DE3546312C2

DE3546312C2 -

Info

Publication number: DE3546312C2
Application number: DE3546312A
Authority: DE
Inventors: Des Erfinders Auf Nennung Verzicht
Original assignee: ORION-YHTYMAE ESPOO FI Oy
Current assignee: SANGTEC MEDICAL AB, BROMMA, SE
Priority date: 1985-01-02
Filing date: 1985-12-30
Publication date: 1992-08-06
Also published as: AU561382B2; AT397514B; SE8600011D0; GB8531414D0; NO166743B; FR2575493A1; GB2169403B; DK386A; FI72146C; LU86238A1; DK386D0; BE903937A; FI850004A0; FI850004L; CH666696A5; IE58290B1; NO855308L; IL77489A; IE853333L; FR2575493B1

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Nucleinsäuren mit Hilfe in Lösung erfolgender Hybridisierung. Kennzeichnend für das erfindungsgemäße Verfahren ist, daß bei der Hybridisierungsreaktion mit wenigstens zwei Sonden in der gleichen Lösungsphase gearbeitet wird. Die Detektorsonde ist mit einem Indikator markiert, während an die Einfangsonde eine Komponente gebunden ist, die als Partner in einem Affinitätspaar zu fungieren vermag, wobei das bei der Hybridisierung gebildete Einfangsonde : :Probe : Detektorsonde-Hybrid von den übrigen in der Hybridisierungsmischung vorliegenden Komponenten mit Hilfe des anderen Partners des Affinitätspaares getrennt werden kann.The invention relates to a method for identification of nucleic acids in solution Hybridization. Characteristic of the invention The method is that in the hybridization reaction with worked at least two probes in the same solution phase becomes. The detector probe is marked with an indicator while a component is bound to the capture probe is to act as a partner in an affinity pair capable, the capture probe formed during hybridization: : Probe: detector probe hybrid from the rest in the Hybridization mixture components present with the help of the other partner of the affinity pair can.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Testbesteck zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, das wenigstens zwei Sonden enthält, wobei eine Sonde als Einfangsonde und eine zweite Sonde als Detektorsonde fungiert.The invention also relates to a test kit for Implementation of the method according to the invention, the at least contains two probes, one being a capture probe and a second probe acts as a detector probe.

Zur Identifizierung von Nucleinsäuren hat man sich verschiedenartiger Hybridisierungsverfahren bedient. Als Beispiele seien die direkten Hybridisierungsverfahren und die Sandwich-Hybridisierungsverfahren genannt. Bei den direkten Hybridisierungsverfahren liegt die Nucleinsäureprobe entweder in Lösung oder an einen festen Trägerstoff gebunden vor. Die zu identifizierende Nucleinsäure wird unter Verwendung einer einzigen markierten Sonde nachgewiesen. Bei den Sandwich-Hybridisierungsverfahren, die ein- oder mehrstufig sein können (US 44 86 539, WO 83/01 459, EP-A 1 39 489) arbeitet man mit zwei verschiedenen Sonden, mit denen die zu identifizierende Nucleinsäure in der Probelösung nachgewiesen wird. Die Detektorsonde ist dabei mit einem Indikatorstoff markiert, während die Trennsonde an einen festen Träger gebunden ist.There have been a variety of ways of identifying nucleic acids Hybridization process served. As examples are the direct hybridization processes and the sandwich hybridization processes called. With the direct Hybridization method is either the nucleic acid sample bound in solution or to a solid carrier in front. The nucleic acid to be identified is used detected by a single labeled probe. At the sandwich hybridization process, the single or multi-stage can be (US 44 86 539, WO 83/01 459, EP-A 1 39 489) one works with two different probes that are used to identify the Detected nucleic acid in the sample solution becomes. The detector probe is with an indicator substance marked while the separation probe attached to a solid support is bound.

Erfindungsgemäß wurde ein neues Hybridisierungsverfahren entwickelt, bei dem man mit zwei verschiedenen Sonden arbeitet, wobei beide Sonden in der gleichen Lösungsphase enthalten sind. Da die an der Hybridisierung teilnehmende Probenucleinsäure und beide Sonden sich in der gleichen Lösungsphase befinden, erfolgt die Hybridisierungsreaktion beträchtlich schneller als bei jener Sandwich-Hybridisierung, bei der die Trennsonde an einen festen Träger gebunden ist. Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist eine einstündige Inkubationszeit ausreichend. Bei der einstufigen Sandwich-Hybridisierung (US 44 86 539) sind für eine ausreichende Hybridisierung 12 Stunden erforderlich. In WO 83/01 459 wird eine übliche Hybridisierungsdauer mit 16 bis 20 Stunden angegeben. Bei der zweistufigen Sandwich-Hybridisierung (Dun und Hassell, Cell. Vol. 12, S. 23-36, 1977) benötigt man eine Hybridisierungszeit von wenigstens 24 Stunden.According to the invention, a new hybridization method was developed developed by working with two different probes, with both probes in the same solution phase are. Since the sample nucleic acid participating in the hybridization and both probes are in the same solution phase are located, the hybridization reaction takes place considerably faster than that sandwich hybridization, at which the separation probe is bound to a solid support. In the method according to the invention is a one hour Sufficient incubation time. With single-stage sandwich hybridization (US 44 86 539) are sufficient Hybridization required 12 hours. In WO 83/01 459 a usual hybridization time of 16 to 20 hours is given. With the two-stage sandwich hybridization (Dun and Hassell, Cell. Vol. 12, pp. 23-36, 1977) you need one Hybridization time of at least 24 hours.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren arbeitet man vorzugsweise mit wenigstens zwei Sonden. Diese Sonden sind zur zu identifizierenden Nucleinsäure ausreichend homologe Nucleinsäurefragmente. Es ist von Vorteil, wenngleich nicht erforderlich, wenn die Sonden homolog zu relativ nahe beieinander liegenden Stellen in der zu identifizierenden Nucleinsäure sind. Die Sonden dürfen nicht homolog zueinander sein.The process according to the invention is preferably carried out with at least two probes. These probes are to be identified Sufficient homologous nucleic acid fragments. It’s an advantage, but not a requirement, if the probes are homologous to relatively close together located in the nucleic acid to be identified are. The probes must not be homologous to one another.

Die Sonden können synthetisch, halbsynthetisch, mit Hilfe von DNA-Rekombinationstechnik oder aus direkt aus der Natur isolierten Nucleinsäuren gewonnen werden. Derartige Sonden sind auch im Handel erhältlich. Die Sonde kann an einen geeigneten Vektor gebunden sein; sie kann Vektorteile enthalten oder völlig frei von Vektorteilen sein.The probes can be synthetic, semi-synthetic, with the help from recombinant DNA technology or directly from nature isolated nucleic acids. Such probes are also commercially available. The probe can be connected to one appropriate vector; it can contain vector parts or be completely free of vector parts.

Die Detektorsonde ist durch passende Indikatoren markiert. Als Indikatoren eignen sich verschiedenartige radioaktive Isotope oder radioaktiv markierte Verbindungen. Der Indikator kann auch fluoreszierend, lumineszierend, lichtemittierend oder enzymatisch bzw. immunologisch nachweisbar sein usw. Als Beispiele seien die auf der Affinität von Biotin und Avidin oder Streptavidin basierenden Indikatorstoffe, die Lanthanidchelate, die Ferritin- und Hämverbindungen und die immunologisch nachweisbaren Haptene, wie die Acetoxyacetylfluorenderivate (WO 83 02 286), genannt. Auch eine Identifizierung über Proteine ist möglich. Das erfindungsgemäße Verfahren ist unabhängig vom verwendeten Indikator. Im Zusammenhang mit dem Verfahren können alle bekannten und zukünftig zu entwickelnden, für die Nucleinsäurehybridisierung geeigneten Indikatorstoffe frei eingesetzt werden. The detector probe is marked by suitable indicators. Various types of radioactive are suitable as indicators Isotopes or radiolabelled compounds. The indicator can also be fluorescent, luminescent, light emitting or be detectable enzymatically or immunologically etc. As examples are those on the affinity of biotin and avidin or streptavidin-based indicator substances, the lanthanide chelates, the ferritin and heme compounds and the immunologically detectable haptens, such as the acetoxyacetylfluorene derivatives (WO 83 02 286). Also one Identification via proteins is possible. The invention The procedure is independent of the indicator used. In connection with the method, all known and to be developed in the future for nucleic acid hybridization suitable indicator substances can be used freely.

An die als Einfangsonde dienende Sonde ist eine Komponente gebunden, die als Partner in einem Affinitätspaar zu fungieren vermag. Derartige Affinitätspaare sind beispielsweise Biotin - Avidin, Biotin - Streptavidin, Schwermetallderivat - Thiogruppe und die verschiedenen Homopolynucleotide, wie Poly dG - Poly dC, Poly dA - Poly dT oder Poly dA - Poly U. Es können jedoch auch andere Affinitätspaare eingesetzt werden, sofern ihre Komponenten nur eine genügend starke Affinität zueinander haben. Unter den bei immunologischen Verfahren eingesetzten Liganden und Konjugaten finden sich geeignete Affinitätspaare.There is a component on the probe serving as a capture probe bound to act as partners in an affinity pair can Such affinity pairs are, for example Biotin - avidin, biotin - streptavidin, heavy metal derivative - thio group and the different homopolynucleotides, like Poly dG - Poly dC, Poly dA - Poly dT or Poly dA - Poly U. However, other affinity pairs can also be used provided their components are only one sufficient have strong affinity for each other. Among those in immunological Find the ligands and conjugates used suitable affinity pairs.

Vor der Hybridisierungsreaktion wird die Probe so behandelt, daß die Nucleinsäuren in einsträngiger Form in die Hybridisierungslösung freigesetzt werden. Die Hybridisierung erfolgt in einer Hybridisierungsmischung, in der die Nucleinsäuren, die markierte Detektorsonde und die Einfangsonde nötigenfalls in einsträngige Form überführt sind. Als Hybridisierungslösung können verschiedenartige für diesen Zweck geeignete Puffer verwendet werden. Die Hybridisierung erfolgt im Temperaturbereich 0-80°C, jedoch wird vorzugsweise mit einer Temperatur von 65°C gearbeitet. Enthält die Hybridisierungslösung Formamid (40-55%), so kann eine Temperatur von 37°C angewendet werden. Als Hybridisierungszeit genügt eine Stunde.Before the hybridization reaction, the sample is treated that the nucleic acids in a single stranded form in the Hybridization solution are released. The hybridization takes place in a hybridization mixture in which the nucleic acids, the marked detector probe and the capture probe are converted into single-stranded form if necessary. As a hybridization solution can be different for this purpose suitable buffers are used. The hybridization takes place in the temperature range 0-80 ° C, but is preferred worked with a temperature of 65 ° C. Contains the Hybridization solution formamide (40-55%), one can Temperature of 37 ° C can be applied. As a hybridization time one hour is enough.

Nach erfolgter Hybridisierung wird die Lösung nötigenfalls so verdünnt, daß sich für das Affinitätspaar günstige Verhältnisse ergeben. Danach bringt man das Gemisch mit dem anderen Partner des Affinitätspaares in Kontakt, der an einen festen Träger gebunden ist, z. B. an eine Affinitätschromatographie-Säule, ein Filter oder eine Plastik- bzw. Glasfläche, und isoliert das Einfangsonde : Probe : Detektorsonde-Hybrid.After hybridization is complete, the solution becomes necessary so diluted that favorable for the affinity pair Relationships. Then you bring the mixture with you in contact with the other partner of the affinity couple, who is bound to a solid support, e.g. B. an affinity chromatography column, a filter or a plastic or glass surface, and isolates the capture probe: sample: detector probe hybrid.

Als Affinitätssäulen-Trägermaterial kann zum Beispiel Cellulose, Latex, Polyacrylamid, Dextran oder Agarose dienen. Diese Materialien können auch als Suspensionen im Reagenzglas eingesetzt werden. Vorteilhaft ist auch, mit Reagenzgläsern zu arbeiten, an deren Innenfläche die eine Komponente des Affinitätspaares angelagert ist. Voraussetzung bei der Wahl des Materials ist, daß daran eine Komponente gebunden werden kann, welche Affinität zu der an die Einfangsonde gebundenen Komponenten hat.For example, cellulose, Latex, polyacrylamide, dextran or agarose are used. These materials can also be used as suspensions in a test tube be used. It is also advantageous to work with test tubes on the inside of which the a component of the affinity pair is attached. requirement when choosing the material is that there is a Component can be linked, which affinity to the components bound to the capture probe.

Falls die Probe zu identifizierende Nucleinsäure enthält, entsteht bei der Hyxbridisierung ein Einfangsonde : Probe : Detektorsonde-Hybrid. Dieses Hybrid haftet sich bei der Fraktionierung an den Träger. Die Markierung der sich an den Träger gehafteten Fraktion kann nach herkömmlichen Verfahren direkt am Träger oder nach vorheriger Elution am Eluat gemessen werden.If the sample contains nucleic acid to be identified, a capture probe is created during hybridization: sample: detector probe hybrid. This hybrid adheres to the fractionation to the carrier. The marking of the at the Supported fraction can be made according to conventional methods directly on the support or after elution on the eluate be measured.

Bei der Fraktionierung können anstelle von Affinitätschromatographie auch andere Systeme, beispielsweise Phasenextraktion oder Magnetfeld, zur Anwendung gebracht werden.Fractionation can be done instead of affinity chromatography other systems, for example phase extraction or magnetic field.

In den folgenden Anwendungsbeispielen wird das erfindungsgemäße Verfahren im einzelnen beschrieben. Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht an die in den Beispielen verwendeten Nucleinsäurefragmente gebunden. Dem Fachmann ist bekannt, wie sich entsprechende Nucleinsäurefragmente gewinnen lassen.In the following application examples, the invention Procedure described in detail. The invention Procedure is not related to that used in the examples Nucleic acid fragments bound. The person skilled in the art knows how corresponding nucleic acid fragments are obtained to let.

example 1 Identification of adenovirus DNA from cell lysate under Use of homopolynucleotide

Als Detektorsonde dient der mit ¹²⁵I markierte rekombinante Phage mKTH 1206, ein Bgl II-Fragment des Adenovirus (Typ 2) aus der Adenovirus-Genkarten-Position 42-45,3%. Der besagte rekombinante Phage ist in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter Nr. 2827 deponiert. Seine spezifische Aktivität beträgt 7×10⁷ cpm/µg DNA. Eine nähere Beschreibung dieser Sonde findet sich in der Schrift Ranki et al. 1983, Gene 21, 77-85.The recombinant labeled with ¹²⁵I serves as the detector probe Phage mKTH 1206, a Bgl II fragment of adenovirus (type 2) 42-45.3% from the adenovirus gene card position. The said recombinant phage is in the German collection deposited by microorganisms under No. 2827. Its specific Activity is 7 × 10⁷ cpm / µg DNA. A closer one This probe is described in Ranki et al. 1983, Gene 21, 77-85.

Als Einfangsonde dient das rekombinante Plasmid pKTH 1202, das in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer DSM 2824 deponiert ist und aus einem BamHI D-Fragment des Adenovirus (Kartenposition 29-42%), cloniert auf das Plasmid pBR322, besteht. Das rekombinante Plasmid pkTH 1202 (DSM 2824) wurde mit Restriktionsenzym Hae III gespalten, und an die 3′ Enden der Fragmente wurde mit Hilfe von Terminaltransferase ein Poly-A-Schwanz gefügt. Die Schwanzlänge wurde durch ³H-A-Inkorporation gemessen. Die Länge betrug im Durchschnitt etwa 70 A-Reste. Vor Gebrauch wurde die Einfangsonde durch Kochen denaturiert. Als Probe dienten Adenovirus-infizierte A-549-Zellen. Die infizierten Zellen wurden 21 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden gesammelt und mit einprozentiger Natriumdodezylsulfatlösung aufgebrochen. Die Lösung enthielt ca. 10⁶ Zellen/ml. Die Viskosität wurde durch Ultraschallbehandlung gesenkt. Als Kontrolle dienten nichtinfizierte A-549-Zellen, die identisch behandelt wurden. Vor der Hybridisierung wurde die Probe 5 min in 0,02 M NaOH gekocht, auf 0°C abgekühlt und mit Essigsäure neutralisiert.The recombinant plasmid pKTH 1202 serves as the capture probe, that in the German collection of microorganisms under number DSM 2824 is deposited and from a BamHI D fragment of the adenovirus (card position 29-42%) for plasmid pBR322. The recombinant plasmid pkTH 1202 (DSM 2824) was cleaved with restriction enzyme Hae III, and at the 3 ′ ends of the fragments was made with the help a poly A tail added by terminal transferase. The Tail length was measured by 3 H-A incorporation. The Length averaged about 70 A residues. Before use the capture probe was denatured by boiling. As a sample served Adenovirus-infected A-549 cells. The infected Cells were incubated for 21 hours. The cells were collected and with one percent sodium dodezyl sulfate solution broken up. The solution contained approximately 10⁶ cells / ml. The Viscosity was reduced by ultrasonic treatment. As Control served for uninfected A-549 cells, which were identical were treated. Before hybridization, the Sample boiled in 0.02 M NaOH for 5 min, cooled to 0 ° C and neutralized with acetic acid.

Für den Test wurden im Reagenzglas 500 000 cpm Detektorsonde, 50 ng Einfangsonden-DNA und 10 µl Probe zusammengebracht. Das Volumen wurde auf 50 µl eingestellt, und als Pufferlösung dienten 0,6 M Natriumchlorid, 0,06 M Natriumzitrat, 0,02 M Natriumphosphat (pH 7,6) und 0,5% Natriumdodezylsulfat. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 65°C inkubiert.For the test, 500,000 cpm detector probe, Bring 50 ng capture probe DNA and 10 µl sample. The volume was adjusted to 50 µl and as Buffer solution served 0.6 M sodium chloride, 0.06 M sodium citrate, 0.02 M sodium phosphate (pH 7.6) and 0.5% sodium dodezyl sulfate. The mixture was incubated at 65 ° C for one hour.

Nach erfolgter Hybridisierung wurde die Lösung auf +20°C abgekühlt und langsam durch eine Chromatographiesäule geschleust, die 1 ml Oligo-dT-Cellulose enthielt. Der Durchlauf wurde aufgefangen und erneut durch die Säule geschickt. Danach wurde die Säule mit 20 ml Lösung gewaschen, welche 0,15 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumphosphat (pH 7,6) und 0,5% Natriumdodezylsulfat enthielt. Die angelagerte DNA wurde zum Schluß mit 1 ml 0,02 M NaOH abgelöst. Diese Lösung wurde aufgefangen, und ihre Radioaktivität wurde bestimmt. After hybridization, the solution was at + 20 ° C. cooled and slowly passed through a chromatography column, containing 1 ml of oligo-dT cellulose. The pass was caught and sent through the column again. The column was then washed with 20 ml of solution, which 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium phosphate (pH 7.6) and contained 0.5% sodium dodezyl sulfate. The attached Finally, DNA was detached with 1 ml of 0.02 M NaOH. These Solution was caught and their radioactivity was reduced certainly.

Ergebnis: ¹²⁵I-Aktivität (cpm) Result: ¹²⁵I activity (cpm)

Example 2 Identification of the DNA from Chlamydia trachomatis under Use of biotin - streptavidin

Als Detektorsonde diente der mit ¹²⁵I markierte rekombinante Phage mKTH 1245, welcher zwei BamHI - Sa1I DNA-Fragmente des Clons pKTH 1220 enthält, die zusammen an den Vector M13mp8 gebunden sind. Der Clon pKTH 1220 ist in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer DSM 2825 deponiert und in der Publikation Palva et al., FEMS Microbiology Letters 23 S. 83-89 (1984) beschrieben.The recombinant labeled with ¹²⁵I served as the detector probe Phage mKTH 1245, which contains two BamHI - Sa1I DNA fragments of the clone pKTH 1220, which together on the Vector M13mp8 are bound. The clone pKTH 1220 is in German Collection of microorganisms under the number DSM 2825 deposited and in the publication Palva et al., FEMS Microbiology Letters 23 pp. 83-89 (1984).

Als Einfangsonde diente das rekombinante Plasmid pkTH 1250. Dieses Plasmid besteht aus einem 2,9 kb S1I - C1aI Fragment des Plasmids pKTH 1220 (DSM 2825) und dem Vector pAT 153. An die DNA des pKTH 1250 wurden unter Anwendung des bekannten Nick-Translationsverfahrens (Rigby et al., J. Mol. Biol. 113, S. 237-251, 1977) und mit Biotin-11-UTP als Substrat (Bethesda Research Laboratoris) Biotinmoleküle konvalent gebunden. Die Einfangsonden-DNA wurde vor Gebrauch 5 min in dem Puffer 10 mM Tris-Cl pH 7,6, 1 mM EDTA gekocht.The recombinant plasmid pkTH 1250 served as the capture probe. This plasmid consists of a 2.9 kb S1I - C1aI fragment of the plasmid pKTH 1220 (DSM 2825) and the vector pAT 153. The DNA of pKTH 1250 was analyzed using the known Nick translation method (Rigby et al., J. Mol. Biol. 113, pp. 237-251, 1977) and with Biotin-11-UTP as Substrate (Bethesda Research Laboratoris) biotin molecules bound in a convex manner. The capture probe DNA was used before Boiled for 5 min in the buffer 10 mM Tris-Cl pH 7.6, 1 mM EDTA.

Als Probe diente das rekombinante Plasmid pkTH 1220 (DSM 2825). Dieses Plasmid enthält etwa 10 kb für Chlamydia trachomatis typische DNA, gebunden an den Vector pBR322. Das Plasmid fungiert als Modell-DNA und repräsentiert Genom-DNA des Bakteriums. Vor Gebrauch wurde das Plasmid 5 min in 0,02 M NaOH gekocht und sodann die Lösung mit Essigsäure neutralisiert. The recombinant plasmid pkTH 1220 (DSM 2825). This plasmid contains approximately 10 kb for Chlamydia trachomatis typical DNA, bound to the vector pBR322. The plasmid acts as model DNA and represents genomic DNA of the bacterium. Before use, the plasmid was 5 min boiled in 0.02 M NaOH and then the solution with acetic acid neutralized.

Das als Affinitätsmaterial verwendete Streptavidin wurde an CNBr-aktivierte Sepharose gebunden (Axen et al., Nature 214, S. 1302-1304, 1967).The streptavidin used as an affinity material was bound to CNBr-activated Sepharose (Axen et al., Nature 214, pp. 1302-1304, 1967).

Für den Test wurden im Reagenzglas 500 000 cpm Detektorsonde, 50 ng Einfangsonden-DNA und 10 ng Proben-DNA zusammengebracht. Das Volumen wurde auf 20 µl eingestellt, und die Pufferlösung war die gleiche wie im Beispiel 1. Als Kontroll-DNA diente Kalbsthymus-DNA.For the test, 500,000 cpm detector probe, Bring 50ng capture probe DNA and 10ng sample DNA. The volume was adjusted to 20 µl, and the Buffer solution was the same as in Example 1. As control DNA served calf thymus DNA.

Das Gemisch wurde bei 65°C 60 min inkubiert. Danach wurden 500 µl Pufferlösung folgender Zusammensetzung zugesetzt: 0,1 M Tris-Cl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl₂, 0,05% Triton x-100. Die Lösung wurde zum Schluß in einer 0,1 ml Streptavidin-Sepharose-Säule fraktioniert. Die Säule wurde mit 10 ml der o. g. Pufferlösung und mit 0,015 M Natriumchlorid-, 0,015 M Natriumphosphat- (pH 7,6) 0,5% Natriumdodezylsulfatlösung (50°C), Volumen 10 ml, gewaschen. Dabei haftete sich die biotinylierte DNA ans Streptavidin, während die übrige DNA die Säule passierte. Die radioaktive Sonde haftete sich nur als Folge der Hybridbildung an. Die angehaftete Radioaktivität wurde durch Einbringen der gesamten Säule in das Zählrohr eines Gammazählers bestimmt.The mixture was incubated at 65 ° C for 60 min. After that 500 µl buffer solution of the following composition added: 0.1 M Tris-Cl pH 7.5, 0.1 M NaCl, 2 mM MgCl₂, 0.05% Triton x-100. The solution was finally poured into a 0.1 ml Streptavidin-Sepharose column fractionated. The pillar was with 10 ml of the above. Buffer solution and with 0.015 M sodium chloride, 0.015 M sodium phosphate (pH 7.6) 0.5% sodium dodezyl sulfate solution (50 ° C), volume 10 ml, washed. The biotinylated DNA adhered to streptavidin, while the rest of the DNA passed the column. The radioactive Probe only adhered as a result of hybrid formation. The radioactivity attached was introduced by introducing the entire column in the counter tube of a gamma counter.

Ergebnis ¹²⁵I-Aktivität (cpm) Result ¹²⁵I activity (cpm)

Example 3 Identification of plasmid pBR322 DNA using of an antigen-antibody pair

Als Detektorsonde diente ein Plasmid-pBR322-Derivat (kommerziell aus verschiedenen Quellen erhältlich), aus dem das Fragment PstI-Sa1I (3613-651) entfernt worden war. Das Plasmid war nach einem bekannten Verfahren (Forster et al., Nucleic Acids Res. 13, S. 745-761, 1985) und unter Verwendung im Handel erhältlicher Reagenzien (Bresa, Adelaide, Australien) mit Photobiotin markiert worden.A plasmid pBR322 derivative (commercial available from various sources) from which the Fragment PstI-Sa1I (3613-651) had been removed. The The plasmid was prepared by a known method (Forster et al., Nucleic Acids Res. 13, pp. 745-761, 1985) and below Use of commercially available reagents (Bresa, Adelaide, Australia) has been labeled with photobiotin.

Als Einfangsonde diente DNA des rekombinanten Phagen M13mp11, an welche das Plasmidfragment PstI-Sa1I gefügt worden war. Die DNA war nach einem bekannten Verfahren Orgenics Ltd. Yavne, Israel) sulfoniert worden.Recombinant phage DNA was used as the capture probe M13mp11, to which the plasmid fragment PstI-Sa1I is added had been. The DNA was by a known method Orgenics Ltd. Yavne, Israel) has been sulfonated.

Als Probe diente E. Coli HB101, an welches das Plasmid pBR322 gefügt war. Die Plasmid-PBR322-Menge wurde durch Chloramphenikol-Amplifikation erhöht (Maniatis et al., Molecular cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Die Bakterienzellen wurden mit Lysozym aufgebrochen und in NaOH gekocht wie in der Publikation Palva, J. Clin, Microbiol. 18, S. 92-100, 1983, beschrieben ist.E. Coli HB101 served as the sample, to which the plasmid pBR322 was added. The amount of plasmid PBR322 was determined by Chloramphenicol amplification increased (Maniatis et al., Molecular cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). The bacterial cells were treated with lysozyme broken up and boiled in NaOH as in the publication Palva, J. Clin, Microbiol. 18, pp. 92-100, 1983 is.

Die Antisulfon-monoklonalen Antikörper wurden nach Standardverfahren (McKearn, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, ed. Kennett et al., Plenum Press 1980) in den Vertiefungen der aus Polystyrol hergestellten Mikrotiter befestigt.The antisulfone monoclonal antibodies were made according to standard procedures (McKearn, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyzes, ed. Kennett et al., Plenum Press 1980) in the wells of polystyrene Microtiter attached.

Für den Test wurden 5×10⁶ aufgebrochene E. coli-Zellen (sowohl aus Plasmid pBR322 gefügt als auch ohne dieses), 100 ng Einfangsonden-DNA und 100 ng Detektorsonden-DNA zu einer Hybridierungslösung vereint, deren Volumen man auf 50 µl einstellte. Die Hybridisierungsverhältnisse waren die gleichen wie im Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß 5% Polyethylenglykol (PEG 6000) zugesetzt wurden und der Natriumdodezylsulfatgehalt 0,1% betrug. For the test, 5 × 10⁶ broken E. coli cells (both from plasmid pBR322 and without it), 100ng capture probe DNA and 100ng detector probe DNA combined into a hybridization solution, the volume of which set to 50 µl. The hybridization ratios were the same as in Example 1 except that 5% Polyethylene glycol (PEG 6000) were added and the Sodium dodezyl sulfate content was 0.1%.

Nach erfolgter Hybridisierung wurde die Lösung mit 0,02 M Natriumphosphat (pH 7,6) auf 250 µl verdünnt; danach wurde die Lösung in die Mikrotiter-Vertiefungen gebracht, in denen die Antikörper befestigt waren. Es folgte eine zweistündige Inkubation bei 37°C. Danach wurden die Mikrotiter mit einer aus 0,15 M Natriumchlorid, 0,02 M Natriumphosphat und 0,05% Triton-X-100 bestehenden Lösung gewaschen.After hybridization, the solution with 0.02 M Sodium phosphate (pH 7.6) diluted to 250 µl; after that the solution was placed in the microtiter wells, in which the antibodies were attached. There followed one incubation for two hours at 37 ° C. After that, the microtiter with one of 0.15 M sodium chloride, 0.02 M sodium phosphate and 0.05% Triton-X-100 existing solution.

Die Beobachtung der Detektorsonde erfolgte durch Zugabe von Streptavidin (Bethesda Research Laboratories, BRL), Waschen, Zugabe von biotinylierter alkalischer Phosphatase (BRL) und Waschen wie in der Publikation Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, S. 4045-4049, 1983, beschrieben ist. Zum Schluß wurden 250 µl Paranitrophenylphosphatlösung (35 mg/ml, Sigma) im Diethanolaminpuffer (pH 10) zugesetzt. Nach 60 Minuten wurde die Reaktion gestoppt und die Absorption bei 410 nm gemessen.The detector probe was observed by adding by streptavidin (Bethesda Research Laboratories, BRL), washing, Add biotinylated alkaline phosphatase (BRL) and washing as in the publication Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, pp. 4045-4049, 1983 is. Finally, 250 ul paranitrophenyl phosphate solution (35 mg / ml, Sigma) in diethanolamine buffer (pH 10) added. The reaction was stopped after 60 minutes and the absorbance measured at 410 nm.

Ergebnis: A 410 nm Result: A 410 nm

Claims

1. A method for identifying nucleic acids, the hybridization method using at least two probes, of which the detector probe is labeled with a suitable measurable indicator substance, while a component which acts as a partner in an affinity pair is bound to the other probe which acts as a capture probe can function so that the capture probe resulting from the hybridization reaction: sample: detector probe hybrid can be separated from the other components in the hybridization mixture using the other components of the affinity pair, characterized in that the probes are in the same solution phase.

2. The method according to claim 1, characterized in that that the pair of components, the affinity for each other has, is biotin - streptavidin or biotin - avidin.

3. The method according to claim 1, characterized in that the pair of components, the affinity for each other has a homopolynucleotide pair.

4. The method according to claim 1 and 3, characterized in that the pair of components, the affinity for each other has poly dC - poly dG is.

5. The method according to claim 1 and 3, characterized in that the pair of components, the affinity for each other has, is poly dA - poly dT.

6. The method according to claim 1 and 3, characterized characterized in that the pair of components, the affinity for each other has, Poly dA - Poly U is.

7. The method according to claim 1, characterized in that the pair of components, the affinity for each other has, consists of heavy metal derivative - thio group.

8. The method according to claim 1, characterized in that the pair of components, the affinity for each other has, consists of antigen antibodies.

9. Test kit for performing the method according to Claims 1 to 8, characterized in that it is at least contains two probes according to claim 1.