DE3877625T2 - Verfahren zum verhindern bakterieller verderbnis und zusammensetzung dafuer. - Google Patents

Verfahren zum verhindern bakterieller verderbnis und zusammensetzung dafuer.

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DE3877625T2 DE8888101624T DE3877625T DE3877625T2 DE 3877625 T2 DE3877625 T2 DE 3877625T2 DE 8888101624 T DE8888101624 T DE 8888101624T DE 3877625 T DE3877625 T DE 3877625T DE 3877625 T2 DE3877625 T2 DE 3877625T2
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG (1) Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Bakteriocins in einem Nahrungsmittelsystem, um die bakterielle Verderbnis durch gram-positive Bakterien, insbesondere Lactobacillen, zu inhibieren. Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Verwendung des von Pediococcus acidilactici NRRL-B-18050 (PAC1.0) erzeugten Bakteriocins in dem System, insbesondere in einer gekühlten Salatsoße.
    • (2) Stand der Technik
  • Die Pediococcen sind eine Gruppe gram-positiver homofermentativer Milchsäurebakterien, von denen bekannt ist, daß sie Bakteriocin, eine Milchsäure produzierende Bakterien inhibierende Substanz, erzeugen. Diese Organismen werden als Saprophyten auf pflanzlichem Material gefunden (Mundt, J.O., W.G. Beattie, und F.R. Weiland, J. Bacteriol. 98:938-942 (1969)). Pediococcen sind kommerziell für die Fermentation von Pflanzen (Pederson, C.S. Bacteriol. Rev. 13:225-232 (1949)) und Fleisch (Diebel, R.H., G.D. Wilson, und C.F. Niven, Jr., Appl. Microbiol. 9:239-243 (1961) und Smith, J.L. und S.A. Palumbo, J. Food Prot. 46:997-1006 (1983)) bedeutsam. Von einem Filtrat, das aus einem zellfreien Kulturmedium erhalten wurde, aus dem eine Kultur nicht-pathogener Organismen der Familie Lactobacteriaceae entfernt worden war, ist gezeigt worden, daß es die Farbe von geräuchertem Fleisch stabilisiert (US-Patent 3 258 344).
  • Im Stand der Technik ist die Gegenwart von Plasmid-DNA in Pediococcen gezeigt worden (Gonzales, C.F. und B.S. Kunka, Appl. Environ. Microbiol. 46:81-89; und Gonzales, C.F. und B.S. Kunka, Appl. Environ. Microbiol. 51:105-109 (1986); Daeschel, M. und T.R. Klaenhammer, Appl. Environ. Microbiol. 50:1538-1541 (1985); Graham, D.C. und L.L. McKay, Appl. Environ. Microbiol. 50:532-534 (1985)). Im Stand der Technik ist auch ein Zusammenhang zwischen dem Bakteriocin und der Plasmid-DNA in Stämmen von Pediococcus pentosaceus bzw. Pediococcus cerevisiae gezeigt worden (Daeschel, M. und T. R. Klaenhammer, Appl. Environ. Microbiol. 50:1538-1541 (1985); und Graham, D.C. und L.L. McKay, Appl. Environ. Microbiol. 50:532-534 (1985)). Im Stand der Technik gibt es keinen Hinweis auf die Verwendung von Bakteriocin in Nahrungsmittelsystemen, insbesondere Salatsoßen und Nahrungsmitteln, die diese enthalten.
    • AUFGABEN
  • Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Bakteriocin in einem Nahrungsmittelsystem zur Inhibition der bakteriellen Verderbnis durch gram-positive Bakterien, insbesondere Lactobacillen, bereitzustellen. Weiter ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein preiswertes und effizientes Verfahren zum Inhibieren dieser bakteriellen Verderbnis in Nahrungsmittelsystemen unter Verwendung des Bakteriocins bereitzustellen. Diese und andere Aufgaben werden durch Bezugnahme auf die folgende Beschreibung und die Zeichnungen zunehmend offensichtlich werden.
    • Figurenbeschreibung
  • Figur 1 ist eine Linienzeichnung von Agarosegelelektrophorese-Plasmidprofilen ausgewählter Stämme vom Pediococcus acidilactici.
    • Allgemeine Beschreibung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Inhibieren der bakteriellen Verderbnis durch grampositive Bakterien in einem Nahrungsmittelsystem, das umfaßt: das Zufügen eines Bakteriocins zu dem Nahrungsmittelsystem in einer wirksamen Menge, die die bakterielle Verderbnis verhindert, wobei das Bakteriocin von einem Pediococcus stammt, der das Bakteriocin produziert.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine Zusammensetzung, die ein Nahrungsmittelsystem umfaßt, das durch gram-positive Bakterien verdorben worden ist; und ein aus Zellen eines Pediococcus, der das Bakteriocin produziert, stammendes Bakteriocin, wobei die Zusammensetzung eine Menge des Bakteriocins von zwischen ungefähr 10 und 100000 Arbeitseinheiten (AU) des Bakteriocins pro Gramm der Flüssigkeit enthält, die ausreicht, um die Verderbnis durch gram-positive Bakterien zu inhibieren, und die voll von lebenden Zellen des Pediococcus ist.
  • Das erfindungsgemäß bevorzugte Bakteriocin wird von Pediococcus acidilactici NRRL-B-18050 erzeugt, der beim Northern Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois, hinterlegt ist und hier auch als PAC1.0 bekannt ist. Pediococcus acidilactici ist ein kommerziell verfügbarer Stamm, der bei der Fleischfermentation verwendet wird. Dieser Stamm enthält ein 6,2 MDa-Plasmid, das für das Bakteriocin kodiert.
  • Das einfachste Verfahren, das Bakteriocin bereitzustellen, ist es, das Wachstumsmedium nach dem Zellwachstum zur Herstellung eines Pulvers zu trocknen. Das Bakteriocin ist ein Protein-artiges Material und kann vom Wachstumsmedium durch Präzipitation oder andere gut bekannte Verfahren, beispielsweise Umkehrosmose, abgetrennt werden.
  • Das Bakteriocin wird in einem Nahrungsmittelsystem bevorzugt in einer Menge von zwischen 10 und 100000 Arbeitseinheiten (AU) des Bakteriocins pro Gramm des Nahrungsmittels verwendet. Eine Arbeitseinheit eines Bakteriocins ist definiert als 5 Mikroliter der höchsten Verdünnung des Kulturüberstandes, der zu einer definierten Wachstumsinhibitionszone auf einem Rasen eines Indikatorstammes eines gram-positiven Bakteriums auf einer Agarplatte führt (P. pentosaceus FBB-63, früher bekannt als Pediococcus cerevisiae FBB-63)
  • So wie er hier verwendet wird, umfaßt der Ausdruck "Nahrungsmittelsystem" Salatsoßen und Krautsalat, Makkaronisalat, Kartoffelsalat und andere pflanzliche Mischungen, die Salatsoßen enthalten. Weiter umfaßt es jedes Nahrungsmittel, das durch Lactobacillen verdorben werden kann. Gewöhnlich werden die Nahrungsmittel bei 2ºC bis 18ºC gekühlt. Der Ausdruck "Verderbnis" bedeutet (1) die Verminderung wünschenswerter organoleptischer Eigenschaften und kann aus überschüssigen Mengen von Milchsäure, Verbindungen wie z.B. Essigsäure, Diacetyl und anderen nicht erwünschten Geschmacksverbindungen bestehen;
  • (2) die Produktion von Gas (CO&sub2;); (3) Proteolyse und (4) Schleim. Das Nahrungsmittel sieht schlecht aus und riecht schlecht.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Die folgende Diskussion und Beispiel 1 zeigen die Produktion und das Testen des bevorzugten Bakteriocins und dann die Verwendung des Bakteriocins in Salatsoßen.
    • Bakterielle Stämme und Medien
  • Die bakteriellen Stämme sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Kohlenhydratfermentation wurde, wie früher beschrieben, unter Verwendung des BM-Mediums bestimmt (Gonzales, C.F., und B.S. Kunka, Appl. Environ. Microbiol. 46:81-89 (1983)). Tabelle 1 In der Studie verwendete Stämme Stamm vorhandene(s) Plasmid(e) (MDa) relevanter Phänotyp Kommentar od. Referenz Pediococcus acidilactici
  • Abkürzungen: Suc&spplus; - Fähigkeit, Saccharose zu fermentieren; Bac&spplus; - Fähigkeit, das Bakteriocin PA-1 zu produzieren; (-) - Verlust des angegebenen Phänotyps.
    • Plasmidisolierung und -reinigung
  • Plasmid-DNA wurde isoliert und die DNA-Proben einer Agarosegelelektrophorese unterworfen, wie zuvor beschrieben. Referenzplasmid-DNA wurde hergestellt, wie zuvor beschrieben (Gonzales, C.F., und B.S. Kunka, Appl. Environ. Microbiol. 46:81-89 (1983)).
    • Curing-Untersuchungen (Untersuchungen zum Verlust der Plasmide)
  • Die Stabilität Plasmid-kodierter Merkmale und die Elimination von Plasmid-DNA durch Wachstum bei erhöhten Temperaturen wurde mit zuvor beschriebenen Verfahren erreicht (Gonzales, C.F., und B.S. Kunka, Appl. Environ. Microbiol. 46:81-89 (1983)). In den Curing-Experimenten zu verwendender PAC1.0 wurde auf BM-Saccharose ausgestrichen. Eine einzelne Säure produzierende Kolonie wurde dann zur Verwendung im Curing-Experiment übertragen. Zum Induzieren des Verlustes (curing) des Bakteriocin erzeugenden Phänotypes (Bac&spplus;) wurden einzelne Kolonien von einer Platte genommen, die ausgestrichen worden war, um einzelne Kolonien zu erhalten, und auf Duplikatplatten ausgestrichen. Isolierte Kolonien, die auf Testplatten ausgestrichen worden waren, wurden auf den Bac&spplus;-Phänotyp unter Verwendung von im folgenden beschriebenen Verfahren durchmustert. Die Duplikatplatte wurde als Vorratsquelle für das Inokulum für Curing-Experimente verwendet. Curing wurde durch 18 stündiges Wachsenlassen der Zellen bei 45, 47 und 50ºC erreicht.
    • Bakteriocintest
  • Die Produktion von Bakteriocin wurde getestet, indem Zellen auf MRS-Agar (Difco, Detroit, Michigan) getropft wurden und bei 35ºC 18 h inkubiert wurden. Die Testplatten wurden 30 min Chloroformdämpfen ausgesetzt, um die Zellen abzutöten, und mit Weichagar (0,75%), der mit Indikatorzellen besiedelt war, überschichtet. Die Platten wurden bei 32ºC 18 h inkubiert. Die Isolate, die eine klare Inhibitionszone erzeugten, wurden als Bakteriocin produzierend angesehen.
    • Partielle Reinigung des Bakteriocins
  • Vier Liter mit 1% einer im gleichen Medium gewachsenen 8h-Kultur des Stammes PAC1.0 (optische Dichte bei 600 nm: 0,60) inokulierte MRS-Nährbrühe (Difco) wurden bei 35ºC 18 h statisch inkubiert. Nach den 18 h wurde der pH der Kultur bestimmt und auf pH 6,0 eingestellt. Die Zellen wurden durch 15 min Zentrifugation mit 16300 x g bei 5ºC entfernt. Der Überstand wurde durch einen 0,45 um Filter (Millipore Corp., Bedford, Mass.) filtriert. Der filtrierte Überstand wurde auf Bakteriocinaktivität durch Auftropfen von 5 ul einer fortlaufenden Zweifach-Verdünnungsreihe auf MRS-Platten getestet, die mit mit Indikatorzellen besiedelten Weichagar überschichtet worden waren. Die Testplatten wurden bei 32ºC inkubiert. Der Indikatorstamm war P. cerevisiae FBB63 (Graham, D.C. und L.L. McKay, Appl. Environ. Microbiol. 50:532-534 (1985)), der unter Verwendung von Kohlenhydrat-Verwendungsmustern und Temperatur-Wachstums-Charakteristika als P. pentosaceus reidentifiziert ist, wie von Garvie (Garvie, E., Int. J. Syst. Bacteriol. 24:301-306 (1974)) beschrieben. Der Indikatorstamm ist ebenfalls ein Bakteriocinproduzent, der relativ ineffektiv ist. Eine Arbeitseinheit (AU) des Bakteriocins wurde als 5 ul der höchsten Verdünnung des Kulturüberstandes definiert, die eine definierte Wachstums-Inhibitionszone auf dem Indikatorrasen erzeugte, wie zuvor diskutiert. Der Titer des Extraktes wurde als der Kehrwert der höchsten Verdünnung, die eine Inhibition zeigte, ausgedrückt.
  • Dem filtrierten Überstand wurde bei 5ºC Ammoniumsulfat (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) bis 60% (w/v) Sättigung zugefügt. Nach 18 h sanften Rührens wurde das Präzipitat durch 20 min Zentrifugation mit 16300 x g bei 5ºC gesammelt. Das Präzipitat wurde in 80 ml 0,05 M Tris- Maleat (Sigma) Puffer pH 6,5 rekonstituiert und getitert. Das rekonstituierte Präzipitat wurde zentrifugiert, um partikuläres Material zu entfernen. Der Überstand wurde filtriert und dann gegen 0,05 M Tris-Maleatpuffer bei 5ºC unter Verwendung eines Spectrapor Nr. 1 Membranschlauches dialysiert (Spectrum Medical Industries, Inc., Los Angeles, Calif.). Das dialysierte Material wurde auf Aktivität getitert, um die Rückgewinnung der Aktivität zu bestimmen. Das partiell gereinigte Bakteriocin wurde für die Untersuchung verwendet und als Bakteriocin PA-1 charakterisiert.
    • Wirkungen der Wärmebehandlung und Enzyme
  • Eine partiell gereinigte Probe von Bakteriocin PA-1 (6400 AU/ml) wurde auf Thermostabilität und enzymatische Effekte auf die Aktivität untersucht. Das Bakteriocin wurde mit jedem Enzym bei einer Endkonzentration von 500 ug/ml 60 min inkubiert. Die Inkubation in Gegenwart von α-Chymotrypsin und Trypsin wurde bei 25ºC durchgeführt, alle anderen Enzym-Bakteriocin-Mischungen wurden bei 37ºC inkubiert. Die Inaktivierung der Enzyme wurde durch 3 min Kochen erreicht.
  • Die Temperaturstabilität des Bakteriocins wurde beurteilt, indem eine Bakteriocinlösung 60 min auf 80ºC, 3 und 10 min auf 100ºC und 15 min auf 121ºC erwärmt wurde. Nach jeder Behandlung wurden die Bakteriocinproben auf den Bakteriocintiter getestet.
    • Enzyme
  • Alle Enzyme wurden von Sigma Chemical Co. bezogen. α-Chymotrypsin (Typ II, 47 E/mg) und Lipase (Typ 1, 8,6 E/mg) wurden in 0,05 M Tris-hydrochlorid (pH 8,0) mit 0,01 M CaCl&sub2; gelöst; Protease (Typ V, 1 E/mg), Lysozym (Grad 1, 41400 E/mg), Papain (Typ III, 109 E/mg) und Trypsin (Typ IX, 15000 E/mg) wurden in 0,05 M Tris-hydrochlorid pH 8,0 gelöst; Pepsin (3200 E/mg) wurde in 0,2 M Citratpuffer (pH 6,0) gelöst; Phospholipase C (Typ I, 10 E/mg) wurde in 0,05 M Tris-hydrochlorid (pH 7,10), enthaltend 0,01 M CaCl&sub2;, gelöst.
    • pH-Stabilität der Aktivität
  • 1 ml partiell gereinigtes PA-1 wurde gegen Puffer verschiedener pH's dialysiert. Die Bakteriocinlösung (6400 AU/ml) wurde 18 h bei zweimaligem Wechsel gegen 0,05 M Glycin-hydrochloridpuffer pH 2,0, 0,05 M Citratpuffer pH 3-6, 0,05 M Tris-hydrochlorid pH 7-9 und 0,05 M Carbonat- Bicarbonatpuffer pH 10-11 dialysiert. Nach der Dialyse wurden die Schlauchinhalte auf Aktivität getestet.
    • Adsorptionsstudien
  • Die Adsorption von Bakteriocin PA-1 an sensitive und resistente Zellen wurde durch Verfahren erreicht, die den von Barefoot und Klaenhammer (Barefoot, S.F., und T.R. Klaenhammer, Appl. Environ. Microbiol. 45:1808-1815 (1983)) beschriebenen ähnlich waren. Zellen aus Übernacht-MRS (Difco)-Nährmediumkulturen wurden in 25 ml frischer Nährbrühe subkultiviert und bis zu einer Konzentration von 10&sup8; CFU/ml wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, 2 mal in 0,05 M Tris-Maleat pH 6,5 gewaschen und in 0,5 ml des gleichen Puffers, enthaltend 200 AU Bakteriocin/ml, resuspendiert. Die Mischung wurde 1 h auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt, gefolgt von Filtration durch 0,22 Mikroporen-Filter (Millipor). Der Titer der Aktivität im zellfreien Filtrat wurde bestimmt. Kontrollen umfaßten die Inkubation des Bakteriocins PA-1 ohne Zellen und Zellen ohne Zusatz von Bakteriocin PA-1.
    • Plasmid-assoziierte Phänotypen
  • Figur 1 zeigt eine Agarosegelelektrophorese von CsCl- Ethidiumbromid-gereinigter Plasmid-DNA aus P. acidilactici PAC1.0 und davon abgeleiteten Stämmen. Die Elektrophorese der DNA wurde in 0,7% Agarose mit 100 V 2 h durchgeführt. (A) Escherichia coli V517 (die Banden sind von oben nach unten angegeben) 35,8, 4,8, 3,7, 3,4, 2,6, 2,0, 1,8 und 1,4 MDa kovalent geschlossene zirkuläre (ccc) DNA. (B) PAC1.0 Suc&spplus;, Bac&spplus;; (C) PAC1.14 Suc&spplus;, Bac&supmin;; (D) PAC1.17 Suc&supmin;, Bac&spplus;. Die Molekularmasse von P. acidilactici Plasmid-DNA ist in Tabelle 1 gezeigt. Die Molekularmasse von Standard-Plasmid-DNA ist angegeben.
  • Von P. acidilactici PAC1.0 ist zuvor berichtet worden (Gonzales, C.F., und B.S. Kunka, Appl. Environ. Microbiol. 46:81-89 (1983)), daß darin zwei Plasmide von 23 und 6,2 MDa enthalten sind, die als pSRQ10 bzw. pSRQ11 bezeichnet worden sind (Figur 1, Spur B). Der Stamm PAC1.0 exprimiert einen Saccharose-fermentierenden (Suc&spplus;)-Phänotyp und erzeugt ein Bakteriocin. Der Effekt des Wachstums bei erhöhten Temperaturen auf die Stabilität des Suc&spplus;-Phänotyps wurde untersucht, indem PAC1.0 bei 45, 47 und 50ºC wachsen gelassen wurde. Einzelne Kolonien, die aus jeder dieser Behandlungen erhalten worden waren, wurden auf den (Suc&spplus;)-Phänotyp untersucht. Saccharose nicht-fermentierende (Suc&supmin;)-Segreganten wurden mit Frequenzen von 1,1 +/- 0,1, 1,4 +/- 0,1 und 4,7 +/- 0,02% bei Wachstum bei 45, 47 bzw. 50ºC gefunden. Repräsentative Suc&spplus;- und Suc&supmin;-Segreganten aus jeder dieser Behandlungen wurden auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Suc&spplus;, Bakteriocin erzeugende (Bac&spplus;)-Segreganten zeigten die Gegenwart sowohl des 23 als auch des 6,2 MDa-Plasmides (Figur 1, Spur B). Isolate, die einen Suc&supmin;, Bac&spplus;-Phänotyp exprimierten, zeigten eine Abwesenheit des 23 MDa-Plasmides. Ein repräsentativer Suc&supmin;, Bac&spplus;-Stamm wurde als PAC1.17 bezeichnet (Figur 1, Spur D).
  • Um festzustellen, ob das verbleibende Plasmid den Bac&spplus;- Phänotyp kodieren könnte, wurde Stamm PAC1.17 bei 45ºC wachsen gelassen. Bakteriocin nicht erzeugende (Bac&supmin;)- Segreganten von PAC1.17 wurden mit einer Frequenz von 3,7% erhalten. Eine repräsentative Bac&supmin;-Segregante von PAC1.17 wurde PAC1.19 bezeichnet. Stamm PAC1.19 zeigte keine nachweisbare Plasmid-DNA. Um einen möglichen Zusammenhang des Bac&supmin;-Phänotyps mit dem Plasmid pSRQ11 weiter zu bestätigen, wurde der Stamm PAC1.0 bei 45, 47 und 50ºC wachsen gelassen. Suc&spplus;, Bac&supmin;-Segreganten von PAC1.0 wurden mit Frequenzen von 2,4, 2,1 und 2,7% erhalten. Die Testlyse repräsentativer Suc&spplus;, Bac&supmin;-Isolate zeigte die Gegenwart des Plasmides pSRQ10 (23 MDa) und die Abwesenheit von pSRQ11 (Figur 1, Spur C). Ein repräsentatives Suc&spplus;, Bac&supmin;-Isolat wurde mit PAC1.14 bezeichnet.
    • Inhibitorisches Spektrum von PA-1
  • Um das Spektrum der Bakteriocin-Aktivität zu untersuchen, wurde das Platten-Testsystem mit PAC1.0 als Bac&spplus;-Stamm und PAC1.14 als Kontroll-Bac&supmin;-Stamm verwendet. PAC1.14 wurde einbezogen, um irgendwelche inhibitorischen Effekte auf Indikatorstämme durch Nebenprodukte des Metabolismus, beispielsweise Milchsäure, nachzuweisen. Stamm PAC1.0 zeigte Aktivität gegen die Stämme von P. acidilactici, P. pentosaceus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei und Leuconostoc dextranicum. Keine Aktivität wurde gegen Streptococcus lactis, S. lactis subsp. diacetylactis, S. cremoris oder S.thermophilus beobachtet. Der Bac&supmin;-Stamm PAC1.14 zeigte keine Empfindlichkeit gegenüber PA-1. Stämme von Staphylococcus aureus zeigten gleiche Empfindlichkeit gegen den Elterstamm und den Stamm, der seines Plasmids verlustig gegangen ist, was darauf hinweist, daß die Inhibition wahrscheinlich eine Folge des inhibitorischen Effekts von Milchsäure war. Unter Verwendung von partiell gereinigtem PA-1 (32000 AU/ml) wurden Stämme von Micrococcus varians, M. sodonensis, Staphylococcus xylosus, S. epidermidis, S. carnosus, Lactobacillus acidophilus, L. lactis und L. bulgaricus auf ihre Empfindlichkeit gegen das Bakteriocin getestet. Keiner dieser Stämme zeigte eine Empfindlichkeit gegen das Pediocin PA-1.
    • Wirkung von Enzymen, Wärmebehandlung und pH
  • Partiell-gereinigtes Bakteriocin wurde auf seine Empfindlichkeit bei Aussetzen gegen verschiedene Enzyme, Wärme und pH getestet. PA-1 war empfindlich für Protease, Papain und α-Chymotrypsin. Die Bakteriocin-Aktivität wurde nicht beeinflußt durch Lipase, Phospholipase C, Lysozym, DNase und RNase oder Erwärmen auf 80 - 100ºC. Erwärmen auf 121ºC zerstörte die Aktivität teilweise. Es wurde festgestellt, daß die Bakteriocin-Aktivität bei pH 4-7 am stabilsten war, mit einigen Aktivitätsverlusten bei pH 2, 3, 9 und 10. Die meiste Aktivität wurde bei pH 11 verloren.
    • BEISPIEL 1
  • Das folgende Beispiel 1 zeigt die Verwendung des Bakteriocins PA-1 in Salatsoße. Tabelle 2 Bezeichnung Soße¹ verderbende Bakterien² 0,05 M Tris/Maleat Puffer Nicht inokulierte Kontrolle Inokulierte Kontrolle Inokulierte plus Bakteriocin
  • ¹ Die verwendete Soße war Mariés Buttermilk Spice Ranch Dressing. Die allgemeine Zusammensetzung dieser Salatsoße bestand aus Sojabohnenöl, frischer Buttermilch, frischem Sauerrahm, ganzen Eiern, destilliertem Essig, Zucker, Salz, Buttermilchfeststoffen, Natriumglutamat, dehydriertem Knoblauch, dehydrierten Zwiebeln, Xanthangummi, Gewürzen, Zitronensaftkonzentrat, Petersilien und natürlichen Geschmacksstoffen.
  • ² Zugabe von ungefähr 1 x 10³ CFU ATCC35409 Lactobacillus bifermentans pro g Salatsoße.
  • ³ Das verwendete Bakteriocin PA-1 war eine 60% Ammoniumsulfatpräparation, die gegen 0,05 TRIS-Maleat pH 6,8 dialysiert und dann steril filtriert worden war. (Konzentration: 20000 AU/ml).
  • Das Experiment wurde 7 Tage bei 25ºC (Raumtemperatur) durchgeführt.
  • Wie aus den Tabellen 3 und 4 entnommen werden kann, ist das Bakteriocin von Pediococcus acidilactici sehr wirksam bei der Verzögerung des Wachstums eines gewöhnlichen Verderbnis-erzeugenden Mikroorganismus, Lactobacillus bifermentans. Tabelle 3 Nachweisbare Aktivität des Bakteriocins in der Salatsoße Bezeichnung a Zeit (Tage) b PA-1 Aktivität (AU/g) Tabelle 4 Bakterien b in der Salatsoße Zeit (Tage) Bezeichnung a Zeit (Tage) b CFU/g (Lactobacillus bifermentans) b Tabelle 5 Organoleptische Bewertung der Salatsoße Bezeichnung nicht verdorben verdorben b verdorbena Zeit (Tage) b Essigsäure wurde durch Geruch und Geschmack nachgewiesen und Gasbildung (CO&sub2;) in der Soße als Beweis für die Verderbnis beobachtet.
  • Das Bakteriocin PA-1 war in der Umgebung einer Salatsoße stabil. Das Bakteriocin war wirksam, die anfängliche Belastung zu verringern und diesen Schutz über einen Zeitraum von mehreren Tagen aufrecht zu erhalten. Die gleichen Ergebnisse können in anderen Nahrungsmittelsystemen, beispielsweise Krautsalat, Makkaronisalat und Kartoffelsalat, erhalten werden, insbesondere dort, wo rohe Nahrungsmittel mit anderen Bestandteilen gemischt werden, die das Wachstum von gram-positiven Bakterien, die natürlicherweise auf den rohen Nahrungsmitteln vorhanden sind, fördern.
  • Es ist beabsichtigt, daß die vorstehende Beschreibung nur der Anschauung dient und daß die vorliegende Erfindung nur durch die Ansprüche beschränkt wird.

Claims (13)

1. Verfahren zum Inhibieren der bakteriellen Verderbnis durch gram-positive Bakterien in einem Nahrungsmittelsystem, das umfaßt:
das Zufügen eines Bakteriocins zu dem Nahrungsmittelsystem in einer Menge von zwischen ungefähr 10 bis 100000 Arbeitseinheiten (AU) des Bakteriocins, das die bakterielle Verderbnis inhibiert, pro Gramm des Nahrungsmittelsystems, wobei das Bakteriocin von einem Pediococcus stammt, der das Bakteriocin produziert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bakteriocin von Pediococcus acidilactici NRRL-B-18050 stammt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bakteriocin durch Wachstum des Pediococcus in einem Wachstumsmedium zum Erzeugen des Bakteriocins gewonnen wird, und wobei das Wachstumsmedium mit dem Bakteriocin getrocknet wird, um ein Pulver herzustellen.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bakteriocin weiter dadurch gekennzeichnet ist, daß es durch die Enzyme Protease, Papain und α-Chymotrypsin inaktiviert wird und in einer wäßrigen Lösung gegen 10 min Wärme von bis zu 100ºC unempfindlich ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bakteriocin die auf den rohen Nahrungsmitteln in dem Nahrungsmittelsystem natürlicherweise vorhandenen Bakterien inhibiert.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das gram-positive Bakterium Lactobacillus bifermentans ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Pediococcus in einem Wachstumsmedium wachsen gelassen worden ist, die Feststoffe vom Wachstumsmedium entfernt werden, um eine wässrige Lösung des Bakteriocins herzustellen, das Bakteriocin aus der wässrigen Lösung durch Zufügen überschüssiger Mengen eines Salzes präzipitiert wird und das Bakteriocin aus dem Präzipitat isoliert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Salz Ammoniumsulfat ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Pediococcus ein Pediococcus acidilactici ist, der ein ungefähr 6,2 Megadalton messendes Plasmid enthält, das für die Bakteriocinproduktion kodiert.
10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Nahrungsmittelsystem eine Salatsoße ist.
11. Zusammensetzung, die umfaßt:
a) ein Nahrungsmittelsystem, das durch Lactobacillen verdorben wird; und
b) ein aus Zellen eines Pediococcus, der das Bakteriocin erzeugt, stammendes Bakteriocin gegen gram-positive Bakterien, wobei die Zusammensetzung eine Menge des Bakteriocins von zwischen ungefähr 10 und 100000 Arbeitseinheiten des Bakteriocins pro Gramm des gekühlten Nahrungsmittelsystems enthält, die ausreicht, um die Verderbnis durch gram-positive Bakterien zu inhibieren und wobei die Zusammensetzung keine lebenden Pediococcus- Zellen enthält.
12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das Nahrungsmittelsystem eine Salatsoße ist.
13. Zusammensetzung nach Anspruch 11, die gekühlt ist.
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