DE3784471T2

DE3784471T2 - Bestimmung und kontrolle von sulfatreduzierenden bakterien.

Info

Publication number: DE3784471T2
Application number: DE8787311305T
Authority: DE
Inventors: Len J Gawel; Thomas Kalon Ng; James Martin Odom
Original assignee: Conoco Inc
Current assignee: ConocoPhillips Co
Priority date: 1986-12-23
Filing date: 1987-12-22
Publication date: 1993-06-17
Anticipated expiration: 2007-12-23
Also published as: NZ223008A; NO875385D0; NO875385L; NO174779C; JPS63173964A; EP0272916B1; DK679687A; KR940005603B1; CN87108357A; AU607443B2; US4999286A; MY102788A; DE3784471D1; AU8118087A; NO174779B; CN1012020B; DK679687D0; CA1303985C; KR880007743A; EP0272916A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die verbesserte Kontrolle schädlicher, Sulfat reduzierender Bakterien, die Korrosion und giftige Sulfidionen oder Säure in wäßrigen Umgebungen, besonders Ölreservoiren, Öl- und Gasschächten, Pipelines, Behältern, Kühltürmen und dergleichen, erzeugen.
Einerseits betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins Sulfat reduzierender Bakterien in wäßriger Umgebung unter Verwendung einer Immuno-Assay- Technik.
Zum anderen betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum Nachweis des Vorhandenseins Sulfat reduzierender Bakterien.

Kurze Beschreibung des Stands der Technik

Sulfat reduzierende Bakterien sind strikt anaerobe Eubakterien. Sie haben beträchtliche physiologische und morphologische Unterschiede, und es gibt kein einfaches Klassifizierungsschema. Sie werden unterschiedlich in wenigstens folgende Gattungen eingeteilt: Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Desulfomonas, Desulfobacter, Desulfobulbus, Desulfococcus, Desulfonema, Desulfosarcina und Thermodesulfobacterium. Des weiteren geben morphologische oder physiologische Ähnlichkeiten unter den Sulfat reduzierenden Bakterien nicht unbedingt enge genetische Verwandtschaft wieder. Die Sulfat reduzierenden Bakterien haben nur ihre Fähigkeit, Sulfat als einen terminalen Elektronendonator zu verwenden und die Tatsache, daß sie alle Anaerobier sind, gemeinsam. Wenn die Bezeichnung "Sulfat reduzierende Bakterien" hier verwendet wird, finden diese beiden Kriterien Anwendung, ungeachtet der taxonomischen Klassifikation, selbst in dem Ausmaß, daß andere Mikroben als "Bakterien" eingeschlossen sein könnten.
In der Natur nutzen die Sulfat reduzierenden Bakterien eine ökologische Nische aus, in der anaerobe Bedingungen vorherrschen. Die größte Verschiedenartigkeit Sulfat reduzierender Bakterien wird in der Natur in dauernd anaeroben sulfatreichen Sedimenten niedriger oder mittlerer Temperatur und Salzigkeit gefunden, wie z.B. in den Reduktionszonen der Ablagerungen von Flußmündungen und Meereshabitaten. Die Reduktion der Sulfationen, letztlich zu H&sub2;S, wird anstelle der Reduktion von Sauerstoff verwendet. Fast alle bekannten Verbindungen, die Abbauprodukte von Kohlenhydraten, Proteinen, Nukleinsäuren und Lipiden sind, werden von den Sulfat reduzierenden Bakterien verwendet. Typische Elektronendonatoren für die Sulfat reduzierenden Bakterien sind H&sub2;, Formiat, Acetat, Porpionat, höhere geradkettige und verzweigtkettige Fettsäuren, Monohydroxyalkohole, Lactate, Dicarbonsäuren, Phenyl-substituierte Carbonsäuren und verwandte, cyclische Verbindungen. Kurz gesagt, sie bevorzugen ein anaerobes wäßriges Medium, das Sulfationen zum "Atmen" und metabolische Überreste zum "Essen" enthält.
Hierin liegt das Problem.
Viele Industriezweige, einschließlich der Öl- und Gasindustrie, der chemischen Industrie, der Elektrizitätswerke und mehrerer anderer Industrien haben fast ideale Habitate für die Sulfat reduzierenden Bakterien und ihre Arbeitsweisen geschaffen. Z.B. können Sulfat reduzierende Bakterien ein Ölreservoir verseuchen, besonders wenn mit Wasser geflutet wird, so daß große Mengen H&sub2;S entstehen und das Reservoir sauer wird, was Probleme der Korrosion, Abtrennung und Sicherheit zur Folge hat. Sulfat reduzierende Bakterien können Bohrlöcher, Pipelines und andere Rohrsysteme, Vorratsbehälter und dergleichen bewohnen, wodurch sie die Bildung von H&sub2;S und ernste Korrosionsprobleme verursachen. Sie können eine biologische Nische unterhalb von Kolonien anderer Mikroorganismen in Behältern, Pipelines, auf Kühltürmen und sonstwo bewohnen und so H&sub2;S und/oder andere metabolische Produkte bilden, die ebenfalls ernste Korrosionsprobleme verursachen.
Obwohl eine Vielfalt an Kontrollmaßnahmen eingesetzt werden kann, um die schädlichen Wirkungen der Sulfat reduzierenden Bakterien in solchen industriellen Arbeitsvorgängen aufzuhalten oder abzuschwächen, wird typischerweise, besonders in der Ölindustrie, ein bakterizides oder bakteriostatisches Mittel in das System eingeführt. Z.B. können Chlor, Ozon, Acrolein, quarternäre Ammoniumsalze, Peroxide oder eine Anzahl anderer bekannter Mittel benutzt werden.
Damit jedoch die Kontrollmaßnahmen nicht nur bei der Kontrolle der Verseuchung durch Sulfat reduzierende Bakterien wirksam und auch kostengünstig sind, sondern auch keine unnötigen schädlichen Auswirkungen in das System einführen, sind bessere Methoden erforderlich, um das Vorhandensein und/oder die Menge der Sulfat reduzierenden Bakterien, die in der zu behandelnden Umgebung sind, nachzuweisen.
Folglich sind Anstregungen unternommen worden, ein Verfahren zum Nachweis Sulfat reduzierender Bakterien in wäßrigen Umgebungen zu entwickeln. Es ist wünschenswert, daß ein Mittel zum Nachweis dieser Bakterien in der Lage ist, in Feldstudien verwendet zu werden, das breit, aber verläßlich, empfindlich, quantitativ, schnell und einfach genug ist, so daß ungeübtes Personal damit umgehen kann. Ein immunologisches Mittel zum Nachweis hauptsächlich aller Sulfat reduzierenden Bakterien, auf das die obigen Kriterien zutreffen, ist ein Gegenstand dieser Erfindung. Das ist möglich, weil die Gattungen der Sulfat reduzierenden Bakterien einzigartige Enzymproteine enthalten, die dennoch einen gemeinsamen Antigenort besitzen.
Es folgt eine detaillierte Beschreibung ausgewählter relevanter Beispiele aus dem stand der Technik:
In Biotechnology News, 15. August 1986, wurden ein Kit, der auf einem halben Dutzend polyclonaler Antikörperpräparationen gegen die Oberflächenantigene verschiedener Sulfat reduzierender Bakterien basierte, und Immunofluoreszenz- Assays zum Zwecke des Nachweises Sulfat reduzierender Bakterien, offenbart. Es gibt zwei Mischungen von Antikörpern, eine für Meeresanwendungen und eine für die Verwendung auf dem Land. Der oben beschriebene Kit, der auf Antikörpern gegen Oberflächenantigene basiert, die bekanntermaßen bei den verschiedenen Gattungen Sulfat reduzierender Bakterien verschieden sind, erfordert Antikörpergemische und muß sich auf die Mutmaßung beziehen, daß eine Mischung für jede Gattung und jede Art der Sulfat reduzierenden Bakterien, auf die sie voraussichtlich treffen kann, einen Antikörper enthält.
Die Publikation von A. D. Smith, Arch. Microbiol. 133: 118-121 (1982), verdeutlicht die mögliche Schwäche der Verwendung von Oberflächenantigenen für die Identifizierung von Sulfat reduzierenden Bakterien. Fünf spezifische Antiseren wurden gegen fünf Stämme Sulfat reduzierender Bakterien hergestellt, und ein polyvalentes Antiserum wurde durch Mischen gleicher Volumina der fünf spezifischen Antiseren gewonnen. Die Seren wurden gegen 44 Stämme der Gattungen Desulfovibrio und Desulfotomaculum zusammen mit 4 Kontrollorganismen getestet. Immunologische Reaktivität war hauptsächlich Stamm-spezifisch, wenn auch schwache Reaktivität sowohl innerhalb der Gruppen als auch zwischen ihnen zu sehen war. Keines der Antiseren, einschließlich des polyvalenten Antiserums, wies alle Sulfat reduzierenden Bakterien in dem Test erfolgreich nach. Die Kreuzreaktivität mit den Kontrollbakterien war schwach oder nicht vorhanden.
Norquist et al., Applied and Environmental Microbiology 50: 31-37 (1985), offenbaren, daß die Hüllproteine einiger Stämme von Desulfovibrio ganz verschieden waren und daß die Hüllproteine von wenigstens einer Art von Desulfotomaculum einzigartig unter denen mehrerer anderer Arten waren. Diese Untersuchung erläutert, warum man nicht erwartet, daß Antiseren gegen Oberflächenantigene gleichartig kreuzreagieren, um Sulfat reduzierende Bakterien verschiedener Gattungen nachzuweisen. Sie stellt auch die Verschiedenheit der Hüllproteinmoleküle unter den Sulfat reduzierenden Bakterien heraus.
Die Verwendung von Antikörpern gegen Oberflächenantigene zum Nachweis von Bakterien ist früher für den Nachweis anderer Bakterien verwendet worden. Z.B. besteht ein Bedarf, schnell und richtig das Vorhandensein der Gattung Neisseria (der Organismus verursacht Gonorrhoe) nachweisen zu können. Einer der herkömmlichen Tests verwendet serologische Methoden. Auf die Grenzen der Verwendung serologischer Methoden für diese Bakterien wurde in der Publikation "International Symposium on Gonorrhea", B. B. Diena, Herausgeber, einer Sammlung von Veröffentlichungen, die auf dem International Symposium on Gonorrhea im Oktober 1973 vorgelegt waren, das von der Health Protection Branch, Health and Welfare Canada, Ottawa gesponsort war, in dem mit "Uses and Limitations of Serologic Tests for Gonorrhea: An Overview" überschriebenen Kapitel von L. C. Norins, S. 34-43, hingewiesen.
Um die Nachweisgrenzen für Neisseria durch Antikörper gegen Bakterien-Oberflächenantigene zu überschreiten, entwickelte H. H. Weetall, US 4 166 765, US 4 188 371 und US 4 245 038, mehrere, verhältnismäßig einfache und schnelle Tests für in flüssigen Proben vorhandene Neisserien, die sich auf die Entdeckung eines Enzyms in den Neisseriabakterien gründete, das für die Gattung Neisseria spezifisch ist. Es wurde ein Antiserum gegen das Enzym für 1,2-Propandiol aus Neisseriabakterien hergestellt und in einem Immuno-Assay verwendet, um das Vorhandensein des Enzyms in Lysaten von Bakterienproben nachzuweisen.
In der vorliegenden Anmeldung ist offenbart, daß Antikörper gegen eine gereinigte Präparation des Enzyms Adenosin-5'- phosphosulfat-Reduktase (APS-Reduktase) von einer Gattung Sulfat reduzierender Bakterien erstaunlicherweise mit Molekülen in Bakterienlysaten anderer Gattungen der Sulfat reduzierenden Bakterien kreuzreagieren.
Wie von Widdel in Anaerobic Bacteria in Habitats Other Than Man, 1986, herausgegeben von E. M. Barnes und G. C. Mead, Blackwell Scientific, beschrieben ist, bestehen die Sulfat reduzierenden Bakterien aus 8 Gattungen. Sie sind sowohl physiologisch als auch morphologisch verschieden, und der Gehalt an Guanin plus Cytosin (ein Maß für die Verwandtschaft ihrer DNA-Zusammensetzung) erstreckt sich über weite Bereiche (von 34 bis 67 Mol-%).
H. D. Peck, Kapitel 18, Seite 309-335 in Microbial Chemoautotrophy, herausgegeben von W. R. Strohl und O. H. Tuovinen, erschienen bei Ohio State University Press, Columbus Ohio, offenbart die physiologischen Unterschiede Sulfat reduzierender Bakterien.
Singleton et al., Arch. Microbiol. 139: 91-94 (1984), die einen indirekten Enzym-Immunoassay für Cytochrom c&sub3; benutzen, um die immunologische Verwandtschaft der c&sub3; Cytochrome verschiedener Sulfat reduzierender Bakterien zu studieren, zeigten, daß die c&sub3; Cytochrome von verschiedenen Stämmen der Gattung Desulfovibrio merklich unterschiedliche Antigendeterminanten besitzen. Die Autoren schlossen daraus, daß die Verschiedenheit Sulfat reduzierender Bakterien viel größer als bisher angenommen wurde sein kann.
Skyring et al., Can. J. Microbiol., 19: 375-380 (1973), stellen heraus, daß die nicht assimilierenden Sulfat reduzierenden Bakterien so genannt werden, wegen ihres einzigartigen Energiemetabolismus, der an die Reduktion von Sulfat zu Schwefelwasserstoff gebunden ist. Sie vermuten, daß alle Sulfat reduzierenden Bakterien Sulfat mittels eines gewöhnlichen Mechanismus reduzieren können. Sie stellen fest, daß sich allgemeine biochemische Abstammung in Enzymähnlichkeiten des Sulfat reduzierenden Stoffwechselweges stärker wiederspiegelt, als in anderen Zellbestandteilen. Sie verglichen die elektrophoretischen Eigenschaften dreier Enzyme des Sulfat reduzierenden Stoffwechselweges einschließlich Adenosin-5'-phosphosulfat-Reduktase (APS Reduktase) von 13 Stämmen nicht-assimilierender Sulfat reduzierender Bakterien aus zwei Gattungen. Sie fanden eine Ähnlichkeit in dem elektrophoretischen Verhalten der APS Reduktase in einigen Stämmen.
Stille et al. Arch. Microbiol. 137: 140-150 (1984) offenbaren einen Vergleich der Eigenschaften von APS Reduktasen, die während der Studie gereinigt wurden. Die Enzyme unterscheiden sich, wie in den Reichweiten ihrer Molekulargewichte von 1,7 x 10&sup5; bis 2,2 x 10&sup5; und enthalten 4 bis 8 nicht an Häm gebundene Eisenatome pro Enzymmolekül. Weitere Ähnlichkeiten und Unterschiede sind offenbart.
Aketagawa et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 31: 347-357 (1985) wiesen die immunologischen Kreuzreaktivitäten zwischen Sulfit-Reduktasen, Hydrogenasen und somatischen Antigenen von 10 Stämmen in 5 Arten der einzelnen Gattung Desulfovibrio nach. Sie offenbaren, daß die Sulfit-Reduktasen aus Desulfovibrio gewöhnliche Antigendeterminanten gemeinsam haben. Die Hydrogenasen jedoch, die von Stamm zu Stamm verschiedene physikochemische Eigenschften hatten, zeigten begrenzte immunologische Kreuzreaktivitäten. Die immunologischen Kreuzreaktivitäten lassen zusammen mit anderen bekannten Merkmalen der Sulfitreduktasen von Desulfovibrio vermuten, daß die Struktur der Sulfit-Reduktase besser als andere Zellbestandteile im Verlauf der Evolution bewahrt blieb. Unter den Hydrogenasen von 10 Stämmen gab es eine geringe immunologische Kreuzreaktivität, und in Übereinstimmung mit den vorher aufgeführten Ergebnissen reagierte keines der gegen somatische Antigene getesteten Antiseren mit allen 10 Arten innerhalb der Gattung, obwohl es unter einigen der Stämme Kreuzreaktivitäten gab.
Trotz aller Heterogenität der Antigene und intrazellulären Moleküle der Sulfat reduzierenden Bakterien, wie oben offenbart wurde, macht die vorliegende Erfindung von den Erkenntnissen Gebrauch, daß die APS-Reduktasen in den Sulfat reduzierenden Bakterien genügend immunologische Kreuzreaktivitätsstellen teilen, um ihren Nachweis durch immunologische Mittel zu erlauben und dadurch als Mittel für den Nachweis des Vorhandenseins Sulfat reduzierender Bakterien in lysierten Proben zu dienen. Selbst wenn APS-Reduktasen bekanntermaßen in einigen Sulfid oxidierenden Bakterien vorhanden sind, verfügen sie nicht über ausreichende immunologische Kreuzreaktivität mit denen aus Sulfat reduzierenden Bakterien, als daß sie den Nachweis der Sulfat reduzierenden Bakterien mit den Mitteln der Erfindung, stören könnten.
Demzufolge stellt die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Kontrolle Sulfat reduzierender Bakterien bei industriellen Arbeitsvorgängen, besonders in der Ölindustrie zur Verfügung. Sie stellt Vorrichtungen für den schnellen Nachweis des Vorhandenseins und/oder der Menge Sulfat reduzierender Bakterien in wäßriger Umgebung zur Verfügung. Sie stellt ein genaues, leicht durchzuführendes und schnelles Verfahren zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung Sulfat reduzierender Bakterien in industriellen Systemen oder sonstwo bereit.

Ziele der Erfindung

Ein Ziel der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Kontrolle Sulfat reduzierender Bakterien in wäßrigen Umgebungen, bereitzustellen. Es wird das Vorhandensein, und wenn dies zutrifft, vorzugsweise die Menge der Sulfat reduzierenden Bakterien mit einem sehr spezifischen Immuno-Assay nachgewiesen, und es wird eine nicht schädliche, aber wirksame Menge eines bakteriziden oder bakteriostatischen Mittels in die wäßrige Umgebung eingeführt, um die Sulfat reduzierenden Bakterien zu kontrollieren, die dann nachgewiesen werden.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren für den spezifischen Nachweis Sulfat reduzierender Bakterien in wäßriger Umgebung mit der Methode eines Immuno-Assays bereitzustellen, der spezifisch für ein Enzym ist, das die Bakterien verwenden, um Energie aus der Reduktion von Sulfat zu gewinnen, wobei zur Zeit Adenosin-5'-phosphosulfat-Reduktase bevorzugt wird.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist auch, eine Vorrichtung für den schnellen Nachweis Sulfat reduzierender Bakterien in wäßriger Umgebung mit einem Immuno-Assay, der ein Enzym, z.B. Adenosin-5'-phosphosulfat-Reduktase verwendet, das die Sulfat reduzierenden Bakterien einsetzen, um Energie aus der Reduktion von Sulfat zu gewinnen, zur Verfügung zu stellen.
Andere Ziele zeigen sich dem Fachmann beim Lesen der Beschreibung und Ansprüche dieser Anmeldung.

Zusammenfassung der Erfindung

Sulfat reduzierende Bakterien in einer wäßrigen Umgebung werden nachgewiesen durch:
(a) Herstellung eines Lysats einer Probe, die der Umgebung entnommen und so ausgewählt ist, daß sie beliebige Mikroorganismen, die in der Umgebung vorhanden sind, einschließt, um in das Lysat ein Enzym, das die Sulfat reduzierenden Bakterien zur Energiegewinnung durch die Reduktion einer Sulfateinheit verwenden, freizusetzen,
(b) das In-Kontakt-Bringen wenigstens eines Anteils des Lysats mit einem Antikörper für das Enzym unter Reaktionsbedingungen für eine Antikörper-Enzym-Reaktion und
(c) den Nachweis irgendeines vorhandenen Reaktionsproduktes des Enzyms und des Antikörpers, um das Vorhandensein Sulfat reduzierender Bakterien zu bestimmen. Gemäß dem gegenwärtig bevorzugten Verfahren, ist das Enzym, das aus der Probe durch Lyse gewonnen ist und zur Bildung des Antikörpers verwendet wird, eine Adenosin-5'- phosphosulfat-Reduktase, die sich innnerhalb der Zellwände der Sulfat reduzierenden Bakterien befindet.
Gemäß einem Gesichtspunkt der Erfindung wird eine wirksame Menge eines bakterioziden oder bakteriostatischen Mittels zur Steuerung Sulfat reduzierender Bakterien, wenn diese nachgewiesen sind, in die wäßrige Umgebung eingeführt und gegenwärtig vorzugsweise in wirksamen aber nicht überschüssigen oder schädlichen Mengen.
Gemäß einem noch anderen Gesichtspunkt der Erfindung, wird die Vorrichtung, gegenwärtig vorzugsweise in Form eines "Testkits" zur Durchführung des Verfahrens oder der Methode der Erfindung zur Verfügung gestellt. In einer Ausführungsform kann der "Testkit" einen Behälter umfassen, der eine Zugangsöffnung und ein Einfang-Reagens hat, das sich in dem Behälter befindet, dadurch gekennzeichnet, daß das Einfang- Reagens einen Antikörper für APS-Reduktase umfaßt, erhalten durch Injektion von APS-Reduktase aus Sulfat reduzierenden Bakterien, die von anderen Proteinen gereinigt worden ist, in einen Organismus mit Immunsystem und dann Zurückgewinnen des Antikörpers für die APS-Reduktase aus dem Organismus. In einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper für die APS-Reduktase an einen Festphasenträger, der in dem Behälter eingelassen und zur Bindung des Antikörpers befähigt ist, gebunden oder daran geknüpft.
Es wird auf EPA Anmeldung Nr. 0 198 413, die in Europa am 22. Oktober 1986 veröffentlicht ist, verwiesen, die der US-Patent Anmeldungs-Nr. 722 373 entspricht. Auf die EPA Anmeldung wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen. Die zur Durchführung der Erfindung nützliche Vorriichtung stellt eine Verbesserung der Vorrichtung jener Anmeldung dar.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Vorrichtung stellt einen Aspekt der Erfindung dar, sie bezieht sich auf einen "Testkit", wobei die Ausführung des Verfahrens oder der Methode der Erfindung besser aus deren folgender detaillierter Beschreibung, die in Verbindung mit begleitenden Zeichnungen vorgenommen ist, die einen Teil der EPA Anmeldung Nr. 0 198 413 bilden, verstanden werden kann.
Figur 1 ist ein Teilstück, ein schematisches Teildiagramm eines Multiport-Processors, der gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung konstruiert worden ist;
Figur 2 ist eine teilweise aufgeschnittene bildhafte Darstellung des Behälters, der gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung für die Verwendung mit dem System der Figur 1 konstruiert wurde;
Figur 3 ist eine in Einzelteile aufgelöste Darstellung einer anderen Form des Behälters, der mit dem System der Figur 1 verwendet werden kann;
Figur 4 ist eine in Einzelteile aufgelöste Darstellung noch eines weiteren Behälters, der mit dem System der Figur 1 verwendet werden kann;
Figur 5 ist eine teilweise aufgeschnittene bildhafte Darstellung eines noch anderen Behälters, der mit dem System der Figur 1 Verwendung finden kann;
Figur 6 ist ein Fließdiagramm, das die coputergesteuerte Methode beschreibt, mit der ein Komplexbildungs-Test unter Verwendung des Systems der Figur 1 durchgeführt wird;
Figur 7 ist eine teilweise bildhafte, teilweise schematische Ansicht einer alternativen Form des Verteilers, die mit dem System dieser Erfindung verwendet werden kann;
Figur 8 ist ein Teilstück, ein teilweise schematisches Diagramm eines Multiport-Processors zur Isolierung von Bestandteilen aus einem zusammengesetzten Gemisch, der gemäß einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung konstruiert ist; und
Figur 9 ist ein teilweise bildhaftes, teilweise schematisches Diagramm eines Systems dieser Erfindung , das für die Verwendung einer Mikrotiterplatte abgewandelt wurde.

Detaillierte Beschreibung der Vorrichtung der Erfindung als verbesserte Vorrichtung gemäß den Abbildungen.

Eine gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, bezüglich der Vorrichtung und des Systems zur Durchführung einer bevorzugten Form, kann unter Bezugnahme auf die Zeichnungen aus der EPA Anmeldung Nr. 0 198 413 ersehen und beschrieben werden. So ist zu sehen, daß das System einen Multiport Verteiler 10 einschließt, der eine geschlossene Kammer in Form einer Leitung 12 definiert, die sich über den Verteiler hinaus verlängert. Ein Ende der Leitung 12 ist mit einem Ventil 14 und einer Falle für Abfall 16 mit einer Vakuumquelle 18 verbunden. Typischerweise ist diese Quelle ein Vakuumaspirator oder eine Vakuumpumpe. Eine Vielzahl von Behälteröffnungen 20 sind in dem oberen Teil des Verteilers 10 ausgebildet, wobei jede so angepaßt ist, um einen geeigneten Behälter, oder andere schnelle Assay-Einrichtungen, wie noch beschrieben wird, aufzunehmen. Jede Öffnung ist so ausgeführt, daß sie einen vakuumdichten Verschluß besitzt, der eine leichte Einführung und leichtes Entfernen des Behälters gestattet. Die Leitung 12 ist auch über ein Ventil 17 mit einer Gasquelle 19, typischerweise Luft von Atmosphärendruck. Das andere Ende der Leitung 12 ist über passende Ventile 22 mit jeweiligen Quellen von Hilfsreagens 24, der Waschflüssigkeit 26 und einem Substrat 28 verbunden. Jedes der Ventile 14, 19 und 22 ist wiederum durch eine geeignete Prozeß-Steuer-Einheit 30 gesteuert.
Die Abdichtung für die Öffnungen 20 kann so ausgeführt sein, daß die Öffnungen entweder mit einer inneren Verjüngung, wie zu sehen ist, ausgelegt sind, die zur Aufnahme einer ähnlich verjüngten Behälterspitze 42 (Fig. 2) angepaßt ist, oder, wenn eine äußerere Abdichtung gewünscht ist, der Verteiler mit konischen Achsschenkeln (nicht dargestellt) versehen ist, die innen an ähnlich verjüngte Behälterspitzen passen, wie es in Verbindung mit Figur 8 beschrieben wird. In jedem Fall können die Öffnungen 20 dazu bestimmt werden, eine breite Vielfalt unterschiedlicher Testvorrichtungen und Zusammenstellungen aufzunehmen.
Die Ventile werden vorzugsweise elektronisch gesteuert, um den Zulauf der verschiedenen Flüssigkeiten und Vakuum- und Luftquelleen an der Leitung 12 zu steuern. Bei der Auswahl der Ventile ist es wichtig, daß sie eine schnelle An-Aus- Steuerung von innerhalb etwa 0,1 Sekunde gewährleisten. Ein geeignetes Ventil, das als zufriedenstellend befunden wurde, ist ein Quetschventil von ACRO Air Associates of Concord, California (Part #940121418). Diese Ventile, die in Kombination mit Siliconkautschukschläuchen für die verbindenden Leitungen verwendet werden, wurden erfolgreich in den Versuchen angewandt. Jeder beliebige geeignete Computer kann als Steuer-Einheit 30 verwendet werden. Sie muß nicht beschrieben werden, da Computer dieses Typs wohl bekannt sind. Z.B. ist ein HP-85 Computer für diesen Zweck erfolgreich eingesetzt worden. Die Software für einen solchen Computer wird unten beschrieben. Die Vakuumquelle 18 sollte in der Lage sein, ein Vakuum gleich oder größer 25 Inch Quecksilber zu erzeugen. Eine Vakuumpumpe, die erfolgreich verwendet wurde, wird von SGA Scientific in Bloomfield, New Jersey, Part #LV-6610 bereitgestellt.
Jede der Öffnungen 20 kann in Form einer konischen Vertiefung 32, die auf der Oberseite des Verteilers 10 ausgebildet ist, vorliegen und mit der Leitung 12 in Verbindung stehen. Der Verteiler 10 kann aus jedem beliebigen geeigneten Material, das chemisch und biologisch inert ist, hergestellt sein. Geeignete Materialien für diesen Zweck sind Polyethylen, Polypropylen oder ein ionomeres Harz, wie z.B. "Surlyn", das von E. I. du Pont de Nemours and Company vertrieben wird.
Ein typischer Behälter, der mit dem Verteiler von Figur 1 Verwendung finden kann, ist in Figur 2 dargestellt, und ist in der allgemeinen Form einer Pipette mit einem ballonförmigen oberen Teil oder Kammer 38 und einem herausragenden röhrenförmigen Teil 40. Der Behälter kann aus irgendeinem der Plastikmaterialien, die für den Verteiler verwendet werden, geformt sein. Vorzugsweise ist der obere ballonförmige Teil 38 flexibel und schließt an den röhrenförmigen Teil 40 an, der in einem konischen Spitzenteil 42 endet, der in den Konus der Öffnungen 32 des Verteilers eingeführt werden kann.
Die obere Kammer 38 stellt eine Möglichkeit zum manuellen Messen des Flüssigkeitsstromes in den Behälter hinein und aus dem Behälter heraus zur Verfügung. Wenn und falls der Behälter manuell verwendet wird, kann der Anwender die Menge der Probe und flüssigen Reagentien, die in den Behälter hineingebracht und herausbefördert werden, steuern, indem mit dem Finger Druck ausgeübt wird. Z.B. können Testflüssigkeiten bis zu einer vorkalibrierten Markierung auf der Röhrchenwand angesaugt werden. Auf diese Weise kann eine abgemessene Probenmenge ohne ein zusätzliches Meßgerät zu benötigen, in den Behälter gebracht werden. Die obere Kammer kann zum Aufbewahren des Einfangreagens dienen. Zusätzlich können andere Reagenzientypen, etwa Antikörper-Enzym-Konjugate oder andere Typen von Markierungsreagenzien auch in diesem Teil der Vorrichtung aufbewahrt werden. Ein poröser Rückhalter kann in den Röhrenteil 40 des Behälters eingelassen sein, um als durchlässige Sperre zu wirken. Die Poren in dem Rückhalter können groß genug sein, um den Flüssigkeitsstrom oder den Eintritt von Zellen, Mikroorganismen, Zellfragmenten oder für die Analyse interessante Teilchen nicht zu behindern. Andererseits können die Poren klein genug sein, um wirksam die aus Teilchen bestehenden Einfangreagenzien zu sammeln. Auf diese Weise können die Einfangreagenzien wirksam zurückgehalten und gewaschen werden. So werden vor dem Einführen eines porösen Rückhalters 44 in den röhrenförmigen Teil 40 des Behälters aus Teilchen bestehende Einfangreagenzien 41 in den oberen Kammerteil 38 eingeführt. Gemäß einer besonders vorteilhaften Verfahrensweise, ist es wünschenswert, die Funktionen des porösen Rückhalters mit dem Einfangabsorbens zu kombinieren. Das kann durch Immobilisieren der Einfangreagenzien, wie z.B. einem Antikörper für APS-Reduktase auf dem porösen Rückhalter oder auf den Wänden der Säule selbst erreicht werden. Das Einfangreagens wird dadurch immobilisiert, daß es auf einem festen Träger angebracht wird, so daß es den Behälter nicht verlassen kann.
Die Länge des Röhrenteils 40 zusammen mit dem inneren Durchmesser des Röhrenteils kann ein Volumen bestimmen, das gleich oder geringer als das Volumen des oberen Kammerabschnitts 38 ist. Ähnlich kann das innere Volumen des Röhrenteils 40 dasjenige der Analytenprobe überschreiten, wie z.B. das Lysat der Sulfat reduzierenden Bakterien und die begleitenden Reagensflüssigkeiten, die verarbeitet werden sollen, d.h. die Testflüssigkeiten. Daher sollte das Innenvolumen des Behälters das Volumen der Testflüssigkeiten um mehr als den Faktor zwei überschreiten.
In einer alternativen Ausführungsform kann der Röhrenteil 40 wie eine Säule gepackt sein. Diese Ausführung ermöglicht es, die Absorptionsreagenzien in einer Mikrosäule zu formen, um den Probenanalyten einzufangen. Der Säulenabschnitt kann auch wie ein zweiter Reagens-Abschnitt wirken. Die Einfang- oder Reagensteilchen, die auf ihrer Oberfläche einen Antikörper für APS-Reduktase haben, können bei der Herstellung hinzugefügt und in der Säulenkammer untergebracht werden. Die Säule ist einfach herzustellen, indem ein poröser Stopfen (nicht dargestellt) an einem Ende der Säule gebildet wird, um das Packungsmaterial der Säule zurückzuhalten.
In noch anderen alternativen Ausführungsformen können der Vorrichtung zusätzliche Kammern hinzugefügt werden. Z.B. können zerbrechbare Ampullen oder blasenförmige Körper in den Ballon 38 eingesetzt sein. Auf diese Weise können die Reagenzien bis zum entsprechenden Schritt des Testverfahrens aufgeteilt werden. Bei Anwendung von Druck können die Ampullen oder blasenförmigen Körper zur Reagenzienfreigabe geöffnet werden.
Eine Schutzkappe 43 kann auf das Ende des Behälters auf Wunsch aufgesetzt werden, um die Reagenzien während des Versands zu schützen oder zum Schutz für den Anwender, bei der Handhabung der Vorrichtung während des Testens. Z.B. kann die Schutzkappe verwendet werden, um einen wirksamen Feuchtigkeitsschutz für trockene Reagenzien innerhalb des Behälters während des Tranports und der Lagerung zu erzeugen. Während des Arbeitsablaufs kann es wünschenswert sein, die Kappe zu verwenden, um die Berührung mit den Probenmaterialien, die in dem Behälter zurückbleiben können, durch den Anwender zu vermindern. Des weiteren kann die Kappe verwendet werden, farbbildende Reagenzien in dem Behälter für nachfolgende Tests einzuschließen, wodurch sie am Heraussickern während des farbbildenden Vorgangs gehindert werden. Die Kappe kann aus flexiblem, chemisch inertem Plastikmaterial, ähnlich jenem, das für den Behälter selbst beschrieben ist, bestehen.
Ein Stopfen 46 mit einer der Öffnungen 32 entsprechenden Form, kann dazu dienen, jede beliebige Öffnung des Verteilers, die nicht durch einen Behälter während des Testablaufs besetzt ist, zu verschließen. Der Stopfen 46 kann aus einem geeigneten Plastikmaterial geformt sein, das das gleiche wie bei den Behältern ist.
Das Prinzip der Durchführung beruht auf der Bildung eines geschlossenen Systems, das durch Einsetzen der Flüssigkeitsbehälter in die Öffnungen des Multiport-Verteilers geschaffen ist. Dies bildet ein geschlossenens System, das ein Kuppeln des Verteilerinneren mit dem Behälterinneren oder der Testvorrichtung einschließt. Coordiniertes Öffnen der Vakuum- und Luftventile ermöglicht es, den Arbeitsdruck innerhalb jeden Behälters sich vermindern oder auf Atmosphärendruck steigern zu lassen. Coordiniertes Öffnen und Schließen der Reagens-, Luft-, Vakuum-, Substrat- und Waschflüssigkeitsventile, schafft für jeden Behälter einen Flüssigkeitszugang. Vorzugsweise wird Vakuum und Luft stoßweise zugeführt. Der gleiche Arbeitsaufwand kann verwendet werden, die Flüssigkeiten aus den Behältern zu entfernen.
Wird Vakuum, Luft oder Gas verwendet, das sich in den Behältern befand oder diesen beigegeben wurde, dehnt sich der Behälter aus, indem er eine Dehnungsblase bildet, die das Entfernen von Flüssigkeit aus dem Behälter durch "Pumpen" der Flüssigkeit aus dem Behälter erleichtert. Auf diese Weise können zwei gerichtete Flüssigkeitsverbindungen in die Behältervorrichtung und aus der Behältervorrichtung durch Anwendung einer in eine Richtung gehenden Vakuumkraft erreicht werden.
Der Flüssigkeitsstrom wird so erreicht, ohne daß komplizierte Ausrüstungsgegenstände, wie z.B. Spritzen oder Flüssigkeitspumpen, benötigt werden. Auf diese Weise kann das System mit negativem Druck arbeiten. Die Flüssigkeiten können schnell in beiden Richtungen in die Behälter und aus den Behältern durch die einzige Öffnung durch einfaches Anlegen von Vakuum bewegt werden. Coordiniertes Pulsieren von Vakuum und Luft bewirkt sowohl das Bewegen der Festphasen-Einfangreagenzien innerhalb der Behälter, als auch das Bereitstellen eines Verteilers für den "aktiven" Einfang des Analyten. Steuerung über das Vakuum im Verteiler befähigt die Probe und die Testreagenzien, vorwärts und rückwärts durch die Reagenzien im Kreise geführt zu werden. Das erhöht nicht nur die Bindungsgeschwindigkeit des Analyten, sondern maximiert auch die Wirksamkeit des Einfangens des Analyten durch den Festphasenträger. Z.B. kann der Recyclingvorgang fortgesetzt werden, bis der Analyt in der Probe wirksam an den Träger gebunden ist. Diese Fähigkeit verkürzt nicht nur die Zeit des Analytikers, sondern sichert auch eine maximale Testantwort.
In Figur 6 ist ein allgemeines Prozessor-Fließdiagramm zu sehen, bei dem die Steuereinheit 30 (Figur 1) die verschiedenen Ventile 14, 17, 22 (Figur 1) betätigt, um den Behälter 36 Vakuum oder Gasdruck oder verschiedenen Waschungen oder Reagenzien auszusetzen. Das Programm schließt ein anfängliches Spülen des Systems ein, wie durch Block 50 beschrieben ist, um das System vor Verwendung zu reinigen. In diesem Umlauf werden alle Öffnungen 32 mit einem Stopfen 46 für die Behälteröffnungen abgedichtet, so daß das System geschlossen ist. Während des Spülumlaufs wird zuerst ein Vakuum der Quelle 18 an die Leitung 12 durch Öffnen des Ventils 14 für einen Zeitraum der Größenordnung von 5 Sekunden angelegt. Unmittelbar danach wird das Ventil 22 für die Waschlösung mit dem Vakuum für einen kurzen Zeitraum, typischerweise 0,2 Sekunden, geöffnet. Während dieses Teils des Umlaufs wird die Waschflüssigkeit in die Leitung 12 eingesaugt und durch die Abfall Falle 16 herausgesaugt in die Vakuumquelle 18, wobei sie die Leitung gründlich reinigt. Dieser Umlauf kann mehrere Male wiederholt werden, typischerweise dreimal, wobei anfänglich Vakuum angelegt wird, woraufhin das Ventil 14 mit einem der Waschventile geöffnet wird. Danach kann das Vakuum für einen kurzen Zeitraum, typischerweise für zwei Sekunden, aufrechterhalten bleiben, um alle Flüssigkeiten aus dem System zu entfernen. Danach wird der ausführenden Person ein Pausenbefehl gegeben, der ihr mitteilt, die Behälter in die Vorrichtung zu stellen, bevor weiter verfahren wird. Während dieser Pause werden die Behälter 36, von denen jeder eine zu verarbeitende Probe enthält und ein Einfangreagens, das in der Lage ist, eine bestimmte Komplexierungsreaktion durchzumachen, auf verschiedene Öffnungen 32 gestellt.
Als nächstes beginnt, wie durch Block 52 beschrieben, die Probenumlauf-Folge. Während dieser Folge werden die Testflüssigkeiten in dem Behälter zwingend nacheinander durch das Einfangreagens hindurch in den röhrenförmigen Teil des Behälters und dann zurück in den ballonförmigen Teil 38 im Inneren des Behälters geleitet. Diese Folge wiederholt sich 5 bis 10mal, um eine wirksame Wechselwirkung der Probe mit den Einfangreagenzien zu erreichen. Dieser Vorgang wird durch ein anfängliches Anlegen eines anwachsenden leichten Vakuums durch das Ventil 14 und dem gleichzeitigen Öffnen des Luftventils 17 durchgeführt. Dann werden die Ventile geschlossen. Nach einer kurzen Verzögerung, etwa 0,5 Sekunden wird das Luftventil 17 für typischerweise 5 bis 10 Sekunden geöffnet. Das ermöglicht den Testflüssigkeiten, in den oberen Teil der Behälter zurückzufließen. Die Vakuum/Luft Ventil Folge, die oben beschrieben ist, wird dann typischerweise 3 bis 10mal wiederholt, bis wirksames Einfangen des Analyten stattgefunden hat. Während des Vorgangs ist es wichtig, etwas Gas oder Luft in dem Behälter zu lassen, damit Flüssigkeit später abgezogen werden kann, wie unten beschrieben wird.
Als nächstes wird, wie durch Block 54 beschrieben, die Probe aus dem Behälter entfernt und zur Falle für Abfall 16 geführt. Das muß unter Vermeidung eines Probenübergangs zwischen den Behältern geschehen. Typischerweise wird dies durch allmähliches Entfernen der Flüssigkeiten aus den Behältern und durch Verdünnen der Testflüssigkeiten in der Verteilerkammer 10 durchgeführt, während sie in die Falle gespült werden. Der Druck der Behälter wird verfahrensgemäß allmählich durch wiederholtes gleichzeitiges Öffnen der Vakuum- und Waschventile in 0,1 Sekunden Intervallen vermindert. Dieses vermindert allmählich den Druck in dem Behälter, während Waschflüssigkeiten durch den Verteiler gezogen werden, um die Flüssigkeiten in die Falle 16 zu spülen. Der Umlauf zur Probenentfernung wird dann durch die Anwendung eines stärkeren Vakuums vervollständigt, um alle Flüssigkeitsreste durch wiederholtes Öffnen des Vakuumventils 14 in 0,5 Sekunden Intervallen zu entfernen.
Als nächstes kann der Behälter, wie bei 56 (Figur 6) beschrieben, gewaschen werden. Während des Waschumlaufs wird der Behälter einem Vakuum ausgesetzt, indem Ventil 14 typischerweise 5 bis 10 Sekunden geöffnet wird. Danach werden Waschflüssigkeiten durch Öffnen der Ventile 19 und 22 injiziert. Das erlaubt das Füllen der Behälter mit Waschflüssigkeit. Die Flüssigkeit wird dann stufenweise entfernt, indem nach und nach Vakuum und dann Luft auf das Verteilersystem angewendet wird. Dieser Wechsel von Vakuum und Luftzufuhr verteilt die Flüssigkeiten und suspendiert das Einfangreagens innerhalb des Behälters. Diese Bewegung sorgt dafür, daß alle inneren Oberflächen mit Flüssigkeit in Berührung kommen. Die abwechselnde Vakuum und Luftzufuhr wird mehrere Male wiederholt. Schließlich wird das Vakuum verwendet, um jegliche zurückbleibende Flüssigkeit in dem Behälter zu entfernen. Während dieser Phase dehnt sich Gas, das in dem Behälter eingefangen ist, aus, wodurch es die Flüssigkeit aus dem Behälter herausdrängt. Die Zufuhr von Luft trägt auf diese Weise sowohl zu gesteigerter Waschwirksamkeit bei, als auch zur Entfernung von Flüssigkeit aus dem Verteilersystem.
Als nächstes werden ein Farbbildner, wie z.B. ein proteinartiges Material, das durch Entwickeln von Farbe erkannt werden kann und ein Farbentwickler entweder zusammen oder nach einander zu jedem Behälter 36 zugegeben (Block 58), wobei zunächst das gesamte Verteilersystem einem Vakuum ausgesetzt wird. Als nächstes wird das Substratreagens 28 (Figur 1) zugegeben, gefolgt von der Anwendung von Luftdruck, um die Einfangteilchen zu suspendieren und den Farbbildner in den Behälter 36 gelangen zu lassen. Diese pulsierende Luftzufuhr wird mehrere Male wiederholt, danach wird Luft etwa 10 Sekunden eingelassen. Es wird eine Pause von einigen Minuten eingelegt, damit Farbentwicklung stattfinden kann und die Behälter "abgelesen" werden können. Danach wird das System gereinigt (Block 60) durch Anlegen eines Vakuums mit anschließenden abwechselnden Pulsen von Waschlösung und Vakuum. Diese Folge von Waschlösung und Vakuum wird mehrere Male wiederholt.
Durch selektives Einwirkenlassen der Reagenzien, Luft, Waschflüssigkeiten und Vakuum auf den Behälter, wird der Flüssigkeitsstrom in die Vorrichtung hinein und aus der Vorrichtung heraus präzise gesteuert, und alle wichtigen arbeitsmäßigen Funktionen, die für den Komplexierungsvorgang erforderlich sind, können ausgeführt werden. Auf diese Weise wird eine vollständige Automation einer Testmethode erreicht.
Die bedeutenden Vorteile beim Testen, die als ein Ergebnis des Systems und der Arbeitsmethode verwirklicht sind, wie z.B. beschleunigte Testantwort und hohe Empfindlichkeit, können auch bei der Verwendung der Testbehälter im manuellen Betrieb erreicht werden. Der flexible, ballonförmige Behälter dieser Erfindung ermöglicht den Flüssigkeiten, in die Vorrichtung gesaugt und manuell verarbeitet zu werden. Auf diese Weise können die Test-Funktionen des Probenmessens, des aktiven Einfangens des Analyten, des Trennen des Reagenzes und zusätzlicher Farbbildner manuell durch den Fingerdruck des Anwenders auf den zusammendrückbaren, ballonförmigen Behälter durchgeführt werden. Während dieses Vorgangs wird auch das aktive Einfangen des Analyten erreicht, indem die Probe vorwärts und rückwärts durch das Einfangreagens umgepumpt wird. Überschüssige Probe und Reagenzien können dann entfernt und von dem "gebundenen" Analyten durch nachfolgende Waschschritte getrennt werden. Gebundener Analyt kann entweder durch Verwendung eines nicht-isotopenmarkiertes und/oder ein isotopenmarkiertes Reagens nachgewiesen werden. Der ballonförmige Behälter kann auf diese Weise viele der Funktionen sowohl einer Pipette als auch eines Tropfers ausführen. Obwohl die Vorteile des Testens der mit diesem System erreichten Testgeschwindigkeit und Empfindlichkeit bei manueller Arbeitsweise erhalten bleiben, erfordern die manuellen Verfahren eine aktive Beteiligung der ausführenden Person und daher sind sie arbeitsintensiver und mit Fehlern durch die ausführende Person behaftet.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung

Einige gegenwärtig bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in dem vorangehenden Abschnitt unter Berücksichtigung der detaillierten Beschreibung der Zeichnungen ausführlich beschrieben worden. Weitere gegenwärtig bevorzugte Formen werden im Anschluß hieran beschrieben und weitere eingehende Ausarbeitungen mitgeteilt.
In einer grundlegenden Ausführungsform betrifft die Erfindung mit einem Verfahren zum Nachweis Sulfat reduzierender Bakterien in wäßriger Umgebung, das drei hauptsächliche Schritte umfaßt. Im ersten Schritt wird ein Lysat einer Probe, die der Umgebung entnommen und so ausgewählt ist, daß sie die in der Umgebung vorhandenen Mikroorganismen enthält, so hergestellt, daß in das Lysat ein Enzym freigesetzt wird, das die Sulfat reduzierenden Bakterien verwenden, um durch die Reduktion des Sulfats Energie zu gewinnen. Die Probe kann nach irgendeiner herkömmlichen Technik genommen werden. Wenn z.B. die zu untersuchende Umgebung eine wäßrige Flüssigkeit in einer Brunnenbohrung oder einer unterirdischen kohlenwasserstoffhaltigen Formation ist, kann die Flüssigkeit einfach mittels einer Einsatzpumpe, die die Brunnenbohrung oder dergleichen abfegt, gewonnen werden, und aus der erhaltenen Flüssigkeit können Proben genommen werden. Wenn sich die Umgebung gemäß einem anderen Beispiel, unterhalb von Bakterienkolonien befindet, die auf Metalloberflächen wachsen, wie z.B. Schweißstellen, in Rohren, auf Kühltürmen oder in Reaktionskesseln, können repräsentative Vertreter der Kolonien in eine wäßrige Flüssigkeit hineingekratzt und aufgebrochen werden, was einen angemessenen Teil der Technik der Lysatherstellung darstellt. Nehmen die Bakterien einen verhältnismäßig geringen Anteil der Probe ein, können sie leicht nach bekannten Techniken konzentriert werden, beispielsweise durch Filtration, Zentrifugation und dergleichen. Wird eine quantitative oder halb quantitative Bestimmung der Anzahl Sulfat reduzierender Bakterien gewünscht, sollte natürlich auf die Aliquots bei Verdünnungs- und Konzentrierungsschritten geachtet werden.
Ist die Probe einmal aus der Umgebung entnommen und passend konzentriert, verdünnt und/oder anderweitig vorbereitet, wird das Lysat nach irgendeiner geeigneten, der Fachwelt bekannten Technik hergestellt. Die Zellwände können z.B. lysiert oder durch mechanische Bewegung, Ultraschall, Enzym- oder andere chemische Einwirkung oder dergleichen, auf die Zellwände, aufgebrochen werden. Natürlich sollte beachtet werden, daß die Verfahren zur Durchführung der Lyse, nicht das Enzym denaturieren, das die Sulfat reduzierenden Bakterien zur Energiegewinnung durch die Reduktion von Sulfat verwenden. Gegenwärtig ist die Schall-Lysis eine bevorzugte Technik, die sowohl als geeignet als auch als wirksam befunden worden ist.
Das Enzym, das Sulfat reduzierende Bakterien zur Energiegewinnung durch Sulfatreduktion verwenden, das freigesetzt ist und dessen sich das Verfahren vorteilhaft bedient, ist gegenwärtig vorzugsweise eine Adenosin-5'-phosphosulfat- Reduktase, kurz APS-Reduktase, jedoch ohne von dem allgemeinen Prinzip der Erfindung abzuweichen. Andere Reduktasen, wie z.B. die Sulfitreduktasen können auch geeignet sein.
Im zweiten Schritt des Verfahrens zum Nachweis Sulfat reduzierender Bakterien, wird ein Anteil des Lysates, das im ersten Schritt hergestellt wurde, mit einem Antikörper für das Enzym unter Reaktionsbedingungen für eine Antikörper- Enzym-Reaktion in Berührung gebracht.
Der Antikörper für das Enzym kann nach herkömmlichen Techniken hergestellt werden. Z.B. kann die bevorzugte APS-Reduktase von anderen proteinhaltigen Materialien nach herkömmlichen biochemischen Techniken gereinigt und danach in einen Organismus, der ein Immunsystem hat, injiziert werden. Bequemerweise können Labortiere, wie z.B. Kaninchen, Mäuse, Ratten und dergleichen als geeignete Organismen mit einem Immunsystem verwendet werden, oder für große Mengen kommen größere Tiere, wie z.B. Ziegen, Schafe, Rinder und Pferde in Betracht. Kaninchen sind bis heute in der Praxis der Erfindung als geeignet befunden worden. Gemäß einer Ausführungsform, wird die gereinigte APS-Reduktase in den Blutstrom eines Tieres injiziert, und die Antikörper werden geerntet, nachdem sie durch das Immunsystem des Tieres gebildet worden sind. Die Antikörper können leicht wiedergewonnen und mit herkömmlichen Techniken gereinigt werden.
Im zweiten Schritt werden der passend isolierte Antikörper und die wäßrige Flüssigkeit, die das Enzym potentiell enthält, unter Reaktionsbedingungen für eine Antikörper-Enzym- Reaktion miteinander in Berührung gebracht. Hier werden wieder herkömmliche, immunologische Techniken angewandt, und im allgemeinen findet die Antikörper-Enzym-Reaktion in einer wäßrigen Umgebung bei gewöhnlichen Raumtemperaturen statt, obwohl andere Bedingungen, so weit die Enzym- und Antikörperproteine nicht denaturiert werden, verwendet werden können.
Weiterhin wird, gemäß dieser gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, das Reaktionsprodukt des Enzyms und des Antikörpers nachgewiesen, um das Vorhandensein der Sulfat reduzierenden Bakterien auf eine einzigartige Weise zu bestimmen. An einfachsten kann das Reaktionsprodukt unter gewissen Umständen visuell auf Grund von stattfindender Agglutination nachgewiesen werden. Jedoch können auch andere Möglichkeiten zum Nachweis verwendet werden, z.B. durch Hinzufügen einer bekannten Menge radioaktiv markierten Enzyms zu der zu untersuchenden Enzymprobe und durch anschließendes Messen der Radioaktivität des Reaktionsproduktes, durch Messen der Absorption, des Reflexionsvermögens oder der Fluoreszenz, die durch Strahlungseinwirkung auf das Reaktionsprodukt induziert wurden oder durch andere, der Fachwelt bekannte Techniken.
Gegenwärtig wird das Reaktionsprodukt vorzugsweise nachgewiesen, indem das als Beispiel reagieren gelassene Antikörper-APS-Reduktase Reaktionsprodukt mit einem proteinhaltigen Material in Berührung gebracht wird, das leicht durch Farbentwicklung über Komplexbildung erkannt werden kann, und dann die Farbe des so gebildeten Komplexes entwickelt wird. Geeignete Nachweistechniken sind insbesondere in den Beispielen dieser Anmeldung offenbart. Andere geeignete Techniken sind der Fachwelt bekannt oder bieten sich leicht dem Fachmann an. Z.B. kann das proteinhaltige Material mit einem radioaktiven Isotop markiert sein, es kann mit einer Gruppierung markiert sein, die leicht durch Absorption, Reflexion oder Fluoreszenz nachzuweisen ist, oder es kann eine Gruppierung enthalten, die leicht mit Magnetischer Kernresonanz (NMR) oder dergleichen nachzuweisen ist, um nur einige Beispiele aus der anwendbaren Methodik zu nennen.
Es ist anzumerken, daß die Reihenfolge der Schritte nicht notwendigerweise kritisch ist. Auf diese Weise kann in einem Versuchsbeispiel der Antikörper mit der APS-Reduktase zur Reaktion gebracht werden, die dann mit einem proteinhaltigen Material zur Reaktion gebracht wird, das einen Komplex bilden kann, der durch die Entwicklung von Farbe erkannt wird, und dann kann die Farbe mittels eines geeigneten Reaktionspartners, wie z.B Peroxid, entwickelt werden. Es ist auch durchführbar, die APS-Reduktase mit einem proteinhaltigen Material reagieren zu lassen, das z.B. Peroxidase enthält und hierauf den Komplex mit dem Antikörper reagieren zu lassen. Des weiteren ist es durchführbar, beide Folgen gleichzeitig ablaufen zu lassen. So ist in einer gegenwärtig besonders bevorzugten Ausführungsform der Antikörper an ein festes Substrat in einem geeigneten Behälter gebunden. Das Lysat, das die APS-Reduktase enthält, wird dann in den Behälter eingeführt und ein Teil davon reagiert mit dem Antikörper, der an das feste Substrat gebunden ist. Ein anderer Anteil der APS-Reduktase bleibt ungebunden. Proteinhaltiges Material, das einen Komplex bilden kann, der durch Farbentwicklung erkannt wird und Material, das die Farbe entwickeln kann, werden vorher in den Behälter gegeben, oder werden in einer beliebigen anderen Reihenfolge in den Behälter gegeben. Ein Teil der APS-Reduktase reagiert mit dem proteinhaltigen Material, das dann mit dem Antikörper reagiert, und der Farbentwickler entwickelt Farbe, wobei alle Reaktionen in dem Behälter stattfinden. Ein Assay für die APS-Reduktase und folglich für Sulfat reduzierende Bakterien wird durch das Vorhandensein und/oder die Intensität der Farbe bestimmt, die mit der Peroxidase in Verbindung steht, die proteinhaltiges Material enthält, das an einen Festphasenträger über den Antikörper gebunden ist, der auf dem Festphasenträger gebunden ist. Selbstverständlich können die reaktionsfähigen Materialien ebenso nacheinander zugegeben werden mit angemessenem Waschen zwischen den Materialzugaben.
Gemäß einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform ist ein fester Träger in einem passenden Behälter angebracht. Der Festphasenträger umfaßt z.B. Polystyrol, das mit einer Monomerenlösung zur Reaktion gebracht wird, die eine Pfropfstelle und eine Antikörperbindungsstelle hat. Die Pfropfstelle kann z.B. eine passend aktivierte Ethyleneinheit sein, und die Antikörperbindungsstelle kann z.B. eine Epoxyeinheit sein. Ein Beispiel eines passenden Monomers ist Glycidylmethacrylat. Andere geeignete Materialien sind bekannt oder bieten sich von selbst dem Fachmann an. Insbesondere werden, gemäß einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform, Polystyrolkugeln mit Glycidylmethacrylat in Gegenwart eines Elektronenstrahls, um ein Oberflächen- Pfropfpolymeres mit einer Vielzahl von Epoxygruppen zu bilden, wie z.B. ein Polystyrol-poly(glycidylmethacrylat)- Pfropfpolymer, reagieren gelassen. Ein Antikörper für ein Enzym, das Sulfat reduzierende Bakterien zur Energiegewinnung durch Sulfatreduktion verwenden, kann dann mit dem Oberflächen-Pfropfpolymer, das eine Antikörperbindungsstelle hat, wie z.B. das Polyglycidylmethacrylat, das eine Vielzahl von Epoxygruppen besitzt, verbunden werden. Antikörper als Beispiele, die durch Injektion von APS-Reduktase aus Sulfat reduzierenden Bakterien in einen Organismus mit einem Immunsystem gebildet wurden, können auf einem Polyglycidylmethacrylat-Oberflächen-Pfropfpolymer gebunden werden, worin sich die Pfropfung auf Polystyrolkugeln befindet, und das entstandene Material kann in einen Behälter gebracht werden, der eine Zugangsöffnung und eine Möglichkeit hat, Flüssigkeiten in den Behälter hineinzubringen und daraus zu entfernen. Gemäß dieser gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform ist es auch oft zweckmäßig, ein proteinhaltiges Material, das leicht durch Farbentwicklung erkannt wird, in einem Behälter unterzubringen, ebenso wie ein Material, das befähigt ist, die Farbe eines proteinhaltigen Materials zu entwickeln. Verschiedene andere Anordnungen bieten sich dem Fachmann im Hinblick auf diese Offenbarung an. Z.B. kann in einer verhältnismäßig einfachen Anordnung der feste Träger in Form von Kugeln oder anderen geformten Körpern zusammen mit den anderen Materialien in einer gewöhnlichen Pipette angeordnet sein, und die zu testenden Lysate und anderen Materialien können mittels Ansaugen oder dergleichen, eingeführt werden.
Eine verfeinerte Ausführungsform war früher mit Hinweis auf die EPA Anmeldung 0 198 413 beschrieben. Jedoch kann für gewöhnliche Felduntersuchung und Kontrolle Sulfat reduzierender Bakterien, eine der einfacheren vorher beschriebenen Ausführungsformen in vielen Fällen praktischer sein.
Gemäß einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform, können Sulfat reduzierende Bakterien in einem qualitativen Sinn nachgewiesen werden, oder durch angemessene Berücksichtigung von Aliquots und passender Eichung, können Sulfat reduzierende Bakterien unter Brücksichtigung der wäßrigen Umgebung sowohl nachgewiesen als auch quantifiziert werden.
Gemäß einer anderen gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, wird eine wirksame Menge eines bakteriziden oder bakteriostatischen Mittels für Sulfat reduzierende Bakterien in die wäßrige Umgebung eingeführt als Antwort auf das Vorhandensein Sulfat reduzierender Bakterien, um sie abzutöten oder das Wachstum der in wäßriger Umgebung vorhandenen Sulfat reduzierenden Bakterien zu hemmen. Zwei Vorteile der Nachweismethode zur Steuerung sind
1.) sie erbringt über das Vorhandensein Sulfat reduzierender Bakterien im Vergleich zu gängigen Verfahren sehr schnell Daten, in wenigen Minuten, verglichen mit gängigen Verfahren, die für die Datenerhebung Wochen erfordern und
2.) ist das erfinderische Verfahren viel empfindlicher, was den Nachweis von sehr niedrigen Bakterienspiegeln erlaubt.
Die Folgen, die sich hieraus für die Steuerung ergeben, sind, daß Biozide angewendet werden können, wenn die Zelldichten niedrig genug sind, um
a) für Biozide anfällig zu sein und
b) durch niedrige Bioziddosen gehemmt zu werden, was sich kostengünstig auswirkt.
Dies steht im Gegensatz zur augenblicklichen Lage, in der Wochen vergehen zwischen der Wasserprobennahme und den Testergebnissen. Da sich Sulfatreduzierer wie die meisten Bakterien sehr schnell vermehren und in der natürlichen Umgebung Verdopplungszeiten von 10 bis 20 Stunden haben, läßt eine Inkubationszeit von zwei Wochen das Anwachsen auf Bakteriendichten zu, die auf die Biozidbehandlung nicht ansprechen können. Außerdem kann die Wirksamkeit eines einzelnen Biozids schnell abgeschätzt werden, was zu einer niedrigeren Biozidverwendung führen kann. Vorzugsweise sind die Mittel zur Steuerung auf die Menge der nachgewiesenen Sulfat reduzierenden Bakterien zugeschnitten. Sie sind auch auf die spezielle Umgebung zugeschnitten. Z.B. können im Fall, daß Sulfat reduzierende Bakterien zwischen korrodierbaren Materialien und Kolonien von anderen Bakterien gefunden werden, Ozon, Wasserstoffperoxid oder andere Peroxide eingesetzt werden. Wenn z.B. die Sulfat reduzierenden Bakterien schädliche Wirkungen in einem Bohrloch oder einer unterirdischen Formation verursachen, können organische Biozide verwendet werden. In der Industrie sind eine Anzahl geeigneter Biozide bekannt, einschließlich Acrolein, Chlor, Aldehyde wie etwa Formaldehyd, Chlorate, quarternäre Ammoniumsalze und dergleichen. Ein Vorteil dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist, daß die Mittel zur Steuerung auf das Vorhandensein und die Menge der vorhandenen Sulfat reduzierenden Bakterien zugeschnitten werden können. Auf diese Weise lassen sich unwirtschaftliche und teure Behandlungen, die schädliche Substanzen in die Umgebung einbringen können, vermeiden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Form dieser Ausführungsform kann ein Assay für Sulfat reduzierende Bakterien nachdem bakteriozide oder bakteriostatische Behandlung der Umgebung stattgefunden hat, durchgeführt werden, um die Wirksamkeit der Behandlung und die mögliche Notwendigkeit weiterer Behandlung nachzuweisen.

Beispiele

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung vollständiger erläutern und dem Fachmann Informationen über den Durchführungsweg zukommen lassen. Jedoch heißt das nicht, daß diese Beispiele in irgendeiner Weise als Begrenzung der Erfindung, wie sie hier beschrieben und beansprucht ist, anzusehen sind.
Eine gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform wird in den folgenden Beispielen 1 bis 7 erläutert. Das folgende Verfahren wurde angewandt:
Ein als Beispiel dienender Stamm von Desulfovibrio desulfuricans wurde aus Brunnenwassergewinnung isoliert, die auf einem Feldgrundstück von Conoco Inc. mit der Bezeichnung Grubb Lease Well #100, bei Ventura, Californien gelegen, erhalten wurde. Der verwendete Stamm wurde durch zweimaliges, nacheinander erfolgendes Herauspicken einer einzelnen Kolonie aus angereichertem BTZ-3 Medium isoliert. Mikrobiologische Charakterisierung wies das Isolat als D. desulfuricans aus.
BTZ-3 Medium hat folgende Zusammensetzung:
NH&sub4;Cl 3,4 g
KH&sub2;PO&sub4; 0,5 g
MgCl&sub2; 6 H&sub2;O 0,2 g
Na-acetat 2,0 g
CaCl&sub2; 2 H&sub2;O 0,1 g
Hefe-Extrakt 0,85 g
Destilliertes Wasser 840 ml
Mineralstofflösung 10 ml
Zusammensetzung der Mineralstofflösung:
Nitrilotriessigsäure 6,4 g
FeCl&sub2; 4 H&sub2;O 150 mg
CuCl&sub2; 10 mg
MnCl&sub2; 4 H&sub2;O 50 mg
CoCl&sub2; 85 mg
ZnCl&sub2; 50 mg
H&sub3;BO&sub3; 5 mg
Na&sub2;MoO&sub4; 2 H&sub2;O 5 mg
H&sub2;O 500 ml
pH-Einstellung auf 7,0
Supplementiertes BTZ-3 Medium wurde durch Zufügen von Aliquots an steril filtrierten Lösungen von Na-lactat und Na-sulfat hergestellt, so daß jede in einer Endkonzentration von 40 mM vorhanden ist. Für ein festes Medium wurden 1,2 Gew.-% Agar dem supplementierten BTZ-3 Medium zugefügt. Hefe-Extrakt wurde von Difco Laboratories, Detroit, Michigan bezogen.
D. gigas, D. vulgaris, D. desulfuricans (Norwegen), D.multispirans, Desulfosarcina variabilis, Desulfotomaculum ruminis, Dt. orientis, D. desulfuricans, Stamm 27774 wurden aus dem Laboratorium von Dr. H. D. Peck, Department of Biochemistry, University of Geogia, Athens, GA, 30601 erhalten. D sulfuricans Stamm API wurde vom American Petroleum Institut erhalten. Diese Sulfat reduzierenden Bakterien wurden in Flaschen mit 500 ml supplementiertem BTZ-3 Medium unter Argonatmosphäre gezüchtet.
Farblose Schwefelbakterien, Thiobacillus thioparus ATCC 8158, T. denitrificans ATCC 23642 und T. neapolitanus ATCC 2308 und T. ferrooxidans ATCC 2370 wurden erhalten und auf dem von ATCC empfohlenem Medium gezüchtet. Sie wurden unter aeroben Bedingungen unter Schütteln in Kulturen mit 200 ml Medium wachsen gelassen.
Fotosynthese-Schwefelbakterien, Clorobium thiosulfatophilum ATCC 17092 und Chromatium vinosum ATCC 17899 wurden erhalten und auf dem von ATCC empfohlenem Medium gezüchtet. Sie wurden unter Fotosynthesebedingungen und anaerob in "WHEATON" Flaschen mit 200 ml Medium gezüchtet.
Escherichia coli HB101 wurde von J. D. Wall, Department of Biochemistry, University of Missouri, Columbia, MO, 65201 erhalten. Sie wurden unter aeroben Bedingungen unter Schütteln in Kulturen mit 200 ml Medium wachsen gelassen.
Streptomyces lividans Stamm J1326 wurde vom John Innes Institute, Norwich, United Kingdom erhalten. Sie wurden unter aeroben Bedingungen unter Schütteln in Kulturen mit 200 ml Medium wachsen gelassen.

Sammeln und Lysieren der Bakterienzellen

Bakterien aus den verschiedenen Kulturen wurden durch Zentrifugieren der Bakteriensuspensionen während 30 Minuten bei 10 000 U/Min in einem Sorvall GSA Rotor gesammelt. Die erhaltenen Bakteriensedimente wurden in 25 mM Hepes (Hydroxyethylpiperazinethansulfonat von Sigma Chemicals Co., St. Louis, Mo) Puffer bei pH 7,0 resuspendiert (1:10 G/V) und durch eine French Pressure Cell unter 20 000 psi geleitet. Das entstandene Zell-Lysat wurde 30 Minuten bei 15 000 U/Min in einem Sorvall SS-34 Rotor zentrifugiert, um unaufgebrochene Bakterienzellen abzusetzen. Die überstehende Flüssigkeit enthielt die löslichen Proteine und teilchenförmigen Membranbruchstücke. Überstehende Flüssigkeiten von den Kulturen verschiedener Bakterien, die geeignet in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,2, (PBS) (Natriumchlorid, 8,0 g, Kaliumchlorid, 0,2 g, Dinatriumhydrogenphosphat, 0,2 g Wasser, 1000 ml) gelöst sind, dienten als Proben für die immunologische Analyse der APS-Reduktase.
Die folgende Technik wurde zur Herstellung und Reinigung von APS-Reduktase, um als Antigen für die Antikörpererzeugung zu dienen, verwendet.
Die sedimentierten Bakterienzellen (50 g aus einer Kultur von D. desulfuricans, Stamm G100A wurden in 25 mM Trispufferlösung (100 ml) mit einem pH von 7,0 suspendiert (1:2 G/V). Die erhaltene Suspension wurde wie oben beschrieben, durch eine French Pressure Cell hindurchgeleitet. Das erhaltene Lysat wurde wie oben beschrieben zentrifugiert, dann wurde die erhaltene überstehende Flüssigkeit zusätzlich 90 Min bei 180 000 x g zentrifugiert. Streptomycinsulfat (35 ml einer 5%-igen Lösung) wurde zu der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit hinzugefügt, um die Nukleinsäuren zu fällen. Die ausgefällten Nukleinsäuren wurden durch Zentrifugation bei 20 000 x g während 20 Minuten sedimentiert. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit enthielt nur lösliche Proteine und wurde als Rohextrakt bezeichnet.

Schritt 1. Ammoniumsulfat Fraktionierung:

Ammoniumsulfat wurde zum Rohextrakt in einer Konzentration von 35% (Gew.-%) der gesättigten Konzentration hinzugefügt. Das erhaltene Präzipitat wurde durch Zentrifugieren der Mischung bei 20 000 x g während 20 Minuten gesammelt. Zur erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde weiteres Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 60% Sättigung zugegeben und das Präzipitat nach einer Zentrifugation wie oben gesammelt. Die beiden wiedergewonnenen Präzipitate wurden in 50 ml Tris-HCl Puffer, pH 7,0, gelöst und auf APS-Reduktaseaktivität, wie hier beschrieben, untersucht. Der Hauptanteil an Aktivität wurde in dem zurückgewonnenen Präzipitat gefunden, wenn das Ammoniumsulfat auf 60% der Sättigungskonzentration gebracht war.

Schritt 2. Phenylsepharose Chromatographie:

Ammoniumsulfat wurde zu dem gelösten Präzipitat aus der 60%-Fraktion von Schritt 1 zu einer Endkonzentration von 1 M dazugegeben. Diese Lösung wurde über eine Phenylsepharose-Säule (2,5 cm x 20 cm)(Sigma Chemicals Co., P. O. Box 14508, St. Louis, Mo. 63178), die mit 1 M Ammoniumsulfatlösung in 25 mM Tris-HCl Puffer, pH 7,0 äquilibriert war, gegeben. Nachdem das Protein vollständig auf der Säule absorbiert war, wurden die Proteine mit einem Ammoniumsulfat Gradienten von 1 M bis 0 M in 25 mM Tris-HCl Puffer, pH 7,0 eluiert. Dieser Schritt erbrachte eine fast dreifache Reinigung mit einer Wiedergewinnung von 63% der Enzymaktivität.

Schritt 3. Hydroxylapatit Chromatographie:

Natriumchlorid wurde zu der Lösung, die die eluierten Proteine aus Schritt 2 enthielt, bis zu einer 0,3 M Konzentration zugegeben, und die erhaltene Lösung wurde über eine Hydroxylapatit-Säule (2,5 cm x 10 cm) (Bio-Rad Laboratories, 2200 Wright Avenue, Richmond, Ca.) gegeben. Zuerst wurden die Proteine mit 25 mM Tris-HCl Puffer, pH 7,0 eluiert. Dieses Eluat enthielt 30% der gesamten APS-Reduktase, und nachfolgende Elektrophorese zeigte, daß sie im wesentlichen homogen war. Die verbleibende APS-Reduktase wurde schrittweise mit 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0 eluiert. Die erste und zweite Fraktion wurden vereinigt und zur Konzentrierung auf ungefähr 5 bis 6 ml in 25 mM Tris-HCl Puffer, pH 7.0, der unter Berücksichtigung des Natriumchlorids 0,4 M war, über eine kleine Diethylaminoethyl 52 Cellulose- Säule (1 cm x 3 cm) (Whatman Ltd., Maidstone, England) geschickt.

Schritt 4. S 300 Gelfiltrations-Chromatographie:

Die in Schritt 3 konzentrierte APS-Reduktase wurde auf eine S 300-Säule (2,5 cm x 90 cm) (Biorad Laboratories), die mit 25 mM Tris-HCl Puffer, pH 7,0 äquilibriert ist, aufgetragen. Die Lösung wurde durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 15 ml/h gepumpt. Die eluierte APS- Reduktase war fast doppelt so hoch gereinigt, verglichen mit dem nach Schritt 3 wiedergewonnem Material, und die gesamte Wiedergewinnung der Enzymaktivität war 21%.
Bei jedem Schritt der Reinigung wurde die Proteinmenge mit der von Lowry et al., J. Biol. Chem., 193: 265 (1951) beschriebenen Methode bestimmt, und es wurde die Menge der APS-Reduktase bestimmt. Die APS-Reduktaseaktivität wurde durch spektrophotometrisches Verfolgen von Eisen(III)cyanid-Reduktion bei 420 nm (Em = 1000) in Gegenwart von Sulfit und Adenosin-5'-monophosphat (AMP) untersucht. Typischerweise wurden 10 bis 100 ul Enzymextrakt zu 3 ml eines Reaktionsgemisches, das aus 2 mM Kaliumeisen(III)cyanid, 0,33 mM AMP und 100 mM Tris Puffer bei pH 7,5 bestand, hinzugegeben. Die Reaktion wird durch Hinzufügen von 100 ul 0,1 mM Natriumsulfit in 5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) in Gang gesetzt. Die Ergebnisse dieser Reinigung sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 Schritt Nr. Volumen (ml) Einheiten pro ml* Gesamteinheiten Protein (mg/ml) Einheiten/mg Protein *Einheiten = Optische Dichte bei 420 nm/Min
Das Reinigungsverfahren ergab 21% Wiederfindung der Enzymaktivität mit einer 10,7-fachen Reinigung. Polyacrylamidgel- Elektrophorese Analyse des erhaltenen Produkts zeigte das Vorhandensein einer einzigen Proteinart mit einem Molekulargewicht von 132 000 Dalton an, wenn die Elektrophorese unter nicht denaturierenden Bedingungen durchgeführt wurde. Die gleiche Analyse zeigte zwei Proteine mit Molekulargewichten von 75 000 und 25 000 an, wenn die Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen ausgeführt wurde. Das Enzym wird als rein angesehen.
Zwei Kaninchen wurden gegen das erhaltene gereinigte Enzymprotein immunisiert, indem ihnen das Protein in einem geeigneten Träger nach einem Injektionszeitplan und nach einer den Immunologen wohl bekannten Weise injiziert wurde. Serum (Seren vor Immunisierung), das als Kontrollserum für spätere Immuntests dienen soll, wurde den Kaninchen, bevor sie die Injektionen mit Enzymprotein erhielten, abgenommen. Die Spezifität und Selektivität der Antikörper für APS-Reduktase ist eine Schlüsselkomponente dieser Erfindung. Während die Antikörper in den unten gegebenen Beispielen durch die Injektion von gereinigter APS-Reduktase aus D. desulfuricans, Stamm G100A in Kaninchen gewonnen wurden, schien gereinigte APS-Reduktase von irgendwelchen Sulfat reduzierenden Bakterien zu genügen, um als Antigen für die Bildung der Antikörper zu dienen, und es scheint Immunserum von irgendeinem Tier, das zur Bildung von Antikörpern geeignet ist, zu genügen.

Beispiele 1 bis 7

Das verwendete Enzymimmuno-Assay Verfahren war das, welches in "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tjissen, Verleger R. H. Burdon, P. H. van Knippenberg, Elsevier, S. 335-336 beschrieben ist. Die Fähigkeit sowohl der Seren vor der Immunisierung, als auch der Immunseren mit Proteinen in Sulfat reduzierenden Bakterien zu reagieren, wurde wie folgt getestet. Rohextrakt, wie oben definiert, der 800 ng Protein von jedem Bakterienstamm enthielt, wurde in jede von zwei Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (Nunclon, von Gibco, Life Technologies, Inc., Grand Island, NY, 14072) gegeben. Nach 2 Stunden Inkubation bei 25 ºC, wurden die Vertiefungen viermal mit einem Überschuß an PBS Puffer, der 0,05% Tween 20 Detergens (Sigma Chemical Co.) und 0,5 Gew.-% Gelatine enthielt, gewaschen. Das Waschen entfernt ungebundenes Antigen und verhindert jegliche zusätzliche Proteinbindung an das Plastikmaterial in den Vertiefungen. Ein Aliquot von 200 ul von Serum vor Immunisierung oder Immunserum, das mit PBS Puffer 1000-fach verdünnt wurde, wurde in die vorgesehenen Vertiefungen gegeben und 2 Stunden bei 25 ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann 4 weitere Male mit PBS gewaschen, das 0.05 Gew.-% des Detergens Tween und 0,5% Gelatine enthielt. Eine zweite Antikörperlösung, die aus anti-Kaninchen IgG, das mit Peroxiden (Sigma Chemical Co.) konjugiert ist, besteht, wurde mit PBS Puffer 1000-fach verdünnt, in jede Vertiefung gegeben (200 ul) und 2 Stunden bei 25 ºC inkubiert. Jede Vertiefung wurde wieder mit Tween- und gelatinehaltigem PBS gewaschen, um Überschüsse an konjugierten Antikörpern zu entfernen. Ein Aliquot (200 ul) einer Peroxidasesubstrat enthaltenden Lösung wurde zu jeder Vertiefung zugegeben. Die vor jeder Verwendung frisch zubereitete Peroxidasesubstratlösung enthielt 100 ml 0,15 M Citrat-Phosphat-Puffer pH 5, 34 mg o-Phenylendiaminhydrochlorid, 50 ul 30%-ige Wasserstoffperoxidlösung. Innerhalb 10 Minuten wurde die optische Dichte bei 410 nm unter Verwendung eines Dyna-Tech Mikrotiterplatten-Lesegeräts festgestellt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Die in der Tabelle für jede getestete Bakterienprobe dargestellten optischen Dichten wurden durch Substraktion der Werte, die in den Vertiefungen gemessen waren, die mit Seren vor der Immunisierung zur Reaktion gebracht waren, von den Werten aus den Vertiefungen mit Immunseren erhalten. Die Ergebnisse zeigen deutlich die Fähigkeit dieses gegen gereinigte APS-Reduktase aus D. desulfuricans G100A hergestellten Antiserums, sowohl mit gereinigtem Enzym aus demselben Organismus, als auch mit Rohextrakten aus demselben Stamm, zu reagieren, drei zusätzliche Stämme derselben Art und zwei andere Arten derselben Gattung sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Bakterienherkunft der Probe opt. Dichte bei 410 nm gereinigte APS-Reduktase aus D. desulfuricans G100A D. desulfuricans Stamm G100A D. desulfuricans Stamm API D. desulfuricans Stamm 13541 D. desulfuricans Stamm 27774 D. gigas D. vulgaris
Alle untersuchten Proben zeigen hohe Reaktivität.

Vergleichsbeispiele 8 und 9

Mit diesen Beispielen soll gezeigt werden, daß das gegen gereinigte APS-Reduktase aus D. desulfuricans, Stamm G100A hergestellte Immunserum nicht mit Extrakten aus nicht-Sulfat reduzierenden Bakterien reagiert.
Die oben beschriebenen Extrakte wurden aus Kulturen von Streptomyces lividans und Escherichia coli gewonnen. Sie wurden mit Serum vor der Immunisierung und Immunserum reagieren gelassen und die Menge der Reaktivität wie in den Beispielen 1 bis 7 beschrieben, nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Bakterienherkunft der Proben opt. Dichte bei 410 nm S. lividans E. coli
Es ergab sich geringe oder keine Reaktivität.

Beispiel 10

Dieses Beispiel bestätigt, daß das Material in den Extrakten, das mit den Immunseren reagiert, APS-Reduktase ist und kein anderes Protein, und daß die Reaktivität nicht irgendeine unspezifische Reaktivität ist. Western Immunoblot Analysen mit Extrakten von drei verschiedenen Arten von Desulfovibrio und der gereinigten APS-Reduktase wurden durchgeführt. Es wurden Rohextrakte von Bakterienkulturen, wie oben beschrieben, hergestellt. Gereinigte APS-Reduktase wurde wie oben beschrieben, hergestellt. Die Analyse bestand in der elektrophoretischen Trennung der Rohextrakte, der anschließenden Elektroelution der Proteinbanden auf Nitrocellulosepapier, wie es im wesentlichen im Bio-Rad Protein slab gel Handbuch (für die Elektrophorese) und den Bio-Rad Trans-Blot Anweisungen für Übertragungsmittel (für die Elektroelution), (Bio-Rad Laboratories) beschrieben ist. Die von Desulfovibrio untersuchten Arten waren D. multispirans, D. desulfuricans, Stamm API und D. desulfuricans, Stamm G100A. Die Nitrocellulose mit den übertragenen Proteinen wurde mit einer 1:1000 Verdünnung des Immunserums 2 Stunden inkubiert, dann mit Tween und Gelatine enthaltendem PBS 30 Minuten inkubiert, und dann mit einer Lösung einer 1:1000 Verdünnung von anti-Kaninchen IgG, das an Peroxidase konjugiert ist, 2 Stunden inkubiert. Die Nitrocellulose und Proteine wurden schließlich mit Peroxidasesubstrat, das an den Lokalisationsstellen der konjugierten Antikörper eine Farbe entwickelt, gefärbt. D. desulfuricans Stamm API und D. desulfuricans Stamm G100A brachten ein eiziges gefärbtes Protein hervor, und beide stimmten in ihren Positionen auf der Nitrocellulose mit der Position der gereinigten APS-Reduktase überein. Daher enthielt das Antiserum nur Antikörper für APS-Reduktase, und das Material aus allen anderen untersuchten Organismen enthielt APS-Reduktase, die mit dem Antiserum reagierte. Der Extrakt aus D. multispirans zeigte auch nur ein einziges gefärbtes Protein, aber die Position dieses Proteins stimmte nicht mit den Positionen der anderen überein. Das Antiserum gegen die APS-Reduktase von D. desulfuricans Stamm G100A reagiert daher mit einer elektrophoretischen Variante des Enzyms. In einem unabhängigen Experiment wurde nachgewiesen, daß das in D. multispirans nachgewiesene Protein APS-Reduktase ist.

Beispiele 11 bis 12

Mit diesen Beispielen soll die Breite der Sulfat reduzierenden Organismen gezeigt werden, die in ihren Extrakten Proteine enthalten, die mit dem Immunserum, das gegen die gereinigte APS-Reduktase von D. desulfuricans STamm G100A hergestellt ist, reagieren. Die Extrakte der verschiedenen Bakterien wurden wie in den Beispielen 1 bis 7 beschrieben, hergestellt. Die Versuche unterscheiden sich darin, daß drei verschiedene Konzentrationen an Extrakten in die Vertiefungen der Plastiktestplatten gegeben wurden. Die Proteinkonzentrationen der in jeweils zwei Vertiefungen gegebenen Extrakte betrugen 600 ng, 60 ng und 6 ng. Der restliche Ablauf wurde wie in den Beispielen 1 bis 7 beschrieben, durchgeführt. Zu Kontrollzwecken wurde gereinigte APS-Reduktase, Extrakt vom D. desulfuricans Stamm G100A und eine Probe eines Extrakts des nicht-Sulfat reduzierenden S. lividans mitgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Bakterienextrakte der Proben optische Dichte bei 410 nm gereinigte APS-Reduktase aus D. desulfuricans G100A D. desulfuricans Stamm G100A D. desulfuricans Stamm Norway Dt. orientis S. lividans
Die Ergebnisse zeigen, daß, wenn Konzentrationen von 60 ng oder mehr an Protein in dem Extrakt auf Vorhandensein von Immunreaktivität auf ein anti-APS-Reduktase spezifisches Antiserum untersucht wurde, enthielten ein weiterer Stamm der Gattung Desulfovibrio und eine Art der Gattung Desulfotomaculum reaktives Material. Die nicht-Sulfat reduzierenden S.lividans reagierten mit dem Antiserum nicht signifikant.

Beispiele 13 bis 17

Arten der Gattungen Thiobacillus, Chlorobium und Chromatium, Sulfid-oxidierende Bakterien, enthalten bekanntermaßen APS-Reduktase. Diese Beispiele sollen verdeutlichen, daß Extrakte dieser Bakterien keine Materialien enthalten, die signifikante Immunreaktivität auf ein anti-APS-Reduktase spezifisches Antiserum zeigen. Extrakte von Kulturen dieser Bakterien wurden wie in den Beispielen 1 bis 7 beschrieben, hergestellt. Die Proteinkonzentrationen in den Extrakten, die in die Vertiefungen gegeben wurden, betrugen 600 ng, 60 ng und 6 ng, wie in den Beispielen 11 und 12. Das restliche Verfahren wurde wie in den Beispielen 1 bis 7 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5 Bakterienextrakte der Proben opt. Dichte bei 410 nm T. thioparus T. neapolitanus T. ferrooxidans Chromatium vinosum Chlorobium thiosulfatophilum
Die Extrakte von nur einer dieser Sulfid oxidierenden Bakterien enthielt Material, das mit dem Antiserum gegen die gereinigte APS-Reduktase des D. desulfuricans Stamm G100A reagierte. In einem weiteren Experiment wurde bei der Untersuchung eines Extraktes von C. vinosum keine Kreuzreaktivität beobachtet.

Beispiel 18

Dieses Beispiel soll zeigen, daß bei der Ausübung einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ein Schlüsselelement vorhanden ist, das APS-Reduktase in Bakterienextrakten erkennt, indem es das Vorhandensein und die Menge der Reaktionsprodukte nachweist, die durch die Reaktion von APS-Reduktase mit spezifischen Antikörpern in einem Antiserum entstehen, das gegen eine gereinigte APS-Reduktase hergestellt ist. Jeder beliebige Assay, der zuverlässig und angemessen das Reaktionsprodukt der APS-Reduktase, anti-APS- Reduktase Antikörper Reaktionsprodukt, nachweisen kann, kann verwendet werden. In diesem Beispiel wird ein unterschiedlicher Weg der Erzeugung und Messung des Reaktionsprodukts verdeutlicht.
Der vollständige Sandwich-Assay benötigt die Beschichtung eines Festphasenträgers, wie z.B. Polystyrol oder eine andere Oberfläche, die in der Lage ist, den polyclonalen Antikörper entweder kovalent oder nicht-kovalent zu binden. Dann fängt der Antikörper das Antigen auf der Oberfläche ein und konzentriert es. Anschließende Zusätze von APS-Reduktase Antikörper, der an ein farbbildendes Enzym konjugiert ist, wie z.B. Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase, bewirkt die Bildung eines vollständigen Sandwich, der den ersten gebundenen Antikörper, das damit reagiert habende Antigen und das zweite Antikörper-Enzymkonjugat, das an das reagiert habende Antigen gebunden ist, umfaßt.
Gereinigter anti-APS-Reduktase Antikörper wurde aus immunem Kaninchen Serum im Batch-Verfahren mit APS-Reduktase Sepharosegel hergestellt, wie in "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molekular Biology: Practice and Theory of Immunoassays" P. Tijssen, S. 110-114 (siehe früheres Zitat) beschrieben. Im allgemeinen wurde reine APS-Reduktase (20 mg) über Nacht mit Cyanbromid aktivierter Sepharose (700 mg) inkubiert. Das entstandene APS-Reduktase Sepharosekonjugat wurde wiederholt mit 0,5 M Phosphatpuffer pH 7,4 in 0,1 M Natriumchlorid gewaschen. Das entstandene APS-Reduktase Sepharosekonjugat wurde zu einem 100 ml Aliquot von gepooltem Immunserum gegeben, das zuvor mit dem gleichen Volumen an Puffer (0,5 M Phosphat, 0,1 M Natriumchlorid) verdünnt war, und das Gemisch wurde über Nacht bei 4 ºC unter konstantem Rühren inkubiert. Das entstandene APS- Reduktase Sepharose-Antikörperkonjugat wurde viermal mit dem Puffer (0,5 M Phosphat, 0,1 M Natriumchlorid) gewaschen. Die Antikörper in dem Konjugat wurden durch Senken des pH-Wertes auf 2,1, durch Abnehmen der überstehenden Flüssigkeit und schnelles Wiedereinstellen ihres pH-Wertes auf pH 7,0 durch Hinzufügen von 0,5 M Puffer, herausgelöst. Der mit Affinitätsreaktionen gereinigte Antikörper wurde anschließend durch Ausfällen mit einem Zusatz von Ammoniumsulfat bis zu einer 50%-igen Sättigungskonzentration konzentriert. Der wiedergewonnene Antikörper (20 mg) wurde in 6 ml einer Lösung, die 5 mM Phosphat, 30 mM Natriumchlorid, 30 mM Natriumazid enthielt, wieder aufgelöst.
Antikörper (anti-APS-Reduktase) wurde mit Peroxidaseenzym, wie in "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molekular Biology: Practice and Theory of Immunoassays" P. Tijssen, S. 236-240 (siehe frühere Referenz) beschrieben, konjugiert. Im allgemeinen wurde Peroxidase (5 mg) (Sigma Chemical Co.) zu 1 ml einer Lösung aus 0,1 M Natriumhydrogencarbonat und 10 mM Natriumperjodat zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die aktivierte Peroxidase (1 ml) wurde mit 7 mg APS-Reduktase Antikörper, der in 1 ml 0,1 M Natriumcarbonat pH 9,2 enthalten war, zu einem Gesamtvolumen von 2 ml zusammengegeben. Die entstandene Lösung wurde 3 Stunden bei 25 ºC inkubiert. Ein gleiches Volumen (2 ml) an gesättigtem Ammoniumsulfat wurde zum selktiven Ausfällen der IgG Moleküle zugegeben. Der entstandene Niederschlag, der aus einer Mischung freien IgG's und IgG-Peroxidase Konjugat besteht, wurde in 10 ml einer Lösung von 0,1 M Natriumphosphat, 0,1 M Natriumchlorid resuspendiert und mit einem Con A Sepharosegel (Sigma Chemical Co.) versetzt. Das IgG-Peroxidase Konjugat war selektiv an Con A gebunden und wurde von dem Con A Sepharosegel durch Zusatz eines Überschusses an α-Methyl-D-mannopyranosid-Lösung (100 mM) in PBS-Puffer bei pH 7,2 eluiert und in einem Gesamtvolumen von 3 ml gesammelt.
Um APS-Reduktase zu untersuchen, wurde anti-APS-Reduktase (4ug) jeweils in eine Anzahl von Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gegeben. Die die anti-APS-Reduktase enthaltenden Platten wurden 2 Stunden bei 4 ºC inkubiert, dann viermal mit Tween und Gelatine enthaltenden PBS-Puffer gewaschen. In die verschiedenen Vertiefungen wurden unterschiedliche Konzentrationen an APS-Reduktase (von 320 bis 4 ng reichend) gegeben. Die Platten wurden 2 Stunden bei 25 ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden 4 mal mit Tween und Gelatine enthaltenden PBS-Puffer gewaschen. Die Vertiefungen mit der jeweiligen Konzentration von APS-Reduktase, erhielten jede der drei Verdünnungen (1/1000, 1/5000 und 1/10 000) des anti- APS-Reduktase Peroxidasekonjugats. Die Platten mit Konjugat wurden zusätzlich 2 Stunden bei 25 ºC inkubiert. Nach weiterem Waschen mit Tween und Gelatine enthaltenden PBS- Puffer, um jegliches ungebundenes Material zu entfernen, wurde Indikatorsubstrat in jede Vertiefung hineingegeben, und die Konzentration der entstandenen Farbe bei op. Dichte &sub4;&sub1;&sub0; wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6 APS-Reduktase pro Vertiefung (ng) opt. Dichte bei 410 nm *Verdünnung des anti-APS-Reduktase Peroxidasekonjugats.
Die in Tabelle 6 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Antikörper in dem Immunserum, das als Antwort auf die gereinigte APS-Reduktase von D. desulfuricans Stamm G100A hergestellt wurde, APS-Reduktase in einem vollständigen Sandwich Immunoassay nachweisen können.
Wenn auch der Nachweis von APS-Reduktase durch die Antikörper in dem Immunserum, das als Antwort auf die gereinigte APS-Reduktase aus D. desulfuricans Stamm G100A in zwei Typen der Immunoassays gezeigt wurde, wird gegenwärtig angenommen, daß jeder beliebige Assay, der in der Lage ist, das Reaktionsprodukt von APS-Reduktase und ihrer Antikörper zu messen, verwendet werden kann.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von Sulfat reduzierenden Bakterien in einer Probe, umfassend:

(a) die Herstellung eines Lysats der Probe, um in das Lysat Adenosin-5'-phosphosulfat Reduktase (APS Reduktase), die in den Sulfat reduzierenden Bakterien enthalten ist, freizusetzen,

(b) das In-Berührung-Bringen wenigstens eines Teils des Lysates mit einem ersten Antikörper, der für die APS-Reduktase spezifisch ist, um einen ersten Komplex zu bilden, und

(c) den Nachweis des ersten Komplexes als einen Hinweis auf das Vorhandensein von Sulfat reduzierenden Bakterien.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der erste Antikörper an einen Festphasenträger gebunden ist und worin Stufe (b) weiterhin umfaßt entweder

(1) das In-Berührung-Bringen des ersten Komplexes mit einem Konjugat, umfassend (i) einen zweiten, für APS-Reduktase spezifischen Antikörper und (ii) einen Farbbildner, so daß ein zweiter Komplex gebildet wird, umfassend den ersten Komplex und das Konjugat, oder

(2) das In-Berührung-Bringen des Teils des Lysats mit Konjugat, umfassend einen zweiten für APS-Reduktase spezifischen Antikörper, und einen Farbbildner, gleichzeitig mit, oder vor dem, In-Berührung-Bringen mit dem ersten Antikörper, so daß ein zweiter Komplex gebildet wird, umfassend den ersten Komplex und das Konjugat,

und worin Stufe (c) das Entfernen unkomplexierten Konjugats und das Zufügen eines Farbentwicklers zu dem zweiten Komplex umfaßt, wobei der Farbbildner und der Farbentwickler reagieren, um ein farbiges Produkt zu bilden, das das Vorhandensein Sulfat reduzierender Bakterien anzeigt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin der Festphasenträger ein Oberflächen-Pfropfpolymer, das auf einem organischen Polymergerüst gebildet ist, umfaßt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin der Farbbildner Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase ist und worin der Festphasenträger Polystyrol umfaßt, auf dessen Oberfläche Gycidylmethacrylat aufgepfropft ist, mit einer Vielzahl von Antikörper Bindungsstellen.

5. Verfahren zur Kontrolle Sulfat reduzierender Bakterien in einer wäßrigen Umgebung, umfassend die Probennahme aus der Umgebung, das Nachweisen des Vorhandenseins irgendwelcher Sulfat reduzierender Bakterien in der Probe durch ein Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, und, als Antwort auf das Vorhandensein der Sulfat reduzierenden Bakterien, die Behandlung der Umgebung mit einer wirksamen Menge von bakteriziden oder bakteriostatischen Mitteln, um das Wachstum der Sulfat reduzierenden Bakterien in der Umgebung zu unterbinden oder zu hemmen.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin die wäßrige Umgebung in einem Bohrloch ist, das eine kohlenwasserstoffhaltige unterirdische Formation durchquert oder sich in der Formation selbst befindet.

7. Behälter für die Verarbeitung von Testflüssigkeiten, die Analyte enthalten, umfassend ein Gefäß mit einer Zugangsöffnung und einem Einfang-Reagens, das sich im Gefäß befindet, worin das Einfang-Reagens einen Antikörper für APS-Reduktase umfaßt, erhalten durch Injektion von APS-Reduktase aus Sulfat reduzierenden Bakterien , die von anderen Proteinen gereinigt worden ist, in einen Organismus mit Immunsystem und dann Zurückgewinnen des Antikörpers für die APS-Reduktase aus dem Organismus.

8. Behälter gemäß Anspruch 7, worin das Gefäß so geformt ist, daß es einen ballonartigen Teil hat und einen verlängerten Durchgangsweg, der zu der Zugangsöffnung führt, ein poröser Rückhalter zwischen dem Durchgangsweg und ballonartigen Teil angebracht ist, wobei das Gefäß zusammenklappbar ist und worin das Innenvolumen des Durchgangswegs und das des ballonartigen Teils jeweils das Volumen der Testflüssigkeit überschreitet.

9. Behälter gemäß Anspruch 7 oder 8, worin der Antikörper für die APS-Reduktase an einen Festphasenträger, der in der Lage ist, den Antikörper zu binden, angebunden ist.

10. Behälter gemäß Anspruch 9, worin der Antikörper durch Injektion von APS-Reduktase aus Desulfovibrio desulfuricans in ein Kaninchen gebildet wurde und dann der Antikörper für die APS-Reduktase aus dem Kaninchen gewonnen wurde, und daß der Festphasenträger Polystyrol umfaßt, auf dessen Oberfläche Glycidylmethacrylat aufgepfropft wurde, das eine Vielzahl von Antikörper Bindungsstellen hat.

11. Vorrichtung für die Verarbeitung von Flüssigkeitsproben, umfassend einen Behälter nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 10;

Mittel, um den Analyt dem Fangreagens auszusetzen;

Rohrverzweigung, die eine geschlossene Kammer und erste und zweite Öffnungen, die mit der Kammer in Verbindung stehen, definiert,

Mittel, die Zugangsöffnung des Flüssigkeitsbehälters in flüssige Verbindung mit der ersten Öffnung zu setzen, und

Mittel für selektives Einführen und Entfernen aus der Kammer und damit aus dem Behälter durch die zweite Öffnung von Gas, Vakuum, Reagenzien und Waschfüssigkeiten, um hierbei schnelle Wechselwirkung zwischen dem Fangreagens und dem Analyten, dem wirksamen Waschen des Fangreagens und dem Sammeln des Analyten abwechselnd zu bewirken.