DE3808798A1 - Vorrichtung zum zaehlen, klassieren und sortieren von in einer stroemenden fluessigkeit suspendierten partikeln und verwendung dieser vorrichtung - Google Patents

Description

Vorrichtungen zum automatischen Zählen von mikrosko­ pischen Partikeln in einem strömenden Medium sind seit längerer Zeit bekannt. Sie arbeiten im wesentlichen nach zwei verschie­ denen Prinzipien: Bei der einen Art wird eine Suspension der zu zählenden Partikeln in einem elektrisch leitenden flüssigen Medium durch eine enge Kapillare geleitet. Beim Durchgang einer Partikel durch den engen Querschnitt der Kapillare resultiert eine Verminderung der Leitfähigkeit im Bereich der Kapillare, die mittels zweier unter Spannung stehender Elektroden gemessen und registriert wird. Der Messbereich kann sich dabei, wie z.B. im bekannten Coulter-Counter in der Längsrichtung der Kapillare erstrecken, d.h. es wird eine Widerstandsveränderung in der Längsachse der Kapillare gemessen. Bei einer andern Ausführungsform, wie sie z.B. aus der Deutschen Offenlegungs­ schrift 23 44 427 bekannt ist, wird der elektrische Widerstand an einer Stelle der Messkapillare in einer Richtung senkrecht zur Längsachse der Kapillare gemessen. Anstelle des elektrischen Widerstands kann auch die Kapazität zwischen den beiden Elektroden, bzw. deren Änderung als Messgrösse verwendet werden. In beiden Fällen ermöglicht dieses elektrische Messprinzip nicht nur eine Zählung, sondern auch eine Klassierung der Partikeln nach ihrer Grösse.

Bei einer zweiten Art von Zählvorrichtungen wird eben­ falls ein Strom einer die Partikeln enthaltenden flüssigen Suspension durch eine Zählkammer geleitet; die Zählung erfolgt jedoch optisch, z.B. mittels eines auf die Zählstelle fokussierten Mikroskopobjektivs und einer zugehörigen Beleucht­ ungsvorrichtung. Der Durchgang eines Teilchens durch das Mess­ feld erzeugt in diesem Falle einen Lichtblitz, der mittels einer photoelektrischen Vorrichtung gezählt und registriert wird. Auch hier ist, auf Grund der Intensität des Lichtsignals, eine Klassierung der Teilchen nach ihrer Grösse möglich. Bei optischen Zählvorrichtungen der beschriebenen Art kann auch mit Fluoreszenz gearbeitet werden, wobei z.B. Partikeln ver­ schiedener Art nach der Wellenlänge ihrer Fluoreszenz­ strahlung unterschieden werden können. Eine Vorrichtung dieser Art ist z.B. in der Deutschen Patentschrift 27 09 399 beschrieben. Bei einer Weiterentwicklung dieses Messprinzips kann im Anschluss an die Messkammer noch eine Weiche in den Strom der Partikelsuspension eingebaut werden, welche imstande ist, die Teilchen aufgrund ihres zuvor in der Zählkammer fest­ gestellten Signals auf verschiedene Strömungswege zu leiten und damit zu sortieren.

Sowohl bei Messkammern, die nach einem elektrischen Prinzip arbeiten, als auch bei solchen welche die Teilchen optisch erfassen, müssen verschiedene Probleme gelöst werden. Das eine ist das Koinzidenzproblem, d.h. die getrennte Zählung von Teilchen, die sich zur gleichen Zeit im Messbereich befinden. Dies kann, wie z.B. in der Deutschen Patentschrift 23 32 667 beschrieben, durch Vergleich des Messignals mit einem Normsignal oder auch mittels rein statistischer Wahr­ scheinlichkeitsüberlegungen geschehen.

Ein weiteres Problem, welches sich insbesondere bei Zählvorrichtungen stellt, die nach dem optischen Prinzip arbei­ ten, ist die Aufgabe, den Partikelstrom so zu leiten, dass jede einzelne Partikel den Messbereich durchläuft. Dieser Mess­ bereich ist, insbesondere bei der Verwendung von Mikroskop­ objektiven mit hoher Apertur, in der Regel sehr eng begrenzt. Es muss auch dafür gesorgt werden, dass keine toten Räume auf­ treten können, in denen einzelne Partikel hängen bleiben und sich dadurch der Messung entziehen. Diese Probleme werden mit gutem Erfolg dadurch gelöst, dass man einen Strom aus einer partikelfreien Flüssigkeit als Hüllstrom verwendet, in welchen die partikelhaltige Flüssigkeit als dünne fadenförmige Strömung eingeleitet wird. Vorzugsweise wird dabei der Hüllstrom senk­ recht zur Richtung des Partikelstroms in die Messkammer einge­ führt und dort umgelenkt. Der Partikelstrom wird an der Umlenkstelle in den Hüllstrom injiziert und passiert dann die Messstelle, senkrecht zur optischen Achse, als wohldefinierter Stromfaden innerhalb des Hüllstroms. Eine solche Vorrichtung ist z.B. in der Deutschen Patentschrift 25 21 236 sowie in der Deutschen Offenlegungsschrift 23 44 427 beschrieben worden.

Für das Sortieren der Partikel auf Grund von in der Zählkammer identifizierten Eigenschaften sind zwei grundsätzlich verschiedene Verfahren bekanntgeworden. Das ältere Verfahren basiert auf der elektrostatischen Ablenkung frei fallender geladener Tröpfchen. Dabei wird der Partikelstrom nach dem Passieren der Zählkammer durch eine Düse gepresst und gleichzeitig mittels einer piezoelektrisch betriebenen Ultraschallquelle in feinste Tröpfchen zerteilt, die frei fallend in einen offenen Raum geleitet werden. Zur Aussonderung von einzelnen, auf Grund von optischen Merkmalen in der Zählkammer identifizierten Partikeln werden die sie enthaltenden Tröpfchen beim Zerstäubungsvorgang elektrisch aufgeladen, wobei mittels einer Zeitverzögerungsvorrichtung die für den Weg der Partikel von der Zählkammer bis zur Zerstäuberdüse benötigte Zeit berücksichtigt wird. Im Fallraum passieren die Tröpfchen geladene Elektroden; elektrisch geladene Tröpfchen werden ausgelenkt und können in einer separaten Sammelvorrichtung aufgefangen werden.

Diese Art von Sortiervorrichtung besitzt verschiedene Nachteile, die sich besonders beim Arbeiten mit Partikeln bio­ logischen Ursprungs auswirken: Beim Zerstäubungsvorgang treten verhältnismässig starke Kräfte auf, wobei empfindliche Partikel mechanisch beschädigt werden können. Noch schwerwiegender ist die Tatsache, dass die Partikel das geschlossene Röhrensystem bei der Zerstäubung verlassen und in einen freien Luftraum aus­ treten. Die Gefahr der Kontamination ist bei diesem Vorgang sehr gross, und die Einhaltung steriler Bedingungen wird prak­ tisch verunmöglicht.

Weit besseren Schutz gegen Kontamination bietet die andere bekanntgewordene Art von Sortiervorrichtungen, bei welcher die die Partikeln führende Flüssikeit während des ganzen Zähl- und Sortiervorgangs in einem geschlossenen Röhrensystem verbleibt. Bei dieser Vorrichtung teilt sich der Flüssigkeitskanal stromabwärts der Zählkammer in zwei Arme. Im Normalzustand fliesst der die Partikeln enthaltende Stromfaden mit einem Teil der Hüllflüssigkeit ausschliesslich durch den einen dieser Arme; durch den andern Arm der Verzweigung fliesst dabei lediglich ein kleiner Teil der Hüllflüssigkeit. Durch eine in der Nähe der Verzweigung befindliche piezoelektrische Vorrichtung kann ein sehr kurz dauernder Schlag ausgelöst werden; die Stosswelle bewirkt eine momentane Einschnürung des Stromfadens, und während einer sehr kurzen Zeit (ca. 40 µsec) die Ableitung eines kleinen Flüssigkeitstropfens in den zweiten Arm der Verzweigung. Durch genaue Einstellung der Zeitverzögerung zwischen Zählkammer und Sortierweiche gelingt es dabei, einzelne, in der Zählkammer identifizierte Partikeln mit grosser Genauigkeit auszusortieren und separat aufzufangen, wobei eine Sortiergeschwindigkeit von 1000 Partikeln pro Sekunde ohne besondere Schwierigkeit erreichbar ist.

Trotz ihrer technischen Vorzüge weist auch die eben be­ schriebene Sortiervorrichtung noch gewisse Mängel auf, die sich beim Sortieren von Partikeln biologischen Ursprungs nach­ teilig auswirken können: Zellen und ihre Bestandteile, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind, neigen oft zur Kon­ glomeration und können damit grössere Partikel bilden, welche die Kanäle des Zähl- und Sortiersystems, insbesondere an engen Stellen und Umlenkpunkten, verstopfen. Grössere Partikel können auch bei der Präparation durch ungenügende Zerteilung des biologischen Materials entstehen. Eine weitere Störquelle bilden Luftblasen, die, falls sie ins System gelangen, sich an der Unterseite des Deckglases festsetzen, die Strömung stören und im Bereich des optischen Strahlengangs den Zählvorgang unterbrechen können. Beide Störquellen, verstopfende Konglome­ rate und Luftblasen können bei den bisher bekannten Vorrichtungen nur durch Öffnen der Zählkammer unter Wegnahme des Deckglases entfernt werden. Damit wird jedesmal die Steri­ lität des Systems in Frage gestellt, was beim Zählen und Sortieren biologischen Materials und insbesondere bei seiner weiteren Verwendung ein schwer zu überwindendes Hindernis bildet.

Aus diesem Grund konnten z.B. Pflanzenzellen, Konglomerate aus Pflanzenzellen und pflanzliche Protoplasten mit den bisher bekannten Vorrichtungen nicht oder nur unter grossen Schwierigkeiten sortiert werden. Die Anlage von selek­ tionierten sterilen Zellinien bzw. deren Regeneration zu ganzen Pflanzen, beispielsweise zur Züchtung neuer Sorten aus selektionierten Zellen, Zellkonglomeraten und Protoplasten, war deshalb praktisch unmöglich.

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung der beschriebenen Art zum Zählen, Klassieren und Sortieren von mikroskopischen Partikeln, bei welcher verstopfende Partikel und Luftblasen ohne Oeffnung der Zählkammer aus dem System entfernt werden können. In einer ersten Ausführungsform umfasst die Erfindung einen in die Zählkammer mündenden Stutzen, der an seinem äusseren Ende über ein Ventil mit einer Unterdruckquelle verbunden ist. Im Falle einer Störung kann ein verstopfendes Teilchen oder eine Luftblase durch kurzes Oeffnen des Ventils auf einfache Weise abgesaugt werden. In einer zweiten Ausführungsform, die sich speziell für die Entfernung von am Deckglas haftenden Blasen eignet, wird in das Deckglas an geeigneter Stelle eine kleine Pore gebohrt, die in einen nach aussen führenden Stutzen mündet, wobei der Stutzen wiederum über ein Ventil mit einer Unterdruckquelle verbunden ist. Durch kurzes Öffnen des Ventils können am Deckglas haftende Luftblasen auf einfache Weise abgesogen werden.

Trotz ihrer relativen Einfachheit bietet die Erfindung beim Zählen und Sortieren von Partikeln biologischen Ursprungs gegenüber den bisher bekannten Vorrichtungen grosse Vorteile und ermöglicht die Lösung von bisher nicht oder nur schwer durchführbaren Arbeiten. So werden z.B. beim Anlegen von Zellkulturen aus pflanzlichen Zellen und insbesondere bei der Regeneration von ganzen Pflanzen bevorzugt Konglomerate von Zellen verwendet, weil sie gegenüber einzelnen Zellen bezw. Protoplasten sich allgemein als besser regenerationsfähig erweisen. Wegen der dauernden Verstopfungsgefahr war das Zählen und Aussortieren solcher Konglomerate mit den bekannten Vorrichtungen kaum durchführbar. Die Möglichkeit, verstopfende Partikel ohne Sterilitätsverlust aus dem System entfernen zu können, erweist sich deshalb als unerlässliche Vorbedingung, um biologische Materialien dieser Art überhaupt sortieren zu können. Luftblasen treten vor allem am Anfang eines Zähl- und Sortiervorgangs auf, sowie dann, wenn der Flüssigkeitsstrom im System durch Ansaugen aufrechterhalten wird. Kleine Undichtigkeiten auf der Eintrittsseite können in diesem Fall bewirken, dass während des ganzen Zählvorgangs gelegentlich Luftblasen in die Kammer gelangen können. Die Möglichkeit, diese Luftblasen auf einfache Weise zu entfernen, erleichtert auch in diesem Fall das Arbeiten mit der Zähl- und Sortiervorrichtung ganz wesentlich.

Die Erfindung und ihre Wirkungsweise sind in den Fig. 1a, 1b und 2 erläutert, wobei die in den Figuren gezeigte Anordnung den Umfang der Erfindung in keiner Weise einschränken soll. Die Zählkammer (5) sowie die halbzylindrischen Kanäle (8, 10 und 11) sind in dem Block (14) eingeschnitten. Durch den Stutzen (4) wird die Flüssigkeit mit den zu zählenden Partikeln, und bei (6), senkrecht dazu, die partikelfreie Flüssigkeit für den Hüllstrom eingeführt. Die in der Figur nicht gezeigte optische Zählvorrichtung befindet sich über der Zählkammer in der Nähe des Ausgangs zum Kanal (8). Der Stutzen (7), der über ein in der Figur nicht gezeigtes Ventil mit einer Unterdruckquelle verbunden ist, dient im Bedarfsfall für das Absaugen von verstopfenden Partikeln und/oder Luftblasen aus der Zählkammer.

An der Stelle (9) befindet sich eine Verzweigung, die so geformt ist, dass der grösste Teil des Flüssigkeitsstroms mit dem zentralen, die Partikeln enthaltenden Stromfaden durch den Kanal (11), und nur ein kleiner Teil des partikelfreien Hüllstroms durch den Kanal (10) abfliesst. Mittels der piezoelektrischen Vorrichtung (12) werden nun, ausgelöst durch die Zählvorrichtung in der Kammer (5), auf eine in der Nähe der Verzweigung (9) liegende Stelle des Kanals (11) kurze Schläge ausgeführt, die eine momentane Verengung des Stromquerschnitts im Kanal (11) und während ganz kurzer Zeit eine Ableitung des partikelführenden Stromfadens in den Kanal (10) bewirken. Dabei muss, zwischen dem Moment der Erkennung einer auszusondernden Partikel in der Messkammer, und dem Signal für die Ableitung an der Verzweigung (9) eine Zeitverzögerung eingebaut werden, die genau der Transportzeit über diese Strecke entspricht.

In den Fig. 1a und 1b ist das den Block (14) mit der Messkammer (5) bedeckende Deckglas (1) mit der Pore (13) darge­ stellt, wobei Fig. 1a eine Gesamtansicht und Fig. 1b einen vergrösserten Ausschnitt zeigt. Ueber der Pore (13) ist der Block (2) mit dem Anschlussstutzen (3) aufgekittet. Dieser Stutzen ist über ein in der Figur nicht gezeigtes Ventil mit einer Unterdruckquelle verbunden. Auf der Unterseite des Deckglases (1) sich ansammelnde Luftblasen und andere Verunreinigungen werden dadurch bei Bedarf oder laufend abgesogen und so aus der Messkammer entfernt.

Beide Ausführungsformen der Erfindung, der Saugstutzen (7) und die Pore (13) mit dem Anschlussstutzen (3) können je einzeln für sich oder auch gleichzeitig in der Zähl- und Sortiervorrichtung verwendet werden.

Claims (8)

1. Vorrichtung zum Zählen, Klassieren und Sortieren von in einer strömenden Flüssigkeit suspendierten mikroskopischen Teilchen, insbesondere lebenden Zellen, Zellorganellen und deren Genomen, mit einer Einspritzvorrichtung, in welcher der die Teilchen enthaltende Flüssigkeitsstrom mit einem partikelfreien Hüllstrom umgeben wird, einer Zählkammer, in welcher der Partikelstrom von einem senkrecht zur Fliessrichtung gerichteten Lichtstrahl durchsetzt wird, einer von diesem Lichtstrahl betätigten optischen Zählvorrichtung mit einem auf den Teilchenstrom fokussierten Mikroskopobjektiv, einem Photomultiplier und einer damit ver­ bundenen Zähl- und Klassierelektronik, sowie einer strom­ abwärts von der Zählkammer gelegenen Flüssigkeitsweiche in welcher einzelne durch die optische Vorrichtung identifizierte Teilchen mittels einer piezoelektrisch erzeugten Druckwelle aussortiert werden können, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Zählkammer mit einer Vorrichtung zum Absaugen von Luftblasen und/oder mechanischen Verunreinigungen ausgerüstet ist.

2. Vorrichtung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Absaugvorrichtung aus einem in die Zählkammer (5) ragenden Stutzen (7) besteht, der über ein nach Bedarf zu be­ tätigendes Ventil mit einer Unterdruckquelle verbunden ist.

3. Vorrichtung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Absaugvorrichtung aus einem in das Deckglas der Zählkammer gebohrten Pore (13) besteht, die auf der Aussenseite des Deckglases in einen Stutzen (3) mündet, der über ein nach Bedarf zu betätigendes Ventil mit einer Unterdruckquelle verbunden ist.

4. Verwendung der Vorrichtung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Zählen und Aussortieren einzelner partikel und/oder aus mehreren Partikeln bestehender Konglomerate auf Grund von optischen Unterscheidungsmerkmalen.

5. Verwendung der Vorrichtung gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel lebende Zellen, Protoplasten, fusionierte Protoplasten bzw. deren Fusionsprodukte, Zellor­ ganellen oder Chromosomen bzw. Genome, vorzugsweise pflanz­ lichen Ursprungs sind.

6. Verwendung der Vorrichtung gemäss den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Unterscheidung der Partikel auf Grund ihrer Grösse nach Massgabe der Intensität des von ihnen reflektierten Lichtes erfolgt.

7. Verwendung der Vorrichtung gemäss den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel auf Grund ihrer Eigenfärbung oder eines durch Fremdfärbung hervorgerufenen Farbunterschiedes nach Massgabe der Wellenlänge des von ihnen reflektierten Lichtes selektioniert werden.

8. Verwendung der Vorrichtung gemäss den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel auf Grund eigener, durch Einfärbung oder durch Anlagerung von Antikörpern erworbener Fluoreszenz nach Massgabe der Wellenlänge des von ihnen ausgestrahlten Fluoreszenzlichts selektioniert werden.