DE355666C

DE355666C - Process for purifying and enriching the active substance of medicinal sera and mixtures of similar compositions

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Publication number: DE355666C
Application number: DEE21565D
Authority: DE
Original assignee: ELEKTRO OSMOSE AG GRAF SCHWERIN GES
Current assignee: ELEKTRO OSMOSE AG GRAF SCHWERIN GES
Priority date: 1916-03-08
Filing date: 1916-03-08
Publication date: 1922-07-01

Description

Verfahren zur Reinigung und zur Anreicherung der wirksamen Substanz von Heilsera und ähnlich zusammengesetzten Gemischen. Die Heilsera werden bekanntlich aus dem, J3,lute dermit dem betreffenden Toxin imraunisierten Tiere hergestellt und enthalten deshalb alle Stoffe des Blutes mit Ausnahme der weißen und roten Blutkörperchen und der Hauptmenge des Fibrinogens #esp. Fibrins, welche hieraus entfernt wurden. Unter den Bestandteilen- der Rohsera sind daher eine Reihe =wirksamer, *zum Teil sogar -für den nienschlichen Organismus schädliche Sulbstan-7-en vorhanden, wie unwirksame Ei-weißkörper und Abbauprodukte derselben, Fette, Extraktivstoffe und anderes mehr. Der Wert der Sera wird da-her umi so günstiger bemessen, je weniger Eiweißkörper und Ahbauprodukte in denselben im Verhältnis =m Antitoxin vorhanden sind. Man war daher seit langem bestrebt,. die unspezifischen bzw. schädlichen Stoffe aus den Heilstra zu entfernen, womit gleichzeitig eine Verstärkung der Schutz- und Heilwirkuno* erhofft werden konnte. Alle in dieser Richtung unternommenen Versuche, unter Anwendung chemischer Mittel die -unerwünschte Nebenrscheinungen hervorrufenden Substanzen zu entfernen, hatten indessen keinen durchschlagenden Erfolg.Process for the purification and enrichment of the active substance of healing sera and similarly composed mixtures. As is well known, the healing sera are made from the, J3, lute of the animals immunized with the toxin in question and therefore contain all substances in the blood with the exception of the white and red blood cells and most of the fibrinogen #esp. Fibrins removed therefrom. Among the constituents of the raw sera there are therefore a number of = more effective, * in some cases even - sulbstane 7-s which are harmful to the human organism, such as ineffective protein bodies and their degradation products, fats, extractive substances and other things. The value of the sera is therefore all the more favorable, the less protein bodies and metabolites are present in them in the ratio = m antitoxin. One was therefore striving for a long time. to remove the unspecific or harmful substances from the Heilstra, with which at the same time a strengthening of the protective and healing effects * could be hoped for. All attempts made in this direction to remove the substances which cause undesirable side effects using chemical means have, however, not met with any resounding success.

Ein wesentlicher Fortschritt in der Reinigung der Rohsera wurde durch Verwendung des elektrischen Stromes erreicht.A major advance in the purification of raw sera was made by Use of electric current achieved.

Wird z. B. Diphtherieserum in der für elektroos-niotische Zwecke bekannten dreiteiligen Zelle unter Ben-utzung geeigneter Diaphragmen der Einwirkung des elektrischen Stromes unterworfen, so wandern die Elektrolyte -und die sich wie Elektrolyte verhaltenden organischen Substanzen, Spaltungsprodukte des Eiweißes, sogenannte Extraktivstoffe usw, nach den Seitenräumen ab. Sobald im Mittelratim Elektrolytfreiheit erzielt ist, fallen die Euglobuline zusammen mit einem kleinen Teil der antitoxischen Substanzen aus und können x. B. mit Hilfe der Zentrifugen beseitigt werden-.Is z. B. Diphtheria serum in the three-part cell known for electroos-niotic purposes using suitable diaphragms subjected to the action of the electric current, the electrolytes migrate - and the organic substances behaving like electrolytes, cleavage products of protein, so-called extractive substances, etc., according to the Side clearing. As soon as freedom from electrolytes is achieved in the Middle Council, the euglobulins precipitate together with a small part of the antitoxic substances and can x. B. be eliminated with the help of the centrifuges.

Man erhält auf diese bekannte Weise bereits ein im wesentlichen asche- und globtilinfreies Serum.In this known way, an essentially ash- and globtilin-free serum.

Das so gereinigte Serum enthält neben den spezifischen Substanzen und dem Pseudo-oder Paraglobulin, welches der Hauptträger des Antitoxins ist, noch Albumine sowie eine gewisse Menge rvon Fetten und fettähnlichen Körpern. Diese letzteren kann man, da sie nur -,ven.i--, bzw. kein Antitoxin enthalten, als Ver,unreinigungen des Heilserums bezeichnen. Ihre -Abtrennung von dem eigentlichen antitoxischen -,Eiweiß ist daher eine sehr wichtige, ,bisher nicht gelöste Aufgabe.The serum purified in this way contains not only the specific substances and the pseudo- or paraglobulin, which is the main carrier of the antitoxin Albumins as well as a certain amount of fats and fat-like bodies. These latter can, since they only contain -, ven.i-, or no antitoxin, as impurities of the healing serum. Their separation from the actual antitoxic, protein is therefore a very important task that has not yet been solved.

Gemäß vorliegendem Verfahren wird nun eine Trennung des Pseudo- oder Paraglobtilins von dem mit ihm vereinigten Albumin, dem Fett und den fettä.hnlichen Substanzen, und damit die Herstellung eines reinen, spezifischen, antitoxischen Ei-weißes erreicht.According to the present method, a separation of the pseudo or Paraglobtilin from the albumin associated with it, the fat and the fat-like Substances, and thus the production of a pure, specific, antitoxic Egg-white achieved.

Dies-es Verfahren besteht darin, (laß die in beliebiger Weise, zweckmäßig aber auf elektroosmotischern Wege von Euglobtilin tin.1 Elektrolyten befreite Lösung des Serums im Mittelraum ei-nesDreilzellenapparates zwischen geeigneten Diaphragmen der Einwirkung des elektrischen Stromesunter Zusatz einergenau bemessenen Mienge g eines geeigneten EI-e-I,:tr,)-lyts, z. B. Natriumhydroxyd, und zweckmäßig bei hoher #Spannung unterworfen wird. Unter diesen Umständen wandern!wesentlich nur flie Albumine durch das positiive Diaphragma nach dem anodischen Seitenraum ab, während das Paraglobtilin wesentlich unbeeinflußt im Mittelraum. nebst::den sonstigen Bestandteilen des #Serums zurückbleibt. In dem Maße, wie iie Albumineaus dem Mittelraum abwandern, scheiden sich daselbst die fett- und fettähnlichen Verunreiniggungen (Cholesterin) des Serunis aus undkönnen. von dem in Lösung bleibenden Paraglobulin z. D. mit Hilfe der Zentriftige abgetrennt werden. Man er-hält schließ-]ich eine fast wasserhelle Lösung, bestellenA ans Paraglobulin und den spezifischen Substanzen, z. B. dem Autitoxiii.This procedure consists in (leave it in any way, expediently but solution freed from euglobtilin tin.1 electrolytes in an electroosmotic way of the serum in the middle of a three-cell apparatus between suitable diaphragms the effect of the electric current with the addition of a precisely measured amount g of a suitable EI-e-I,: tr,) - lyts, e.g. B. sodium hydroxide, and useful in is subjected to high voltage. In these circumstances wander! Essentially only albumine flows through the positive diaphragm to the anodic side space, while the paraglobtilin is essentially unaffected in the central area. besides :: the others Components of the #serum remains. To the same extent as the albumin from the middle room migrate away, the fat- and fat-like impurities separate there (Cholesterol) of the serunis and can. of the paraglobulin remaining in solution z. D. be separated with the help of the centrifuge. You finally get one almost water-white solution, orderA ans paraglobulin and the specific substances, z. B. the Autitoxiii.

Dader beidem Verfahren zugesetzte Elektrolyt (z. B. Natriumhydroxyd) unter dem Einfluß des iStromes ebenfalls abwandert und schließlich Elektrolyt-freiheit eintreten würde, so muß man durch zeitweiliges Hinzufügen von Natronlaugge die günstigen Bedingungen für die Wanderung der Albumine aufrechterhalten. Der Prozeß der Reinigung ist beendet, wenn durch Halbsättigung einer Probe mit Ammoniumsulfat alles Eiweiß, nierlei#geschlagen wird.The electrolyte added in the process (e.g. sodium hydroxide) also migrates under the influence of the iStrom and finally freedom from electrolytes would occur, one has to add the favorable sodium hydroxide solution from time to time Maintain conditions for albumins to migrate. The process of purification is over when all protein, nothing is beaten.

Bei dem Verfahren kann das Alkali mit gleichem Resultat durch andere organische oder anorganische Basen ersetzt werden. Als Diaphragma veri,#endet man zweckmäßig an der Kathode veggetaihilische Substanzen, -wie Pergamentpapier, Vis-kose -ii. dgl., an der Anode ein solches aus tierischer Haut (vegetahilisch oder mineralisch gegerbtem Leder, Rinds- oder Pferdeblasen usw.).In the process, the alkali can be used by others with the same result organic or inorganic bases are replaced. As a diaphragm veri, # ends Appropriately at the cathode veggetaihilic substances, such as parchment paper, viscose -ii. Like., At the anode one made of animal skin (vegetarian or mineral tanned leather, cow or horse bladders, etc.).

Verwendet man an Stelle basischer Substanzen Säuren, so wandert das Eiweiß nach dem Kathodenraum.If acids are used instead of basic substances, this migrates Egg white after the cathode compartment.

Arbeitet man unter Zusatz eines sauren Elektrolyten, so ist das kathodische Diaphragin# ehenif#Ils a-us tierischer Haut zu wählen.If you work with the addition of an acidic electrolyte, it is cathodic Diaphragm # ehenif # Ils to choose from animal skin.

,Das Verfahren soll durch nachstehendes Beispiel erläutert werden., The procedure is illustrated by the following example.

Der Apparat - siehe die Zeichnung - ist die bekannte dreiteilige Zelle. Durch die beiden Diaphrag-men 6 und 7 wird;derselbe in die Räume 1, 2 -und 3 geteilt. Hinter den Diqplira,gmen liegen die Pole -t und 5. In den Mittelraum des Apparates 3 kommt das zu obmosierende Serum, in die Räume i und 2 destilliertes Wasser. Das Diaphragnia 7 besteht aus Pergament, das Diaphragma 6 aus tierischer Hut.The apparatus - see the drawing - is the well-known three-part cell. The two diaphragms 6 and 7 divide it into spaces 1, 2 and 3 . The poles -t and 5 are located behind the Diqplira, gmen. The serum to be obmosed is placed in the central area of the apparatus 3 , and distilled water is placed in rooms i and 2. The diaphragm 7 consists of parchment, the diaphragm 6 of an animal hat.

:2 1 des bereits vorgereinigten und von Eugglobulin ibefreiten antitoxischenHeilserums (im vorliegenden iF-alleDipht;herieser#um) kom.-men inden Mittelraun1- 3 der Zelle; die Seitenräume i und :2 werden mitdestilliertem Wasser gefüllt, das häufig erneuert wird. Man arbeitet zweckmäßig , mit hoher Spannung, nämlich mit bis zu 5oo Volt Anfangsspannung bei oj bis o,2 Ampere. Unter beständigem Umrühren gibt man in den Mittelraum allinählich 2o ccm normale Natronlatige zu, wobei zunächst..die Stromstärke ansteigt, --um sodann wieder stark zurüdkzugehen. Der Zusatz von Natronlauge muß evtl. mehrmals wiederholt werden.: 2 1 of the already pre-cleaned and eugglobulin-free antitoxic healing serum (in the present iF-alleDipht; here # um) come into the middle space 1-3 of the cell; the side spaces i and: 2 are filled with distilled water, which is frequently renewed. It is expedient to work with a high voltage, namely with an initial voltage of up to 500 volts at oj to o.2 amperes. While stirring constantly, approximately 20 cc of normal soda lavender is added to the central area, initially increasing the current strength - and then decreasing strongly again. The addition of caustic soda may have to be repeated several times.

Während des Prozesses wandern die Albuinine nach dein Anodenraum ab; gleichzeitig Z> fallen im Mittelraum fette und fettähnliclie Körper aus. Läßt sich im Mittelraum kein Albumin mehr nachw-eisen, so wird der Versuch unterbrochen und die Flüssigkeit abgezogen; die abgeschiedenen Fette usw.-werden mit Hilfe der Zentrifuge entfernt.During the process, the albuinins migrate to your anode compartment; simultaneously Z> fall in the central space fat and fettähnliclie body. If no more albumin can be detected in the central space, the experiment is interrupted and the liquid is drawn off; the separated fats etc. are removed with the help of the centrifuge.

Die erhaltene Lösung des Serums stellt eine #%,asserklare Lösung dar. Zum Gebrauch kann sie' im Vakutun bei niedriger Temperatur zur Trockene oder auf die gewünschte Konzentration eingedampft werden.The resulting solution of the serum is a #%, water-clear solution. It can be used in a vacuum at a low temperature to dryness or on the desired concentration can be evaporated.

Ein Rohmaterial, welches vor dem Versuche die Zusammensetzung: -,#,ntitoxin i cem -2oo A. E. 1 gEi;weiß - 2 32o A. E. Trocken-Z, (Ye,halt io,ig Prozent, hiervon Asche 1,53 Prozent, Gesamteiweiß 8,66 Prozent, hiervon Globuline 5,36 Prozent, Albumine 3,3 Prozent hatte, wurde zunächst in bekannter Weise von Euglobulinen und V#lektrolyten befreit und dann in der dreiteili#gen Zelle, wie oben be- schrieben, behandelt. Es zeigte nach zweistimdigger Behandlung folgende Zusammensetzung: #Gesamteiweiß 2,9?, Prozent, hiervon Globuline :2,90 Prozent, Album-in#e Spuren; 1 ccm enthält 145 A.E., i g Eiweiß enthält etwa 5 ooo A. E. A raw material which, before the experiment, has the following composition: -, #, ntitoxin i cem -2oo AE 1 gEi; white - 2 32o AE dry Z, (Ye, hold io, ig percent, of which ash 1.53 percent, total protein 8 , 66 percent thereof globulins 5.36 percent, 3.3 percent albumin had been lektrolyten initially in a known manner of euglobulins and V # freed and then gen in the dreiteili # cell as advertised loading above, is treated. It was after two digger stim treatment following composition: total protein # 2.9 ?, percent thereof globulins: 2.90 percent, album in # e tracks; 1 contains 145 cc AE, i g protein contains about 5 ooo AE

In gleicher Weise wie auf antitoxische Sera wird das Verfahren auf bakterizide uni anti-bakterielle Immunsera angewendet.The procedure is applied in the same way as on antitoxic sera bactericidal and anti-bacterial immune sera applied.

Von Bedeutung ist das neue Verfahren vor allem dann, wenn die Menge des Fettes und (-]es Cholesterins, die im Blutserum enthalten ist, erheblich ist. Solche Sera. lösen bei ihrer Verwendung amKrankenbett oft sehr schwere und unerklärliche Reaktionen aus. Der Fett-, Cholesterin- und Lipoidgehalt eines normalen Serums ist nur sehr gering. Erkann jedoch eine sehr wesentliche -Stei-gerung dadurch erfahren, daß bei den zur Immunisierung verwendeten Tieren, z. B. Pierden, lange und heftige Fieberperioden bestanden haben. In einem bestimmten Falle hatte z. B. das Blutstrum eines Diphtheriepferdes ein starik getrübtes, milchiges, völlig undurehsichtigesAussehen. Neben einem Gehalt von 10,3 Prozent Eiweiß -und 1,2 Prozent Asche enthielt dieses Serum nicht weniger als 1,4 Prozent ätherlösliche Substanzen. Auch das Zentrifugat, welches nach der Befrei-ung von EI-ektrolyten und Euglobulinen aus einem Liter dieses Serunig durch, den elektrischen Strom erhalten wurde, zeigte noch dieselbe staiire Trübung, wiewohl ein kleinerer Teil der Fette, Lipoid-, und des Cholesterins von den abgeschiedenen -C"u",ylo,bulinen mechanisch mitgerissen war.The new procedure is particularly important when the amount of the fat and (-] it cholesterol contained in the blood serum is significant. Sera like that. often solve very difficult and inexplicable problems when used at the bedside Reactions off. The fat, cholesterol and lipoid content of a normal serum is only very little. However, it can experience a very substantial increase in that in the animals used for immunization, e.g. B. Pierden, long and violent Have had periods of fever. In one particular case, e.g. B. the blood stream a diphtheria horse has a starik cloudy, milky, completely opaque appearance. In addition to a content of 10.3 percent protein and 1.2 percent ash, it contained Serum no less than 1.4 percent ether-soluble substances. Also the centrifugate, which after the release of EI electrolytes and euglobulins from one liter of this Serunig by the electric current obtained still showed the same staiire Cloudiness, albeit a smaller portion of the fats, lipids, and cholesterol of the deposited -C "u", ylo, bulinen was mechanically carried away.

Nach der ersten Osmose wurden 1 1 Serum "gewonnen: 23,3 g Trorjl<:,enr.üdkstand, i ioo ccm Zentrifügat mit 7,2 Prozent gelöstemE, Dieses Zentrifugat zeigte noch lieselbe Tr.ü.bwi#-" Avie das Auggangsserum. Es wurde zur Trennung des Paraglobulins x-oin Albumin nach dem neuen Verfahren'unter,kontinuierlichem Hinzufügen von N.atronlauge im Dreizellenapparat wiederum der Einwirkung- des elektrischen Stromes ausgesetzt. Nach erfolgter Abwanderung des Alb-Limins hatte sich im Mittelraum ein bedeutender Niederschlag abgeschieden, welcher mit Hil--fe der Zentrifugevon der Flüssi z# gkeit abgetrennt wurde. Es wurde auf diese Weise erhalten: 13,5 g eines vollikommen in Äther löslichen Produktes, also eines Gemisches -von Fetten, Lipoiden und Cholesterin, und fernerhin ein vollkommen klares Zentrifugat, nämlich 8oo 23 ccin mit 5,5 Prozent Eiweiß, im ganzen also Init 44 9 #Paraglobulin.Avie the Auggangsserum: - After the first osmosis were "Tr.ü.bwi # 23.3 g Trorjl <:, enr.üdkstand, i ioo cc Zentrifügat 7.2 percent gelöstemE, this centrifugate was still read the same won" 1 1 serum . In order to separate the paraglobulin x-o in albumin according to the new process, with continuous addition of sodium hydroxide solution in the three-cell apparatus, it was again exposed to the action of the electric current. After the Alb-Limins had migrated, a significant amount of precipitation had deposited in the central area, which was separated from the liquid with the help of the centrifuge. In this way the following was obtained: 13.5 g of a product completely soluble in ether, i.e. a mixture of fats, lipids and cholesterol, and furthermore a perfectly clear centrifugate, namely 8oo 23 ccin with 5.5 percent protein, so on the whole Init 44 9 #paraglobulin.

Claims

PATENT CLAIMS: i. Process for purifying and enriching the active substance of healing sera and similarly composed mixtures, which were first freed from the ash components, extractive substances and euglobulins in a known manner, characterized in that the sera between diaphragms with coordinated potential are subjected to Zugatz suitable electrolytes of Eldktroosmose, wherein in the "non-specific albumins vesentliehen walk through waste, fat, cholesterol-like and related # bodies are removed by precipitation.

2. The method according to claim i, characterized in that the addition of the suitable electrolyte takes place continuously or with interruptions according to the course of the cleaning. 3. The method according to claim i, characterized in that the known Befreinnu the healing sera and similar zub composite mixtures of ash constituents and globulins with the aid of electroosmosis with the method according to claim i is combined into one process. 4. The method according to claim 1 and 3, characterized in that the electroosmotic treatment of the healing sera, and similar, composite mixtures is initially carried out at a relatively low voltage and after removal of the ash components and globulins at increased voltage.