DE2828944C2 - Process for the production of lysozyme - Google Patents
Process for the production of lysozymeInfo
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- C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
Description
Beschreibungdescription
Die Erfindung betrifft ein neues und verbessertes Verfahren für die Herstellung von Lysozym.The invention relates to a new and improved method for the production of lysozyme.
Vor seiner Einführung in die medizinische Therapie vor ungefähr 20 Jahren wurde Lysozym (EC 3.2.1.17). das ein Enzym ist, das antibakierieiie und immunisierende Aktivität besitzt und das von Fleming 1922 isoliert wurde, nur in bakteriologischen Laboratorien in begrenzten Mengen, beispielsweise für die Untersuchung der Strukturen und Komponenten der Bakterienzellwände, verwendet.Before its introduction into medical therapy about 20 years ago, lysozyme (EC 3.2.1.17) was used. the is an enzyme which has antibacterial and immunizing activity and which was isolated by Fleming in 1922, only in limited quantities in bacteriological laboratories, for example for the study of structures and components of bacterial cell walls are used.
Bedingt durch die günstigen klinischen Ergebnisse bei der Bekämpfung von Entzündungen und Infektionen und darauffolgend als Ergebnis seiner Verwendung zusammen mit Nahrungsmitteln als Konservierungsmittel und Schimmelkonservierungsmittel hat der Bedarf an großen Mengen reinen Lysozym zugenommen und zahlreiche industrielle Verfahren für die Erzeugung von Lysozym wurden patentiertDue to the favorable clinical results in combating inflammation and infections and subsequently as a result of its use with food as a preservative and mold preservatives, the need for large quantities of pure lysozyme has increased and numerous industrial processes for the production of lysozyme have been patented
Lysozym ist ein Enzym, das besser als N-Acetyl-muramido-glycano-hydrolase definiert werden kann. Es besitzt einen basischen Charakter und ein Molekulargewicht von etwa 15 000. Es ist in saurem Medium recht stabil und in alkalischem Medium weniger stabil. Es ist besonders aktiv gegenüber grampositiven Bakterien, aus denen es Substanzen freisetzt, die spezifisch mit Arninozuckerreagentien nachgewiesen werden können.Lysozyme is an enzyme that can be better defined as N-acetyl-muramido-glycano-hydrolase. It has a basic character and a molecular weight of about 15,000. It is quite in acidic medium stable and less stable in an alkaline medium. It is especially active against gram-positive bacteria, out which it releases substances that can be specifically detected with aminosugar reagents.
Seine primäre Struktur als basisches Polypeptid. gebildet aus 129 Resten der Aminosäuren, wurde besonders von Jolles (Exp. Ann. Bioch. Med„ 27. Reihe, Seite 1. publ. Masson. Paris 1966).Its primary structure as a basic polypeptide. formed from 129 residues of the amino acids, became special von Jolles (Exp. Ann. Bioch. Med “27th series, page 1. publ. Masson. Paris 1966).
In der GB-PS 11 10 466 der gleichen Anmelderin wird ein Verfahren für die Herstellung von Lysozym aus Eiweiß beschrieben und beansprucht, wobei das Eiweiß mit einem schwach sauren Ionenaustauschharz bei einem pH-Wert von 6 bis 7 bei einer Temperatur unter Umgebungstemperatur behände!: wird, das Harz abgetrennt wird, die Verunreinigungsproteine aus dem Harz mit einer Salzlösung mit einer Konzentration nicht über 0,2 M und einen pH-Wert von nicht mehr als 7 abgetrennt werden, dann das Lysozym mit einer wäßrigen Lösung eines Salzes eluiert wird und das Lysozym aus dem Eluat durch Erhöhung der Salzkonzentration darin ausgefällt wird.In GB-PS 11 10 466 of the same applicant, a process for the production of lysozyme from Protein described and claimed, with the protein having a weakly acidic ion exchange resin a pH of 6 to 7 at a temperature below ambient temperature !: the resin is separated, the contaminant proteins from the resin with a saline solution with a concentration not above 0.2 M and a pH of not more than 7, then the lysozyme with an aqueous Solution of a salt is eluted and the lysozyme is eluted from the eluate by increasing the salt concentration therein is precipitated.
Gegenstand der Erfindung ist ein neues und verbessertes Verfahren für die Herstellung von Lysozym, vorzugsweise aus Eiweiß, aber ebenfalls aus anderen Ausgangsmaterialien, die Lysozym enthalten, und die pflanzlichen oder tierischen Ursprungs sein können.The invention relates to a new and improved process for the production of lysozyme, preferably from protein, but also from other starting materials that contain lysozyme, and the can be of vegetable or animal origin.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, das auf der Extraktion von Lysozym aus Eiweiß oder anderen lysozymenthaltenden Materialien mittels schwach kationischer Harze unter speziellen Versuchsbedingungen beruht, können verschiedene Ziele bzw. Ergebnisse erreicht werden, die besser sind, als man sie mit den derzeit bekannten Verfahren erreicht. Das verwendete Eiweiß wird nicht durch Fremdsubstanzen verunreinigt und es wird nicht hinsichtlich seines natürlichen alkalischen pH-Wertes von etwa 9 modifiziert. Da weiterhin die Extraktionszeit beschränkt ist, findet keinerlei Verschlechterung der physikalischen Eigenschaften des Eiweiß statt, beispielsweise seiner Bindungs- und Steigeigenschaften, so daß es auf gleiche Weise wie das ursprüngliche Eiweiß für Nahrungsmittel verwendet werden kann und deiventsprechend bleibt sein Handelswert fast unverändert. Das erfindungsgemäße Verfahren ist leicht durchzuführen und dio kürzeren Arbeitszeiten ermöglichen verringerte Herstellungskosten. Weiterhin werden bei den verschiedenen Verfahrensstufen alle die Verbindungen, deren Anwesenheit in dem Abstromwasser große Umweltverschmutzungsprobleme ergeben würde, beseitigt. In der Praxis wird bei dem neuen erfindungsgemäßen Verfahren nur Natriumchlorid und Natriumhydroxid verwendet, deren Lösungen bei den darauffolgenden Herstellungszyklen wieder verwendet werden können. Die unvermeidlichen, aber geringen Verluste an Natriumchlorid (das teilweise von der Neutralisation von Natriumhydroxid durch Chlorwasserstoffsäure stammt) können als Abstrom nach einfacher Verdünnung auf die Grenzwerte, die von den Antiumweltverschmutzungsrichtiinien zugelassen werden, verdünnt werden.According to the method according to the invention, which is based on the extraction of lysozyme from egg white or other Lysozyme-containing materials using weakly cationic resins under special test conditions is based, various goals or results can be achieved that are better than you currently can known method achieved. The protein used is not contaminated by foreign substances and it is not modified in terms of its natural alkaline pH of around 9. Since the Extraction time is limited, there is no deterioration in the physical properties of the protein instead of, for example, its binding and climbing properties, so that it is in the same way as the original Protein can be used for food and accordingly its commercial value remains almost unchanged. The method according to the invention is easy to carry out and allows shorter working times reduced manufacturing costs. Furthermore, in the various process stages, all the connections the presence of which in the effluent water would cause major pollution problems is eliminated. In practice, only sodium chloride and sodium hydroxide are used in the new process of the invention are used, the solutions of which can be reused in the subsequent manufacturing cycles. the inevitable but small losses of sodium chloride (which is partly due to the neutralization of sodium hydroxide originates from hydrochloric acid) can be used as an effluent after simple dilution to the limit values, allowed by the anti-pollution directives are diluted.
Gegenstand der Erfindung ist das im Anspruch 1 definierte Verfahren zur Herstellung von Lysozym. Die Ansprüche 2 bis 4 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.The subject of the invention is the process defined in claim 1 for the production of lysozyme. the Claims 2 to 4 name embodiments of the invention.
Die Verwendung eines equilibrierten Harzes mit einem alkalischen pH-Wert ergibt zwei Vorteile, zusätzlich zu den zuvor erwähnten, die zuvor bei anderen industriellen Verfahren noch nicht erreicht wurden:Using an equilibrated resin with an alkaline pH gives two advantages in addition to the previously mentioned, which have not yet been achieved in other industrial processes:
a) erstens verbleibt der pH-Wert der Eiweiß-Harzmischung bei etwa 9, d.h. bei etwa dem normalen pH-Wert von Eiweiß, wodurch die Möglichkeit einer Verunreinigung durch Bakterien oder Fungi während der Bearbeitung des Eiweiß vermieden wird. Weiterhin wird durch die alkalische bzw. alkalisierende Lösung, die bei dem neuen Verfahren verwendet wird, die Adsorptionsrate des Lysozyms an dem Harza) Firstly, the pH of the protein-resin mixture remains at about 9, i.e. at about normal pH of protein, reducing the possibility of bacterial or fungi contamination during the processing of the protein is avoided. Furthermore, the alkaline or alkalizing Solution used in the new process, the rate of adsorption of the lysozyme on the resin
erhöht, so daß die Behandlungszeit in dieser Phase wesentlich verkürzt wird, wodurch große Ersparnisse in den Produktionskosten möglich sind. Das Verfahren kann nahe bei Umgebungstemperatur (10 bis 15°C) durchgeführt werden, was wirtschaftlich vorteilhaft ist, und Eiweiß, dessen Eigenschaften und Bakteriengehalt nicht wesentlich modifiziert ist. kann nach der Entfernung von seinem Lysozymgehalt für andere Zwecke verwendet werden.increased, so that the treatment time in this phase is significantly shortened, creating great savings in the production costs are possible. The process can be carried out close to ambient temperature (10 to 15 ° C) be carried out, which is economically advantageous, and protein, its properties and bacterial content is not significantly modified. may after removal of its lysozyme content for others Purposes.
b) Es ist ein weiterer Vorteil, daß, wenn die Adsorption des Lysozyms innerhalb eines pH-Bereichs von 8 bis 9 durchgeführt wird, nach der Behandlungszeit, wenn das Eiweiß entfernt und das Harz mit Wasser gewaschen wurde, um es von den letzten Spuren an Eiweiß zu befreien, es nicht erforderlich ist, das Harz mit einer Salzlösung zur Entfernung von irgendwelchen Proteinsubstanzen zu waschen wegen des ho^en Selektivitätsgrades bei der Adsorption.b) It is a further advantage that if the adsorption of the lysozyme is within a pH range of 8 to 9 is carried out, after the treatment time, when the egg white is removed and the resin with water Washed to rid it of the last traces of protein, it is not necessary to use the resin Wash with a saline solution to remove any protein substances because of the hope Degree of selectivity in adsorption.
Das Lysozym kann mit einer wäßrigen Lösung aus einem anorganischen Salz, beispielsweise Natriumnitrat, Kaliumnitrat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumsulphat, Kaliumsulphat, Ammoniumsulphat, oder aus organischen Salzen, beispielsweise Natriumacetat, Äthanolaminhydrochlorid oder Pyridinhydrochlorid, eluiert werden.The lysozyme can be mixed with an aqueous solution of an inorganic salt, for example sodium nitrate, Potassium Nitrate, Sodium Chloride, Potassium Chloride, Sodium Sulphate, Potassium Sulphate, Ammonium Sulphate, or from organic Salts, for example sodium acetate, ethanolamine hydrochloride or pyridine hydrochloride, eluted will.
Sehr gute Ergebnisse wurden mit 6- bis 10%igen Lösungen aus Ammoniumsulphat und mit 1,5- bis 3%igen wäßrigen Lösungen aus Natriumchlorid erhalten.Very good results were obtained with 6 to 10% solutions of ammonium sulphate and with 1.5 to 3% solutions obtained aqueous solutions of sodium chloride.
Das Lysozym kann von dem Eluat nach dem folgenden Verfahren abgetrennt werden:The lysozyme can be separated from the eluate by the following procedure:
a) Zugabe eines Salzes zu den eluierten Lösungen.a) Adding a salt to the eluted solutions.
b) Ultrafiltration des Eluats, gefolgt von der Zugabe eines Salzes zu dem Konzentrat.b) ultrafiltration of the eluate followed by the addition of a salt to the concentrate.
c) Konzentration durch Ultrafiltration, gefolgt durch Sprühtrocknen oder Lyophilisierung der Lösung. Die Konzentration durch Ultrafiltration kann nach dem folgenden Schema durchgeführt werden:c) concentration by ultrafiltration followed by spray drying or lyophilization of the solution. Concentration by ultrafiltration can be carried out according to the following scheme:
Elution von 100 1 (1% Lysozym; 3% Natriumchlorid)
Ultrafiltration IElution of 100 1 (1% lysozyme; 3% sodium chloride)
Ultrafiltration I
40 1 (2,5% Lysozym; 3% Natriumchlorid)
Verdünnung mit 30 1 Wasser40 1 (2.5% lysozyme; 3% sodium chloride)
Dilute with 30 liters of water
3030th
70 I (1 *5% Lysozym; 1,7% Natriumchlorid)
Ultrafiltration I70 I (1 * 5% lysozyme; 1.7% sodium chloride)
Ultrafiltration I
15 1 (6,65% Lysozym; 1,7% Natriumchlorid)15 1 (6.65% lysozyme; 1.7% sodium chloride)
+ Natriumchlorid+ Sodium chloride
LysozymLysozyme
4545
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Lysozym kann therapeutisch und in Nahrungsmitteln
ohne weitere Behandlung oder gegebenenfalls nach der Salzbildung mit einer nicht toxischen, physiologisch
annehmbaren, anorganischen oder organischen Säure verwendet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.The lysozyme obtained by the process according to the invention can be used therapeutically and in foods without further treatment or, if appropriate, after salt formation with a non-toxic, physiologically acceptable, inorganic or organic acid.
The following examples illustrate the invention.
11 1 Methacrylharz eines carbonsäuregruppenhaltenden Typs, All 1 Methacrylharz eines carbonsäuregruppenhaltenden Typs, in dem die Carboxylgruppen in freier Form vorliegen ("Amberlite" IRC50), werden in etwa 601 Wasser suspendiert. Eine 20%ige wäßrige Lösung aus Natriumhydroxid wird langsam unter Rühren zugegeben, bis der pH-Wert der Suspension 8 beträgt. Die Flüssigkeit wird abdekantiert und das Harz wird wiederholt durch Dekantieren mit demineralisiertem Wasser gewaschen. Nach der Entfernung des Wassers wird das Harz mit 66 kg Eiweiß bei einer Temperatur von 100C behandelt, bis der Lysozymgehalt in dem Eiweiß etwa 300 //ml beträgt. Das Harz wird dann mit Wasser gewaschen und anschließend mit einer wäßrigen Lösung aus 3%igem Natriumchlorid eluiert. Man erhält etwa 25 1 Eluat, das 240 bis 260 g Lysozym enthält. Die Lösung wird durch Ultrafiltration (DDS Membran Typ 600) auf ein Volumen von 101 konzentriert. Nach der Verdünnung mit 7,51 Wasser wird sie dann erneut auf ein Volumen von etwa 3,8 1 konzentriert und filtriert. Der pH-Wert wird auf 3,5 eingestellt und etwa 85 g Natriumchlorid werden zugegeben. Nach dem Kühlen, Zentrifugieren und Trocknen erhält man 240 bis 250 g Lysozym mit einem Titer von 94 bis 96%.11 1 methacrylic resin of a carboxylic acid group-containing type, All 1 methacrylic resin of a carboxylic acid group-containing type in which the carboxyl groups are in free form ("Amberlite" IRC50) are suspended in about 60 liters of water. A 20% strength aqueous solution of sodium hydroxide is slowly added with stirring until the pH of the suspension is 8. The liquid is decanted off and the resin is washed repeatedly by decanting with demineralized water. After the water has been removed, the resin is treated with 66 kg of protein at a temperature of 10 ° C. until the lysozyme content in the protein is about 300 ml. The resin is then washed with water and then eluted with an aqueous solution of 3% sodium chloride. About 25 liters of eluate are obtained which contain 240 to 260 g of lysozyme. The solution is concentrated to a volume of 101 by ultrafiltration (DDS membrane type 600). After dilution with 7.5 liters of water, it is then concentrated again to a volume of about 3.8 liters and filtered. The pH is adjusted to 3.5 and about 85 grams of sodium chloride are added. After cooling, centrifuging and drying, 240 to 250 g of lysozyme with a titer of 94 to 96% are obtained.
6565
Beispiel 2
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt, ausgenommen daß das Harz auf einen pH-WertExample 2
The procedure described in Example 1 is repeated except that the resin is brought to pH
von 9 equilibriert wird. Nach dem Eluieren wird der pH-Wert des Eluats auf 93 eingestellt und Natriumchlorid wird zugegeben, bis seine Konzentration 5% beträgt. Nach dem Kühlem werden 240 bis 245 g Lysozymbase abgetrennt. Sie besitzt einen Titer von > 94%.is equilibrated by 9. After the elution, the pH of the eluate is adjusted to 93 and sodium chloride is added until its concentration is 5%. After cooling, 240 to 245 g of lysozyme base are obtained severed. It has a titer of> 94%.
5 Beispie! 35 example! 3
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt. Die nach der Ultrafiltration erhaltene konzentrierte Lösung wird mit Chlorwasserstoffsäure bis zu einem pH-Wert von 3.3 angesäuert und sprühgetrocknet. Da«· I so erhaltene Lysozymhydrochlorid besitzt einen Titer von > 94%.The procedure described in Example 1 is repeated. The concentrated obtained after ultrafiltration Solution is acidified with hydrochloric acid to pH 3.3 and spray dried. There"· The lysozyme hydrochloride obtained in this way has a titer of> 94%.
ε Beispiel 4ε example 4
ψ Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt Nachdem das Lysozym adsorbiert ist und das Harz ψ The procedure described in Example 1 is repeated after the lysozyme has been adsorbed and the resin
fl mit Wasser gewaschen wurde, wird das Lysozym mit einer 8%igen wäßrigen Lösung aus Ammoniumsulphatfl was washed with water, the lysozyme with an 8% aqueous solution of ammonium sulphate
% 15 eluiert Die Konzentration des Ammoniumsulphats wird dann auf 40% zur Ausfällung des Lysozyms erhöht Zur % 15 eluted. The concentration of ammonium sulphate is then increased to 40% to precipitate the lysozyme
y Herstellung von Lysozymhydrochlorid und Beseitigung von irgendwelchen Spuren an Verunreinigungen wirdy production of lysozyme hydrochloride and elimination of any traces of impurities
\ der Niederschlag in filtriertem Wasser gelöst der pH-Wert wird auf 33 mit Chlorwasserstoffsäure eingestelltDissolved \ the precipitate in filtered water, the pH is adjusted to 33 with hydrochloric acid
£ und das Lysozym durch Zugabe einer wäßrigen Lösung aus Natriumchlorid ausgefällt£ and the lysozyme precipitated by adding an aqueous solution of sodium chloride
ΐ 20 Beispiel 5 ΐ 20 Example 5
I* 1110 ml Methacrylsäureharz des carboxylgruppenenthaltenden Typs ("Amberlite" IRCui) in Säureform wer-I * 1110 ml of methacrylic acid resin of the carboxyl group-containing type ("Amberlite" IRCui) in acid form are
fden in einen 6 !-Kolben gegeben und ^ine 30%ige wäßrige Lösung aus Natriumhydroxid wLd langsam unter Rühren zugegeben, während die Suspension einen pH-Wert von 9 hat Man hört dann mit dem Rühren auf. die I 25 Flüssigkeit wird abdekantiert und das Harz wird durch einen Büchner-Trichter filtriert und mehrere Male mitThe fden is placed in a 6! flask and a 30% aqueous solution of sodium hydroxide is slowly poured in Stirring added while the suspension has a pH of 9. Stirring is then stopped. the I 25 liquid is decanted off and the resin is filtered through a Buchner funnel and several times with
f demineralisiertem Wasser gewaschen. Das Harz wird dann mit 6,6 kg Eiweiß bei etwa Umgebungstemperaturwashed f demineralized water. The resin is then mixed with 6.6 kg of protein at around ambient temperature
I* (etwa 15°C) behandelt bis der Lysozymgehalt des Eiweiß [00 bis 200//ml beträgt. Das Harz wird dann mitI * (approx. 15 ° C) treated until the lysozyme content of the protein is [00 to 200 // ml. The resin is then with
f Wasser gewaschen, anschließend wird das Lysozym mit einer 3%igen wäßrigen Lösung aus Natriumchloridf water, then the lysozyme with a 3% aqueous solution of sodium chloride
I eluiert Der pH-Wen des Eluats wird auf etwa 93 bis 9,8 eingestellt und reines basisches Lysozym wird durch I eluted. The pH of the eluate is adjusted to about 93 to 9.8 and pure basic lysozyme is passed through
I 30 Erhöhung der Konzentration an Natriumchlorid auf 5% präzipitiert.I 30 increase the concentration of sodium chloride precipitated to 5%.
j; Beispiel 6j; Example 6
'( Das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren wird wiederholt, ausgenommen daß der pH-Wert des Harzes auf '( The procedure described in Example 5 is repeated except that the pH of the resin is increased to
. 35 einen Wert von 9 mit einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung eingestellt wird. Nach der Elution des Harzes mit. 35 is set to a value of 9 with an aqueous sodium hydroxide solution. After eluting the resin with
·' einer 23%igen Lösung aus Natriumchlorid erhält man 1900 bis 2100 ml IZIuat, das 1,4 bis 13% Lysozym enthältA 23% solution of sodium chloride is obtained from 1900 to 2100 ml of IZIuat, which contains 1.4 to 13% lysozyme
; Die Lösung wird dann der Ultrafiltration (DDS Membran Typ 600) unterworfen, bis das Volumen auf 800 ml; The solution is then subjected to ultrafiltration (DDS membrane type 600) until the volume is 800 ml
; reduziert ist. Anschließend wird die Lösung mit 600 mi Wasser verdünnt und eine zweite uitrafiitrationskonzentrierung wird durchgeführt, bis das Volumen 300 ml beträgt Die Lösung, die während der Konzentrierung trüb; is reduced. The solution is then diluted with 600 ml of water and subjected to a second uitrafiitration concentration is carried out until the volume is 300 ml. The solution, which becomes cloudy during concentration
ι 40 geworden sein kann, wird filtriert. Der pH-Wert wird r.üt Chlorwasserstoffsäure auf 33 eingestellt und 6 gι 40 can be filtered. The pH is adjusted to 33 r.üt hydrochloric acid and 6 g
ξ Natriumchlorid werden zugegeben. Beim Abkühlen findet eine Präzipitation von 243 bis 253 g Lysozymhydro-ξ Sodium chloride is added. On cooling, 243 to 253 g of lysozyme hydro-
t chlorid mit einem Titer von 95 bis 97% statt.t chloride with a titer of 95 to 97%.
Nach Beendigung der Elution wird das in Beispiel 6 verwendete Harz mit demineralisierf;m Wasser gewaschen, bis keine Chloride mehr nachgewiesen werden können. Das Harz wird dann mit 6,6 kg Eiweiß behandelt und dann wird gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren weitergearbeitet. Der pH-Wert des Eluats wird auf 3,5 mit Chlorwasserstoffsäure eingestellt und Natriumchlorid wird dann bis zu einer Konzentration von 5% 50 zugegeben. Nach dem Stehen während einiger Zeit in einem Kühlschrank scheiden sich 24 g Lysozymhydrochlorid ab.After completion of the elution, the resin used in Example 6 with demineralisierf washed m water can be until there are no chlorides mor e detected. The resin is then treated with 6.6 kg of egg white and then the procedure described in Example 5 is continued. The pH of the eluate is adjusted to 3.5 with hydrochloric acid and sodium chloride is then added to a concentration of 5%. After standing in a refrigerator for some time, 24 g of lysozyme hydrochloride are deposited.
Claims (1)
Z Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß als Harz ein carbonsäuregruppenenthaltendes Methacrylharz eingesetzt wird.1. Process for the production of lysozyme. wherein the pH of a weakly acidic ion exchange resin containing carboxyl groups is adjusted to a certain pH, washed with water and treated with a lysozyme-containing material, after which adsorbed lysozyme is eluted from the resin, characterized in that the pH The value of the resin is adjusted to a value of 8 to 9.5 with an aqueous solution of sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonium hydroxide.
Z Process according to Claim 1, characterized in that a methacrylic resin containing carboxylic acid groups is used as the resin.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
| D2 | Grant after examination | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |