DE3205849A1 - REAGENT AND METHOD FOR IMMUNOLOGICAL DETERMINATION - Google Patents
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Description
HOFFMANN · EITLE <& PARTNER 3 £ Q 5 §HOFFMANN · EITLE <& PARTNER 3 £ Q 5 §
PATENTANWÄLTEPATENT LAWYERS
DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) ■ DI PL-I N G. W. EITLE · D R. R ER. NAT. K. H O FFMAN N · DI PL.-1N G. W. LEHNDR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976). DI PL-IN G. W. EITLE · D R. R ER. NAT. K. HOFFMAN N · DI PL.-1N G. W. LEHN
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3636
Mochida Seiyaku Kabushiki Kaisha Tokyo / JapanMochida Seiyaku Kabushiki Kaisha Tokyo / Japan
Reagens und Verfahren zur immunologischen BestimmungReagent and method for immunological determination
Reagens und Verfahren zur immunologischen Bestimmung Reagent and method for the immunological Be humor
Die Erfindung betrifft ein Reagens und Verfahren zur immunologischen Bestimmung.The invention relates to a reagent and a method for immunological determination.
In den letzten Jahren haben die Entwicklungen in der Immunchemie zu ausgedehnten Untersuchungen von Antikörpern geführt, über die in der Vergangenheit nur wenig bekannt war; die Kontrollmechanismen für die Antikörperproduktion und die biochemischen Strukturen und Eigenschaften von Antikörpern wurden im Detail untersucht.In recent years, developments in immunochemistry have led to extensive studies of antibodies about which little is known in the past was; the control mechanisms for antibody production and the biochemical structures and properties of Antibodies were examined in detail.
Im Jahre 1975 gelang es C. Milstein et al., durch Zellfusion von Mäuse-Myelomäzellen mit Antikörper erzeugenden Zellen der Milz, einen monoklonalen Antikörper .herzustellen. Es ist anzunehmen, daß der monoklonale Antikörper wesentliches zur Entwicklung grundlegender Forschungen in der Immunologie beitragen wird; Untersuchungen auf diesem Gebiet sind in großem Maße durchgeführt worden.In 1975 C. Milstein et al. Succeeded by cell fusion of mouse myeloma cells with antibody-producing Cells of the spleen to produce a monoclonal antibody. It is believed that the monoclonal antibody is essential to the development of basic research will contribute in immunology; Studies in this field have been made on a large scale been.
Der Enzym-Immunoassay (EIA) wurde bisher als sehr empfindliche und quantitative immunologische Bestimmungsmethode durchgeführt. Insbesondere wird die Sandwich-Methode, die auf dieser Bestimmung basiert, aufgrund der Einfachheit des Verfahrens und der hohen Empfindlichkeit häufig durchgeführt. Da jedoch die Sandwich-Methode 1 bis 4 Tage zur Reaktion erfordert, ist es wünschenswert, die erforderliche Reaktionszeit auf ein Minimum zu beschränken. Außerdem wird aufgrund der neueren Fortschritte in der klinischen Medizin eine schnelle Auswertung der Testergebnisse verlangt, um den Patienten unmittelbar einer Behandlung unterziehen zu können. Auch von diesem Standpunkt ist eine Abkürzung der Reaktionszeit äußerst wünschenswert. Bei der konventionellen Sandwich-Methode führtThe enzyme immunoassay (EIA) has so far been considered to be very sensitive and quantitative immunological determination method carried out. In particular, the sandwich method, which is based on this determination is common due to the simplicity of the procedure and the high sensitivity carried out. However, since the sandwich method requires 1 to 4 days to react, it is desirable to have the required Keep response time to a minimum. Also, due to recent advances in the Clinical medicine requires a quick evaluation of the test results to give the patient an immediate one To be able to undergo treatment. From this point of view, too, shortening the response time is highly desirable. With the conventional sandwich method, it leads
jedoch eine Kürzung der Reaktionszeit zu einer Verringerung der Empfindlichkeit und Genauigkeit der Bestimmung, was im nachfolgenden näher erläutert wird, so daß eine signifikante Verkürzung der Reaktionszeit nicht erreicht werden kann.however, a shortening of the reaction time leads to a reduction in the sensitivity and accuracy of the determination, which is explained in more detail below, so that a significant shortening of the reaction time cannot be achieved.
Im folgenden wird die konventionelle Sandwich-Methode im einzelnen beschrieben. Obwohl aus Gründen der Einfachheit die Methode in der gesamten Beschreibung als auf EIA basierend beschrieben wird, kann die Erklärung auch auf eine auf FIA basierende Methode (Fluoroimmunoassay) angewandt werden.The conventional sandwich method is described in detail below. Though for the sake of simplicity the method is described throughout the specification as being based on EIA, the explanation may be can also be applied to an FIA-based method (fluoroimmunoassay).
Die konventionelle Sandwich-I-iethode wird in der Folge, wie sie in dem schematischen Diagramm in Fig. 1 dargestellt ist, durchgeführt.The conventional sandwich method is subsequently used as shown in the schematic diagram in Fig. 1, performed.
i) Insolubilisxerter Antikörper 2", welcher durch Bindung eines Antikörpers für ein zu bestimmendes Antigen 3 an einen unlöslichen Träger (feste Phase) 4 erhalten worden ist, wird mit dem Antigen 3 umgesetzt, um das Antigen 3 an den Antikörper 2' auf der festen Phase zu binden (erste Reaktion).i) Insolubilisxerter antibody 2 ", which by binding an antibody for a to be determined Antigen 3 on an insoluble carrier (solid phase) 4 is obtained with the Antigen 3 reacted in order to bind the antigen 3 to the antibody 2 'on the solid phase (first reaction).
ii) Die feste Phase 4 wird gewaschen, um nichtumgesetzte Substanzen zu entfernen.ii) The solid phase 4 is washed to remove any unreacted Remove substances.
iii) Die auf diese Weise gewaschene feste Phase 4 wird mit markiertem Antikörper 1', welcher durch Bindung eines Enzyms 5 an einen Antikörper für das zu bestimmende Antigen 3 erhalten wurde, umgesetzt, um den markierten Antikörper 1' an eine nichtuingesetzte antigene Stelle des Antigens 3, welches an die feste Phase 4 fixiert wurde, zu binden (zweite Reaktion).iii) The solid phase 4 washed in this way is labeled with antibody 1 ', which by Binding of an enzyme 5 to an antibody for the antigen 3 to be determined was obtained, converted, around the labeled antibody 1 'to a Unused antigenic site of antigen 3, which was fixed to solid phase 4, to bind (second reaction).
iv) Die feste Phase 4 wird gewaschen, um einen Überschuß an markiertem Antikörper 1' zu entfernen; daraufhin wird ein Substrat für das Enzym zugegeben und einer enzymatischen Reaktion unterworfen.iv) The solid phase 4 is washed to remove an excess to remove labeled antibody 1 '; then a substrate for the enzyme is added and subjected to an enzymatic reaction.
Da an die feste Phase 4 Antigen 3 und markierter Antikörper 1' gebunden sind, findet die Enzymreaktion in Proportion zu der vorliegenden Enzymmenge statt. Die Menge des zu bestimmenden Antigen 3 wird aus der Menge des erhaltenen Reaktionsproduktes bestimmt.Since antigen 3 and labeled antibody 1 'are bound to solid phase 4, the enzyme reaction takes place in proportion to the amount of enzyme present. The amount of the antigen 3 to be determined is determined from the amount of the obtained Determined reaction product.
Da man die Sandwich-Methode im allgemeinen als eine nicht kompetitive Bestimmung klassifiziert, könnte angenommen werden, daß keine Kompetitxonsreaktion vorliegt. Diese Klassifizierung gibt jedoch nicht notwendigerweise die genauen Reaktionszustände wieder. In der Tat kann bei der Sandwich-Methode ein Gleichgewichtszustand vorliegen, der schematisch wie folgt aufgezeigt wird.Since the sandwich method is generally classified as a non-competitive determination, it could be assumed be that there is no competition reaction. However, this classification does not necessarily give the exact reaction states again. Indeed, the sandwich method can have a state of equilibrium that is shown schematically as follows.
Erste ReaktionFirst reaction
'Sl'Sl
r (DEJ - AOr (DEJ - A O
Zweite ReaktionSecond reaction
-Ag ) + (Ab*D-Ag) + (Ab * D
(In dem vorstehenden Schema stellt | Ab] den insolubilisierten Antikörper dar; Ag bedeutet das zu bestimmende Antigen; Ab* stellt den markierten Antikörper dar; a, a1, b, b', c, c1, d, d1, e und e1 bedeuten Gleichgewichtskonstanten; und - bedeutet/ daß das Antigen und der Antikörper miteinander verbunden sind).(In the above scheme, | Ab] represents the insolubilized antibody; Ag means the antigen to be determined; Ab * represents the labeled antibody; a, a 1 , b, b ', c, c 1 , d, d 1 , e and e 1 mean equilibrium constants; and - means / that the antigen and the antibody are linked).
Wenn der Komplex des insolubilisierten Antikörpers und des zu bestimmenden Antigens mit dem markierten Antikörper in der zweiten Reaktion umgesetzt werden, so binden der insolubilisierte Antikörper und der markierte Antikörper kompetitiv an das zu bestimmende Antigen gemäß ihrer Affinitätniveaus für das Antigen (da die Eigenschaften des insolubilisierten Antikörpers und des markierten Antikörpers nahezu die gleichen sind, wird ihre Affinität zu dem zu bestimmenden Antigen als nahezu äquivalent angenommen), und aufgrund der !Competition dissoziiert der in der ersten Reaktion gebildete Komplex insolubilisierter Antikörper/Antigen, wobei Komplexe verschiedener Kombination, wie vorstehend gezeigt, gebildet werden.When the complex of the insolubilized antibody and the antigen to be determined with the labeled antibody are converted in the second reaction, the insolubilized antibody and the labeled antibody bind Antibodies compete with the antigen to be determined according to their affinity levels for the antigen (since the Properties of the insolubilized antibody and the labeled antibody are almost the same, their affinity for the antigen to be determined is assumed to be almost equivalent), and due to the ! Competition dissociates the complex of insolubilized antibody / antigen formed in the first reaction, whereby complexes of various combinations as shown above are formed.
Dies wird durch das folgende Experiment bewiesen:This is proven by the following experiment:
Ein Plastik-Reagensglas mit einem daran fixierten Anti-HCG-ß-üntereinheit-Antikörper wird mit HCG-ß, welches mit Peroxidase markiert ist, umgesetzt und dann gewaschen. Nach Umsetzung mit einem Anti-HCG-ß-Antikörper dissoziiert das enzymmarkierte HCG-ß, welches an der festen Phase fixiert worden war, allmählich von der festen Phase und wandert in die flüssige Phase. Fig. 2 gibt diesen Zustand wieder.A plastic test tube with an anti-HCG-ß-subunit antibody attached is reacted with HCG-ß, which is labeled with peroxidase, and then washed. After reaction with an anti-HCG-ß antibody, the enzyme-labeled HCG-ß, which is attached to the solid phase had been fixed, gradually moving from the solid phase and migrating to the liquid phase. Fig. 2 reflects this state.
Wenn jedoch die Zeit der ersten Reaktion ausreichend lange ist, so wird die Bindung Antigen und Antikörper teilweise irreversibel, und der Antigen-Antikörper-Koraplex dissoziiert nicht leicht, selbst wenn markierterHowever, if the time of the first reaction is long enough, the binding becomes antigen and antibody partly irreversible, and the antigen-antibody coraplex does not dissociate easily, even when labeled
Antikörper zu demselben zugegeben wird. Andererseits wird gesagt, daß, wenn die Zeit für die zweite Reaktion ausreichend lange ist, die Reaktion in einer Richtung fortschreitet, wonach sie einen Komplex aus "dem insolubilisierten Antikörper, dem zu untersuchenden Antigen und dem markierten Antikörper" bildet. Aus diesen Gründen ist es bei der konventionellen Sandwich-Methode unbedingt erforderlich, die Reaktion ausreichend lange Zeit durchzuführen. Wenn daher die Sandwich-Methode ohne erste Reaktion durchgeführt wird oder die Zeitdauer der ersten Reaktion extrem gekürzt wird (z. B. wenn der insolubilisierte Antikörper und der markierte Antikörper gleichzeitig mit dem zu bestimmenden Antigen umgesetzt werden), muß die zweite Reaktion langer durchgeführt werden und trotzdem sind Empfindlichkeit und Genauigkeit der Bestimmung reduziert. Wenn die Zeitdauer der zweiten Reaktion abgekürzt wird, so wirkt sich das noch nachteiliger auf die Empfindlichkeit und Genauigkeit aus. Aus diesen Gründen war es bei der konventionellen Methode unmöglich, die Reaktionszeit zu verkürzen, ohne eine Verringerung der Empfindlichkeit und Genauigkeit zu bewirken. Unter Berücksichtigung dieser Tatsache wurde von Ichihara et al. (The Japanese Journal of Clinical Pathology, 26, 1027 (1978)) berichtet, daß eine solche kompetitive Reaktion vorkommt, und daß nur dann, wenn die Reaktion über eine ausreichend lange Zeitdauer durchgeführt wird, die Reaktion teilweise irreversibel wird.Antibody is added to the same. On the other hand, it is said that if the time for the second reaction is long enough, the reaction in one Direction progresses, after which they create a complex of "the insolubilized antibody, the one to be examined Antigen and the labeled antibody "forms. For these reasons it is with the conventional Sandwich method absolutely necessary to carry out the reaction for a long enough time. Therefore, if the Sandwich method is carried out without a first reaction or the duration of the first reaction is extremely shortened (e.g. if the insolubilized antibody and the labeled antibody simultaneously with the one to be determined Antigen are converted), the second reaction must be carried out longer and still be The sensitivity and accuracy of the determination are reduced. When the duration of the second response is shortened becomes even more detrimental to sensitivity and accuracy. From these With the conventional method, it was impossible to shorten the response time without reducing it effect of sensitivity and accuracy. With this in mind, Ichihara was made by Ichihara et al. (The Japanese Journal of Clinical Pathology, 26, 1027 (1978)) reports that such competitive Reaction occurs and that only if the reaction has been carried out for a sufficiently long period of time the reaction becomes partially irreversible.
Das Reaktionssystem der konventionellen Methode ist daher kompliziert, wenig effizient und erfordert eine lange Reaktionszeit.The reaction system of the conventional method is therefore complicated, inefficient, and requires long response time.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Reagens zur immunologischen Bestimmung zur Verfügung zu stellen,The object of the present invention is to provide a reagent for immunological determination available,
welches eine deutliche Verkürzung der erforderlichen Bestimmungszeit ohne Reduzierung der Empfindlichkeit und Genauigkeit gewährleistet.which is a significant shortening of the required Determination time without reducing the sensitivity and accuracy guaranteed.
Außerdem ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes immunologisches Verfahren nach der Sandwich-Methode zur Verfügung zu stellen, welches eine deutliche Verkürzung der erforderlichen Bestimmungszeit ohne Reduzierung der Empfindlichkeit und Genauigkeit der Nachweisreaktion erlaubt.It is also an object of the present invention to provide an improved immunological method according to Sandwich method to provide which one Significant reduction in the required determination time without reducing sensitivity and accuracy the detection reaction allowed.
Die vorstehende Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß ein Reagens zur immunologischen Bestimmung nach der Sandwich-Ilethode zur Verfügung gestellt wird, welches insolubilisierten monoklonalen Antikörper und markierten monoklonalen Antikörper umfaßt, wobei die monoklonalen Antikörper die Fähigkeit besitzen, zwischen unterschiedlichen Antigendeterminan-"ten des zu bestimmenden Antigens zu unterscheiden und an dieselben zu binden.The above object is thereby achieved according to the invention solved that a reagent for immunological determination is made available by the Sandwich Ilethode which comprises insolubilized monoclonal antibody and labeled monoclonal antibody, wherein the monoclonal antibodies have the ability to distinguish between different antigen determinants to distinguish the antigen to be determined and to bind to the same.
Im weiteren wird gemäß der Erfindung ein verbessertes immunologisches Verfahren nach der Sandwich-Methode zur Verfügung gestellt, wobei das vorstehende Reagens verwendet wird.In addition, an improved immunological method according to the sandwich method for Using the above reagent.
Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm, welches die Reaktionsweise
nach der konventionellen Sandwich-Methode aufzeigt,
30Fig. 1 is a schematic diagram showing the reaction mode according to the conventional sandwich method,
30th
Fig. 2 und 3 stellen Diagramme dar, welche das Vorliegen "oder Nichtvorliegen einer Kompetition zwischen Antikörpern wiedergeben,Figures 2 and 3 are diagrams showing the presence or absence of competition between Reproduce antibodies,
Fig. 4 ist ein schematisches Diagramm, welches die Reaktionsweise gemäß der Erfindung aufzeigt,Fig. 4 is a schematic diagram showing the mode of reaction according to the invention,
Fig. 5 ist ein Diagramm, welches einen Vergleich zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und der konventionellen Methode wiedergibt,Fig. 5 is a diagram showing a comparison between the method of the invention and the reproduces the conventional method,
Fig. 6 ist eine Diagramm, welches die Ergebnisse von Beispiel 1 wiedergibt,Fig. 6 is a graph showing the results of Example 1,
Fig. 7 ist ein Diagramm, welches die Ergebnisse vonFig. 7 is a graph showing the results of
Beispiel 2 wiedergibt, und 10Example 2 reproduces, and 10
Fig. 8 ist ein Diagramm, welches die Ergebnisse von Beispiel 8 wiedergibt.8 is a graph showing the results of Example 8.
Gemäß der Erfindung werden monoklonale Antikörper zur Herstellung des unlöslichen Antikörpers und des markierten Antikörpers verwendet, welche zwischen verschiedenen antigenen Determinanten auf demselben Antigen unterscheiden, während bei der konventionellen Methode sog. polyklonale Antikörper (erhalten von Tieren, die mit dem gleichen Antigen immunisiert worden waren) zur Herstellung dieser zwei Antikörper verwendet wurden, so daß sie um die gleichen Antigendeterminanten des Antigens kompetieren.According to the invention, monoclonal antibodies are used for Production of the insoluble antibody and the labeled antibody used, which between different differentiate antigenic determinants on the same antigen, while with the conventional method so-called. polyclonal antibodies (obtained from animals immunized with the same antigen) for production these two antibodies have been used so that they target the same antigen determinant of the antigen compete.
Somit ist die vorliegende Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß der insolubilisierte Antikörper und der markierte Antikörper jeweils Antikörper umfassen, die fähig sind, verschiedene antigene Determinanten des gleichen zu bestimmenden Antigens wahrzunehmen und an diese zu binden; oder sie umfassen Antikörper, die zwischen verschiedenen antigenen Determinanten des Antigens unterscheiden, so daß es möglich ist, die jeweiligen zwei Antikörper an verschiedene antigene Stellen, die auf dem gleichen Antigen lokalisiert sind, in genügendem Abstand voneinander zu binden, um die Bindung eines jeden der Antikörper nicht zu stören.Thus, the present invention is characterized in that the insolubilized antibody and the labeled Antibodies each comprise antibodies that are capable of different antigenic determinants of the to perceive and bind to the same antigen to be determined; or they include antibodies between different antigenic determinants of the antigen so that it is possible to identify the respective two antibodies to different antigenic sites localized on the same antigen in sufficient quantity To tie distance from each other so as not to interfere with the binding of each of the antibodies.
Monoklonale Antikörper sind dafür als Antikörper am besten geeignet.Monoclonal antibodies are best suited as antibodies for this.
Die monoklonalen Antikörper werden durch Zellfusion zwisehen Myelomazellen und Antikörper-produzierenden Zellen nach der Methode von Milstein et al. (Nature, 256, 495 (1975)) erhalten. Da diese Antikörper aus Antikörper-produzierenden Zellen eines einzelnen Klons gebildet werden, sind sie vollständig homogen und ihre Spezifität für antigene Determinanten ist vollständig identisch. Da die gewöhnlich zu bestimmenden Antigene mehrere antigene Determinanten besitzen, tritt bei Verwendung monoklonaler Antikörper als insolubilisierter Antikörper und markierter Antikörper, die in der LageThe monoclonal antibodies are produced by cell fusion between myeloma cells and antibody-producing cells according to the method of Milstein et al. (Nature, 256 , 495 (1975)). Because these antibodies are formed from antibody-producing cells of a single clone, they are completely homogeneous and their specificity for antigenic determinants is completely identical. Since the antigens to be determined usually have several antigenic determinants, when using monoclonal antibodies as insolubilized antibodies and labeled antibodies, which are capable
sind, verschiedene antigene Determinanten des Antigens wahrzunehmen und zu binden, keine Kompetition zwischen
diesen Antikörpern auf, und es wird eine hochspezifische Bestimmung des Antigens erreicht. Es kann auch ein
Gemisch von zwei oder mehreren monoklonalen Antikörpern, welche an verschiedene antigene Determinanten binden,
als insolubilisierter Antikörper und/oder markierter
Antikörper verwendet werden, vorausgesetzt, daß diese
Antikörper keine Kompetition verursachen.are to perceive and bind different antigenic determinants of the antigen, there is no competition between these antibodies, and a highly specific determination of the antigen is achieved. It can also be a
Mixture of two or more monoclonal antibodies that bind to different antigenic determinants,
as insolubilized antibody and / or labeled
Antibodies can be used provided that these
Antibodies do not cause competition.
Die Bestimmung gemäß der Erfindung kann auf die gleiche Weise, wie es nach dem Stand der Technik bekannt ist,
durchgeführt werden. Es ist jedoch zu betonen, daß der Reaktionsmechanismus gegenüber der konventionellen Methode
vereinfacht wurde, da der insolubilisierte Antikörper nicht mit dem markierten Antikörper kompetiert,
wie nachfolgend gezeigt wird.The determination according to the invention can be carried out in the same way as is known in the prior art,
be performed. However, it should be emphasized that the reaction mechanism has been simplified from the conventional method because the insolubilized antibody does not compete with the labeled antibody as shown below.
= 42-= 42-
320584a320584a
+ [Ag) + (Ab*)+ [Ag) + (Ab *)
"Ag) + (Ab*)"Ag) + (Ab *)
-Ag -Ab*)-Ag -Ab *)
( j Ab I , Ag, Ab* und - haben die gleichen Bedeutungen
wie vorstehend angegeben, und p, p1, q, q1, r, r', s, s1
stellen jeweils Gleichgewichtskonstanten dar).( j Ab I , Ag, Ab * and - have the same meanings
as stated above, and p, p 1 , q, q 1 , r, r ', s, s 1 each represent equilibrium constants).
Da zwischen dem insolubilisierten Antikörper und dem
•markierten Antikörper keine Kompetition existiert, wenn diese verschiedene Bindungsstellen an einem Antigen
haben, verläuft die Reaktion in der Richtung, daß die
Komponenten in der Reaktionslösung einen "insolubilisierten Antikörper-Antigen-markierten Antikörper"-Komplex
bilden.Since between the insolubilized antibody and the
• labeled antibodies no competition exists if these have different binding sites on one antigen
have, the reaction proceeds in the direction that the
Components in the reaction solution form an "insolubilized antibody-antigen-labeled antibody" complex.
Dies kann durch das nachfolgende Experiment bewiesen
werden:This can be proven by the following experiment
will:
In dem gleichen Reaktionssystem wie bei der konventionellen Sandwich-Methode wurden zwei verschiedene monoklonale
Anti-HCG-Antikörper als insolubilisierta:Antikörper
und markierter Antikörper verwendet, die in der Lage waren, verschiedene antigene Determinanten von
HCG wahrzunehmen, und ein ähnliches Experiment wurde
durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen (Fig. 3), daß, sobald das Antigen an den insolubilisierten Antikörper gebunden
ist, dieses nicht vom insolubilisierten AntikörperIn the same reaction system as in the conventional sandwich method, two different anti-HCG monoclonal antibodies were used as insolubilizeda: antibody and labeled antibody capable of different antigenic determinants of
Perceiving HCG, and a similar experiment was made
carried out. The results show (Fig. 3) that once the antigen is bound to the insolubilized antibody, it is not bound by the insolubilized antibody
{feste Phase) dissoziiert, wenn ein Anti-HCG-Antikörper, der mit unterschiedlichen Antigendeterminanten korrespondiert, zugegeben wird. Somit ist es verständlich, daß eine !Competition zwischen Antikörpern um das selbe antigene Zentrum nicht auftritt. Dementsprechend werden gemäß der Erfindung ähnliche Ergebnisse erhalten, wenn der insolubilisierte Antikörper, das zu bestimmende Antigen und der markierte Antikörper gleichzeitig umgesetzt werden, oder der insolubilisierte Antikörper und das Antigen zuerst gemischt und dann mit dem markierten Antikörper umgesetzt werden, oder der insolubilisierte Antikörper mit dem Antikörper umgesetzt wird und nach einer Weile das Gemisch mit dem markierten Antikörper umgesetzt wird. Es besteht somit keine Begrenzung in der Folge der Reaktionen.{solid phase) dissociates when an anti-HCG antibody, which corresponds to different antigen determinants is added. So it is understandable that competition between antibodies for the same antigenic center does not occur. Accordingly similar results are obtained according to the invention when the insolubilized antibody is the one to be determined Antigen and the labeled antibody are reacted simultaneously, or the insolubilized one Antibody and the antigen are first mixed and then reacted with the labeled antibody, or the insolubilized antibody is reacted with the antibody and after a while the mixture with the labeled antibody is implemented. There is therefore no limitation in the sequence of reactions.
Die Reaktion gemäß der Erfindung wird in einem schematischen Diagramm in Fig. 4 gezeigt. Da der insolubilisierte Antikörper 2 und der markierte Antikörper 1 nicht miteinander kompetieren, kann eine größere Menge an markiertem Antikörper 1 an das Antigen 3 innerhalb einer kürzeren Zeitdauer gebunden werden, und es ist nicht nur möglich, die Zeit zur Bestimmung abzukürzen, sondern auch die Genauigkeit und Empfindlichkeit der Bestimmung zu erhöhen.The reaction according to the invention is carried out in a schematic Diagram shown in Fig. 4. Since the insolubilized antibody 2 and the labeled antibody 1 do not compete with each other, a larger amount of labeled antibody 1 to the antigen 3 within a shorter period of time, and it is not only possible to shorten the determination time, but also the accuracy and sensitivity of the determination to increase.
In Tabelle T sind die Vortei3e des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zur konventionellen Methode unter Verwendung polyklonaler Antikörper bei der Bestimmung 0 von Üf-Fötoprotein (AFP) zusammengestellt. Der Tabelle ist zu entnehmen, daß gemäß der Erfindung viele Vorteile, wie z. B. eine deutliche Verkürzung der Bestimmungszeit, eine Vereinfachung des Bestimmungsverfahrens und eine Zunahme in der Bestimmungsgenauigkeit und -empfindlichkeit erreicht werden können.Table T shows the advantages of the method according to the invention compared to the conventional method using polyclonal antibodies in the determination 0 compiled from Üf-fetoprotein (AFP). The table it can be seen that according to the invention many advantages such. B. a significant shortening of the determination time, a simplification of the determination process and an increase in the determination accuracy and -sensitivity can be achieved.
ler Fehler, CV.
bei 10 Wiederholungen
Interexperimentel-
Fehler, CV. bei 5
WiederholungenIntra-experimental
ler mistake, CV.
at 10 repetitions
Inter-experimental
Error, CV. at 5
Repetitions
gemäße MethodeInvention
proper method
MethodeConventional
method
schen—>- Enzym
reaktionResponse - ^ Wa
-> - enzyme
reaction
Waschen -^-zweite
Reaktion -> Waschen
—">■ EnzymreaktionFirst reaction -? -
Washing - ^ - second
Reaction -> washing
- "> ■ enzyme reaction
körperMonoclonal anti
body
körperPolyclonal Anti
body
3,7 %1.2%
3.7%
5,6 %2.5%
5.6%
Die Bestimmung wurde unter Verwendung eines Fluorphotometers, mit dem Serum einer schwangeren Frau als zu bestimmende Probe, einem Polystyrol-Reagensglas als feste Phase, Meerrettich-Peroxidase als markierendes Enzym und Phloretinsäure als Substrat durchgeführt.The determination was made using a fluorophotometer, with the serum of a pregnant woman as the sample to be determined, a polystyrene test tube as the solid Phase, horseradish peroxidase as the labeling enzyme and phloretinic acid as the substrate.
Es ist auch möglich, daß nur einer von dem insolubilisierten Antikörper oder dem markierten Antikörper aus monoklonalem Antikörper hergestellt wird und der andere aus gewöhnlichem polyklonalem Antikörper. In diesem Fall tritt jedoch an einer antigenen Determinante, die sowohl der monoklonale als auch der polyklonale Antikör-It is also possible that only one of the insolubilized Antibody or the labeled antibody is made from monoclonal antibody and the other from ordinary polyclonal antibody. In this case, however, an antigenic determinant occurs both the monoclonal and the polyclonal antibody
per gemeinsam haben, Kompetition auf und manchmal kann die Affinität der antigenen Determinante zum polyklonalen Antikörper stärker sein, wodurch sich eine verminderte Genauigkeit und Empfindlichkeit der Bestimmung ergibt im Vergleich selbst mit der konventionellen Methode, nicht nur mit der Methode, wonach beide Antikörper monoklonal sind.per have in common, competition on and sometimes the affinity of the antigenic determinant for the polyclonal antibody be stronger, which results in a reduced accuracy and sensitivity of the determination Compare even with the conventional method, not just with the method according to which both antibodies are monoclonal are.
Fig. 5 zeigt Standardkurven in der Bestimmung von CEA (Carcino-embryonisches Antigen), wenn der insolubilisierte Antikörper und der markierte Antikörper kombiniert werden, wie dies in Tabelle 2 gezeigt wird. Es zeigt sich deutlich, daß das Bestimmungssystem, daß auf der Kombination gemäß der Erfindung beruht, zu den besten Ergebnissen führt.Fig. 5 shows standard curves in the determination of CEA (carcino-embryonic antigen) when the insolubilized Antibody and the labeled antibody can be combined as shown in Table 2. It appears It is clear that the determination system based on the combination according to the invention produces the best results leads.
AntikörperInsolubilized
antibody
AntikörperMarked
antibody
dungMethod according to the invention
manure
Die verwendeten monoklonalen Antikörper wurden durch Zellfusion-Techniken unter Verwendung von Mäuse-Myelomazellen in Übereinstimmung mit dem nachfolgend gegebenen Beispiel 2 erhalten und stammen aus Klonen, die auf unterschiedliche antigene Stellen ansprechen. Die verwendeten polyklonalen Antikörper stellten handelsübliche Produkte von DakoThe monoclonal antibodies used were obtained by cell fusion techniques using mouse myeloma cells obtained in accordance with Example 2 given below and are derived from clones which refer to different address antigenic sites. The polyclonal antibodies used were commercially available products from Dako
Company (Dänemark) dar. Polystyrol-Reagensgläser wurden
als unlösliche Träger verwendet; Meerrettich-Peroxidase wurde als Enzym eingesetzt, und o-Phenylendiamin wurde
als Substrat verwendet.
5Company (Denmark). Polystyrene test tubes were used as insoluble supports; Horseradish peroxidase was used as the enzyme and o-phenylenediamine was used as the substrate.
5
Es kann jede gewünschte Kombination von Myelomazeilen und Antikörper-produzierenden Zellen zum Erhalt monoklonaler Antikörper angewandt werden,und es besteht keine Begrenzung in bezug auf das Tier, aus welchem die Zellen stammen, solange beide Zellen in Kombination zusammen Hybridoma bilden können und während des Wachsens Antikörper produzieren.It can be any combination of myeloma cells you want and antibody-producing cells are used to obtain monoclonal antibodies, and it exists no limitation on the animal from which the cells are derived as long as both cells are in combination can form hybridomas together and produce antibodies as they grow.
Gemäß der Erfindung können alle unlöslichen Träger verwendet werden, wie sie auch bei konventionellen Immunobestimmungen eingesetzt werden. Beispiele derartiger unlöslicher Träger sind Polystyrol, Polyethylen, Acrylsäureharze, Polytetrafluoroethylen (Teflon), Papier, Glas und Agarose. Der unlösliche Träger kann in von Rollet, (zahnradähnliches Gebilde) Perle, Stab, Scheibe oder Küvette vorliegen. Er kann z. B. eine optische Zelle, ein Reagensglas etc. darstellen. Er kann aber auch in einer anderen Form vorliegen.According to the invention, all insoluble carriers can be used as they are in conventional immuno-determinations can be used. Examples of such insoluble carriers are polystyrene, polyethylene, acrylic acid resins, Polytetrafluoroethylene (Teflon), paper, Glass and agarose. The insoluble carrier can be in a von Rollet (gear-like structure) bead, rod, disc or cuvette are present. He can z. B. represent an optical cell, a test tube, etc. But it can also be in another Form.
Markierungssubstanzen, die gewöhnlich verwendet werden, umfassen z. B. Peroxidase, ß-D-Galactosidase und alkalische Phosphatase für EIA, und Pluoresceinisothiocyanat für FIA.Marking substances commonly used include e.g. B. peroxidase, ß-D-galactosidase and alkaline phosphatase for EIA, and pluorescein isothiocyanate for FIA.
Wenn das markierende Agens ein Enzym darstellt, so ist ein Substrat erforderlich, um dessen Aktivität zu bestimmen. Das Substrat kann so gewählt werden, daß nach Umsetzung mit dem korrespondierenden Enzym die Menge des erhaltenen Produktes oder die Menge des abgenommenen oder verbleibenden Substrates leicht bestimmt wird.When the labeling agent is an enzyme, a substrate is required to determine its activity. The substrate can be chosen so that, after reaction with the corresponding enzyme, the amount of the product obtained or the amount of the removed or remaining substrate is easily determined.
Zum Beispiel können 5-Aminosalicylsäure-H202, o-Pheny-For example, 5-aminosalicylic acid H 2 0 2 , o-pheny-
lendiamin-H2O2, Phloretinsäure-H202 etc. als Substrate für Peroxidase, und Fluorescein-di-(ß-D-galactopyranosid), o-Nitrophenol-ß-D-galactopyranosid, 4-Methyl-umbelIiferyl-ß-D-galactosid etc. als Substrate für ß-D-Galactosidase verwendet werden.Lenediamine-H 2 O 2 , phloretinic acid-H 2 0 2 etc. as substrates for peroxidase, and fluorescein-di- (ß-D-galactopyranoside), o-nitrophenol-ß-D-galactopyranoside, 4-methyl-umbelIiferyl-ß -D-galactosid etc. can be used as substrates for ß-D-galactosidase.
Substanzen, welche mit dem Reagens gemäß der Erfindung bestimmt werden können, sollten mindestens zwei antigene Determinanten im Molekül aufweisen. Da die Substanzen, welche mit Hilfe der Sandwich-Methode bestimmt worden sind, zwei oder mehr antigene Determinanten aufweisen, können im wesentliche alle Substanzen, die mit der konventionellen Methode bestimmt worden sind, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden. Beispiele für solche Substanzen umfassen.Enzyme, wie ^"-Glutamyl-transpeptidase (^-GTP), alkalische Phosphatase und Transglykosidase; Proteinhormone, wie Thyroidstimulierendes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon (LH), menschliches Choriongonadotropin (HCG), Insulin, Sekretin und Wachstumshormon (GH); Plasmaproteine, wie Fibrin-Degradationsprodukt (FDP), C-reaktives Protein (CRP), (X1-saures Glycoprotein (&..-AG), Od1-Antitrypsin (Od1-AT), O^-Plasmin-Inhibitor ((X2-PI), ß„-Mikroglobulin (B2-MG) und Immunoglobulin; .karzinoembryonische Proteine, wie iX-Fötoprotein (AFP), karzinoembryonisches Antigen (CEA) und embryonisches Ferritin; und Lmyphocyten und Bakterienzellen, Zelloberflächenantigene, Zellfraktionen etc.Substances which can be determined with the reagent according to the invention should have at least two antigenic determinants in the molecule. Since the substances which have been determined using the sandwich method have two or more antigenic determinants, essentially all substances which have been determined using the conventional method can be determined using the method according to the invention. Examples of such substances include enzymes such as ^ "-glutamyl transpeptidase (^ -GTP), alkaline phosphatase and transglycosidase; protein hormones such as thyroid stimulating hormone (TSH), luteinizing hormone (LH), human chorionic gonadotropin (HCG), insulin, secretin and growth hormone (GH); plasma proteins such as fibrin degradation product (FDP), C-reactive protein (CRP), (X 1 -acid glycoprotein (& ..- AG), Od 1 -antitrypsin (Od 1 -AT), O ^ Plasmin inhibitor ((X 2 -PI), ß "-microglobulin (B 2 -MG) and immunoglobulin;. Carcinoembryonic proteins such as iX-fetoprotein (AFP), carcinoembryonic antigen (CEA) and embryonic ferritin; and lymphocytes and Bacterial cells, cell surface antigens, cell fractions, etc.
Da unter Anwendung des Reagens gemäß der Erfindung die Reaktionsfolge unter insolubilisiertem Antikörper, dem zu bestimmenden Antigen und dem markierten Antikörper überhaupt nicht limitiert isc, ist es auch möglich, den insolubilisierten Antikörper und den markierten Antikörper vorher zu mischen. Genauer ausgedrückt, es ist möglich, daß insolubilisierterAntikörper, der an einenSince using the reagent according to the invention the Reaction sequence under insolubilized antibody, the antigen to be determined and the labeled antibody is not limited at all, it is also possible to use the insolubilized antibody and the labeled antibody to mix beforehand. More specifically, it is possible that insolubilized antibody bound to a
Träger gebunden ist, z, B. Kunststoffperlen etc., und markierter Antikörper im gleichen Gefäß vorliegen, z. B. einem Reagensglas, oder es ist möglich, Antikörper an die innere Wand eines geeigneten Gefäßes bzw. Behälters, z. B. einem Reagensglas, das selbst als unlöslicher Träger dient, gebunden wird und dann markierter Antikörper diesem Gefäß zugegeben wird. Der markierte Antikörper kann eine Lösung oder ein lyophilisiertes Produkt der Lösung darstellen oder ebenso in Form von Tabletten, Granalien oder als Pulver vorliegen.Carrier is bound, e.g. plastic beads etc., and labeled antibodies are present in the same vessel, e.g. B. a test tube, or it is possible to use antibodies to the inner wall of a suitable vessel or container, e.g. B. a test tube, which itself is considered insoluble Carrier is used, is bound and then labeled antibody is added to this vessel. The marked Antibody can be a solution or a lyophilized product of the solution or also in the form of Tablets, granules or powder.
Neben dem insolubilisierten Antikörper und dem markierten Antikörper kann das Reagens gemäß der Erfindung verschiedene Hilfsstoffe enthalten, die dessen Brauchbarkeit erhöhen. Diese können z. B. ein auflösendes Agens für den markierten Antikörper (wenn er als ein lyophilisiertes Produkt zugegeben wird), einer Waschflüssigkeit zum Waschen der festen Phase nach der Reaktion des insolubilisierten Antikörpers und des zu bestimmenden Antigens und nach der weiteren Reaktion mit dem markierten Antikörper, ein Substrat zur Bestimmung der Enzymaktivität des markierten Agens (wenn dieses ein Enzym darstellt), und ein Reaktionsstopper für die enzymatische Reaktion, darstellen.In addition to the insolubilized antibody and the labeled antibody, the reagent according to the invention contain various auxiliaries that affect its usefulness raise. These can e.g. B. a dissolving agent for the labeled antibody (when used as a lyophilized product is added), a washing liquid for washing the solid phase after the reaction of the insolubilized antibody and the antigen to be determined and after the further reaction with the labeled antibody, a substrate for determining the enzyme activity of the labeled agent (if this represents an enzyme), and represent a reaction stopper for the enzymatic reaction.
Im folgenden werden Arbeitsbeispiele gemäß der Erfindung aufgeführt, um dieselbe näher zu erläutern, ohne daß die Beispiele beschränkend wirken sollen.In the following, working examples according to the invention are given in order to explain the same in more detail, without the examples are intended to be limiting.
Reagens zur Bestimmung von ■'X-Fötoprotein (AFP)Reagent for the determination of X-fetoprotein (AFP)
a) Herstellung von gereinigtem AFPa) Preparation of purified AFP
16,2 g roher AFP-Extrakt wurde aus 5 1 Aszites von Hepatompatienten durch Aussalzen mit Ammoniumsalz ge-16.2 g of crude AFP extract was obtained from 5 l of ascites from Hepatoma patients by salting out with ammonium salt
49-49-
wonnen (Fraktion des überStandes bei 45 % wurde ausgesalzt und die Niederschlagsfraktion bei 70 % gesammelt). Der Rohextrakt wurde durch Äffinitätschromatographie unter Verwendung von 50 ml Sepharose 4 B, an welche Kaninchen-Anti-AFP-Antikörper fixiert war (1 mg/ml Sepharose) gereinigt, wobei 924 mg gereinigtes AFP erhalten wurden.gained (fraction of the supernatant at 45% was salted out and the precipitate fraction collected at 70%). The crude extract was determined by affinity chromatography using 50 ml of Sepharose 4 B, to which Rabbit anti-AFP antibody was fixed (1 mg / ml Sepharose), giving 924 mg of purified AFP became.
b) Herstellung von monoklonalen Anti-AFP-Antikörpernb) Production of anti-AFP monoclonal antibodies
50 μg des unter a) gewonnenen gereinigten AFP wurden durch subkutane Injektion in eine weibliche BALB/C-Maus zusammen mit komplettem Freundsehen Adjuvans immunisiert. Die Immunisierung wurde viermal in Intervallen von 1 Woche wiederholt. Am vierten Tag nach der letzten Immunisierung wurde die Milz entfernt und die Milzzellen gesammelt. Die Milzzellen wurden mit modifiziertem MEM-Kulturmedium nach Dulbecco (im folgenden abgekürzt50 μg of the purified AFP obtained under a) were immunized by subcutaneous injection into a female BALB / C mouse together with Freund's complete adjuvant. The immunization was repeated four times at 1 week intervals. On the fourth day after the last Immunization, the spleen was removed and the spleen cells collected. The spleen cells were modified with MEM culture medium according to Dulbecco (hereinafter abbreviated
als D-MEM) gewaschen. 1 χ 10 dieser Zellen wurden gezählt und mit 1 χ 1O7 Maus-Myelomazellen (P3-NSI/1-Ag 4.1) gemischt. Diese wurden 1 min lang bei 370C in 1 ml D-MEM-haltigem, 42,5 %igem Polyethylenglykol #1540 und 7,5 % Dimethylsulfoxid einer Zellfusion unterworfen. Zu den der Zellfusion unterworfenen Zellen wurden 20 ml HAT-Medium (RPMI-1640-Medium, welches Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin und 10 % Fötal-Rinderserum enthält) zugegeben. Nachdem 0,2 ml Aliquote des Zellgemisches in eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen (wells) gegeben und zwei Wochen lang kultiviert worden waren, wurden die Antikörper-Titer der überstände in den Vertiefungen bestimmt.as D-MEM). 1 × 10 of these cells were counted and mixed with 1 × 10 7 mouse myeloma cells (P3-NSI / 1-Ag 4.1). These were subjected to a cell fusion for 1 min at 37 ° C. in 1 ml of D-MEM-containing, 42.5% polyethylene glycol # 1540 and 7.5% dimethyl sulfoxide. To the cells subjected to cell fusion, 20 ml of HAT medium (RPMI-1640 medium containing hypoxanthine, aminopterin, thymidine and 10% fetal bovine serum) were added. After 0.2 ml aliquots of the cell mixture had been placed in a 96-well microplate and cultivated for two weeks, the antibody titers of the supernatants in the wells were determined.
Dann wurden die Zellen in den Vertiefungen, in welchen Antikörper beobachtet wurden, jeweils zu 40 ml RPMI-1640-Medium, welches 10 % Fötal-Rinderserum und Thymocyten einer BALB/c-Maus enthielten, zugegeben. Aliquote Teile der erhaltenen Zellsuspension wurden zwei MikroplattenThen the cells in the wells in which antibodies were observed were each added to 40 ml of RPMI-1640 medium, which 10% fetal bovine serum and thymocytes one BALB / c mouse was added. Aliquots of the resulting cell suspension became two microplates
(96 Vertiefungen) zugegeben und eine Woche lang kultiviert, wobei neun Klone mit Anti-AFP-Antikörper-produzierendem Hybridom erhalten wurden. Diese wurden in Kulturen größeren Maßstabes transferiert und jeweils 10 1 der erhaltenen überstände einer Affinitätschromatographie unter Verwendung von 50 ml Sepharose 4B, fixiert mit gereinigtem AFP (0,5 mg AFP/ml Sepharose) unterworfen. Als Ergebnis wurden 4,2 bis 11,6 mg monoklonale Antikörper erhalten, die als Partie Nr. 1 bis 9 bezeichnet wurden.(96 wells) were added and cultured for one week, leaving nine clones with anti-AFP antibody-producing Hybridoma were obtained. These were transferred to larger scale cultures and each 10 1 of the supernatants obtained from affinity chromatography using 50 ml of Sepharose 4B, fixed with purified AFP (0.5 mg AFP / ml Sepharose). As a result, it was 4.2 to 11.6 mg of monoclonal antibodies identified as Lot Nos. 1-9.
c) Identifizierung von Antigen-erkennenden Stellenc) Identification of antigen-recognizing sites
i) Herstellung von Anti-AFP-Antikörper-sensibilisierten Reagensgläserni) Preparation of anti-AFP antibody sensitized test tubes
Physiologische Kochsalzlösungen, gepuffert mit 0,05M Phosphat (pH 6,4; im folgenden abgekürzt als PBS), die jeweils 0,2 mg monoklonale Anti-AFP-Antikörper der Partie Nr. 1 bis 9 enthielten, wurden in einer Menge von 2 ml den mit PBS gewaschenen Polystyrol-Reagensgläsern zugegeben. Daraufhin wurden die Reagensgläser 20 min lang bei 5 60C inkubiert und mit PBS gewaschen, wobei sensibilisierte Reagensgläser erhalten wurden.Physiological saline solutions, buffered with 0.05M phosphate (pH 6.4; in the following abbreviated as PBS), each containing 0.2 mg of monoclonal anti-AFP antibodies of lot No. 1 to 9, were in an amount of 2 ml added to the PBS washed polystyrene test tubes. Thereafter, the test tubes were incubated for 20 min at 5 6 0 C and washed with PBS, giving sensitized tubes were obtained.
ii) Herstellung von Enzym-markierten Anti-AFP-Antikörpern ii) Production of enzyme-labeled anti-AFP antibodies
5 mg Meerrettich-Peroxidase (Grad 1 von Boehringer Mannheim GmbH; im folgenden abgekürzt als HRPO) wurden in 1,0 ml 0,3M Natriumbicarbonatpuffer gelöst; zu dieser Lösung wurde 0,1 ml einer 1 %igen Ethanollösung von 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzol zugegeben und das Gemisch 1 h lang umgesetzt.5 mg horseradish peroxidase (grade 1 from Boehringer Mannheim GmbH; hereinafter abbreviated as HRPO) were dissolved in 1.0 ml of 0.3M sodium bicarbonate buffer; 0.1 ml of a 1% strength was added to this solution Ethanol solution of 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene added and the mixture reacted for 1 hour.
Im folgenden wurden 1,0 nil 0,06M Natriumperjodatlösung zu dem Gemisch zugegeben und 3 min umgesetzt. Dann wurde 1,0 ml 0,16M Ethylenglykollösung zugegeben und die Reaktion 1 h lang durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde gegen 0,01M Natriumcarbonatlösung bei pH 9,5 dialysiert. Zu der erhaltenen Lösung wurden jeweils 9 Partien von Anti-AFP-Antikörpern, die unter b) hergestellt worden waren, in jeweils einer Menge von 5 mg zugegeben und bei Raumtemperatur 3 h lang umgesetzt. Daraufhin wurden 5 mg Natriumborhydrid zugegeben und über Nacht reagieren gelassen. Die Reaktionsgemische wurden jeweils gegen 0,01M PBS bei pH 7,2 dialysiert, wobei HRPO-markierte Anti-AFP-Antikörper erhalten wurden.The following was 1.0 nil 0.06M sodium periodate solution added to the mixture and reacted for 3 minutes. Then 1.0 ml of 0.16M ethylene glycol solution was added and the reaction was carried out for 1 hour. The reaction mixture was against 0.01M sodium carbonate solution dialyzed at pH 9.5. To the solution obtained were in each case 9 lots of Anti-AFP antibodies, which had been produced under b), in an amount of 5 mg each added and reacted at room temperature for 3 hours. Thereupon 5 mg of sodium borohydride were added added and allowed to react overnight. The reaction mixtures were each against 0.01M PBS dialyzed at pH 7.2, whereby HRPO-labeled anti-AFP antibodies were obtained.
iii) Identifizierung von Antigen-erkennenden Stelleniii) Identification of antigen-recognizing sites
Zu jedem der Anti-AFP-Antikörper-sensibilisiertenReagensgläser-, die unter i) hergestellt worden waren, wurden 1,5 ml PBS, 0,1 ml der Standardlösung des in a) hergestellten AFP, welche mit PBS auf 100 ng/ ml verdünnt worden war, und 0,4 ml HRPO-markierte Anti-AFP-Antikörper, die vorstehend unter ii) hergestellt wurden, zugegeben und auf das 100-fache verdünnt, worauf man das Gemisch 30 min reagieren ließ. Nach der Reaktion wurdedas Reagensglas mit Waschflüssigkeit gewaschen und 3 ml Substratlösung, welche 100 mg/dl o-Phenylendiamin und 0,01 % Wasserstoffperoxid enthielt, zugegeben. Die Enzymreaktion wurde 30 min lang durchgeführt; dann wurden 0,05 ml 4M Schwefelsäure zugegeben, um die enzymatische Reaktion zu stopper. Die Extinktion des Reaktionsgemisches bei 45 0 nm wurde gemessen. In Tabelle 3 sind diejenigen Kombinationen, die eine positive Reaktion induzierten, mit + angegeben und diejenigen, die keine Reaktion induzierten, mit -.For each of the anti-AFP antibody sensitized test tubes, which had been prepared under i), 1.5 ml of PBS, 0.1 ml of the standard solution of the AFP produced in a), which had been diluted to 100 ng / ml with PBS, and 0.4 ml HRPO-labeled Anti-AFP antibodies, which were prepared under ii) above, added and increased to 100-fold diluted, whereupon the mixture was allowed to react for 30 minutes. After the reaction, the test tube was used Wash liquid and washed 3 ml substrate solution, which 100 mg / dl o-phenylenediamine and 0.01% hydrogen peroxide contained, admitted. The enzyme reaction was carried out for 30 minutes; then were 0.05 ml of 4M sulfuric acid was added to stop the enzymatic reaction. The absorbance of the Reaction mixture at 450 nm was measured. In Table 3 are those combinations that have a induced positive reaction, indicated by + and those that did not induce a reaction, indicated by -.
HRPO-markierter AntikörperHRPO-labeled antibody
2-.. . 3 -4 '5 2- ... 3 -4 '5
•9• 9
1 2 3 4 5 6 7 8 '91 2 3 4 5 6 7 8 '9
Aufgrund der Unterschiede in den Antigen-erkennenden Stellen können die 9 Partien der monoklonalen Anti-AFP-Antikörper, welche unter b) erhalten wurden, in drei Gruppen aufgeteilt werden, nämlich, die erste Gruppe, welche aus den Partien Nr. 1, 2, 3, 5 und 7 besteht, die zweite Gruppe, welche aus der Partie Nr. 6 besteht, und die dritte Gruppe, welche aus den Partien Nr. 4, 8 und 9 besteht. Diese Antikörpergruppen wurden jeweils als Anti-APP-Anti-0 körper fh] , TbJ und £cj bezeichnet.Due to the differences in the antigen-recognizing sites, the 9 lots of the monoclonal anti-AFP antibodies obtained under b) can be divided into three groups, namely, the first group, which consists of lots 1, 2, 3, 5 and 7, the second group consisting of game number 6 and the third group consisting of game number 4, 8 and 9. These antibody groups were designated as anti-APP anti-bodies fh], TbJ and £ cj, respectively.
d) Herstellung eines Reagens zur AFP-Bestimmungd) Preparation of a reagent for determining AFP
Anti-AFP-Antikörper-sensibilisierte Reagensgläser wurden nach der vorstehend beschriebenen Methode c-i) hergestellt, wobei monoklonaler Antikörper Γ A j verwendet wurde.Anti-AFP antibody sensitized test tubes were made produced by method c-i) described above, using monoclonal antibody Γ A j.
Der monoklonale Antikörper \JZ J wurde mit HRPO nach der vorstehend beschriebenen Methode c-ii) markiert und im Verhältnis 1:10 mit PBS verdünnt. 2 ml des verdünnten markierten Antikörpers wurden in das sensibilisierte Reagensglas gegeben. Nach dem Lyophilisieren des Reagensglasinhaltes, wurde dieses versiegelt und bildet ein Reagens für die AFP-Bestimmung.The monoclonal antibody \ JZ J was labeled with HRPO according to the method c-ii) described above and diluted 1:10 with PBS. 2 ml of the diluted labeled antibody was added to the sensitized test tube. After the contents of the test tube were lyophilized, they were sealed and used as a reagent for AFP determination.
e) Bestimmung von AFPe) Determination of AFP
1/8 ml PBS wurden zu dem Anti-AFP-Antikörper-sensibilisierten Reagensglas, welches vorstehend unter d) hergestellt wurde, zugegeben; dann wurde 0,1 ml der Standardlösung des unter a) produzierten AFP zugegeben und auf Konzentrationen von 1000, 100, 10 und 1 und O ng/ ml mit dem Serum von gesunden Personen verdünnt, worauf im weiteren 0,1 ml einer Lösung von HRPO-markiertem Anti-AFP-Antikörper, welcher vorstehend unter d) erhalten wurde, in 2 ml destilliertem Wasser zugegeben. Die Reaktion wurde 20 min lang durchgeführt. Nach der Umsetzung wurde das Reagensglas mit physiologischer Kochsalzlösung, welche 0,005 % Tween 20 (im folgenden als Waschagens bezeichnet) enthielt, gewaschen, Dann wurden 3 ml Enzymsubstratlösung, welche 5 mg/ml o-Phenylendiamin enthielt und 0,01 % Wasserstoffperoxid zugegeben und 10 min lang umgesetzt. 0,005 ml 4N Schwefelsäure wurden dem Reaktionsgemisch zugegeben, um die Enzymreaktion zu stoppen. Die Extinktion des Reaktionsgemisches wurde bei 45 0 nm mit Hilfe eines Photometers bestimmt. Die erhaltene Standardkurve ist in Fig. 6 wiedergegeben.1/8 ml of PBS was sensitized to the anti-AFP antibody Test tube, which was prepared under d) above, added; then 0.1 ml of the Standard solution of the AFP produced under a) is added and adjusted to concentrations of 1000, 100, 10 and 1 and 0 ng / ml diluted with the serum of healthy people, followed by 0.1 ml of a solution of HRPO-labeled anti-AFP antibody, which was obtained above under d), added in 2 ml of distilled water. The reaction was carried out for 20 minutes. After the reaction, the test tube was filled with physiological saline solution, which contained 0.005% Tween 20 (hereinafter referred to as washing agent), then 3 ml of enzyme substrate solution, which contained 5 mg / ml of o-phenylenediamine and added 0.01% hydrogen peroxide and reacted for 10 minutes. 0.005 ml of 4N sulfuric acid was added to the reaction mixture to stop the enzyme reaction. the Absorbance of the reaction mixture was at 45 0 nm with Determined with the help of a photometer. The standard curve obtained is shown in FIG.
Reagens zur Bestimmung von karzino-embryonischem Antigen (CEA)Reagent for the determination of carcino-embryonic antigen (CEA)
a) Herstellung von gereinigtem CEAa) Manufacture of purified CEA
40 g Krebsgewebe des Dickdarms wurden nach Zugabe von 100 ml destilliertem Wasser mittels eines Homogenisierapparates homogenisiert. Zu dem Homogenat wurde die gleiche Menge 1 , 2M Perchlorsäure zugegeben und 30 min lang unter Rühren extrahiert. Der zentrifugierte überstand wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei der CEA-Rohextrakt erhalten wurde.40 g of cancerous tissue of the large intestine were after adding 100 ml of distilled water by means of a homogenizer homogenized. The same amount of 1.2M perchloric acid was added to the homogenate and 30 min long extracted with stirring. The centrifuged supernatant was dialyzed against distilled water to obtain the crude CEA extract.
Der Rohextrakt wurde auf 10 ml konzentriert und einer Gelfiltration unter Verwendung von Sepharose 4B, welche mit physiologischer Kochsalzlösung equilibriert war, unterworfen und die erste Fraktion gesammelt. Diese wurde nochmals einer Gelfiltration auf Sephadex G-200, die ebenso equilibriert war, unterzogen und die zweite Fraktion gesammelt. Diese wurde auf 2 ml konzentriert, wobei 135 μg gereinigtes CEA erhalten wurden.The crude extract was concentrated to 10 ml and one Gel filtration using Sepharose 4B, which was equilibrated with physiological saline solution, subjected and the first fraction collected. This was again gel filtration on Sephadex G-200, which was also equilibrated, and the second fraction collected. This was concentrated to 2 ml, 135 µg of purified CEA were obtained.
b) Herstellung von monoklonalen Anti-CEA-Antikörperηb) Production of monoclonal anti-CEA antibodies
Unter Verwendung des vorstehend hergestellten, gereinigten CEA wurden 8 Klone von Anti-CEA-Antikörper-produzierendem Hybridoma erhalten, wobei nach einer ähnlichen Methode wie im Beispiel 1-b) beschrieben, gearbeitet wurde. Es wurden Mäuse immunisiert, wobei für jede Immunisierung 30 μg des gereinigten CEA verwendet wurden.Using the purified CEA prepared above, 8 clones of anti-CEA antibody-producing Hybridoma obtained using a method similar to that described in Example 1-b) became. Mice were immunized using 30 µg of the purified CEA for each immunization.
1x10 Hybridoma wurden intraperitoneal einer weiblichen BALB/c-Maus inokuliert, welcher intraperitoneal 0,5 ml Pristan verabreicht worden waren (2, 6, 10, 14-Tetramethylpentadecan; ein Produkt von Wako Pure Chemicals Co., Ltd.). Zwei Wochen später wurden die Aszites gesammelt. Diese wurden mit Hilfe von DEAE-Cellulose, welche mit 0,01M Phosphatpuffer von pH 7,0 equilibriert war, chromatographiert, wobei als ein monoklonaler Anti-CEA-Antikörper eine nicht-adsorbierte Fraktion erhalten wurde.1x10 hybridomas were intraperitoneally given to a female BALB / c mouse to which 0.5 ml of pristane had been administered intraperitoneally (2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecane; a product of Wako Pure Chemicals Co., Ltd.). The ascites were collected two weeks later. These were with the help of DEAE cellulose, which was equilibrated with 0.01M phosphate buffer of pH 7.0 was chromatographed to obtain a non-adsorbed fraction as an anti-CEA monoclonal antibody became.
3-2Ö58493-2Ö5849
Mit Hilfe eines Testes zur Identifizierung Antigenerkennender Stellen, welcher im wesentlichen gemäß Beispiel 1r-;c) durchgeführt wurde, konnten die erhaltenen Antikörper in drei Gruppen eingeteilt werden, d. h. 5 Partien, 2 Partien und 1 Partie, die jeweils als Anti-CEA-Antikörper Γα], [β] und [CJ bezeichnet wurden.With the help of a test to identify antigen recognizers Places which were carried out essentially according to Example 1r-; c) could be obtained Antibodies can be divided into three groups, d. H. 5 games, 2 games and 1 game, each as Anti-CEA antibodies Γα], [β] and [CJ were designated.
c) Herstellung von Anti-CEA-Antikörper-sensibilisierten Reagensgläsernc) Production of anti-CEA antibody sensitized Test tubes
Polystyrol-Reagensgläser wurden jeweils mit PBS gewaschen und 2 ml Anti-CEA-Antikörper [Aj (1 mg/ml), welcher gemäß b) hergestellt worden war, wurden in dieselben gegeben und 20 min lang bei 56°C umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde das Reagensglas mit PBS gewaschen, wobei ein Anti-CEA-Antikörper ΓAj-sensibilisiertes Testglas erhalten wurde.Polystyrene test tubes were each washed with PBS and 2 ml of anti-CEA antibody [Aj (1 mg / ml), which according to b) were added to the same and reacted for 20 minutes at 56 ° C. After In the reaction, the test tube was washed with PBS using an anti-CEA antibody ΓAj-sensitized test tube was obtained.
d) Herstellung eines Reagens zur CEA-Bestimmungd) Preparation of a reagent for CEA determination
HRPO-markierter Anti-CEA-Antikörper ^B j wurde erhalten durch Verwendung von Anti-CEA-Antikörper I Bj, wie er vorstehend unter b) hergestellt wurde, gemäß Beispiel 1-c-ii) . Der markierte Antikörper wurde 1:50 mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt; 0,2 ml des verdünnten Antikörpers wurden in jedes der{Anti-CEA-Antikörpe^-sensibilisierten Reagensgläser, welche vorstehend unter c) erhalten wurden, gegeben und lyophilisiert, wobei ein Reagens zur CEA-Bestimmung erhalten wurde.HRPO-labeled anti-CEA antibody ^ B j was obtained by using anti-CEA antibody I Bj, like him was prepared under b) above, according to Example 1-c-ii). The labeled antibody was 1:50 with physiological Saline solution diluted; 0.2 ml of the diluted antibody was sensitized into each of the {anti-CEA antibodies Test tubes, which were obtained above under c), and lyophilized, wherein a Reagent for CEA determination was obtained.
e) Bestimmung von CEAe) Determination of CEA
Das wie vorstehend unter a) beschrieben hergestellte gereinigte CEA wurde mit dem Serum gesunder Personen auf eine Konzentration von jeweils 100, 30, 10, 3 und 1 ng/ml verdünnt. Jeweils 0,2 ml des verdünnten CEA und 0,8 ml destilliertes Wasser wurden gleichzeitig zu dem CEA-Be-The purified CEA prepared as described above under a) was obtained with the serum of healthy persons a concentration of 100, 30, 10, 3 and 1 ng / ml, respectively diluted. In each case 0.2 ml of the diluted CEA and 0.8 ml of distilled water were added simultaneously to the CEA loading
32Ö584932Ö5849
stimmungsreagens, welches wie vorstehend unter d) beschrieben, hergestellt worden war, zugegeben und unter Rühren 20 min lang umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde das Reagensglas mit Waschagens gewaschen; dann wurden 3 ml Substratlösung, welche 300 mg/dl Phloretinsäure und 0,01 % Wasserstoffperoxid enthielt, zugegeben. Die Reaktion wurde 10 min lang durchgeführt; dann wurde 0,1 ml 5 %iges Natriumsulfit zugegeben, um die Enzymreaktion zu stoppen. Im folgenden wurde die Fluoreszenzintensität bei einer Extinktions-Wellenlänge von 323 nm und einer Fluoreszenz-Wellenlänge von 420 nm mit Hilfe eines Fluorophotometers bestimmt. Die erhaltene Standardkurve ist in Fig. 7 wiedergegeben.mood reagent, which as described above under d), was added and reacted with stirring for 20 minutes. After the implementation was washed the test tube with washing agent; then 3 ml of substrate solution containing 300 mg / dl of phloretinic acid and containing 0.01% hydrogen peroxide was added. The reaction was carried out for 10 minutes; then became 0.1 ml of 5% sodium sulfite was added to stop the enzyme reaction. The following became the fluorescence intensity at an extinction wavelength of 323 nm and a fluorescence wavelength of 420 nm a fluorophotometer determined. The standard curve obtained is shown in FIG.
Reagens zur HCG-ß-Bestimmung (Chorion.gonadotropin-Bestimmung) a) Herstellung der HCG-ß-UntereinheitReagent for HCG-ß determination (chorionic gonadotropin determination) a) Production of the HCG-ß-subunit
1 g HCG (2000 iu/mg) wurde in 2 ml 0,025M Phosphatpuffer (pH 5,6) gelöst; die Lösung wurde mit Hilfe von Chromatographie auf DEAE-Sephadex A-50 (3 g), welche vorher mit demselben Puffer equilibriert worden war, fraktioniert. Eine mit 0,05M Phosphatpuffer (pH 5,6) eluierte Fraktion wurde gesammelt und gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei eine Lösung mit 308 mg gereinigtem HCG erhalten wurde, welches dann lyophilisiert wurde.1 g of HCG (2000 iu / mg) was dissolved in 2 ml of 0.025M phosphate buffer (pH 5.6); the solution was obtained using chromatography on DEAE-Sephadex A-50 (3 g), which had previously been equilibrated with the same buffer, fractionated. One eluted with 0.05M phosphate buffer (pH 5.6) Fraction was collected and dialyzed against distilled water, a solution containing 308 mg of purified HCG was obtained, which was then lyophilized.
300 mg des lyophilisierten HGC wurden in 10 ml 10M Harnstoff (pH 4,5) gelöst und 1 h lang bei 400C umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mittels Chromatographie an DEAE-Sephadex A-50 (2 g), welches vorher mit einer Lösung, die 0,03M Glycin und 10M Harnstoff enthielt, equilibriert worden war, fraktioniert. Eine Fraktion, welche mit einer Lösung aus 0,2M Glycin, 1M NaCl und 8M Harnstoff eluiert wurde, wurde gegen physiologische Kochsalz-300 mg of the lyophilized HGC were dissolved in 10 ml of 10M urea (pH 4.5) and reacted at 40 ° C. for 1 hour. The reaction mixture was fractionated by means of chromatography on DEAE-Sephadex A-50 (2 g), which had previously been equilibrated with a solution containing 0.03M glycine and 10M urea. A fraction which was eluted with a solution of 0.2M glycine, 1M NaCl and 8M urea was tested against physiological saline
32Ö58A9"32Ö58A9 "
lösung dialysiert, wobei 147 mg HCG-ß-Untereinheit erhalten wurden.solution dialyzed, with 147 mg HCG-ß-subunit obtained became.
b) Herstellung von Anti-HCG-ß—Antikörpern 5b) Production of anti-HCG-ß-antibodies 5
11 Partien von Anti-HCG-ß-Antikörpern wurden gemäß der Methode von Beispiel 2-b) hergestellt, mit der Ausnahme, daß Ratten vom Wistar-Stamm als Tiere zur Verabreichung von Antigen verwendet wurden, anstelle von BALB/c-Mäusen.11 lots of anti-HCG-ß-antibodies were determined according to the Method of Example 2-b), with the exception that rats of the Wistar strain were used as animals for administration of antigen were used instead of BALB / c mice.
Die Antigen-erkennenden Stellen dieser Antikörper wurden im wesentlichen gemäß der Methode von Beispiel 1-c) identifiziert. Die erhaltenen Antikörper wurden in zwei Gruppen eingeteilt, nämlich eine Gruppe, welche aus 8 Partien Anti-HCG-ß-Antikörpern £aJ bestand, und eine andere Gruppe, welche aus drei Partien von Anti-HCG-ß-Antikörpern bestand.The antigen-recognizing sites of these antibodies were identified essentially according to the method of Example 1-c). The obtained antibodies were divided into two groups, namely one group consisting of 8 lots Anti-HCG-ß-antibodies consisted of £ aJ, and another group, which consisted of three batches of anti-HCG-ß antibodies.
c) Herstellung von Anti-HCG-ß-Antikörper-sensibilisierten Kügelchen (unlöslicher Träger)c) Production of anti-HCG-ß-antibody-sensitized Globules (insoluble carrier)
100 Polyethylenkugeln wurden zu 100 ml PBS, welches 50 mg Anti-HCG-ß-Antikörper ΓαJ, hergestellt wie vorstehend unter b) beschrieben, enthält, zugegeben und 20 min lang bei 56°C umgesetzt. Dann wurden die Polyethylenkugeln gewasehen, wobei Anti-HCG-ß-Antikörper I Aj-sensibilisierte Kugeln erhalten wurden.100 polyethylene balls were added to 100 ml of PBS containing 50 mg Anti-HCG-β antibody ΓαJ, prepared as above under b) described, contains, added and reacted at 56 ° C. for 20 minutes. Then the polyethylene balls were washed, whereby anti-HCG-ß-antibody sensitized I Aj Bullets were obtained.
d) Herstellung von Enzym-markierten Anti-HCG-ß-Antikörpernd) Production of enzyme-labeled anti-HCG-ß-antibodies
Es wurde das gleiche Verfahren, wie unter 1-c-ii) beschrieben, wiederholt, wobei die Anti-HCG-ß-Antikörper [bJ, hergestellt wie vorstehend unter b) beschrieben, verwendet wurden. Nach 200-facher Verdünnung des Volumens mit PBS, wurden HRPO-markierte Anti-HCG-ß-Antikörper £bJ erhalten.The same procedure as described under 1-c-ii) was followed, repeated, using the anti-HCG-ß-antibody [bJ, produced as described above under b) were used. After diluting the volume 200-fold with PBS, HRPO-labeled anti-HCG-β antibodies £ bJ were obtained.
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e) Herstellung des Waschagense) Manufacture of the washing agent
9 g NaCl und 50 μΐ Tween 20 wurden genau ausgewogen und in deionisiertem Wasser unter Bildung von 100 ml einer Lösung aufgelöst. Die Lösung wurde in eine Glasflasche gefüllt und ergab eine 1 0-fach konzentrierte Lösung des Waschagens.9 g NaCl and 50 μΐ Tween 20 were weighed out exactly and dissolved in deionized water to form 100 ml of a solution. The solution was in a glass bottle filled and gave a 1 0-fold concentrated solution of the washing agent.
f) Herstellung des Enzymsubstrates 10f) Production of the enzyme substrate 10
26,40 g 5-Aminosalicylsäure, 54,34 g Monokaliumphosphat und 5,72 g Dinatriumphosphat wurden vermischt und in einem Mörser gepulvert. 550 mg des Gemisches wurden genau ausgewogen und in eine Glasflasche gefüllt.26.40 g 5-aminosalicylic acid, 54.34 g monopotassium phosphate and 5.72 g of disodium phosphate were mixed and powdered in a mortar. 550 mg of the mixture were exactly balanced and filled in a glass bottle.
1,5 ml Wasserstoffperoxid (30 %ige Lösung) wurden mit deionisiertem Wasser verdünnt, d. h» auf 100 ml aufgefüllt. 1 ml der Lösung wurde in eine Ampulle gefüllt, welche dann durch Schmelzen versiegelt wurde. Auf diese Weise wurde das Enzymsubstrat hergestellt.1.5 ml hydrogen peroxide (30% solution) were with deionized water, d. h »made up to 100 ml. 1 ml of the solution was filled into an ampoule, which was then sealed by melting. In this way the enzyme substrate was prepared.
g) Herstellung eines Stoppers für die Enzymreaktiong) Production of a stopper for the enzyme reaction
2 g Natriumazid wurden genau ausgewogen und in 100 ml destilliertem Wasser aufgelöst. 2 ml der Lösung wurden in eine Ampulle eingefüllt, welche dann durch Schmelzen verschlossen wurde und einen Stopper für die Enzymreaktion bildeten.Two grams of sodium azide was precisely weighed and dissolved in 100 ml of distilled water. 2 ml of the solution were Filled into an ampoule, which was then sealed by melting, and a stopper for the enzyme reaction formed.
h) Herstellung des Reagens zur Bestimmung von HCG 30h) Preparation of the reagent for the determination of HCG 30
Ein Reagens zur Bestimmung von HCG wurde hergestellt durch Kombinieren der Materialien, wie sie unter c) bis g) auf vorstehend beschriebene Weise hergestellt wurden.A reagent for the determination of HCG was prepared by combining the materials as described under c) to g) manner described above.
1. Anti-HCG-ß-Antikörper ^A^-sensibilisierte Kugeln1. Anti-HCG-ß-Antibodies ^ A ^ -sensitized Bullets
2. HRPO-markierter Anti-HCG-ß-Antikörper iß 72. HRPO-labeled anti-HCG-ß-antibody eats 7
'3205549'3205549
3. Waschagens (10-fach konzentrierte Lösung)3rd washing agent (10-fold concentrated solution)
4. Enzymsubstrat (5-Aminosalicylsäure-Wasserstoffperoxid) 4. Enzyme substrate (5-aminosalicylic acid hydrogen peroxide)
5. Stopper für die Enzymreaktion5. Stopper for the enzyme reaction
i) Bestimmung yon HCGi) Determination of HCG
Es wurde die folgende Bestimmung durchgeführt, wobei das Reagens zur Bestimmung von HCG, wie vorstehend unter h) beschrieben, verwendet wurde. 0,4 ml des HRPO-markierten Anti-HCG-ß-Antikörpers TbJ wurden in ein Reagensglas gegeben. Ein Stück einer Anti-HCG-ß-Antikörper^AJ-sensibilisierten Kugel wurde zugegeben. Dann wurde 0,1 ml der Standardlösung, die durch Verdünnen von HCG, wie in der Japanese Pharmacopoeia beschrieben, mit dem Serum gesunder Personen auf eine Konzentration von jeweils 10000, 1000, 100, 10 und 1 miu/ml erhalten wurde, zugegeben und 15 min lang reagieren gelassen. Nach der Umsetzung wurde das Waschagens mit destilliertem Wasser auf das 10-fache verdünnt, und die Kugel mit dem verdünnten Waschagens gewaschen.Daraufhin wurden 3 ml der Substratlösung, welche durch Auflösung des gesamten Enzymsubstrates in 150 ml destilliertem Wasser erhalten wurde, zugegeben und die Reaktion 30 min lang durchgeführt. Dann wurden 0r025 ml des Stoppers zugegeben, um die Reaktion abzu-' stoppen. Die Extinktion des Reaktionsgemisches wurde bei 5 00 nm gemessen. Die erhaltene Standardkurve ist in Fig. wiedergegeben.The following determination was carried out using the reagent for the determination of HCG as described above under h). 0.4 ml of the HRPO-labeled anti-HCG-β antibody TbJ was placed in a test tube. A piece of anti-HCG-β antibody ^ AJ sensitized ball was added. Then 0.1 ml of the standard solution obtained by diluting HCG as described in the Japanese Pharmacopoeia with the serum of healthy persons to a concentration of 10,000, 1,000, 100, 10 and 1 miu / ml, respectively, was added and 15 left to react for min. After the reaction, the washing agent was diluted 10 times with distilled water, and the ball was washed with the diluted washing agent. Then, 3 ml of the substrate solution obtained by dissolving the whole enzyme substrate in 150 ml of distilled water was added and the reaction was carried out Carried out for 30 minutes. Then the stopper 0 r 025 ml was added to the reaction ERS 'stop. The absorbance of the reaction mixture was measured at 500 nm. The standard curve obtained is shown in FIG.
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|---|---|
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3402938A1 (en) * | 1983-02-02 | 1984-08-02 | Australian Monoclonal Development Pty. Ltd., Artarmon, New South Wales | DIAGNOSTIC AID |
| DE3323645A1 (en) * | 1983-07-01 | 1985-01-10 | Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt | DIAGNOSTIC TEST SYSTEM |
| EP0223977A1 (en) * | 1985-11-25 | 1987-06-03 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Colour developing method in clinical examinations |
| EP0227921A1 (en) * | 1985-11-05 | 1987-07-08 | Roche Diagnostics GmbH | Process for the determination of an immunologically bindable substance |
| US4690890A (en) * | 1984-04-04 | 1987-09-01 | Cetus Corporation | Process for simultaneously detecting multiple antigens using dual sandwich immunometric assay |
| DE3590722T1 (en) * | 1982-08-20 | 1987-11-19 |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2118300B (en) * | 1982-02-12 | 1985-06-19 | Corning Glass Works | Method of immunoassay |
| DK76983A (en) * | 1982-03-05 | 1983-09-06 | Takeda Chemical Industries Ltd | METHOD AND REAGENT FOR IMMUNKEMIC DETERMINATION OF HUMAN CHORIOGONADOTROPIN |
| US4477576A (en) * | 1982-07-26 | 1984-10-16 | Mex Research Associates | Antigen assay method and kit |
| US4606855A (en) * | 1982-07-26 | 1986-08-19 | Mex Research Associates C/O Leon Reimer | Monoclonal antibody to digoxin |
| EP0113075A3 (en) * | 1982-12-06 | 1985-05-02 | Fielder Gillespie Davis Limited | Field immunoassay reaction system, method of immunoassay diagnosis and probe or carrier for use therewith |
| US4508643A (en) * | 1983-02-08 | 1985-04-02 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Rat antibody to hCG |
| US4579827A (en) * | 1983-03-11 | 1986-04-01 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies to human gastrointestinal cancers and hybridoma method of production of the monoclonal antibodies |
| JPS6060557A (en) * | 1983-09-13 | 1985-04-08 | Eisai Co Ltd | Method and reagent for measuring pivka-ii |
| JPS6080768A (en) * | 1983-10-12 | 1985-05-08 | Eisai Co Ltd | Method and reagent for measuring basic fetal protein |
| EP0158291A3 (en) * | 1984-04-10 | 1988-07-27 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | A method for purifying carcinoembryonic antigen and a method for producing a carcinoembryonic antigen-reactive monoclonal antibody |
| US5011771A (en) * | 1984-04-12 | 1991-04-30 | The General Hospital Corporation | Multiepitopic immunometric assay |
| GR850899B (en) * | 1984-04-12 | 1985-11-25 | Gen Hospital Corp | |
| JPS60231168A (en) * | 1984-05-01 | 1985-11-16 | Teijin Ltd | Immunoassay reagent and kit employing monoclonal antibody for human alpha2-plasmin inhibitor |
| JPS6134465A (en) * | 1984-07-26 | 1986-02-18 | Teijin Ltd | Immunoassay reagent and kit using monoclonal antibody against human alpha2-plasmin inhibitor |
| JPS61213671A (en) * | 1985-03-20 | 1986-09-22 | Teijin Ltd | Method for measuring human plasmin-alpha2-plasmin inhibitor compound body |
| JPS61196166A (en) * | 1985-02-27 | 1986-08-30 | Eiken Kagaku Kk | Imunological measurement reagent and preparation thereof |
| JPS61213670A (en) * | 1985-03-20 | 1986-09-22 | Teijin Ltd | Method for measuring human alpha2-plasmin inhibitor |
| WO1986007154A1 (en) * | 1985-05-31 | 1986-12-04 | Teijin Limited | Method for assaying human pulmonary surface active substance and reagent kit therefor |
| JPS6238362A (en) * | 1985-08-12 | 1987-02-19 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Method for measuring tsh |
| JPS63127160A (en) * | 1986-06-30 | 1988-05-31 | Sukeyasu Yoneda | Detection of specific protein |
| JP2617299B2 (en) * | 1986-09-17 | 1997-06-04 | ダイナボット 株式会社 | Immunoassay method for elastase 1 |
| JPH02213766A (en) * | 1989-02-15 | 1990-08-24 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | Reagent and implement for immunoassay |
| GB2270976A (en) * | 1992-09-18 | 1994-03-30 | Marconi Gec Ltd | Immunoassay/separation process using an auxiliary species on a support |
| AUPN214095A0 (en) * | 1995-04-03 | 1995-04-27 | Australian Water Technologies Pty Ltd | Method for detecting microorganisms using flow cytometry |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2925565A1 (en) * | 1978-09-05 | 1980-03-13 | Bio Rad Laboratories | INCUBATIONAL DOUBLE SPACE IMMUNE DETECTION METHOD AND MEANS FOR IMPLEMENTING THE METHOD |
| EP0042755A2 (en) * | 1980-06-20 | 1981-12-30 | Unilever Plc | Processes and apparatus for carrying out specific binding assays |
| EP0048357A1 (en) * | 1980-09-12 | 1982-03-31 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method for the determination of an antigen in solution |
| DE3130834A1 (en) * | 1980-08-04 | 1983-02-03 | Hybritech Inc., La Jolla, Calif. | IMMUNOMETRIC AND INHIBITION ASSAYS USING MONOCLONAL ANTIBODY |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH642458A5 (en) * | 1980-04-25 | 1984-04-13 | Hoffmann La Roche | Immunological method |
-
1981
- 1981-02-18 JP JP56022415A patent/JPS57136165A/en active Pending
-
1982
- 1982-02-17 IT IT47814/82A patent/IT1147626B/en active
- 1982-02-17 CH CH969/82A patent/CH658131A5/en not_active IP Right Cessation
- 1982-02-17 GB GB8204602A patent/GB2095831B/en not_active Expired
- 1982-02-17 NL NL8200631A patent/NL8200631A/en not_active Application Discontinuation
- 1982-02-17 SE SE8200978A patent/SE8200978L/en not_active Application Discontinuation
- 1982-02-18 DE DE3205849A patent/DE3205849C2/en not_active Expired
- 1982-02-18 FR FR8202669A patent/FR2500166B1/en not_active Expired
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2925565A1 (en) * | 1978-09-05 | 1980-03-13 | Bio Rad Laboratories | INCUBATIONAL DOUBLE SPACE IMMUNE DETECTION METHOD AND MEANS FOR IMPLEMENTING THE METHOD |
| GB2029571A (en) * | 1978-09-05 | 1980-03-19 | Bio Rad Laboratories | Single-incubation immunoassay for a multivalent ligand |
| EP0042755A2 (en) * | 1980-06-20 | 1981-12-30 | Unilever Plc | Processes and apparatus for carrying out specific binding assays |
| DE3130834A1 (en) * | 1980-08-04 | 1983-02-03 | Hybritech Inc., La Jolla, Calif. | IMMUNOMETRIC AND INHIBITION ASSAYS USING MONOCLONAL ANTIBODY |
| EP0048357A1 (en) * | 1980-09-12 | 1982-03-31 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method for the determination of an antigen in solution |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Methods in Enzymologie, Vol. 70, 1980, S. 201-209 * |
| Molecular Immunology, Vol. 17, 1980, S. 1315-1318 * |
| Proc.Nat.Acad.Sci. USA, Vol. 77, 1980, S. 563-566 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3590722T1 (en) * | 1982-08-20 | 1987-11-19 | ||
| DE3402938A1 (en) * | 1983-02-02 | 1984-08-02 | Australian Monoclonal Development Pty. Ltd., Artarmon, New South Wales | DIAGNOSTIC AID |
| DE3323645A1 (en) * | 1983-07-01 | 1985-01-10 | Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt | DIAGNOSTIC TEST SYSTEM |
| US4690890A (en) * | 1984-04-04 | 1987-09-01 | Cetus Corporation | Process for simultaneously detecting multiple antigens using dual sandwich immunometric assay |
| EP0227921A1 (en) * | 1985-11-05 | 1987-07-08 | Roche Diagnostics GmbH | Process for the determination of an immunologically bindable substance |
| EP0223977A1 (en) * | 1985-11-25 | 1987-06-03 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Colour developing method in clinical examinations |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2500166B1 (en) | 1986-03-07 |
| FR2500166A1 (en) | 1982-08-20 |
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| GB2095831B (en) | 1985-05-30 |
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| SE8200978L (en) | 1983-08-19 |
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