DE3825189A1

DE3825189A1 - In vitro synthesis of an infectious RNA of HRV2

Info

Publication number: DE3825189A1
Application number: DE3825189A
Authority: DE
Inventors: Markus Duechler; Timothy Dr Skern; Dieter Dr Blaas; Berthold Dipl Ing Berger; Wolfgang Dr Sommergruber; Ernst Prof Dr Kuechler
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1988-07-25
Filing date: 1988-07-25
Publication date: 1990-02-08
Also published as: ZA895609B

Abstract

The present invention relates to the in vitro synthesis of an infectious RNA of HRV2 as well as to so-called "full size" clones of HRV2.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die in vitro Synthese einer infektiösen RNA von HRV2 sowie sogenannte "full size" Klone von HRV2.The present invention relates to in vitro Synthesis of an infectious RNA from HRV2 as well so-called "full size" clones of HRV2.

Humane Rhinoviren sind die Hauptverursacher von Schnupfen (1). Obwohl mehr als einhundert antigenisch unterschiedliche Serotypen existieren, binden mit Ausnahme von 10 Serotypen alle bisher getesteten an denselben Rezeptor (2). Jüngste Fortschritte der Rhinovirusforschung, wie die Bestimmung der Nukleotidsequenz von 4 Serotypen und die Bestimmung der Kristallstruktur von HRV14, haben zu einem besseren Verständnis der Vielfalt der Serotypen geführt (3, 4, 5, 6, 7, 8). Die Unterschiede der Rezeptorbindungsstelle, die für die Unterscheidung zwischen den beiden Rezeptoren verantwortlich sind, sind jedoch unklar.Human rhinoviruses are the main cause of Runny nose (1). Although more than a hundred antigenic different serotypes exist, bind with Exception of 10 serotypes all tested so far the same receptor (2). Recent advances in Rhinovirus research, such as the determination of Nucleotide sequence of 4 serotypes and the determination of the Crystal structure of HRV14, have a better one Understanding of the diversity of serotypes (3, 4, 5, 6, 7, 8). The differences of the Receptor binding site responsible for differentiation between the two receptors are responsible are however unclear.

Vor einigen Jahren konnte gezeigt werden, daß eine vollständige cDNA Kopie von Poliovirus infektiöses Virus produzieren, wenn sie in HeLa Zellen transfiziert wurde. Von HRV14, einem Vertreter der sogenannten "major receptor group" war eine vollständige cDNA hergestellt worden, mit der eine infektiöse RNA erhalten werden konnte. Dieser "full size" Klon enthielt 21 Nukleotide mehr als die "native" DNA.A few years ago it was shown that a complete cDNA copy of poliovirus infectious Produce virus when transfected into HeLa cells has been. From HRV14, a representative of the so-called Major receptor group was a complete cDNA with an infectious RNA could be obtained. This "full size" clone contained 21 nucleotides more than the "native" DNA.

Von keinem der zehn Rhinoviren, die zu der sogenannten "minor receptor group" gehören, war es bislang möglich, eine solche vollständige cDNA herzustellen.None of the ten rhinoviruses that belong to the so-called minor receptor group, it was previously possible to produce such a complete cDNA.

Daher und weil HRV2, der bekannteste Vertreter dieser Gruppe, eine weit größere Homologie zu den bisher sequenzierten Rhinoviren aufweist als HRV14, war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen "full size" Klon von HRV2 herzustellen, mit dem sich infektiöse RNA transkribieren läßt. Therefore and because HRV2, the best known representative of this Group, a far greater homology to that so far sequenced rhinoviruses as HRV14, it was Object of the present invention, a "full size" Produce clone of HRV2, with which infectious RNA can be transcribed.

cDNA Klone von HRV2 sind bereits beschrieben worden (6). Die durchschnittliche Länge von 0,5 kb war jedoch für die Konstruktion einer vollständigen cDNA ungeeignet.HRV2 cDNA clones have already been described (6). However, the average length was 0.5 kb for the construction of a complete cDNA not suitable.

Zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe wurde daher wie folgt verfahren:To solve the problem according to the invention, therefore proceed as follows:

Die Synthese des ersten Stranges von HRV2 RNA (5 µg) wurde wie beschrieben durchgeführt (10). Diese cDNA wurde dann mit RNase H und DNA Polymerase 1 doppelsträngig gemacht, wobei die Reagenzien von Amersham verwendet wurden. T4 DNA Polymerase wurde verwendet, um Überhänge abzubauen. Nach Behandlung mit Eco RI Methylase wurden Eco RI Linker angefügt, und die cDNA wurde mit Eco RI verdaut. Moleküle, die länger als 4 kb waren, wurden von einem 1% Agarosegel isoliert und in die Eco RI Stelle des Plasmids Bluescript (Stratagene, San Diego, California) ligiert. Wie in Fig. 1 gezeigt, wurden cDNA Rekombinanten einer Größe bis zu 6 kb erhalten. Da keiner der Klone jedoch das vollständige 5′ Ende enthielt, wurde ein Klon, der die Nukleotide 1 bis 471 enthielt und schon früher beschrieben worden war (p100, (6)) verwendet, um diese Region abzudecken.The synthesis of the first strand of HRV2 RNA (5 µg) was carried out as described (10). This cDNA was then double-stranded with RNase H and DNA polymerase 1 using the reagents from Amersham. T4 DNA polymerase was used to break down overhangs. After treatment with Eco RI methylase, Eco RI linkers were added and the cDNA was digested with Eco RI. Molecules longer than 4 kb were isolated from a 1% agarose gel and ligated into the Eco RI site of the Bluescript plasmid (Stratagene, San Diego, California). As shown in Fig. 1, cDNA recombinants up to 6 kb in size were obtained. However, since none of the clones contained the full 5 'end, a clone containing nucleotides 1 to 471 and previously described (p100, (6)) was used to cover this region.

4 cDNA Klone p 100 (mit dem größeren Pst I Fragment für die Nukleotide 1-471), p19 (19-5101), p15 (2125- 7102dA50) und p1 (5373-7102dA50) wurden verwendet, um ein vollständiges cDNA Molekül zusammenzusetzen, das von der T7 RNA Polymerase transkribiert werden konnte. Die in Fig. 1 gezeigte Strategie wurde verwendet, um zwei Segmente entsprechend den 5′ und 3′ Teilen des Moleküls zusammenzusetzen. Für den 5′ Teil wurde das 0,6 kb Bam HI/Pst I Fragment von Klon 100 in die Sac I/Pst I Stelle des Plasmids Bluescript eingebaut. 4 cDNA clones p 100 (with the larger Pst I fragment for nucleotides 1-471), p19 (19-5101), p15 (2125-7102dA50) and p1 (5373-7102dA50) were used to assemble a complete cDNA molecule, that could be transcribed by the T7 RNA polymerase. The strategy shown in Fig. 1 was used to assemble two segments corresponding to the 5 'and 3' parts of the molecule. For the 5 'part, the 0.6 kb Bam HI / Pst I fragment from clone 100 was inserted into the Sac I / Pst I site of the plasmid Bluescript.

Dieses Plasmid enthält den T7 RNA Polymerase Promotor neben dem Polylinker. Ein synthetisches, doppelsträngiges Oligonukleotid, das die Nukleotide 1 bis 9 von HRV2 und die korrekten überhängenden Enden enthielt wurde verwendet, um die Ligation in die Sac I und BAM HI Stellen zu ermöglichen. Die Bluescript Sac I Stelle wurde ausgewählt, weil sie dem T7 RNA Polymerase Promotor am nächsten liegt. Das daraus resultierende Plasmid wurde p100b genannt und enthält die Nukleotide 1-471. Es wurde mit Hpa I am Nukleotid 226 von HRV2 geöffnet. Das isolierte 4,9 kb Hpa I/Sma I Fragment des Klons 19 wurde eingebaut um zu Klon 119 zu kommen (Nukleotide 1 bis 5101). Diese Konstruktion führt zwar zu einer weiteren Insertion der Nukleotide 226 bis 471 der HRV2 Sequenz zwischen die Hpa°/Sma°I und AspI Restriktionsstelle, doch wird sie bei den nachfolgenden Klonierungsschritten wieder entfernt (Fig. 1).This plasmid contains the T7 RNA polymerase promoter next to the polylinker. A synthetic, double-stranded oligonucleotide containing nucleotides 1 to 9 of HRV2 and the correct overhanging ends was used to allow ligation into the Sac I and BAM HI sites. The Bluescript Sac I site was chosen because it is closest to the T7 RNA polymerase promoter. The resulting plasmid was called p100b and contains nucleotides 1-471. It was opened with Hpa I at nucleotide 226 of HRV2. The isolated 4.9 kb Hpa I / Sma I fragment of clone 19 was inserted to get clone 119 (nucleotides 1 to 5101). Although this construction leads to a further insertion of nucleotides 226 to 471 of the HRV2 sequence between the Hpa ° / Sma ° I and AspI restriction site, it is removed again in the subsequent cloning steps ( FIG. 1).

Ein Plasmid, das den 3′ Teil enthält, wurde anschließend wie folgt zusammengebaut: Die Klone 1 und 15 wurden miteinander verbunden, indem das 1,2 kb Spe I/Spe I Fragment des Klons 1 (die Spe I Stellen sind im Polylinker und an der Position 6554 im HRV2) durch das 4,1 kb Spe I/Spe I Fragment von Klon 15 ersetzt wurde; es resultierte Klon 115 (Nukleotide 2435 bis 7102dA50). Es war nicht möglich, Klon 15 direkt zu verwenden, da der polydA-Trakt der Sac I Stelle des Polylinkers benachbart war. Hierdurch lag die cDNA in der falschen Orientierung vor und konnte daher nicht an die 5′-Hälfte der cDNA ligiert werden. Bei der in vitro Synthese der infektiösen RNA ist eine im Plasmid nur einmal auftretende Restriktionsschnittstelle nach dem polydA-Trakt (hier ungefähr 50 Nukleotide lang) hilfreich. Am besten ist hierzu die Asp 718 I am Ende des Polylinkers geeignet. Der Teil des Polylinkers, der zwischen der polydA-Sequenz und der Asp 718 I Stelle lag, wurde daher entfernt, indem das Plasmid 115 mit Eco RI geöffnet wurde, und die überhängenden Nukleotide mit "mung bean" Nuklease wegverdaut wurden. Durch Spaltung mit Asp 718 I wurde der verbleibende Teil des Polylinkers entfernt; die überhängenden Enden wurden mit dem Klenow Fragment der DNA Polymerase I aufgefüllt. Die modifizierten Enden wurden anschließend ligiert, wodurch Klon 115m erhalten wurde; diese Strategie regeneriert die Asp 718 Stelle, die nun dem PolydA Trakt benachbart liegt.A plasmid containing the 3 'part was then assembled as follows: Clones 1 and 15 were connected to each other using the 1.2 kb Spe I / Spe I fragment of clone 1 (the Spe I sites are in the Polylinker and at position 6554 in HRV2) by the 4.1 kb Spe I / Spe I fragment from clone 15 was replaced; clone 115 resulted (nucleotides 2435 to 7102dA50). It was not possible to use clone 15 directly because the polydA tract of the Sac I site of the polylinker was neighboring. As a result, the cDNA was wrong Orientation before and could therefore not to the 5'-half of the cDNA are ligated. In the in vitro Synthesis of infectious RNA is one in the plasmid only restriction interface occurring after the polydA tract (here about 50 nucleotides long) helpful. The best is the Asp 718 I at the end of the polylinker. The part of the polylinker that between the polydA sequence and the Asp 718 I site was therefore removed by plasmid 115 with Eco RI was opened and the overhanging nucleotides were digested away with "mung bean" nuclease. By Cleavage with Asp 718 I was the remaining part of the Polylinkers removed; the overhanging ends were with the Klenow fragment of DNA polymerase I replenished. The modified ends were then ligated to give clone 115m; these Strategy regenerates the Asp 718 position, which is now the PolydA tract is adjacent.

Die beiden Hälften der HRV2 cDNA wurden danach über die einzige Sph I Stelle vereinigt; das 1,2 kb Sph I/Asp 718 I Fragment des Klons 119 wurde durch das 3,2 kb Sph I/Asp 718 I Fragment des Klons 115m ersetzt, man erhielt den Klon pHRV2.The two halves of the HRV2 cDNA were then over the only Sph I site combined; the 1.2 kb Sph I / Asp 718 I fragment of clone 119 was separated by the 3.2 kb Sph I / Asp 718 I fragment of clone 115m replaced, obtained the clone pHRV2.

Bei der Transkription dieses Plasmids nach Linearisierung mit Asp 718 I entsteht eine RNA, die das ganze Genom von HRV2 umfaßt. Allerdings befinden sich am 5′-Ende 16 zusätzliche Nukleotide (welche der Sequenz von der Initiationsstelle der T7 RNA Polymerase bis zur ersten Base der cDNA entsprechen) und am 3′-Ende 5 zusätzliche Nukleotide von der Asp 718 I Stelle.When transcribing this plasmid after Linearization with Asp 718 I creates an RNA that does entire genome of HRV2. However, there are 16 additional nucleotides (which of the Sequence from the initiation site of T7 RNA polymerase correspond to the first base of the cDNA) and on 3'-end 5 additional nucleotides from Asp 718 I. Job.

Die Transkription mit T 7 RNA Polymerase wurde nach Standardmethoden ausgeführt (11). Das Transkriptionsgemisch wurde ohne weitere Behandlung direkt als RNA-Lösung verwendet. Die Qualität der RNA wurde auf einem 1,0% Agarosegel, das 0,1% SDS enthält, überprüft; üblicherweise waren mehr als 90% der RNA "full-length"-Moleküle. Die RNA-Konzentration wurde nach der Methode von Fleck and Begg (12) abgeschätzt. The transcription with T 7 RNA polymerase was followed Standard methods performed (11). The Transcription mixture was left without further treatment used directly as an RNA solution. The quality of the RNA was on a 1.0% agarose gel containing 0.1% SDS checked; typically more than 90% of the RNA was "full-length" molecules. The RNA concentration was estimated using the method of Fleck and Begg (12).

Die Nukleosidtriphosphate wurden durch zweimalige Ethanolfällung in Anwesenheit von 800 mM Ammoniumacetat entfernt, die Nukleinsäuren in Wasser gelöst, und die RNA wurde mit Alkali hydrolysiert. DNA und Proteine wurden mit Perchlorsäure ausgefällt. Mittels nachfolgender spektrophotometrischer Messung der Nukleotid-konzentration konnte unter der Annahme, daß 90% der RNA "full length"-Moleküle waren, die anfängliche RNA-Konzentration abgeschätzt werden.The nucleoside triphosphates were replaced by two Ethanol precipitation in the presence of 800 mM ammonium acetate removed, the nucleic acids dissolved in water, and the RNA was hydrolyzed with alkali. DNA and proteins were precipitated with perchloric acid. Means subsequent spectrophotometric measurement of the Nucleotide concentration could be assumed that 90% of the RNA "full length" molecules were that initial RNA concentration can be estimated.

Hela Zellen (Ohio Stamm) wurden unter Verwendung der DEAE-Dextranmethode transfiziert (9), wobei 300 µl der Transfektionsmischung mit RNA, von Asp 718 I geschnittenem pHRV2 transkribiert, pro Platte verwendet wurden. Nach 3 Tagen wurden die Zellen mit Neutralrot oder Kristallviolett gefärbt und auf die Anwesenheit von Plaques hin untersucht.Hela cells (Ohio strain) were made using the DEAE dextran method transfected (9), using 300 µl the transfection mixture with RNA, from Asp 718 I. cut pHRV2 transcribed, used per plate were. After 3 days the cells became neutral red or crystal violet colored and on the presence examined by plaques.

Überraschenderweise konnte keine Infektion beobachtet werden. Die mögliche Ursache hierfür könnten die zusätzlichen Nukleotide sein, obwohl Mizutani und Colonno (9) eine infektiöse RNA von einer 21 Nukleotide längeren cDNA und HRV14 erhalten hatten.Surprisingly, no infection was observed will. The possible cause of this could be the additional nucleotides, although Mizutani and Colonno (9) an infectious RNA from a 21 nucleotide received longer cDNA and HRV14.

Um die Auswirkungen, die durch die Präsenz der zusätzlichen Nukleotide am 5′-Ende hervorgerufen werden, festzustellen, wurde eine alternative Strategie entwickelt, die die zusätzliche Sequenz auf nur zwei G-Reste reduziert. Eine völlige Eliminierung ist unmöglich, da die T7 RNA Polymerase zwei G Reste in den Positionen +1 und +2 benötigt. Van der Werf et al. (11) konnten zeigen, daß eine Stu I Stelle genau an der Initiationsstelle der Transkription der T7 Polymerase durch "site directed mutagenesis" eingeführt werden kann, indem die Sequenz AGGGCG (die Transkription startet mit dem ersten G) in AGGCCT geändert wird, wobei die beiden essentiellen G's für die Transkription mit der T7 RNA Polymerase unberührt bleiben. Das Restriktionsenzym Stu I schneidet nach dem zweiten G und erzeugt glatte Enden; daher enthält das RNA-Transkript eines Fragmentes, das in diese Stelle kloniert wurde, nur 2 zusätzliche G. Mit Hilfe eines "oligo-nucleotide directed mutagenesis kit" von Amersham wurde daher eine STu I Stelle im Plasmid p 100b eingeführt, wobei die Möglichkeit genutzt wurde, einzelsträngige DNA aus Bluescript Plasmiden zu erzeugen. Das resultierende Plasmid 100b STu I wurde mit STu I und Asp 718 I verdaut; das 7,0 kb Bam HI/Asp 718 I Fragment von pHRV2 wurde dann mit Hilfe eines synthetischen, doppelsträngigen Oligonukleotides eingebaut, das die ersten neun Nukleotide der HRV2-Sequenz und entsprechende Enden enthielt, um korrekt in die Restriktionsstellen eingefügt werden zu können. Sequenzierung einiger der erhaltenen Kandidaten zeigte, daß alle mehr als eine Kopie des Oligonukleotides enthielten. Diese wurden durch Restriktionsverdau mit Bam HI, Eluierung des 10 kb Fragments von einem Agarosegel und Religation entfernt. Für einen Klon wurde gezeigt, daß er nur eine Kopie des Oligonukleotides enthielt; er wurde pHRV2/1 genannt.To the impact caused by the presence of additional nucleotides at the 5 'end an alternative strategy has been established developed the additional sequence on just two G residues reduced. It is a total elimination impossible because the T7 RNA polymerase contains two G residues in the Positions +1 and +2 required. Van der Werf et al. (11) were able to show that a Stu I position exactly at the T7 polymerase transcription initiation site through "site directed mutagenesis" can by the sequence AGGGCG (the transcription starts with the first G) is changed to AGGCCT, where the two essential G's for transcription remain untouched with the T7 RNA polymerase. The Restriction enzyme Stu I cuts after the second G and creates smooth ends; therefore it contains RNA transcript of a fragment in this site was cloned, only 2 additional G. Using one "oligo-nucleotide directed mutagenesis kit" from Amersham therefore became a STu I site in plasmid p 100b introduced, taking advantage of the opportunity single-stranded DNA from Bluescript plasmids produce. The resulting plasmid was 100b STu I digested with STu I and Asp 718 I; the 7.0 kb Bam HI / Asp 718 I fragment of pHRV2 was then removed using of a synthetic, double-stranded oligonucleotide built in, which is the first nine nucleotides of the HRV2 sequence and corresponding ends included to correctly inserted into the restriction sites can. Sequencing of some of the candidates received showed that all more than one copy of the Contained oligonucleotides. These were through Restriction digestion with Bam HI, elution of the 10 kb Fragments removed from an agarose gel and religation. A clone was shown to have only one copy of the Contained oligonucleotides; it was called pHRV2 / 1.

Die Transkription und Transfektion wurde wie für pHRV2 beschrieben durchgeführt. Bei der Überprüfung der Zellen nach 3 Tagen wurden überraschenderweise Plaques mit einer Effizienz von 20-50 Plaques/µg erhalten. RNA aus Viruspartikeln erzeugte 100-200 Plaques/µg. Die Effizienz der in vitro transkribierten RNA entsprach also ungefähr der Hälfte derjenigen die mit viraler RNA erhalten wurde. Durch eine Kontrolltransfektion mit pHRV2/1 DNA konnte eindeutig nachgewiesen werden, daß die Infektion von RNA abhängig ist; die entsprechende DNA erzeugte nämlich keine Plaques. The transcription and transfection was like for pHRV2 described. When reviewing the Cells surprisingly became plaques after 3 days obtained with an efficiency of 20-50 plaques / µg. RNA from virus particles generated 100-200 plaques / µg. The efficiency of RNA transcribed in vitro corresponded to about half of those with viral RNA was obtained. By a Control transfection with pHRV2 / 1 DNA was unambiguous demonstrated that the infection is dependent on RNA is; the corresponding DNA did not produce any Plaques.

Überraschenderweise, im Gegensatz zu den Ergebnissen von Mizutani und Colonno für HRV14 (9) war die Infektiösität der aus diesen Klonen transkribierten RNA jedoch abhängig von der Anzahl der zusätzlichen Nukleotide. Erst der "full size" Klon, der nicht mehr als die für die Transkription mit der T7 Polymerase notwendigen zusätzlichen zwei Guanine am 5′ Ende aufwies, ergab ein infektiöses Transkript.Surprisingly, contrary to the results by Mizutani and Colonno for HRV14 (9) was the Infectiousness of the RNA transcribed from these clones however depending on the number of additional ones Nucleotides. First the "full size" clone, which is no longer than that for transcription with the T7 polymerase necessary additional two guanines at the 5 ′ end revealed an infectious transcript.

Der durch die vorliegende Erfindung erstmals bereitgestellte, in vitro infektiöse RNA liefernde "full size" Klon pHRV2/1 bietet die wertvolle Gelegenheit, durch spezifische Mutagenese die strukturellen Erfordernisse für die Bindung an den "minor group receptor" zu untersuchen. Aufgrund der bestehenden weit größeren Homologie des HRV2 zu den anderen, bisher sequenzierten Rhinoviren als HRV14 ist außerdem zu erwarten, daß diese Resultate mit höherer Sicherheit auch auf Rhinoviren Anwendung finden können, die zu der sogenannten "major receptor group" gehören.The first by the present invention provided in vitro infectious RNA providing "full size" clone pHRV2 / 1 offers the valuable Opportunity, through specific mutagenesis structural requirements for binding to the to investigate "minor group receptor". Due to the existing far greater homology to the HRV2 rhinoviruses other than HRV14 previously sequenced also expect these results to be higher Safety can also be applied to rhinoviruses, which belong to the so-called "major receptor group".

Die vorliegende Erfindung stellt somit erstmals Plasmide bereit, die die vollständige c-DNA für HRV2 bzw. die durch spezifische Mutagenese erhältlichen Analog unter der Kontrolle des T7 RNA Polymerase Promotors enthalten.The present invention thus represents the first time Plasmids ready that contain the complete c-DNA for HRV2 or those obtainable by specific mutagenesis Analogously under the control of the T7 RNA polymerase Promotors included.

Bevorzugte Plasmide enthalten vor dem 1. Basenpaar der cDNA nur so viele Nukleotide, wie für die Initiation der Transkription erforderlich sind. Bei Verwendung der T7 RNA Polymerase sind dies beispielsweise die zwei essentiellen Guanine. Preferred plasmids contain the before the 1st base pair cDNA only as many nucleotides as for initiation transcription are required. When using the For example, T7 RNA polymerase are the two essential guanine.

Von Vorteil ist es, in diesen Plasmiden zusätzlich eine nur einmal auftretende Restriktionsstelle im Anschluß an das 3′-Ende der cDNA vorzusehen.It is advantageous to have one in these plasmids restriction site occurring only once to be provided at the 3'-end of the cDNA.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist selbstverständlich auch die von diesen Plasmiden durch Transkription erhältliche RNA.The subject of the present invention is of course also those of these plasmids RNA available for transcription.

Verwendet werden können die erfindungsgemäßen Plasmide beispielsweise zur Erzeugung viraler Polypeptide, indem geeignete Wirtsysteme mit diesen Plasmiden transformiert werden. Diese viralen Polypeptide können dann zur therapeutischen Behandlung, beispielsweise zur Stimulierung des Immunsystems und zur Bindung und/oder Blockierung der zellulären Rezeptoren für die Rhinoviren Verwendung finden. The plasmids according to the invention can be used for example to generate viral polypeptides by suitable host systems with these plasmids be transformed. These viral polypeptides can then for therapeutic treatment, for example for Stimulation of the immune system and for binding and / or Blocking the cellular receptors for the Find rhinoviruses.

Legend to the figures Figure 1

Schematische Darstellung des Zusammenbaus der vollständigen cDNA Kopie von HRV2, die unter der Kontrolle eines T7 RNA Polymerase Promotors steht. Die Fragmente, die in jedem Abschnitt zusammenligiert wurden, sind dick ausgezogen. Die Nummern über den Restriktionsstellen beziehen sich auf ihre Position auf der HRV2 Karte, außer jenen über den Sac I und Asp 718 I Stellen, die die Enden jedes cDNA Klons darstellen. Die folgenden Restriktionsstellen werden gezeigt: A, Asp 718 I; B, Bam HI; H, Hpa I; P, Pst I; R, Eco RI; S, Sac I; Se, Spe I; Sh, Sph I; Sm, Sma I. Alle Asp 718 I und Sac I Stellen und diejenigen Restriktionsstellen die mit einem Punkt markiert sind, stammen von Polylinkern der Vektors. Der T7 RNA Polymerase Promotor ist mit einem Pfeil markiert.Schematic representation of the assembly of the full cDNA copy of HRV2, available under the Control of a T7 RNA polymerase promoter is. The Fragments ligated together in each section have moved out thick. The numbers above the Restriction sites refer to their position the HRV2 card, except for those on Sac I and Asp 718 I sites representing the ends of each cDNA clone. The following restriction sites are shown: A, Asp 718 I; B, Bam HI; H, Hpa I; P, Pst I; R, Eco RI; S, Sac I; Se, Spe I; Sh, Sph I; Sm, Sma I. All Asp 718 I and Sac I sites and those restriction sites that are marked with a dot come from Vector polylink core. The T7 RNA polymerase promoter is marked with an arrow.

Figure 2

Restriktionskarte des HRV2 Genoms.Restriction map of the HRV2 genome.

Figure 3

Sequenz des klonierten HRV2 Genoms und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz. Sequence of the cloned HRV2 genome and the result thereof deduced amino acid sequence.

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Claims

1. Plasmid, characterized in that it contains the complete cDNA for HRV2 or the analogs obtainable by specific mutagenesis under the control of an RNA polymerase promoter.

2. Plasmid according to claim 1, characterized in that the RNA polymerase is the T7 RNA polymerase.

3. Plasmid according to claim 1 or 2, characterized characterized in that before the 1st base pair of the cDNA only contain as much nucleotides as for the Initiation of transcription required.

4. Plasmid according to claim 3, characterized in that before the 1st base pair of the cDNA only the two for T 7 RNA polymerase contain essential guanine are.

5. Plasmid according to one of the preceding claims, characterized in that it is an additional only restriction site that occurs once has at the 3'-end of the cDNA.

6. Plasmid, characterized in that it is pHRV2 / 1.

7. RNA that can be produced by transcription from one of the Plasmids according to claims 1 to 6.