DE3431780A1 - MANUFACTURING A SELECTABLE SHUTTLE CLONING VECTOR FOR THIOBACILLUS FERROOXIDANS - Google Patents

MANUFACTURING A SELECTABLE SHUTTLE CLONING VECTOR FOR THIOBACILLUS FERROOXIDANS

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DE3431780A1
DE3431780A1 DE19843431780 DE3431780A DE3431780A1 DE 3431780 A1 DE3431780 A1 DE 3431780A1 DE 19843431780 DE19843431780 DE 19843431780 DE 3431780 A DE3431780 A DE 3431780A DE 3431780 A1 DE3431780 A1 DE 3431780A1
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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Description

Beschreibungdescription

Die. Erfindung bezieht sich auf die Herstellung einesThe. Invention relates to the manufacture of a

_ rekombinanten, DNA-klonierenden Plasraid-Vektors für Thioo _ recombinant, DNA-cloning Plasraid vectors for Thioo

bacillus ferrooxidans, der ein selektierbares Gen für Chloratnphenicolresistenz enthält und fähig ist, sich sowohl in T. f errooxidans als auch in Escherichia coli zu replizieren- · .bacillus ferrooxidans, which is a selectable gene for Contains chlorate phenicol resistance and is able to spread in both T. ferrooxidans and Escherichia coli replicate- ·.

Obwohl selektierbare Clonierungsvektoren für andere Bakterien bereits hergestellt wurden, gibt es, soweit der Anmelderin bekannt ist, bisher keine Berichte Über die Herstellung eines selektierbaren Clonierungsvektors fürAlthough selectable cloning vectors for other bacteria have already been produced, there are, as far as the applicant is aware, no reports about the Production of a selectable cloning vector for

,_ T. ferrooxidans, der sich auch in E. coli replizieren kann. 15, _ T. ferrooxidans, which can also replicate in E. coli. 15th

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein Plasmid-Vektor hergestellt, indem ein kryptisches DNA-Plasmid aus einem Stamm der Art T. ferrooxidans extrahiert wird, das Plasmid aus T. ferrooxidans und ein zweites Plasmid, das ein Gen für Chloramphenieolresistenz enthält, mit ein und demselben Restriktionsenzym geschnitten und die Plasmid'e miteinander verbunden werden, um ein rekombinantes Plasiftid zu bilden.In the context of the present invention, a plasmid vector produced by extracting a cryptic DNA plasmid from a strain of the species T. ferrooxidans which Plasmid from T. ferrooxidans and a second plasmid, the contains a gene for resistance to chloramphenol, with and the same restriction enzyme cut and the plasmids linked together to form a recombinant plasiftid to build.

Das zweite Plasmid kann das Plasmid pBR325 sein, obwohl andere geeignete Plasmide anstelle des Plasmids pBR 325 ebenso verwendet werden können. .The second plasmid can be plasmid pBR325, though other suitable plasmids can also be used in place of plasmid pBR 325. .

Das resultierende rekombinante Plasmid pDRUüt repliziert 30The resulting recombinant plasmid pDRUut replicates 30th

sich in E. coli.themselves in E. coli.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung kann das Plasmid pDRMOI reisoliert werden und durch Schneiden mitIn a particular embodiment of the invention, the plasmid pDRMOI can be reisolated and cut with

__ mindestens einem Restriktionsenzym in der Weise modifi-35 __ at least one restriction enzyme in the manner modifi-35

ziert werden, als der E. coli-Origin der Replikation entfernt wird.be adorned as the E. coli origin of replication is removed will.

Das deletierte rekombinante Plasmid pDR4i2 enthält das GenThe deleted recombinant plasmid pDR4i2 contains the gene

für Chloramphenicolresistenz und repliziert sich in E. coli unter. Verwendung des T. ferrooxidans-Origins der Replikae tion.for chloramphenicol resistance and replicates in E. coli under. Use of the T. ferrooxidans origins of replication.

Die Erfindung erstreckt sich weiterhin auf die rekombitianten Plasmide pDR401 und pDR4i2, wie sie hier definiert . sind, bei denen es sich um neue, selektierbare Shuttle-Vektoren handelt, die für genetische Manipulationsexperimente eingesetzt werden können, bei denen T. ferrooxidans und E. coli verwendet werden.The invention also extends to the recombined Plasmids pDR401 and pDR4i2 as defined herein. that are new, selectable shuttle vectors acts that can be used for genetic manipulation experiments in which T. ferrooxidans and E. coli can be used.

Die Erfindung stellt somit ein Plasmid pDR4O1 zur Verfügung, das eine Größe von etwa 17,8 kb aufweist und durch das Restriktionsenzym Pvul in drei Fragmente der Größen 3,5 kb, 6,2 kb bzw. 8,1 kb teilbar ist.The invention thus provides a plasmid pDR4O1 available, which has a size of about 17.8 kb and by the restriction enzyme Pvul in three fragments of the sizes 3.5 kb, 6.2 kb or 8.1 kb is divisible.

Weiterhin stellt die Erfindung ein Plasmid pDR4i2 zurThe invention also provides a plasmid pDR4i2

Verfügung, das eine Größe von etwa 14,8 kb hat und durchAvailable that is approximately 14.8 kb in size and by

das Rest-riktionsenzym Pvul in drei Fragmente der Größenthe restriction enzyme Pvul in three fragments of sizes

3,5 kb, 5,1 kb bzw. 6,2 kb teilbar ist.3.5 kb, 5.1 kb or 6.2 kb is divisible.

Im folgenden wird die Erfindung an einem Beispiel be- __ schrieben mit Bezug auf die Zeichnung, in der die Restriktionskarte des kryptischen Plasmids dargestellt ist sowie die rekoabinanten Plasmide der Erfindung.In the following, the invention is illustrated using an example __ wrote with reference to the drawing in which the restriction card of the cryptic plasmid and the recoabinant plasmids of the invention.

Das kryptische Plasmid pTF-FC2 mit einer Größe von 12,4 on Kilobasen (kb) wurde aus einem T. ferrooxidans FC-Stamm extrahiert, der aus einer auslaugenden Säureflüssigkeit von Fairview Mine, General Mining Union Corporation Limited, Südafrika isoliert wurde. Die Restriktionskartierung Von pTF-FC2 zeigt, daß je einmal"Restriktionseroc kennungsstellen der Restriktionsenzyme Pstl, Xhol, Kpnl,The cryptic plasmid pTF-FC2, 12.4 on kilobases (kb) in size, was extracted from a T. ferrooxidans FC strain isolated from an acid leaching liquor from Fairview Mine, General Mining Union Corporation Limited, South Africa. The restriction mapping of pTF-FC2 shows that once each "Restrictioner oc recognition sites of the restriction enzymes Pstl, Xhol, Kpnl,

EcoRI, Apal, CIaI sowie zwei Restriktionserkennungsstellen des Restriktionsenzyms Pvul vorliegen, wie es in der anliegenden Zeichnung dargestellt ist.EcoRI, Apal, CIaI and two restriction recognition sites of the restriction enzyme Pvul are present, as in the appended Drawing is shown.

34317-99 Das rekombinante Plasmid pDR401 wird durch Insertion des ! E. coli-Plasmids pBR325 in die Pstl-Erkenrtungsstelle des Plasmids pTF-FC2 hergestellt. Das Plasmid pBR325 enthält die Gene für Ampicillinresistenz (Ap), Chloramphenicolresistenz (Cm) und Te t racy el in resistenz (Tc). Das Cionieren an der Pstl-Erkennungsstelle inaktiviert durch Insertion das Ap'-Gen, so daß E. coli-Transformanten. isoliert warden, die bezüglich der Antibiotikaresistenzen den Geno-34317-99 The recombinant plasmid pDR401 is generated by insertion of the ! E. coli plasmid pBR325 prepared into the PstI recognition site of plasmid pTF-FC2. The plasmid pBR325 contains the genes for ampicillin resistance (Ap), chloramphenicol resistance (Cm) and teracy el in resistance (Tc). Cloning at the PstI recognition site inactivates the Ap 'gene by insertion, so that E. coli transformants. are isolated which, with regard to antibiotic resistance, match the genome

RRS
typ Cm , Tc und Ap aufweisen. Das rekombinante PlasmidRRS
type Cm, Tc and Ap. The recombinant plasmid

1^ pDR401 (etwa 17,8 kb) wird aus den Έ. coli-Transformanten extrahiert und durch Restriktionsanalyse charakterisiert,. 1 ^ pDR401 (about 17.8 kb) is derived from the Έ. coli transformants extracted and characterized by restriction analysis.

Dieses neue rekombinante Plasmid enthält die Gerte fürThis new recombinant plasmid contains the devices for

RR
Cm und Tc und ist fähig, sich sowohl in T, ferrooxidansRR
Cm and Tc and is able to turn into both T, ferrooxidans

als auch E. coli zu replizieren.
15as well as E. coli to replicate.
15th

Ein Deletionsplasmid pDR4i2 (etwa 14,8 kb) wird als Folge einer Sall/Xhol-Verdauung des Plasmids pDR401 hergestellt, wobei das Sall/Xhol-Fragment (etwa 3,0 kb).entfernt wird, das den pBR325-Origin der Replikation und annähernd die Hälfte des Tc-Gens, sowie ein Stück von der Größe 0,3 kb der DNA von T. ferrooxidans pTF-VC2 enthält. Durch Restriktionsanalyse kann bestätigt werden, daß das Sall/Xhol-Fragment mit der Größe von 3,1 kb im Plasmid pDR4i2 deletiert ist. Dieses neue rekombinante Plasmid enthält da3 Gen Cm und ist fähig, sich sowohl in T. ferrooxidans als auch E. coli zu replizieren.A deletion plasmid pDR4i2 (about 14.8 kb) is produced as a result a Sall / Xhol digestion of the plasmid pDR401, removing the Sall / Xhol fragment (about 3.0 kb). that the pBR325 origin of the replication and almost half of the Tc gene, as well as a piece of the size 0.3 kb the DNA of T. ferrooxidans contains pTF-VC2. By restriction analysis it can be confirmed that the Sal / Xhol fragment with the size of 3.1 kb in the plasmid pDR4i2 deleted is. This new recombinant plasmid contains the Cm da3 gene and is capable of transforming itself into both T. ferrooxidans as well as E. coli to replicate.

Die beiden Plasmide pDR401 und pDR4i2 wurden durch endonucleolytisches Schneiden mit einem Re'striktionsenzym' charakterisiert.The two plasmids pDR401 and pDR4i2 were endonucleolytic Characterized cutting with a restriction enzyme.

Das Restriktionsenzym Pvul schneidet das Plasmid pDR40.1 in drei Fragmente mit den Größen 3,5 kb, 6,2 kb bzw. 8,1 kb.
35The restriction enzyme Pvul cuts the plasmid pDR40.1 into three fragments with the sizes 3.5 kb, 6.2 kb and 8.1 kb, respectively.
35

Dasselbe Restriktionsenzym Pvul schneidet das Plasmid pDR4i2 in drei Fragmente mit. den Größen 3,5 kb, 5,1 kb bzw. 6,2 kb.The same restriction enzyme Pvul cuts the plasmid pDR4i2 in three fragments with. the sizes 3.5 kb, 5.1 kb or 6.2 kb.

Claims (11)

GRÜNECKER. KINKELDEY STOCKMAlR & PARTNER PATENTANWÄLTE UR w STOC-.Mi.iR; . .· .... , P l-i , 4KO6 ι.' W ^iISTUR. Γ" . M HlLGERS ι ·'- -.c. Uli H MEYER-PLATH .- - ·. DR U-SOTTBODENHi^SE-.'. DR U KINKELDEY π =, C-- -t->CENCe GM DRCHT CEi..-. Si 'jE'-E.E 8000 MÜNCHEN 52 29. August 1984 ,P 19 058-002/er • GENERAL MINING UNION CORPORATION LIMITED 7^-78 Marshall Street . Johannesburg,' Transvaal Südafrika 20 Herstellen eines selektierbaren Shuttle-Clonierungsvektors für Thiobacillus ferrooxidans PatentansprücheGRÜNECKER. KINKELDEY STOCKMAlR & PARTNER PATENTANWÄLTE UR w STOC-.Mi.iR; . . · ...., P l-i, 4KO6 ι. ' W ^ iISTUR. Γ ". M HlLGERS ι · '--.c. Uli H MEYER-PLATH .- - ·. DR U-SOTTBODENHi ^ SE-.'. DR U KINKELDEY π =, C-- -t-> CENCe GM DRCHT CEi ..-. Si 'jE'-EE 8000 MUNICH 52 August 29, 1984, P 19 058-002 / er • GENERAL MINING UNION CORPORATION LIMITED 7 ^ -78 Marshall Street. Johannesburg,' Transvaal South Africa 20 Establishing a Selectable Shuttle Cloning Vector for Thiobacillus ferrooxidans patent claims 1. Verfahren zum Herstellen eines Plasmid-Vektors, dadurch· gekennzeichnet , daß ein kryptisches Plasmid aus einem Stamm der Art Thiobacillus ferrooxidans extrahiert wird, das Plasmid aus Thiobacillus ferrooxidans sowie ein zweites Plasmid, das ein Gen für Chloramphenicol-• resistenz enthält, mit ein und demselben Restriktionsenzyrr. geschnitten und die Plasmide miteinander verbunden werden. um ein.rekombinantes Plasmid zu bilden.1. A method for producing a plasmid vector, thereby · marked that a cryptic Plasmid is extracted from a strain of the species Thiobacillus ferrooxidans, the plasmid from Thiobacillus ferrooxidans and a second plasmid, which contains a gene for chloramphenicol • resistance, with one and the same restriction enzyme. cut and the plasmids are linked together. to create a recombinant plasmid. 2. Verfahren nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das kryptische DNA-Plasmid das Plasmid pTF~FC2 ist und eine Größe von 12 ,'-t kb aufweist.2. Procedure according to. Claim 1, characterized in that the cryptic DNA plasmid the Plasmid is pTF-FC2 and is 12'-t kb in size. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß das zweite Plasmid das Plasmid pBR 325 ist. .3. The method according to claim 1 and / or 2, characterized in that the second plasmid is the plasmid pBR 325 is. . 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß das Plasmid pBR 325 in die Pstl-Erkennungsstelle des Plasmids pTF-FC2 inseriert wird. .4. The method according to claim 3, characterized in that the plasmid pBR 325 in the Pstl recognition site of the plasmid pTF-FC2 is inserted. . 5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , 'daß' das rekombinante Plasmid reisoliert wird und das rekombinante Plasmid mit mindestens einem Restriktionsenzym geschnitten wird, um den E. coli-Restriktionsorigin zu entfernen, um ein deletiertes rekombinantes Plasmid zu bilden.5. The method according to at least one of claims 1 to 4, characterized in that 'that' the recombinant Plasmid is reisolated and the recombinant plasmid is cut with at least one restriction enzyme, to remove the E. coli restriction original to create a deleted recombinant plasmid. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß durch das Schneiden des rekombinanten Plasmids ein etwa 3,0 kb großes Fragment, das den Replikationsorigin des zweiten Plasmids enthält, aus dem rekombinanten Plasmid entfernt wird.6. The method according to claim 5, characterized in that by cutting the recombinant Plasmid, an approximately 3.0 kb fragment containing the origin of replication of the second plasmid from the recombinant plasmid is removed. 7. Rekombinantes Plasmid pDR 401 mit einer Größe von etwa 17,8 kb, das durch das Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4 hergestellt wurde.7. Recombinant plasmid pDR 401, approximately 17.8 kb in size, obtained by the method according to at least any one of claims 1 to 4 was produced. 8. Deletiertes rekombinantes Plasmid pDR 412 mit. einer Größe von etwa 14,8 kb, das durch das Verfahren nach, Anspruch 5 oder 6 hergestellt wurde.8. Deleted recombinant plasmid pDR 412 with. a size of about 14.8 kb obtained by the method according to, Claim 5 or 6 was made. 9. Ein Plasmid pDR 401, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Größe von etwa 17,8 kb hat und durch das Restriktionsenzym Pvul in drei Fragmente der Größen 3,5 kb,. 6,2 kb bzw. 8,1 kb teilbar ist.9. A plasmid pDR 401, characterized in that that it has a size of about 17.8 kb and by the restriction enzyme Pvul in three fragments of the sizes 3.5 kb. 6.2 kb or 8.1 kb is divisible. 10. Ein Plasmid pDR '!12, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Größe von etwa 14,8 kb. hat und durch das Restriktionsenzym Pvul in drei Fragmente der Größen 3,5 kb, 5,1 kb bzw. 6.2 kb teilbar ist.10. A plasmid pDR '! 12, characterized in that it is about 14.8 kb in size. and has kb by restriction enzyme PvuI in three fragments of sizes 3.5, 5.1 kb and 6.2 kb divisible i s t. 1 1 11. Plasniid pDR4O1 und Plasmid pDR4i2, im wesentlicher, gekennzeichnet durch die vorliegende Be- · Schreibung mit Bezug auf die anliegende Zeichnung.11. Plasniid pDR4O1 and plasmid pDR4i2, essentially characterized by the present Writing with reference to the attached drawing. 5 12.' Verfahren zum Herstellen eines Plasmid-Vektors, im wesentlichen gekennzeichnet durch die vorliegen.de Beschreibung mit Bezug auf die anliegende Zeichnung.5 12. ' Method for producing a plasmid vector, im essentially characterized by the haben.de description with reference to the attached Drawing.
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