-
Enzympräparat und Verfahren zu
-
seiner Herstellung
Enzympräparat und Verfahren zu
seiner Herstellung Die Erfindung betrifft wasserunlösliche Enzympräparate sowie
Verfahren zu ihrer Herstellung, wobei die Enzyme über ein übergangsmetallhalogenid
oder eine polyfunktio-' nelle organische Verbindung als Kupplungsagens an speziell
behandelte Glasoberflächen gebunden sind.
-
In der klinischen Chemie werden wichtige Metabolite auf einfache
und spezifische Weise mit Hilfe von Enzymen bestimmt. Wo viele Proben von Körperflüssigkeiten
auf bestimmte Metaboliten untersucht werden müssen, werden in der Regel Analysenautomaten
eingesetzt. Ein Nachteil dieser Analysatoren ist ihr relativ großer Bedarf an Reagenzien,
der insbesondere beim Einsatz kostspieliger Enzyme die Analyse erheblich verteuert.
Da die Zurückgewinnung der Enzyme unrentabel ist, versuchte man durch den Einsatz
von trägergebundenen Enzymen, die mehrfach verwendet werden können, die Analysenkosten
zu senken.
-
Zu diesem Zweck wurden Enzyme an partikuläre Träger gebunden und
in Säulen gepackt zur Anwendung gebracht.
-
Diese Methode hat sich jedoch überwiegend nicht bewährt, da die Säulen
oft schlechte Laufeigenschaften zeigten und die meist an Polysaccharide gebundenen
unlöslichen Enzyme leicht von Mikroorganismen befallen und zerstört wurden.
-
Eine andere bekannte Möglichkeit, die Enzyme unlöslich zu machen,
ist die Bindung an die innere Oberfläche Von dünnen Schläuchen oder dünnen Rohren.
Die so gebundenen Enzyme sind für ihre Substrate besser zugänglich als die Enzyme
an porösen Partikeln.
-
Aus FEBS Letters 93, 102 (1978) ist die Immobilisierung von Glucosedehydrogenase,
durch Bindung über Titantetrachlorid als Kupplungsagens an Polyamidschläuche bekannt.
-
Dabei ergab sich, daß bei vorausgehender partieller hydrolytischer
Spaltung der Peptidbindungen an der inneren Oberfläche der Polyamidschläuche unter
Bildung freier Amino- und Carboxylgruppen die Enzymaktivität während eines bestimmten
Zeitraums erhalten blieb. Im Fall der nichthydrolytischen Spaltung der Peptidbindungen,
wobei zwar freie Aminogruppen, aber keine freien Carboxylgruppen entstehen, ging
dieEnzymaktivitEt innerhalb dieses Zeitraumes um 70 % zurück. Bei der Verwendung
von Polyamid als Trägermaterial ergeben sich darüber hinaus noch weitere Nachteile.
So ist z.B. die Belegung mit Enzymen nicht sehr groß und auch nicht gut reproduzierbar.
Außerdem werden Polyamidschläuche leicht von Mikroorganismen befallen, und die Lagerfähigkeit
der polyamidgebundenen Enzyme ist unzureichend.
-
In der DOS 22 06 360 ist die Immobilisierung von Amyloglucosidase
mit Hilfe von Titan- oder Zinnchloridlösungen an pulverisiertem Glas beschrieben,
wobei die Retention der spezifischen Aktivität bei Borosilicatglas 50,5 % nicht
übersteigt und bei Natronglas überhaupt keine Bindung zustande, kommt.
-
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, einen röhrenförmigen Träger
zur Verfügung zu stellen, der problemlos in Analysenautomaten eingesetzt werden
kann und an den sich die Enzyme in einfacher Weise binden lassen; die erhaltenen
wasserunlöslichen Enzympräparate sollten lange lagerfähig sein und eine hohe Enzymaktivität
besitzen.
-
Gelöst wurde diese Aufgabe durch ein Glasrohr als Trägermaterial,
dessen innere Oberfläche vor der Immobilisierung des Enzyms einer speziellen Vorbehandlung
unterzogen wurde.
-
Gegenstand der Erfindung ist ein wasserunlösliches Enzympräparat,
bei dem das Enzym über ein Übergangsmetallhalogenid oder eine polyfunktionelle organische
Verbindung als Kupplungsagens gebunden ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
sich das Kupplungsagens auf einer angeätzten und mit Aminosilanen behandelten Glasoberfläche
befindet. Vorzugsweise liegt die Glasoberfläche in'Spiralform vor.
-
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
eines wasserunlöslichen Enzympräparates durch Bindung des Enzyms über ein Übergangsmetallhalogenid
oder eine polyfunktionelle organische Verbindung als Kupplungsagens, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß man eine angeätzte Glasoberfläche mit Aminosilanen behandelt,
dann mit dem Kupplungsagens behandelt und anschließend mit einer Enzymlösung umsetzt.
-
Nach den von der Immobilisierung von Enzymen an Polyamid bekannten
Ergebnissen, wonach für eine stabile Bindung sowohl Amino- als auch Carboxylgruppen
erforderlich sind, war es völlig überraschend, daß bei Verwendung von sila,-nisiertem
Glas, das nur funktionelle Aminogruppen besitzt, nach Behandlung mit einem übergangsmetallhalogenid
stabile Enzympräparate erhalten werden. Die erfindungsgemäß immobilisierten Enzyme
können problemlos in Analysenautomaten eingebaut und zur quantitativen Bestimmung
von Metaboliten verwendet werden. Als geeignete Träger erwiesen sich Glas rohre
von ca. 1 - 2 mm Innendurchmesser und
ca. 1 - 2-m Länge, die zur
besseren Handhabung zu Spiralen von ca. 1,5 - 2 cm Durchmesser gewickelt werden
können.
-
Zur Herstellung der trägergebundenen Enzympräparate wird die innere
Oberfläche der Glasspirale angeätzt, z.B.
-
durch Behandlung mit Fluorwasserstoff und Königswasser.
-
Die so vorbehandelte Glasoberfläche wird zur Einführung funktioneller
Aminogruppen mit n-Aminoalkyltrialkoxysilanen in an sich bekannter Weise umgesetzt.
Anschließend wird die Glasspirale mit einer Lösung eines Übergangsmetallhalogenids
behandelt. Die Spirale wird dann mit der betreffenden Enzymiösung umgesetzt und
mit Pufferlösung gewaschen. Die Bindung des Enzyms an die mit Aminosilanen behandelte
Glasoberfläche kann auch mit Hilfe polyfunktioneller organischer Verbindungen erfolgen
(Methods in Enzymology, Volume XLIV, Academic Press, 1976, Seiten 118-134).
-
Die Umsetzung des Enzyms mit. einem unbehandelten Glas oder mit einem
nur mit einem übergangsmetallhalogenid behandelten Glas oder mit einem nur silanisierten
Glas ergeben wasserunlösliche Enzympräparate, die höchstens 2 - 6. % der Aktivität
besitzen, die das Enzym zeigt, das mit Hilfe eines Übergangsmetallhalogenids an
mit Aminosilanen behandeltes Glas gebunden ist.
-
Die Vorbehandlung der inneren Oberfläche der Glasspiralen erfolgt
vorzugswelsein 2 Stufen, zunächst mit ca. 40%iger Fluorwasserstoffsäure und anschließend
mit Königswasser bei erhöhter Temperatur. Die auf diese Weise angeätzte Glasoberfläche
wird dann zur Einführung funktioneller Aminogruppen mit einem Q-Aminoalkyltrialkoxysilan
umgesetzt, vorzugsweise mit y-Aminopropyltriethoxysilan bei erhöhter Temperatur.
-
Die silanisierte Glas spirale wird dann bei Raumtemperatur mit einer
10 - 25%igen Lösung eines übergangsmetallhalogenids in einem organischen Lösungsmittel
behandelt oder unter Erhitzen mit einer sauren, wäßrigen Lösung der Übergangsmetallhalogenide.
Vorzugsweise werden die Chloride der Übergangsmetalle Titan, Zirkonium, Vanadium,
Molybdän, Eisen oder Zinn verwendet, insbesondere eignet sich hierfür Titantetrachlorid
in Lösungsmitteln wie Pentan, Hexan oder Methanol.
-
Zur Belegung mit Enzym wird durch die so behandelte Glasspirale längere
Zeit eine gekühlte gepufferte Enzymlösung gepumpt. Vorzugsweise arbeitet man, je
nach der Stabilität der Enzyme bei möglichst niederen Temperaturen, z.B.
-
bei 0 - 15 0C während 12 - 48 Stunden. Die Konzentration der Enzymlösung
kann in weiten Bereichen variiert werden und liegt in der Regel zwischen 0,1 und
5,0 % vorzugsweise bei 2 %.
-
Anstelle der komplexchemischen Bindung des Enzyms über ein übergangsmetallhalogenid
an die mit Aminosilanen behandelte Glasoberfläche kann das Enzym auch kovalent mit
Hilfe polyfunktioneller organischer Verbindungen wie Imine, Dialdehyde, Diimidoester,
Dicarbonsäurehalogenide, Diepoxide, Diisocyanate, Dirhodanide, ferner z.B. Halogencarbonsäurehalogenide
wie Chloracetylchlorid, Bromacetylchlorid oder Jodacetylchlorid, halogenierte Epoxide
wie Epichlorhydrin oder Epibromhydrin, Halogenide von Aldehydsäuren wie Glutaraldehydsäurechlorid
usw. nach bekannten Methoden gebunden werden. Für die erfindungsgemäßen Enzympräparate
eignet sich zu diesem Zweck insbesondere Glutardialdehyd.
-
Zur Herstellung der Enzympräparate sind im Prinzip alle Enzyme geeignet,
die sich nach den obigen Methoden an einen Träger binden lassen, z.B. Proteasen
und Peptidasen, z.B. Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin. Papain, Ficin, Bromelin, Bakterienproteinasen
(Thermolysin, Subtilisin), Pilz-proteinasen, Aminopeptidase, Carboxypeptidase; Enzyme
des Nucleinsäurestoffwechsels, z.B. Endonucleasen (Desoxyribonucleasen, Ribonucleasen)
oder Exonucleasen (Phosphodiesterasen I und II, DNS-polymerase, ENS-polymerase);
ferner weitere Hydrolasen, z.B. a-Amylase, ß-Amylase, Amyloglucosidase, Saccharase
(= Invertase), Lactase (= ß-Galactosidase), ß-Glucuronidase, Penicillinase, Urease,
saurer Phosphatase, alkalische Phosphatase; Transferasen, z.B. Glyceratkinase, Glutamat-Pyruvat-Transaminase,
Glutamat-Oxalacetat-Transaminase; Oxidoreduktasen, z B. Lactatdehydrogenase, Malatdehydrogenase,
Steroiddehydrogenasen, Steroidhydroxylasen, Glucosedehydrogenase, Glucoseoxidase,
Cholesterinoxidase, L- und D-Aminosäureoxidase, Phenöloxidase, Katalase, Peroxidase,
Uricase; Lyasen, z.B. Aminosäuredecarboxylasen und Ketocarbonsäuredecarboxylasen;
Carboxylesterasen wie Cholesterinesterase und Deacylasen; Isomerasen, z.B. Glucoseisomerase;
Synthetasen, z.B. Aminosäure-tRNS-ligasen, Peptidsynthetasen, Carboxylasen. Bevorzugt
sind die Enzyme, die in der klinischen Chemie zur enzymatischen Bestimmung von häufig
zu bestimmenden Metaboliten verwendet werden, wie Giucosedehydrogenase, Glucoseoxidase,
Urease, Uricase, Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase.
-
Die erfindungsgemäß hergestellten Enzympräparate werden vorzugsweise
feucht bei -40 bis -70 OC aufbewahrt. Unter diesen Bedingungen ist auch nach einem
Jahr noch kein
Aktivitätsverlust feststellbar. Zur kurzfristigen
Lagerung während des Einsatzes werden die Spiralen mit einer Pufferlösung gefüllt
und z.B. über Nacht bei 4 OC aufbewahrt. Selbst bei ständigem Einsatz sind die Spiralen
etwa 4 Wochen lang verwendbar.
-
Beispiel 1 Ein Glasrohr aus einem Borosilicatglas mit 1 - 1,5 mm Innendurchmesser
und einer Länge von ca. 150 cm wurde zu einer Spirale mit ca. 2 cm Durchmesser und
23 Windungen gewickelt. Die Spirale wurde zuerst mit Toluol gespült und getrocknet,
danach wurde sie mit 40%iger Fluorwasserstoffsäure gefüllt und 2 Stunden lang bei
Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wurde sie mit Königswasser gefüllt
und 2 Stunden lang in einem Trockenschrank auf 110 OC erhitzt. Danach wurde die
Spirale mit Toluol gewaschen und trocken gesaugt. Zur Einführung der y-Aminopropylgruppe
wurde auf 130 OC erhitztes y-Aminopropyltriethoxysilan 24 Stunden lang durch die
Spirale gepumpt.
-
Danach wurde die Spirale entleert und 16 Stunden bei 130°C getrocknet.
Nach kurzem Spülen mit Toluol und n-Pentan wurde eine 2O%ige Lösung von Titantetrachlorid
in n-Pentan 1 Stunde lang durch die Spirale gepumpt. Anschließend wurde die Spirale
über Nacht bei 60 OC im Vakuumtrockenschrank getrocknet. Nach dem Abkühlen wurde
sie 2 Stunden lang mit einer 0,65 M Kochsalzlösung in 0,1 M Na,K-Phosphatpuffer,
pH 7,6, gespült. Zur Belegung mit Enzym wurde dann durch die Spirale bei 4 OC 24
Stunden lang eine Glucosedehydrogenaselösung gepumpt, die ca. 3500 U/ml enthielt
Danach betrug die Aktivität der Enzymlösung ca. 3200 U/ml, ihre spezifische Aktivität
lag bei 200 U/mg Protein. Schließlich wurde die belegte
Spirale
mit einer 0,35 M Kochsalzlösung in 0,1 M Na, K-Phosphatpuffer, pH 7,6, gespült.
Zur kurzfristigen Aufbewahrung bei ca. 4 OC wurde die Spirale mit Phosphatpuffer
gefüllt, zur langfristigen Aufbewahrung wurde die feuchte Spirale tiefgefroren.
Die Spirale wurde im Analysenautomaten im Konzentrationsbereich bis 500 mg/dl zur
Glucosebestimmung verwendet. Sie blieb bei einer Frequenz von 400 Proben pro Tag
etwa einen Monat lang verwendet bar.
-
Beispiel 2 Eine Glasspirale wurde analog Beispiel 1 mit Fluorwasserstoffsäure
und Königswasser vorbehandelt. Nach dem Waschen mit Toluol wurde sie mit einer 10%igen
Lösung von y-Aminopropyltriethoxysilan in Toluol gefüllt. Die beiden Enden wurden
mit einem Schlauch aus Polytetrafluorethylen verschlossen und die Spirale wurde
während 30 Stunden in einem Ofen bei 105 0C.aufbewahrt. Danach wurde die entleerte
Spirale während 5 Stunden bei 110 OC belassen, mit Toluol gewaschen und schließlich
bei 110 OC über Nacht getrocknet. Die silanisierte Glas spirale wurde mit 200 ml
Phosphatpuffer (0,05 M, pH 7) gewaschen und dann mit einer 2,5%igen Lösung von Glutardialdehyd
in Phosphatpuffer bei 4°C während 2 Stunden behandelt. Dabei färbte sich das Glas
leicht rosa. Nach dieser Behandlung wurde die Spirale mit 200 ml Pufferlösung (KE2PO
0,1 M, pH 7,6; NaCl 0,15 M) während 20 Min. bei 4 C gewaschen. Anschließend wurden
20 mg Glucosedehydrogenase und 3 mg NAD in 1,5 ml Pufferlösung (TRIS-HC1, 0,05 M,
pH 8,0; NaCl 0,15 M) gelöst und in einem geschlossenen System bei 4 OC während 24
Stunden durch die Spirale zirkulieren gelassen (Pumpgeschwindigkeit: 0,4 ml/min).
Die Enzymlösung wurde zurückgewonnen und das Glasrohr mit 100 ml einer 0,2 M Lösung
von NaCl in Phosphatpuffer und anschließend
mit 50 ml Phosphatpuffer,
der 0,01 % Natriumazid und 0,1 % NADH enthielt, gewaschen und bei -40 bis -70 OC
aufbewahrt.
-
Beispiel 3 Ein Glasrohr aus einem Borosilicatglas mit 1-1,5 mm Innendurchmesser
und einer Länge von ca. 1 m wurde analog Beispiel 1 behandelt. Nach der Silanisierung
und Umsetzung mit Titantetrachlorid wurde die Spirale 1 Stunde lang mit 0,5 M Kochsalzlösung,
enthaltend 5 pM 2-Mercaptoethanol in 0,1 M Na,K-Phosphatpuffer, pH 7,0 gespült.
Durch die aktivierte Spirale wurde bei 4 OC 24 Stunden lang eine Glucoseoxidaselösung
gepumpt, die ca. 400 U/ml enthielt. Anschließend wurde die Spirale mit einer 0,2
M Kochsalzlösung gespült, die 5 pM 2-Mercaptoethanol und 0,1 M Na,K-Phosphatpuffer,
pH 7,0, enthielt. Bei ca.
-
4 OC blieb die feuchte Spirale monatelang stabil und zeigte keine
signifikante Desaktivierung. Die Spirale ist zur Bestimmung von Glucose im Analysenautomaten
jederzeit einsatzfähig.
-
Auf analoge Weise läßt sich eine Spirale zur Bestimmung von Harnstoff
herstellen, wenn man anstelle von Glucoseoxidase eine Ureaselösung durch die aktivierte
Spirale pumpt, deren Aktivität etwa 500 U/ml beträgt.