide für die basierend auf veröffentlichten Berichten über die Struktur natürlicher inhibitorischer Proteine eine hohe Aktivität vorausgesagt worden war (die letzten 4 Peptide), zeigten in Bezug zu dem Leistungsverhalten des Polyaspartats oder der aktiveren PH-Peptide keine erhöhte Aktivität. Dies vier letzten Peptide sind geordnete Copolymere aus Aspartat, Glycin und Serin, in einem Fall mit einem Polyalaninschwanz. Tabelle 1 INHIBITION DER CaCO&sub3; KRISTALLISATION DURCH SYNTHETISCHE PEPTIDE pH-DRIFT-TEST PEPTID KONZENTRATION INDUKTIONSPERIODE; MIN KRISTALLWACHSTUMS-GESCHW.; pH/MIN KONTROLLE (Polyaspartat)
    • BEISPIEL 7: Inhibition des CaCO&sub3;-Kristallwachstums durch synthetische Peptide: Konstantzusammensetzungs-/Impfkristall- Tests
  • In diesem Test wurden 0,1 ml 10 M CaCl&sub2; und 0,2 ml 0,5 M NaHCO&sub3; zu 49,7 ml künstlichem Meerwasser gegeben. Um die Reaktion zu starten, wurden 0,1 ml einer wäßrigen Aufschlämmung von CaCO&sub3;-Kristallen (Baker Analytical Reagents) dazugegeben und der pH-Wert durch Titration mit u-Litermengen an 1 N NaOH eingestellt. Kristalle beginnen sofort in der Lösung zu wachsen, die 2,0 mM Ca²&spplus; und 1,6 mM gelösten anorganischen Kohlenstoff enthält. Die Reaktion wird wiederum mittels einer mit einer computergestützten Titrationsvorrichtung verbundenen pH-Elektrode überwacht, um den pH-Wert bei 8,50 zu halten. Die Titrationsvorrichtung gibt gleichzeitig 0,1 M CaCl&sub2; und 0,1 M Na&sub2;CO&sub3; (pH-Wert 11,0) ab, um die während des CaCO&sub3;-Kristallwachstums entfernten Ca²+- und CO&sub3;²&supmin;-Ionen zu ersetzen. Somit wird das chemische Potential der Lösung konstant gehalten. Wenn Inhibitoren verwendet werden, werden sie nach der Zugabe des Calciums hinzugefügt. Die in Fig. 7 gezeigten Experimente stellen die Durchschnittsergebnisse von mindestens drei Tests für jedes Molekül dar. Kontrollkurven wurden vor oder nach jeder Reihe experimenteller Kurven ausgeführt. Die Tests zeigen deutlicher die Wirkungen der Inhibitoren auf das Kristallwachstum, da das Wachstum unter konstanten Bedingungen über ausgedehnte Perioden überwacht werden kann. Wirkungen der Inhibitoren auf die Kristallkeimbildung sind in diesem Test andererseits nicht zu beobachten, da es vor dem Kristallwachstum keine Induktionsperiode, während der es zur Kristallkeimbildung kommt, gibt. Umgekehrt eignet sich der pH-Drift-Test am besten zur Messung der Wirkungen auf die Kristallkeimbildung, wie durch die Veränderungen in der Induktionsperiode gezeigt wird. Aber der pH-Drift-Test ist zur Messung des Kristallwachstums nicht gut geeignet, da die Reaktion sich während der Kristallisation wegen der Verarmung an den Reaktanten und der Senkung des pH-Wertes selbst beschränkt.
  • In diesen Experimenten wurden alle Polypeptide zu dem Kristallwachstumsmedium mit einer Dosis von 0,02 ug/ml vor der Zugabe von 2,5 mg CaCO&sub3;-Impfkristallen zugegeben. Eine besondere Wirkung der Zunahme der Inhibition des Kristallwachstums wurde beobachtet, wenn die Länge des Polyalaninschwanzes um 10 Reste verlängert wurde, wobei im Polyaspartatbereich 15 Reste beibehalten wurden. Zu Vergleichszwecken wurden auch Polyaspartatmoleküle mit zunehmenden Kettenlängen getestet.
  • Die Ergebnisse lassen darauf schließen, daß die aktivsten Moleküle auf Gewichtsbasis eine bestimmte Kettenlänge des polyanionischen Bereichs aufweisen müssen, um eine für die Kristalloberflächen optimale Affinität zu liefern. Außerdem ist eine spezielle Kettenlänge des hydrophoben Bereichs erforderlich, vermutlich um eine optimale Bedeckung der Kristalloberfläche, einschließlich der Zone, die die Oberfläche unmittelbar umgibt, zu liefern.
    • BEISPIEL 8: Die Wirkung einiger Inhibitoren auf die Calciumphosphatbildung
  • Die Daten in Tabelle 2 zeigen, daß die inhibitorische Aktivität eines Moleküls gegenüber einer CaCO&sub3;-Kristallisation auch auf die Bildung von Calciumphosphat angewandt werden kann. Sowohl das Austernschalenprotein als auch das Polyaspartat können sowohl die CaCO&sub3;- als auch die Calciumphosphatbildung inhibieren. Die Gegenwart von phosphorylierten Resten in dem Austernschalenprotein vergrößert die inhibitorische Aktivität in Bezug auf die amorphe Calciumphosphat- (ACP) und Apatitbildung.
  • Die Wirkungen anderer Moleküle werden zu Vergleichszwecken gezeigt. Das Phosphino-Carboxylat-Copolymer und das Polymaleat sind Vertreter industrieller Polymere, die zur Zeit zur Verhinderung der Mineralverkrustung in Kühltürmen und anderen Einrichtungen Verwendung finden. Die Phosphonatdiethylentriaminpentamethylenphosphonsäure (DENTPP) ist das wirksamste für die Inhibition der Calciumphosphatbildung bekannte Phosphonat. Das Speichelprotein Statherin ist in einer Gruppe von Speichelproteinen der wirksamste Inhibitor, der die Mineralabscheidung in der Mundhöhle regelt. Tabelle 2 WIRKUNG EINIGER INHIBITOREN AUF DIE CALCIUMPHOSPHAT- BILDUNG INHIBITOR DAUER DER ACP-BILDUNG pH/min ACP-BILDUNG APATIT-BILDUNG Keiner (Kontrolle, Austernschalenmatrix, phosphoryliert, Austernschalenmatrix, dephosphoryliert, Polyaspartat, Phosphinocarboxylatcopolymer, Polymaleat, Phosphonat Statherin ¹Testbedingungen: Ca mit 4,4 mM, gelöster anorganischer Phosphor mit 3,0 mM. Anfangs-pH-Wert: 7,40, 20ºC. ²Die Ergebnisse für die experimentellen Moleküle werden als Durchschnittswerte von mindestens drei Experimenten gegeben. ³Angepaßt an Hay, D.I., E.L. Moreno und D.H. Schlesinger. 1979. Phosphoprotein-inhibitors of calcium phosphate precipitation from salivary secretions. Inorganic Perspectives in Biology and Medicine 2, 271 - 285.
    • BEISPIEL 9: Die Wirkung der Phosphorylierung auf die Inhibition der CaCO&sub3;-Bildung durch die Austernschalenmatrix
  • Der Zweck der Messungen, über die in Tabelle 3 berichtet wird, bestand in der Klärung des Einflusses der Phosphorylierung des Austernschalenproteins auf seine Aktivität in Bezug auf die CaCO&sub3;-Bildung. Es wurde wiederum deutlich, daß die Gegenwart phosphorylierter Reste zu einer deutlich erhöhten inhibitorischen Aktivität führt. Tabelle 3 WIRKUNG DER PHOSPHORYLIERUNG AUF DIE INHIBITION DER CaCO&sub3;- BILDUNG DURCH DIE AUSTERNSCHALENMATRIX² Unbehandelt Gew.-% Teilweise dephosphoryliert Dephosphoryliert ¹Testbedingungen: 10 mM Ca, 10 mM gelöster anorganischer Kohlenstoff, 25 ml künstliches Meerwasser, pH 8,3, pH-stat-Test. ²Das Potein aus der Austernschale wurde durch Auflösen der zerdrückten Schale in 10% EDTA, pH 8,0, gefolgt von einer Isolierung unter Anwendung der Gelpermeation (Sephacryl) löslich gemacht, um eine Fraktion von ungefähr 30.000 dalton zu erhalten, die dann durch Tangentialflußanalyse konzentriert, lyophilisiert und eingefroren wurde. ³Die Dephosphorylierung wurde durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase gemäß Termine, J.D. und K.M. Conn, 1976, Inhibition of apatite formation by phosphorylated metabolites and macromolecules, Calcif. Tiss. Res. 22, 149 - 157 erreicht. Der Phosphor wurde spektralphotometrisch nach Marsh, B.B., 1959, The estimation of inorganic phosphate in the presence of adenosintriphosphat. Biochem. Biophys. Acta 32, 351 - 361, gemessen.
    • Verwendung der beanspruchten Polypeptide
  • Die verschiedenen erfindungsgemäßen Polypeptide können direkt, ohne Zusatz- oder Trägerstoffe, zur Inhibierung der Ablagerung von Mineralien, wie Phosphaten und Carbonaten anorganischen oder biologischen Ursprungs verwendet werden. Die Verwendung für die Inhibition anderer Carbonat-, Phosphat- und Sulfatsalze, z. B. Magnesium- oder Bariumsalze, wird in Betracht gezogen. Die verschiedenen Polypeptide können verwendet werden, indem eine wirksame Menge des Inhibitors zu einer Flüssigkeit gegeben wird, die in Berührung mit einer Oberfläche steht, auf der sich die Ablagerung bilden kann. Dies ist in industriell nützlichen und kommerziell wichtigen Behältern der Fall, z. B. in Kesseln, Rohrleitungen, Entsalzungsaggregaten, Kühltürmen und ähnlichem. Die verschiedenen erfindungsgemäßen Aminosäurepolymere können zu Wasser, wasserhaltigen Flüssigkeiten oder zu anderen Flüssigkeiten in so kleinen Mengen wie 0,01 ng/ml gegeben werden. Die Obergrenze für die Inhibitormenge wird im allgemeinen nur durch seine Löslichkeit in der Flüssigkeit, zu der er hinzugefügt wird, gegeben. Es kann jedoch, wenn die Gegenwart unlöslicher Reste dieser Polymere den industriellen Betrieb nicht beeinträchtigt, wünschenswert sein, diese Inhibitoren in einer Menge zuzusetzen, die größer als diejenige ist, die durch ihre Löslichkeitsgrenze gegeben wird. Ein bevorzugter Bereich der verschiedenen Peptidderivate zur Kontrolle der anorganischen Verkrustung von z. B. Calciumcarbonat liegt bei 10&supmin;&sup4; - 10² ug/ml. Andere bevorzugte Bereiche liegen bei 10&supmin;&sup4; - 0,1 ug/ml und 0,1 - 10² ug/ml der verschiedenen Polymerderivate.
  • Wenn die beanspruchten Inhibitoren wegen ihrer Antifouling-Eigenschaften verwendet werden, um die Inkrustation von pflanzlichen oder tierischen Organismen zu verhindern, können sie in eine Flüssigkeit wie Wasser, wasserhaltigen Flüssigkeiten oder zu nichtwäßrigen Flüssigkeiten gegeben werden, bevorzugt in einer Menge von ungefähr 0,001 - 1,000 ug/ml, obwohl auch größere Mengen verwendet werden können. In diesen Konzentrationen angewandt, finden die Inhibitoren unter anderem Verwendung bei der Verhinderung der Inkrustation von Organismen in, zum Beispiel, Leitungen für fließendes Wasser oder Abwasserleitungen.
  • Die beanspruchten Inhibitoren können auch direkt auf eine Oberfläche aufgebracht werden, bevor diese mit mineralhaltigen Flüssigkeiten in Berührung kommt, z. B. industriellen Behältern, Oberflächen, die mit dem Meer in Berührung kommen, wie diejenigen in Pieren, Schiffen und ähnlichem. Die beanspruchten Inhibitoren können selbst oder in Kombination mit anderen Salzen zur Inhibierung der Ablagerung, Rostschutzmitteln oder ähnlichem und/oder mit einem Träger, direkt auf die freie Oberfläche aufgebracht werden, oder sie können mit anderen Polymeren gemischt werden, die für den Schutz dieser Oberflächen verwendet werden. Eine Vielzahl an Trägern wird für die Anwendung der beanspruchten Inhibitoren in Betracht gezogen. Einige der üblichen Träger schließen wäßrige und nichtwäßrige Flüssigkeiten, Gele, Öle, organische und anorganische Lösungsmittel, komprimierte Gase und ähnliches ein. Es kann jedoch, je nach Bedarf, jeder Träger verwendet werden. Wenn sie alleine in hohen Konzentrationen verwendet werden, können die erfindungsgemäßen Polyaminsäureinhibitoren hochviskos sein und leicht auf eine Oberfläche aufgebracht werden. Nach der Aufbringung der Inhibitoren sollte den Inhibitoren ausreichend Zeit zum Eindringen in die Oberfläche gegeben werden, wie es bei porösen Oberflächenmaterialien, wie Holz, keramischen Werkstoffen und ähnlichem der Fall ist. So wird innerhalb des Materials ein großer Vorrat an den beanspruchten Inhibitoren geschaffen und die Oberfläche kann dann teilweise mit einem einen Überzug bildenden Polymer abgedichtet werden, um die Freisetzung der aktiven Komponente zu verzögern. Oder aber die verschiedenen Polypeptide können unter Bildung einer Suspension mit einem Träger gemischt werden, die auf eine Oberfläche aufgebracht werden kann. Die beanspruchten Inhibitoren können auf jeden Typ von Oberfläche aufgebracht werden, der der Bildung von anorganischen oder biologischen Mineralablagerungen ausgesetzt sein kann. Einige der üblichen Materialien, auf die die beanspruchten Inhibitoren aufgebracht werden können sind Metalle, Hölzer, synthetische Polymere und Copolymere, Glas, keramische Werkstoffe und angestrichene oder anderweitig beschichtete Oberflächen, obwohl auch andere Materialien in Erwägung gezogen werden. Wenn sie in Berührung mit der mineralhaltigen Flüssigkeit kommen werden die Inhibitoren langsam unter der polymeren Deckschicht hervortreten. Die beanspruchten Inhibitoren können ferner in Beimischungen mit dem einen Überzug bildenden Polymer, z. B. Anstrichen oder einem synthetischen Polymer, das zum Schutz von Oberflächen verwendet wird, wie Polyurethane, angewandt werden. Wenn die beanspruchten Inhibitoren in Beimischungen mit einem einen Überzug bildenden polymer verwendet werden, können sie in einer Konzentration zwischen 0,001 - 90%, bezogen auf das Gewicht der Gesamtzusammensetzung, verwendet werden, obwohl auch höhere und niedrigere Konzentrationen in der Erfindung in Betracht gezogen werden. Einige der bevorzugten Konzentrationen liegen bei 1 -75 Gew.-%. Andere bevorzugte Konzentrationen liegen bei 5 - 25, 25 - 50 und 10 - 40 Gewichts-%. Wenn sie auf eine Oberfläche aufgebracht werden, können die beanspruchten Inhibitoren mit einem Träger in Form eines Pulvers, einer Lösung, einer Suspension, eines Gels, eines Öls, eines Aerosols, einer Paste oder eines viskosen Kolloids zubereitet werden.
  • In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung können die beanspruchten Materialien als Inhibitoren einer Zahnstein- und Plaquebildung (darauf wird hier als Schutzmittel gegen Zahnstein (tartar barrier agents) Bezug genommen) für die Verwendung bei Mensch und Tier dienen. In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform der Erfindung können die oralen Zusammensetzungen irgendeine herkömmliche, pharmazeutisch verträgliche Zubereitung für die Mundhygiene umfassen, die eine wirksame Menge eines Anticalculusmittels, wie es hier beschrieben ist, enthält und mit ihr verträglich ist. Solche Zubereitungen schließen zum Beispiel ein: Mundwasser, Spülmittel, Lösungen zum Ausspülen, Abrasiv- und Nichtabrasiv-Zahnreinigungsgele, Gebißreiniger, beschichtete Zahnseide und Beschichtungen für Interdental-Stimulatoren, Kaugummis, Pastillen, Mundsprays (breath fresheners), Schäume und Sprays. Diese Zubereitungen können zur Behandlung von natürlichem oder künstlichem Zahnschmelz oder irgendeinem oral verträglichen Material, das einer Mineralablagerung ausgesetzt ist, angewandt werden. Obwohl die Verwendung beim Menschen bevorzugt ist, ist auch eine Verwendung beim Tier möglich.
  • Die Schutzmittel gegen Zahnstein können in den Zubereitungen in wirksamen Konzentrationen von im allgemeinen im Bereich von ungefähr 0,05 Gew.-% bis zu 30 Gew.-% oder bis zur Verträglichkeitsgrenze mit einem Vehikel anwesend sein. Ein bevorzugter Konzentrationsbereich für die erfindungsgemäßen Zubereitungsmittel liegt bei ungefähr 0,5 bis ungefähr 10 Gewichts-%. Ein bevorzugterer Bereich liegt bei ungefähr 2 bis ungefähr 8 Gewichts-%.
  • Der pH-Wert dieser Zubereitungen sollte zwischen ungefähr pH 5 und 10, bevorzugt zwischen pH 5 und 8, noch bevorzugter zwischen ungefähr 6 und 7,5 liegen. Ein pH-Wert kleiner als 5 ist wegen einer möglichen Verstärkung der Demineralisation des Zahnschmelzes nicht wünschenswert.
  • Geeignete herkömmliche pharmazeutisch verträgliche Vehikel, die mit den Mitteln gegen die Zahnsteinbildung verwendet werden können, um die Zusammensetzungen dieser Erfindung herzustellen, können folgendes umfassen: Wasser, Ethanol, Feuchthalte- bzw. Benetzungsmittel wie Polypropylenglycol, Glycerol und Sorbitol, solche Geliermittel, wie Cellulosederivate, zum Beispiel Methocelcarboxymethylcellulose (CMF 7MF) und Klucel HF, Polyoxypropylen/Polyoxyethylen-Blockcopolymere, zum Beispiel Pluronic F-127, Pluronic F-108, Pluronic P-103, Pluronic P-104, Pluronic P-105 und Pluronic P-123, kolloidale Magnesiumaluminosilicatkomplexe, wie Veegum, und Mittel zur Mucoproteinverdickung, wie Carbopol 934, Gelstabilisatoren, beispielsweise die Siliziumdioxide, zum Beispiel Cab-O-Sil MS, und Polyvinylpyrrolidon, Süßstoffe, beispielsweise Natriumsaccharin und Aspartam, Konservierungsmittel, beispielsweise Zitronensäure, Natriumbenzoat, Cetylpyridiniumchlorid, Kaliumsorbat, Methyl- und Ethyl-PHB-Ester, Detergentien, wie Natriumlaurylsulfat, Natriumcocomonoglyceridsulfonat, Natriumlaurylsarcosinat und Polyoxyethylenisohexadecylether (Arlasolve 200) und genehmigte Farben bzw. Färbemittel und Geschmacksstoffe.
  • Die nachstehenden speziellen Beispiele dienen zur weiteren Darstellung der erfindungsgemäßen Schutzmittelzusammensetzungen gegen Zahnstein.
    • BEISPIEL A - Mundwasserlösung
  • Schutzmittel gegen 0,5 - 2,0% w/w Zahnstein
  • Glycerol (Benetzungsmittel) 6,0
  • Pluronic F-108 1,0
  • Natriumsaccharin (Süßstoff) 0,3
  • Deionisiertes Wasser q.s.
  • Geschmackstoffe 1 0
  • 100,0
    • BEISPIEL B - Mundwasserlösung
  • Schutzmittel gegen 0,5 - 3,0% w/w Zahnstein
  • Ethanol, USP 15,0
  • Pluronic F-108 (Schäumungsmittel) 2,0
  • Glycerol (Benetzungsmittel) 10,0
  • Sorbitol (Benetzungsmittel) 10,0
  • Natriumsaccharin (Süßstoff) 0,2
  • Deionisiertes Wasser q.s.
  • Geschmacksstoffe 0,2
  • 100,0
    • BEISPIEL C - Abrasiv-Zahnreinigungsgel
  • Schutzmittel gegen Zahnstein 2,0 - 10,0% w/w
  • Quarzstaub 55,0
  • Natriumlaurylsulfat (Detergens) 1,5
  • Glycerol (Benetzungsmittel) 10,0
  • Carboxymethylcellulose 2, 0 (Geliermittel)
  • Natriumsaccharin (Süßstoff) 0,2
  • Sorbitol (Benetzungsmittel) 10,0
  • Geschmacksstoffe 1 ,0
  • Deionisiertes Wasser q.s.
  • Konservierungsstoff 0, 05
  • 100,0
    • BEISPIEL D - Kaugummi
  • Schutzmittel gegen 1,0 - 11,0% w/w Zahnstein
  • Gummibestandteil 21 , 3
  • Zucker 48,5 - 58,5
  • Maisstärkesirup (Baume 45) 18,2
  • Geschmacksstoffe Din
  • 100,0
    • BEISPIEL E - Nich-Abrasiv-Zahnreinigungsgel
  • Schutzmittel gegen 0,05 - 30,0% w/w Zahnstein
  • Sorbistat (Konservierungsmittel) 0,15
  • Deionisiertes Wasser q.s.
  • Siliziumdioxid (Gel-Stabilisierer) 1,0
  • Pluronic F-127 (Geliermittel) 20,0
  • Natriumsaccharin 0, 2
  • Geschmacksstoffe 1 5
  • 100,0
  • Zusätzlich zu den vorstehenden Materialien, die in die beanspruchten Zusammensetzungen gegen Zahnsteinbildung eingeschlossen werden können, wird ebenfalls an einem Einschluß eines Protease-Inhibitors zur Verhinderung der Abbaubarkeit der Peptide und Polypeptide durch verschiedene proteolytische Enzyme gedacht.
  • Beispiele solcher Inhibitoren schließen Aprotinin- und Trypsininhibitoren vom Typ I-P, I-S, II-L, II-O, II-S, II-T, III-O und IV-O ein, obwohl auch andere Inhibitoren in den Geltungsbereich dieser Erfindung fallen. Ebenfalls wird, wenn Phosphopeptide verwendet werden, an die Verwendung von Phosphatase-Inhibitoren in Verbindung mit den Polypeptiden gedacht, um eine Dephosphorylierung der Polypeptide zu verhindern oder zu hemmen. Beispiele solcher Phosphatase-Inhibitoren sind Natriumfluorid, Adenosindiphosphat und Vinylether/Maleinsäurepolymere (Gantrez). Die Verwendung anderer Phosphatase-Inhibitoren ist ebenfalls möglich.
  • Die beanspruchten Peptide und Polypeptide könnten auch an Antikörper gebunden sein, insbesondere an diejenigen gegen Löcher verursachenden Bakterien, oder die Antikörper könnten zu der Zusammensetzung gegen Zahnsteinbildung gegeben werden, um die antibakterielle Aktivität zu erhöhen.
  • Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch bei der Behandlung und der Vorbeugung gegen Mineralaufbau in Arterien und Venen, wie bei der Atherosklerose, verwendet werden.
  • In diesem Zusammenhang ist Art der Verabreichung der Polypeptide bevorzugt parenteral, d. h. intravenös, intraperitoneal, intramuskulär oder subkutan, wobei die intravenöse Verabreichung am meisten bevorzugt ist. Sie können alleine verabreicht werden, ohne Trägersubstanz, sie können jedoch auch mit pharmazeutisch verträglichen, nicht-toxischen Trägern verabreicht werden, wobei dessen Anteile durch die Eignung und die chemische Natur des speziellen Trägers festgelegt werden. Für die intravenöse oder intramuskuläre Verabreichung können sie in Form einer sterilen Lösung, die andere gelöste Stoffe enthält, zum Beispiel ausreichend Salzlösung oder Glukose, um die Lösung isotonisch zu machen, verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen Peptide könnten sich, wie Insulin, als durch die Verwendung einer kontinuierlichen Perfusions-Vorrichtung verabreichbar erweisen, wodurch das Verabreichungsverfahren vereinfacht würde.
  • Der Arzt wird die Dosierung festlegen, die in einer bestimmten Situation am geeignetsten ist. Die Dosierung wird allgemein vom Alter und der Größe des Patienten und der Schwere des zu behandelnden Leidens abhängen. Eine normale Dosis wird allgemein im Bereich von 200 - 600 mg pro Tag liegen.
  • Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch zum Imprägnieren prosthetischer Vorrichtungen verwendet werden. Zum Beispiel könnten die erfindungsgemäßen Polypeptide in Matrizen auf Polymerbasis (z. B. ein Copolymer aus Ethylen- Vinylacetat oder ein Silikongummi) zur geregelten Freisetzung von Medikamenten für eine regiospezifische Therapie direkt in den perianularen Bereich der Herzprothese eingearbeitet werden (Levy, R.J. et al., CRC Critical Reviews in Biocompatibility 2, 148 - 187 (1986)). Vorrichtungen zur geregelten Freisetzung, in die ein Phosphonatderivat eingearbeitet worden war, wurden aufgebaut, um dieses Medikament ohne Erschöpfung länger als 30 Jahre zuzuführen. Außerdem könnten auch Ventilspitzen (valve cusps) mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid mittels kovalenter Aldehyd-Aminobindungen vorgeladen werden (preloaded); solch ein Ansatz könnte als primäre Anticalciummaßnahme oder als eine begleitende Maßnahme für die Vorbereitung einer Anti-Mineralisationstherapie mit geregelter Freisetzung nützlich sein.

Claims (19)

1. Polyaminosäureverbindung, die die nachstehende polyanionische Cluster-/nichtionische, teilweise hydrophobe Clusterstruktur aufweist:
Poly (X)n poly (Y)m
wobei jedes X einen unabhängig aus der Gruppe bestehend aus Asparaginsäure, Glutaminsäure, Phosphoserin, Phosphohomoserin, Phosphotyrosin und Phosphothreonin ausgewählten Rest darstellt,
und wobei jedes Y einen unabhängig aus der Gruppe bestehend aus Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin und Glycin ausgewählten Rest darstellt,
wobei
n 2 bis 60,
m 2 bis 60, und
n + m ≥ 5 ist,
und wobei Poly (X)n bis zu 10% Y-Reste und Poly (Y)m bis zu 10% X-Reste enthalten kann, und Salze davon.
2. Verbindung nach Anspruch 1, bei der der erste X-Rest am N-Terminus der Verbindung auftritt und der letzte Y-Rest am C-Terminus der Verbindung auftritt.
3. Verbindung nach Anspruch 1, bei der der erste X-Rest am C-Terminus der Verbindung auftritt und der letzte Y-Rest am N-Terminus der Verbindung auftritt.
4. Verbindung nach Anspruch 1, mit einer Formel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
H&sub2;N-(Asp)n-(Ala)m-OH
H&sub2;N-(Ala)m-(Ala)n-OH
H&sub2;N-(pSer)n-(Ala)m-OH
H&sub2;N-(Ala)m-(pSer)n-OH
H&sub2;N-(Glu)n-(Ala)m-OH
H&sub2;N-(Ala)m-(Glu)n-OH
H&sub2;N-(Ala)m-(Asp)n-(pSer)x-OH und
H&sub2;N-(Ala)m-(Glu)n-(pSer)x-OH
wobei:
n = 10 - 60,
m = 2 - 10, und
x = 2 - 5.
5. Verbindung nach Anspruch 4, dargestellt durch: H&sub2;N-(Ala)&sub5;-(Asp)&sub1;&sub8;-(pSer)&sub2;-OH.
6. Verbindung nach Anspruch 4, dargestellt durch: H&sub2;N-(Ala)&sub5;-(Asp)&sub1;&sub5;-OH.
7. Verbindung nach Anspruch 4, dargestellt durch: H&sub2;N-(Ala)&sub8;-(Asp)&sub4;&sub0;-OH.
8. Verbindung nach Anspruch 1, wobei n = 20 - 40, m = 2 - 8 und die Zahl der phosphorylierten Aminosäuren 0 - 3 beträgt.
9. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Asparaginsäure- und die Glutaminsäurereste in Form der Natrium- oder Kaliumsalze vorliegen.
10. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Phosphoserin-, Phosphohomoserin-, Phosphotyrosin- und Phosphothreoninreste in der Form der Dinatrium-, Dikalium-, Calcium- oder Magnesiumsalze vorliegen.
11. Verfahren zur Inhibierung der Mineralablagerung auf einer Oberfläche, umfassend das Kontaktieren der Oberfläche mit einer zur Inhibierung der Mineralablagerung wirksamen Menge einer Verbindung nach Anspruch 1.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Oberfläche aus Zahnschmelz besteht.
13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Oberfläche zu einer prosthetischen Vorrichtung zur in vivo-Implantation gehört.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die prothetische Vorrichtung ein Herzventil ist.
15. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Verbindung zu einer Flüssigkeit gegeben wird, die in Kontakt mit einem Industriebehälter steht.
16. Verfahren nach Anspruch 11, wobei eine Oberfläche, die üblicherweise mit einer Meeresumgebung in Kontakt steht, mit der Verbindung imprägniert oder beschichtet wird.
17. Zusammensetzung zur Inhibierung der Mineralablagerung auf einer Oberfläche aus Zahnschmelz, umfassend eine zur Inhibierung der Mineralablagerung wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1, in Kombination mit einem oral verträglichen und mit der Verbindung verträglichen Vehikel.
18. Zusammensetzung nach Anspruch 17 in Form einer Mundhygiene-Zubereitung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mundwassern, Mitteln zur Mundspülung, Spüllösungen, Abrasiv-Zahnreinigungsgelen, Nichtabrasiv-Zahnreinigungsgelen, Gebißreinigern, beschichteter Zahnseide, beschichteten Interdental-Stimulatoren, Kaugummis, Pastillen, Mundsprays, Schäumen und Sprays.
19. Wäßrige Lösung, umfassend ein kristallisierbares anorganisches Mineral und eine für die Mineralkristallisation inhibitorische Menge einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei das anorganische Mineral in Abwesenheit der Verbindung kristallisieren würde.
DE3887233T 1987-08-24 1988-08-23 Hemmung von Mineralabsetzung mit Hilfe von polyanionischen/hydrophobischen Peptiden und deren Derivaten. Expired - Fee Related DE3887233T2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/088,247 US4868287A (en) 1987-08-24 1987-08-24 Inhibition of mineral deposition by polyanionic/hydrophobic peptides and derivatives thereof having a clustered block copolymer structure

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3887233D1 DE3887233D1 (de) 1994-03-03
DE3887233T2 true DE3887233T2 (de) 1994-06-09

Family

ID=22210250

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3887233T Expired - Fee Related DE3887233T2 (de) 1987-08-24 1988-08-23 Hemmung von Mineralabsetzung mit Hilfe von polyanionischen/hydrophobischen Peptiden und deren Derivaten.

Country Status (5)

Country Link
US (1) US4868287A (de)
EP (1) EP0305283B1 (de)
JP (1) JP2677623B2 (de)
CA (1) CA1318986C (de)
DE (1) DE3887233T2 (de)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5051401A (en) * 1989-04-07 1991-09-24 University Of South Alabama Inhibition of mineral deposition by phosphorylated and related polyanionic peptides
US5000940A (en) * 1989-05-30 1991-03-19 Nabisco Brands, Inc. Devices, compositions and the like having or containing an inorganic pyrophosphate
US5094870A (en) * 1989-05-30 1992-03-10 Nabisco Brands, Inc. Canine biscuits containing an inorganic pyrophosphate
US5015485A (en) * 1989-05-30 1991-05-14 Nabisco Brands, Inc. Dog biscuits having a coating containing an inorganic pyrophosphate
US5011679A (en) * 1989-05-30 1991-04-30 Nabisco Brands, Inc. Raw hide having a coating containing an inorganic pyrophosphate
US5000943A (en) * 1989-05-30 1991-03-19 Nabisco Brands, Inc. Canine biscuits containing an inorganic pyrophosphate
US5000973A (en) * 1989-05-30 1991-03-19 Nabisco Brands, Inc. Nutritionally-balanced canine biscuits containing an inorganic pyrophosphate
US5114704A (en) * 1989-05-30 1992-05-19 Nabisco Brands, Inc. Raw hide having a coating containing an inorganic pyrophosphate
US5047231A (en) * 1989-05-30 1991-09-10 Nabisco Brands, Inc. Raw hide containing an inorganic pyrophosphate
JPH0338599A (ja) * 1989-07-05 1991-02-19 Calpis Food Ind Co Ltd:The 抗ｈｉｖペプチド及び抗ｈｉｖ修飾ペプチド
US6200499B1 (en) * 1990-02-06 2001-03-13 Solutia Inc. Compositions for corrosion inhibition of ferrous metals
US5328690A (en) * 1991-02-21 1994-07-12 University Of South Alabama Polyamino acid dispersants
US5284936A (en) * 1991-03-29 1994-02-08 University Of South Alabama Polyamino acid superabsorbents
US5260272A (en) * 1991-03-29 1993-11-09 University Of South Alabama Polyanionic polyamino acid inhibitors of mineral deposition and their synthesis
US5120528A (en) * 1991-06-12 1992-06-09 Block Drug Company, Inc. Taste preserving, mild oral hygiene compositions
EP0523776A3 (en) * 1991-07-17 1993-05-26 Unilever N.V. Oral compositions containing a phosphopeptide
US5227154A (en) * 1991-08-22 1993-07-13 The University Of Melbourne Phosphopeptides for the treatment of dental calculus
US5258044A (en) * 1992-01-30 1993-11-02 Etex Corporation Electrophoretic deposition of calcium phosphate material on implants
DE4217847A1 (de) * 1992-05-29 1993-12-02 Basf Ag Verwendung von Kondensaten der Asparaginsäure als Belagsverhinderer bei der Eindampfung von Zuckersäften
DE4221875A1 (de) * 1992-07-03 1994-01-05 Basf Ag Modifizierte Polyasparaginsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
US5266305A (en) * 1992-10-29 1993-11-30 Srchem Incorporated Copolymers of polyamino acids as tartar barrier agents
EP0621300B1 (de) * 1993-04-23 1998-09-30 Rhodia Chimie Polyanhydroasparaginsäure und seine bioabbaubaren Hydrolyseprodukte
GB2294268A (en) 1994-07-07 1996-04-24 Procter & Gamble Bleaching composition for dishwasher use
AU701456B2 (en) * 1994-09-12 1999-01-28 Rohm And Haas Company Method of inhibiting sulfate scale in aqueous systems
US5531934A (en) * 1994-09-12 1996-07-02 Rohm & Haas Company Method of inhibiting corrosion in aqueous systems using poly(amino acids)
DE19517715A1 (de) * 1995-05-13 1996-11-14 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von Polycokondensaten der Asparaginsäure
US5776875A (en) * 1996-07-16 1998-07-07 Nalco Chemical Company Use of biodegradable polymers in preventing scale build-up
DE19709024A1 (de) 1997-03-06 1998-09-10 Bayer Ag Polyasparaginsäure Homo- und Copolymere, ihre biotechnologische Herstellung und Verwendung
US5981691A (en) * 1997-04-23 1999-11-09 University Of South Alabama Imide-free and mixed amide/imide thermal synthesis of polyaspartate
US5908885A (en) * 1997-07-01 1999-06-01 University Of South Alabama Polysuccinimide and polyaspartate as additives to cementitious materials
ATE380568T1 (de) * 1999-03-25 2007-12-15 Cadbury Adams Usa Llc Kaugummi und konfekt zur mundpflege
US6846500B1 (en) 1999-03-25 2005-01-25 Cadbury Adams Usa Llc Oral care chewing gums and method of use
TWI227143B (en) 1999-12-15 2005-02-01 Guo-Jiun Sung In situ gel formation for ophthalmic delivery by combining Pluronic/Carbopol medic composition and its preparing method
GB0018230D0 (en) * 2000-07-26 2000-09-13 Boots Co Plc Dental compositions
US20030191209A1 (en) * 2000-07-26 2003-10-09 Guan Yue Hugh Dental compositions
US6495658B2 (en) 2001-02-06 2002-12-17 Folia, Inc. Comonomer compositions for production of imide-containing polyamino acids
DE102005028460A1 (de) * 2005-06-17 2006-12-28 Basf Ag Verwendung von Alkylenoxideinheiten enthaltenden Copolymeren als Zusatz zu wäßrigen Systemen
CN113603315B (zh) * 2021-08-06 2023-07-11 中建三局第一建设工程有限责任公司 一种基于絮凝反应特性的淤泥脱水工艺

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4339431A (en) * 1980-12-31 1982-07-13 Colgate-Palmolive Company Anticalculus oral composition
NZ199891A (en) * 1981-03-04 1985-07-31 Univ Melbourne Caries-inhibiting compositions containing casein or x-s-casein or phosuitin
US4534881A (en) * 1983-12-19 1985-08-13 University Of South Alabama Inhibition of inorganic or biological CaCO3 deposition by poly amino acid derivatives
US4585560A (en) * 1983-12-19 1986-04-29 University Of South Alabama, A Public Body Corporate Inhibition of inorganic and biological CaCO3 deposition by a polysaccharide fraction obtained from CaCO3 -forming organisms
US4587021A (en) * 1983-12-19 1986-05-06 University Of South Alabama Inhibition of the formation of inorganic or biological CaCO3 -containing deposits by a proteinaceous fraction obtained from CaCO3 -forming organisms
US4603006A (en) * 1983-12-19 1986-07-29 University Of South Alabama Inhibition of inorganic or biological CaCO3 deposition by synthetic polysaccharide derivatives
US4643988A (en) * 1984-05-15 1987-02-17 Research Corporation Amphipathic peptides

Also Published As

Publication number Publication date
EP0305283A2 (de) 1989-03-01
DE3887233D1 (de) 1994-03-03
EP0305283B1 (de) 1994-01-19
JPH01125400A (ja) 1989-05-17
CA1318986C (en) 1993-06-08
US4868287A (en) 1989-09-19
JP2677623B2 (ja) 1997-11-17
EP0305283A3 (en) 1990-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3887233T2 (de) Hemmung von Mineralabsetzung mit Hilfe von polyanionischen/hydrophobischen Peptiden und deren Derivaten.
US5051401A (en) Inhibition of mineral deposition by phosphorylated and related polyanionic peptides
US4866161A (en) Inhibition of tartar deposition by polyanionic/hydrophobic peptides and derivatives thereof which have a clustered block copolymer structure
US5066487A (en) Antisudoral composition comprising dibasic aluminium salts of acylated amino acids
Nancollas et al. Calculus formation and inhibition
GB1579974A (en) Anti-caries composition
US5648082A (en) Polyamino acid dispersants
JP2004231665A (ja) 歯石処理用ホスホペプチド
US5260272A (en) Polyanionic polyamino acid inhibitors of mineral deposition and their synthesis
JPH02117612A (ja) 歯科用抗加水分解剤
US4587021A (en) Inhibition of the formation of inorganic or biological CaCO3 -containing deposits by a proteinaceous fraction obtained from CaCO3 -forming organisms
EP0453018B1 (de) Poly-(alpha-Hydroxyakrylsäure) und Derivate als zahnsteinverhindernde Wirkstoffe in oralen Zusammensetzungen
DE69030747T2 (de) Hemmung von Mineralabsetzung mit Hilfe von phosphorylierten und ähnlichen polyanionischen Peptiden
US4143128A (en) Oral compositions for calculus retardation
US4144324A (en) Oral compositions for calculus retardation
DE2265735C3 (de) Mittel zur Verhütung von Zahnstein
CH651204A5 (de) Mittel zur foerderung der mundhygiene.
JPH05930A (ja) 口腔用組成物
WO1994009751A1 (en) Copolymers of polyamino acids as tartar barrier agents
SE456403B (sv) Medel for hemmande av tandsten innehallande en alkylendiamintetra-(metylenfosfonsyra) eller ett salt derav
EP0428493B1 (de) Zinktripolyphosphatverbindungen als Wirkstoffe gegen Zahnstein und Zahnbeläge
US3639571A (en) Composition and method for retarding plaque and dental calculus
RU94018525A (ru) Замещенные 2-гидрокси-3[1-(1н-имидазол-4-ил)алкил]-бензолкарбоксимидамиды, способы их получения и фармацевтическая композиция на их основе
Amjad et al. The remineralization of fluoride-treated bovine enamel surfaces
EP0154886A3 (de) Carboxyalkyldipeptidderivate, Verfahren zu deren Herstellung, diese enthaltende Mittel und deren Verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee