AT397514B - METHOD FOR IDENTIFYING NUCLEIC ACIDS - Google Patents
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Description
AT397 514BAT397 514B
Verfahren zur Identifizierung vnn NukleinsäurenMethods for identifying nucleic acids
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Nukleinsäuren mit Hilfe in Lösung erfolgender Hybridisierung. Kennzeichnend für das erfindungsgemäße Verfahren ist, daß bei der Hybridisierungsreaktion mit wenigstens zwei Sonden gearbeitet wird. Die Detektorsonde ist mit einem Indikator markiert, während an die Einfangsonde eine Komponente gebunden ist, die als Partner in einem Affinitätspaar zu fungieren vermag, wobei das bei der Hybridisierung gebildete Einfangsonde:Probe> Detektorsonde-Hybrid von den übrigen in der Hybridisierungsmischung vorliegenden Komponenten mit Hilfe des anderen Partners des Affinitätspaares getrennt werden kann.The invention relates to a method for identifying nucleic acids with the aid of hybridization taking place in solution. It is characteristic of the method according to the invention that the hybridization reaction is carried out with at least two probes. The detector probe is marked with an indicator, while a component is bound to the capture probe that can act as a partner in an affinity pair, the capture probe formed during hybridization: sample > Detector probe hybrid can be separated from the other components present in the hybridization mixture with the help of the other partner of the affinity pair.
Zur Identifizierung von Nukleinsäuren hat man sich verschiedenartiger Hybridisierungsverfahren bedient Als Beispiele seien die direkten Hybridisierungsverfahren und die Sandwich-Hybridisierungsverfahren genannt Bei den direkten Hybridisierungsverfahren liegt die Nukleinsäureprobe entweder in Lösung oder an einen festen Trägerstoff gebunden vor. Die zu identifizierende Nukleinsäure wird unter Verwendung einer einzigen markierten Sonde nachgewiesen. Bei den Sandwich-Hybridisierungsverfahren (US 4 486 539) arbeitet man mit zwei verschiedenen Sonden, mit denen die zu identifizierende Nukleinsäure in der Probelösung nachgewiesen wird. Die Detektorsonde ist dabei mit einem Indikatorstoff markiert, während die Trennsonde an einen festen Träger gebunden istVarious types of hybridization methods have been used to identify nucleic acids. Examples are the direct hybridization methods and the sandwich hybridization methods. In the direct hybridization methods, the nucleic acid sample is either in solution or bound to a solid carrier. The nucleic acid to be identified is detected using a single labeled probe. In the sandwich hybridization method (US 4,486,539), two different probes are used to detect the nucleic acid to be identified in the sample solution. The detector probe is marked with an indicator substance, while the separation probe is bound to a solid support
Erfindungsgemäß wurde ein neues Hybridisierungsverfahren entwickelt, bei dem man mit zwei verschiedenen Sonden arbeitet wobei beide Sonden in der gleichen Lösungsphase enthalten sind. Da die an der Hybridisierung teilnehmende Probenukleinsäure und beide Sonden sich in der gleichen Lösungsphase befinden, erfolgt die Hybridisierungsreaktion beträchtlich schneller als bei jener Sandwich-Hybridisierung, bei der die Trennsonde an einen festen Träger gebunden ist. Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist eine einstündige Inkubationszeit ausreichend. Bei der einstufigen Sandwich-Hybridisierung (US 4 4S6 539) sind fiir eine ausreichende Hybridisierung 12 Stunden erforderlich. Bei der zweistufigen Sandwich-Hybridisierung (Dun und Hassell, CelL Vol. 12 S. 23 - 36,1977) benötigt man eine Hybridisierungszeit von wenigstens 24 Stunden.According to the invention, a new hybridization method was developed in which two different probes are used, both probes being contained in the same solution phase. Since the sample nucleic acid participating in the hybridization and both probes are in the same solution phase, the hybridization reaction takes place considerably faster than in the case of the sandwich hybridization in which the separation probe is bound to a solid support. In the method according to the invention, an incubation time of one hour is sufficient. In the case of the single-stage sandwich hybridization (US 4 4S6 539), 12 hours are required for sufficient hybridization. The two-stage sandwich hybridization (Dun and Hassell, CelL Vol. 12 pp. 23 - 36, 1977) requires a hybridization time of at least 24 hours.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren arbeitet man vorzugsweise mit wenigstens zwei Sonden. Diese Sonden sind zur zu identifizierenden Nukleinsäure ausreichend homologe Nukleinsämefragmente. Es ist von Vorteil, wenngleich nicht erforderlich, wenn die Sonden homolog zu relativ nahe beieinander liegenden Stellen in der zu identifizierenden Nukleinsäure sind. Die Sonden dürfen nicht homolog zueinander sein.The method according to the invention is preferably carried out with at least two probes. These probes are sufficiently homologous nucleic acid fragments to the nucleic acid to be identified. It is advantageous, though not necessary, if the probes are homologous to relatively close sites in the nucleic acid to be identified. The probes must not be homologous to one another.
Die Sonden können synthetisch, halbsynthetisch, mit Hilfe von DNA-Rekombinationstechnik oder aus direkt aus der Natur isolierten Nukleinsäuren gewonnen werden. Derartige Sonden sind auch im Handel erhältlich. Die Sonde kann an einen geeigneten Vektor gebunden sein; sie kann Vektorteile »ithalten oder völlig frei von Vektorteilen sein.The probes can be obtained synthetically, semi-synthetically, with the aid of recombinant DNA technology or from nucleic acids isolated directly from nature. Such probes are also commercially available. The probe can be bound to a suitable vector; it can contain vector parts or be completely free of vector parts.
Die Detektorsonde ist durch passende Indikatoren markiert. Als Indikatoren eignen sich verschiedenartige radioaktive Isotope oder radioaktiv markierte Verbindungen. Der Indikator kann auch fluoreszierend, lumineszierend, lichtemittierend oder enzymatisch bzw. immunologisch nachweisbar sein usw. Als Beispiele seien die auf der Affinität von Biotin und Avidin oder Streptavidin basierenden Indikatorstoffe, die Lanthanidchelate, die Ferritin· und Hämverbindungen und die immunologisch nachweisbaren Haptene, wie die Acetoxyacetylfluorenderivate (WO 8 302 286), genannt. Auch eine Identifizierung über Proteine ist möglich. Das erfindungsgemäße Verfahren ist unabhängig vom verwendeten Indikator. Im Zusammenhang mit dem Verfahren können alle bekannten und zukünftig zu entwickelnden, für die Nukleinsäurehybridisierung geeigneten Indikatorstoffe frei eingesetzt werden.The detector probe is marked by suitable indicators. Various types of radioactive isotopes or radioactively labeled compounds are suitable as indicators. The indicator can also be fluorescent, luminescent, light-emitting or enzymatic or immunologically detectable etc. Examples include the indicator substances based on the affinity of biotin and avidin or streptavidin, the lanthanide chelates, the ferritin and haem compounds and the immunologically detectable haptens such as Acetoxyacetyl fluorene derivatives (WO 8 302 286). Identification via proteins is also possible. The method according to the invention is independent of the indicator used. In connection with the method, all known indicator substances suitable for nucleic acid hybridization and to be developed in the future can be used freely.
An die als Einfangsonde dienende Sonde ist eine Komponente gebunden, die als Partner in einem Affinitätspaar zu fungieren vermag. Derartige Affinitätspaare sind beispielsweise Biotin - Avidin, Biotin -Streptavidin, Schwermetallderivat - Thiogruppe und die verschiedenen Homopolynukleotide, wie Poly dG -Poly dC, Poly dA - Poly dT oder Poly dA - Poly U. Es können jedoch auch andere Affinitätspaare eingesetzt werden, sofem ihre Komponenten nur eine genügend starke Affinität zueinander haben. Unter den bei immunologischen Verfahren eingesetzten Liganden und Konjugaten finden sich geeignete Affinitätspaare.A component that can act as a partner in an affinity pair is bound to the probe serving as a capture probe. Such affinity pairs are, for example, biotin-avidin, biotin-streptavidin, heavy metal derivative - thio group and the various homopolynucleotides, such as poly dG -poly dC, poly dA - poly dT or poly dA - poly U. However, other affinity pairs can also be used, if their Components only have a sufficiently strong affinity for one another. Suitable affinity pairs can be found among the ligands and conjugates used in immunological processes.
Vor der Hybridisierungsreaktion wird die Probe so behandelt, daß die Nukleinsäuren in einsträngiger Form in die Hybridisierungslösung freigesetzt werden. Die Hybridisierung erfolgt in einer Hybridisierungs-mischung, in der die Nukleinsäuren, die markierte Detektorsonde und die Einfangsonde nötigenfalls in einsträngige Form überführt sind. Als Hybridisierungslösung können verschiedenartige für diesen Zweck geeignete Puffer verwendet werden. Die Hybridisierung erfolgt im Temperaturbereich 0-80 °C, jedoch wird vorzugsweise mit einer Temperatur von 65 °C gearbeitet. Enthält die Hybridisierungslösung Formamid (40 - 55 %), so kann eine Temperatur von 37 °C angewendet werden. Als Hybridisierungszeit genügt eine Stunde.Before the hybridization reaction, the sample is treated in such a way that the nucleic acids are released into the hybridization solution in a single strand. The hybridization takes place in a hybridization mixture in which the nucleic acids, the labeled detector probe and the capture probe are converted into single-stranded form if necessary. Various buffers suitable for this purpose can be used as the hybridization solution. The hybridization takes place in the temperature range 0-80 ° C, but preferably a temperature of 65 ° C is used. If the hybridization solution contains formamide (40 - 55%), a temperature of 37 ° C can be used. One hour is sufficient as the hybridization time.
Nach erfolgter Hybridisierung wird die Lösung nötigenfalls so verdünnt, daß sich für das Affinitätspaar günstige Verhältnisse ergeben. Danach bringt man das Gemisch mit dem anderen Partner des Affinitätspaares in Kontakt, der an einen festen Träg» gebunden ist, z. B. an eine Affinitätschromatographie-Säule, ein Filter oder eine Plastik- bzw. Glasfläche, und isoliert das Einfangsonde:Probe:Detektorsonde-Hybrid.After hybridization has taken place, the solution is diluted, if necessary, in such a way that favorable conditions result for the affinity pair. Then the mixture is brought into contact with the other partner of the affinity pair, who is bound to a solid support, eg. B. on an affinity chromatography column, a filter or a plastic or glass surface, and isolates the capture probe: sample: detector probe hybrid.
Als Affinitätssäulen-Trägermaterial kann zum Beispiel Zellulose, Latex, Polyacrylamid, Dextran oder Agarose dienen. Diese Materialien können auch als Suspensionen im Reagenzglas eingesetzt werden. Vorteilhaft gestaltet es sich auch, mit Reagenzgläsern zu arbeiten, an deren Innenfläche die eine Komponente des -2-Cellulose, latex, polyacrylamide, dextran or agarose, for example, can serve as the affinity column support material. These materials can also be used as suspensions in the test tube. It is also advantageous to work with test tubes on the inner surface of which one component of the -2-
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Affinitätspaares angelagert ist. Voraussetzung bei der Wahl des Materials ist, daß daran eine Komponente gebunden werden kann, welche Affinität zu der an die Einfangsonde gebundenen Komponenten hat.Affinity pair is attached. A prerequisite when choosing the material is that a component can be bound to it which has an affinity for the components bound to the capture probe.
Falls die Probe zu identifizierende Nukleinsäure enthält, entsteht bei der Hybridisierung ein Einfang-sonde:Probe:Detektorsonde-Hybrid. Dieses Hybrid haftet sich bei der Fraktionierung an den Träger. Die Markierung der sich an den Träger gehafteten Fraktion kann nach herkömmlichen Verfahren direkt am Träger oder nach vorheriger Elution am Eluat gemessen werden.If the sample contains nucleic acid to be identified, a capture probe is created during hybridization: sample: detector probe hybrid. This hybrid adheres to the carrier during fractionation. The marking of the fraction adhering to the support can be measured directly on the support by conventional methods or after elution on the eluate.
Bei der Fraktionierung können anstelle von Affinitätschromatographie auch andere Systeme, beispielsweise Phasenextraktion oder Magnetfeld, zur Anwendung gebracht werden.For fractionation, other systems, for example phase extraction or magnetic field, can also be used instead of affinity chromatography.
In den folgenden Anwendungsbeispielen wird das erfindungsgemäße Verfahren im einzelnen beschrieben. Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht an die in den Beispielen verwendeten Nukleinsäurefragmente gebunden. Für den Fachmann ist es eine Selbstverständlichkeit, wie sich entsprechende Nukleinsäurefragmente gewinnen lassen.The process according to the invention is described in detail in the following application examples. The method according to the invention is not bound to the nucleic acid fragments used in the examples. It is a matter of course for the person skilled in the art how appropriate nucleic acid fragments can be obtained.
Beispiel 1example 1
Identifizierung von Adenovirus-DNA aus Zellenlvsat unter Verwendung von HomopolvnukleotidIdentification of adenovirus DNA from cell lvsat using homopole nucleotide
Als Detektorsonde dient der mit ^1 markierte rekombinante Phage mKTH 1206, ein Bgl II-Fragment des Adenovirus (Typ 2) aus der Adenovirus-Genkarten-Position 42 - 453 %· Der besagte rekombinante Phage ist in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter Nr. 2827 deponiert Seine spezifische Aktivität beträgt 7 x 107 cpm/jig DNA. Eine nähere Beschreibung dieser Sonde findet sich in der Schrift Ranki et al. 1983, Gene 21,77 - 85.The recombinant phage mKTH 1206, a Bgl II fragment of the adenovirus (type 2) from the adenovirus gene card position 42-453%, which is marked with ^ 1, serves as the detector probe. The recombinant phage is in the German collection of microorganisms under no. 2827 deposited Its specific activity is 7 x 107 cpm / jig DNA. A more detailed description of this probe can be found in the publication Ranki et al. 1983, Gene 21.77-85.
Als Einfangsonde dient das rekombinante Plasmid pKTH 1202, das in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer DSM 2824 deponiert ist und aus einem BamHI D-Fragment des Adenovirus (Kartenposition 29 - 42 %), kloniert auf das Plasmid pBR322, besteht Das rekombinante Plasmid pkTH 1202 (DSM 2824) wurde mit Restriktionsenzym Hae III gespaltet und an die 3' Enden der Fragmente wurde mit Hilfe von Terminaltransferase ein Poly-A-Schwanz gefügt Die Schwanzlänge wurde durch 3H-A-Inkoiporation gemessen. Die Länge betrug im Durchschnitt etwa 70 A-Reste. Vor Gebrauch wurde die Einfangsonde durch Kochen denaturiert. Als Probe dienten Adenovirus-infizierte A-549-Zellen. Die infizierten Zellen wurden 21 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden gesammelt und mit einprozentig» Natriumdodecyl- sulfatlösung aufgebrochen. Die Lösung enthielt ca. 106 Zellen/ml. Die Viskosität wurde durch Ultraschallbehandlung gesenkt. Als Kontrolle dienten nichtinfizierte A-549-Zellen, die identisch behandelt wurden. Vor der Hybridisierung wurde die Probe 5 min in 0,02 M NaOH gekocht auf 0 °C abgekühlt und mit Essigsäure neutralisiert. Für den Test wurden im Reagenzglas 500.000 cpm Detektorsonde, 50 ng Einfangsonden-DNA und 10 μΐ Probe zusammengebracht. Das Volumen wurde auf 50 μΐ eingestellt, und als Pufferlösung dienten 0,6 M Natriumchlorid, 0,06 M Natriumzitrat, 0,02 M Natriumphosphat (pH 7,6) und 0,5 % Natriumdodecylsulfat. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 65 °C inkubiert.The recombinant plasmid pKTH 1202, which is deposited in the German Collection of Microorganisms under the number DSM 2824 and consists of a BamHI D fragment of the adenovirus (card position 29-42%), cloned onto the plasmid pBR322, is used as the capture probe. The recombinant plasmid pkTH 1202 (DSM 2824) was cleaved with restriction enzyme Hae III and a poly-A tail was added to the 3 'ends of the fragments with the aid of terminal transferase. The tail length was measured by 3H-A inciporation. The average length was about 70 A residues. Before use, the capture probe was denatured by boiling. Adenovirus-infected A-549 cells served as sample. The infected cells were incubated for 21 hours. The cells were collected and disrupted with one percent »sodium dodecyl sulfate solution. The solution contained approximately 106 cells / ml. The viscosity was reduced by ultrasonic treatment. Uninfected A-549 cells, which were treated identically, served as controls. Before hybridization, the sample was boiled in 0.02 M NaOH for 5 minutes, cooled to 0 ° C. and neutralized with acetic acid. For the test, 500,000 cpm detector probe, 50 ng capture probe DNA and 10 μΐ sample were combined in a test tube. The volume was adjusted to 50 μΐ and 0.6 M sodium chloride, 0.06 M sodium citrate, 0.02 M sodium phosphate (pH 7.6) and 0.5% sodium dodecyl sulfate were used as the buffer solution. The mixture was incubated at 65 ° C for one hour.
Nach erfolgter Hybridisierung wurde die Lösung auf +20 °C abgekühlt und langsam durch eine Chromatographiesäule geschleust, die 1 ml Oligo-dT-Zellulose enthielt. Der Durchlauf wurde aufgefangen und erneut durch die Säule geschickt Danach wurde die Säule mit 20 ml Lösung gewaschen, welche 0,15 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumphosphat (pH 7,6) und 0,5 % Natriumdodecylsulfat enthielt. Die angelagerte DNA wurde zum Schluß mit 1 ml 0,02 M NaOH äbgelöst. Diese Lösung wurde aufgefangen, und ihre Radioaktivität wurde bestimmtAfter hybridization, the solution was cooled to +20 ° C and slowly passed through a chromatography column containing 1 ml of oligo-dT cellulose. The run was collected and passed through the column again. The column was then washed with 20 ml of solution containing 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium phosphate (pH 7.6) and 0.5% sodium dodecyl sulfate. The attached DNA was finally dissolved with 1 ml of 0.02 M NaOH. This solution was collected and its radioactivity determined
Ergebnis: ^I-Aktivität (cpm)Result: ^ I activity (cpm)
Probe: infizierte Zellen Kontrollzellen 5230 325Sample: infected cells control cells 5230 325
Beispiel 2Example 2
Identifizierung der DNA von Chlamydia trachomatis unter Verwendung von Biotin - StrentavidinIdentification of Chlamydia trachomatis DNA using biotin - strentavidin
IOCIOC
Als Detektorsonde diente der mit I markierte rekombinante Phage mKTH 1245, welcher zwei BamHI -Sali DNA-Fragmente des Klons pKTH 1220 enthält, die zusammen an den Vektor M13mp8 gebunden sind. Der Klon pKTH 1220 ist in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer DSM 2825 deponiert und in der Publikation Palva et al., FEMS Microbiology Leiters 23 S. 83 - 89 (1984) beschrieben.The I-labeled recombinant phage mKTH 1245, which contains two BamHI-Sali DNA fragments of the clone pKTH 1220, which are bound together to the vector M13mp8, served as the detector probe. The clone pKTH 1220 is deposited in the German Collection of Microorganisms under the number DSM 2825 and is described in the publication Palva et al., FEMS Microbiology Leiters 23 pp. 83-89 (1984).
Als Einfangsonde diente das rekombinante Plasmid pKTH 1250. Dieses Plasmid besteht aus einem 2,9 kb Sali - Clal Fragment des Plasmids pKTH 1220 (DSM 2825) und dem Vector pAT 153. An die DNA des pKTH 1250 wurden unter Anwendung des bekannten Nick-Translationsverfahrens (Rigby et al., J. Mol. Biol. 113, S. 237 - 251,1977) und mit Biotin-ll-UTP als Substrat (Bethesda Research Laboratories) Biotinmoleküle kovalent gebunden. Die Einfangsonden-DNA wurde vor Gebrauch 5 min in dem Puffer 10 mM Tris-Cl pH 7,6,1 -3-The recombinant plasmid pKTH 1250 was used as the capture probe. This plasmid consists of a 2.9 kb Sali-Clal fragment of the plasmid pKTH 1220 (DSM 2825) and the vector pAT 153. The DNA of pKTH 1250 was applied using the known nick translation method (Rigby et al., J. Mol. Biol. 113, pp. 237-251, 1977) and with biotin-II-UTP as substrate (Bethesda Research Laboratories) biotin molecules bound covalently. The capture probe DNA was 5 min in the buffer 10 mM Tris-Cl pH 7.6.1 -3- before use
AT 397 514 B mM EDTA gekocht.Cooked AT 397 514 B mM EDTA.
Als Probe diente das rekombinante Plasmid pKTH 1220 (DSM 2825). Dieses Plasmid enthält etwa 10 kb für Chlamydia trachomatis typische DNA, gebunden an den Vector pBR322. Das Plasmid fungiert als ModellDNA und repräsentiert Genom-DNA des Bakteriums. Vor Gebrauch wurde das Plasmid 5 min in 0,02 M NaOH gekocht und sodann die Lösung mit Essigsäure neutralisiert.The recombinant plasmid pKTH 1220 (DSM 2825) served as a sample. This plasmid contains approximately 10 kb of DNA typical for Chlamydia trachomatis, bound to the vector pBR322. The plasmid acts as a model DNA and represents genomic DNA of the bacterium. Before use, the plasmid was boiled in 0.02 M NaOH for 5 minutes and then the solution was neutralized with acetic acid.
Das als Affinitätsmaterial verwendete Streptavidin wurde an CNBr-aktivierte Sepharose gebunden (Axen et al., Nature 214, S. 1302 -1304,1967). Für den Test wurden im Reagenzglas 500.000 cpm Detektorsonde, 50 ng Einfangsonden-DNA und 10 ng Proben-DNA zusammengebracht Das Volumen wurde auf 20 μΐ eingestellt, und die Pufferlösung war die gleiche wie im Beispiel 1. Als Kontroll-DNA diente Kalbsthymus-DNA.The streptavidin used as affinity material was bound to CNBr-activated Sepharose (Axen et al., Nature 214, pp. 1302-1304, 1967). For the test, 500,000 cpm detector probe, 50 ng capture probe DNA and 10 ng sample DNA were brought together in a test tube. The volume was adjusted to 20 μl and the buffer solution was the same as in example 1. Calf thymus DNA served as control DNA.
Das Gemisch wurde bei 65 °C 60 min inkubiert Danach wurden 500 μΐ Pufferlösung folgender Zusammensetzung zugesetzt: 0,1 M Tris-Cl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgC^, 0,05 % Triton X-100. Die Lösung wurde zum Schluß in einer 0,2 ml Streptavidin-Sepharose-Säule fraktioniert. Die Säule wurde mit 10 ml der o. g. Pufferlösung und mit 0,015 M Natriumchlorid-, 0,015 M-Natriumphosphat- (pH 7,6), 0,5 % Natriumdodecylsulfatlösung (50 °C), Volumen 10 ml, gewaschen. Dabei haftete sich die biotinylierte DNA ans Streptavidin, während die übrige DNA die Säule passierte. Die radioaktive Sonde haftete sich nur als Folge der Hybridbildung an. Die angehaftete Radioaktivität wurde durch Einbringen der gesamten Säule in das Zählrohr eines Gammazählers bestimmtThe mixture was incubated at 65 ° C. for 60 min. Then 500 μl of buffer solution of the following composition were added: 0.1 M Tris-Cl pH 7.5, 0.1 M NaCl, 2 mM MgC ^, 0.05% Triton X-100 . The solution was finally fractionated in a 0.2 ml streptavidin-Sepharose column. The column was washed with 10 ml of the above. Buffer solution and washed with 0.015 M sodium chloride, 0.015 M sodium phosphate (pH 7.6), 0.5% sodium dodecyl sulfate solution (50 ° C), volume 10 ml. The biotinylated DNA adhered to the streptavidin, while the rest of the DNA passed the column. The radioactive probe only adhered as a result of hybrid formation. The radioactivity adhered to was determined by inserting the entire column into the counter tube of a gamma counter
Ergebnis: ^1-Aktivität (cpm)Result: ^ 1 activity (cpm)
Probe: 10 ng pKTH 1220 10 ng Kontroll-DNA 1350 115Sample: 10 ng pKTH 1220 10 ng control DNA 1350 115
Beispiel 3Example 3
Identifizierung von Plasmid-pBR322-DNA unter Verwendung eines Antigen-Antikörper-PaaresIdentification of plasmid pBR322 DNA using an antigen-antibody pair
Als Detektorsonde diente ein Plasmid-pBR322-Derivat (kommerziell aus verschiedenen Quellen erhältlich), aus dem das Fragment Pstl-Sall (3613 - 651) entfernt worden war. Das Plasmid war nach einem bekannten Verfahren (Förster et al., Nucleic Acids Res. 13, S. 745 - 761,1985) und unter Verwendung im Handel erhältlicher Reagenzien (Bresa, Adelaide, Australien) mit Photobiotin markiert worden.A plasmid pBR322 derivative (commercially available from various sources) from which the fragment PstI-Sal (3613-651) had been removed served as the detector probe. The plasmid was labeled with photobiotin by a known method (Förster et al., Nucleic Acids Res. 13, pp. 745-761, 1985) and using commercially available reagents (Bresa, Adelaide, Australia).
Als Einfangsonde diente DNA des rekombinanten Phagen M13mpll, an welche das Plasmidfragment Pstl-Sall gefügt worden war. Die DNA war nach einem bekannten Verfahren (Orgenics Ltd. Yavne, Israel) sulfoniert worden.DNA of the recombinant phage M13mpll, to which the plasmid fragment Pstl-Sall had been added, served as the capture probe. The DNA had been sulfonated by a known method (Orgenics Ltd. Yavne, Israel).
Als Probe diente E. Coli HB101, an welches das Plasmid pBR322 gefügt war. Die Plasmid-pBR322-Menge wurde durch Chloramphenikol-Amplifikation erhöht (Maniatis et al., Molecular cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Die Bakterienzellen wurden mit Lysozym aufgebrochen und in NaOH gekocht wie in der Publikation Palva, J. Clin. MicrobioL 18, S. 92 -100,1983, beschrieben ist.E. Coli HB101, to which the plasmid pBR322 was added, served as a sample. The amount of plasmid pBR322 was increased by chloramphenicol amplification (Maniatis et al., Molecular cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). The bacterial cells were broken up with lysozyme and boiled in NaOH as described in Palva, J. Clin. MicrobioL 18, pp. 92-100, 1983, is described.
Die Antisulfon-monoklonalen Antikörper wurden nach Standardverfahren (McKeam, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, ed. Kennett et al., Plenum Press 1980) in den Vertiefungen der aus Polystyrol hergestellten Mikrotiter befestigt. Für den Test wurden 5 x 10^ aufgebrochene E, coli-Zellen (sowohl ans Plasmid pBR322 gefügt als auch ohne dieses), 100 ng Einfangsonden-DNA und 100 ng Detektorsonden-DNA zu einer Hybridiesierungslösung vereint, deren Volumen man auf 50 μΐ einstellte. Die Hybridisierungsverhältnisse waren die gleichen wie im Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß 5 % Polyethylenglykol (PEG 6000) zugesetzt wurden und der Natriumdodecylsulfatgehalt 0,1 % betrug.The antisulfone monoclonal antibodies were fixed by standard methods (McKeam, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyzes, ed. Kennett et al., Plenum Press 1980) in the wells of the microtiter made of polystyrene. For the test, 5 x 10 ^ broken E, coli cells (both added to plasmid pBR322 and without it), 100 ng capture probe DNA and 100 ng detector probe DNA were combined to a hybridization solution, the volume of which was adjusted to 50 μΐ. The hybridization ratios were the same as in Example 1, except that 5% polyethylene glycol (PEG 6000) was added and the sodium dodecyl sulfate content was 0.1%.
Nach erfolgter Hybridisierung wurde die Lösung mit 0,02 M Natriumphosphat (pH 7,6) auf 250 μΐ verdünnt; danach wurde die Lösung in die Mikrotiter-Vertiefungen gebracht, in denen die Antikörper befestigt waren. Es folgte eine zweistündige Inkubation bei 37 °C. Danach wurden die Mikrotiter mit einer aus 0,15 M Natriumchlorid, 0,02 M Natriumphosphat und 0,05 % Triton-X-100 bestehenden Lösung gewaschen.After hybridization, the solution was diluted with 0.02 M sodium phosphate (pH 7.6) to 250 μΐ; the solution was then placed in the microtiter wells in which the antibodies were attached. This was followed by a two hour incubation at 37 ° C. The microtiter was then washed with a solution consisting of 0.15 M sodium chloride, 0.02 M sodium phosphate and 0.05% Triton-X-100.
Die Beobachtung der Detektorsonde erfolgte durch Zugabe von Streptavidin (Bethesda Research Laboraties, BRL), Waschen, Zugäbe von biotinylierter alkalischer Phosphatase (BRL) und Waschen wie in der Publikation Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, S. 4045 - 4049,1983, beschrieben ist. Zum Schluß wurden 250 μΐ Paranitrophenylphosphatlösung (35 mg/ml, Sigma) im Diethanolaminpuffer (pH 10) zugesetzt. Nach 60 Minuten wurde die Reaktion gestoppt und die Absorption bei 410 nm gemessen.The detector probe was observed by adding streptavidin (Bethesda Research Laboraties, BRL), washing, adding biotinylated alkaline phosphatase (BRL) and washing as described in the publication Leary et al., Proc. Natl. Acad. Be. USA 80, pp. 4045-4049, 1983, is described. Finally 250 μΐ paranitrophenyl phosphate solution (35 mg / ml, Sigma) in the diethanolamine buffer (pH 10) were added. After 60 minutes the reaction was stopped and the absorbance measured at 410 nm.
Ergebnis: A 410 nmResult: A 410 nm
Probe: Zellen, an die Kontrollzellen pBR322 gefügt war (ohne pBR322) >2 0,15 -4-Sample: cells to which control cells pBR322 had been added (without pBR322)> 2 0.15 -4-
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