DE2741192A1 - Alpha-amylase determination - using a malto-heptose deriv. substrate and measuring the enzymatically split scission - Google Patents

Alpha-amylase determination - using a malto-heptose deriv. substrate and measuring the enzymatically split scission

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DE2741192A1 DE19772741192 DE2741192A DE2741192A1 DE 2741192 A1 DE2741192 A1 DE 2741192A1 DE 19772741192 DE19772741192 DE 19772741192 DE 2741192 A DE2741192 A DE 2741192A DE 2741192 A1 DE2741192 A1 DE 2741192A1
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Abstract

Determn. of alpha-amylase comprises enzymatic splitting of an alpha-amylase substrate of formula (I) pref. 0.1-250 mm mmoles/1) and determination of the scission prod. In (I), R is a glucoside, phenyl-glucoside, monitrophenyl-glucoside, dinitrophenyl-glycoside, sorbitol or gluconic acid gp.). Reagents contg. (I) are also claimed. Used for determn. of alpha-amylase; determn, in serum is used clinically to measure pancreatic function. The process uses a substrate of better homogeneity and purity than previously (e.g. starch, maltopentose, maltotetrose, maltohexose) and gives rapid diagnosis using simple appts. e.g. test papers.

Description

Verfahren zur Bestimmung von α-AmylaseMethod for the determination of α-amylase

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Reagenz zur Bestimmung der « -Amylase.The invention relates to a method and a reagent for determination the «amylase.

Die Bestimmung des o(-Amylasespiegels im Serum ist ein wichtiger klinischer Parameter für die Bauchspeicheldrüsenfunktion.The determination of the o (amylase level in serum is an important clinical one Parameters for pancreatic function.

Die handelsüblichen Reagenzien zur Bestimmung derO(-Amylase basieren überwiegend auf einem System, bei dem Stärke durch die « -Amylase abgebaut und die gebildeten Bruchstücke im sichtbaren oder im UV-Bereich bestimmt werden, je nachdem, ob man angefärbte Stärke oder native Stärke als Amylasesubstrat in den Test einsetzt. Ein wesentlicher Nachteil dieser Verfahren bzw. Reagenzien beruht darauf, daß die Stärke als Makromolekül nur unzureichend zu charakterisieren und zu standardisieren ist, so daß die Umsatzrate der einzelnen Chargen sehr unterschiedlich ausfällt und bei den Messungen immer ein Standard mitgeführt werden muß. Für bessere Ergebnisse wäre ein einheitlicheres Substrat erforderlich, welches zuverlässige Ergebnisse bei der Spaltung liefert.The commercially available reagents for the determination of O (-amylase are based predominantly on a system in which starch is broken down by the -amylase and the formed fragments can be determined in the visible or in the UV range, depending on whether colored starch or native starch is used as the amylase substrate in the test. A major disadvantage of these methods and reagents is based on the fact that the To characterize and standardize starch as a macromolecule inadequately is, so that the conversion rate of the individual batches turns out very different and A standard must always be carried along with the measurements. For better results a more uniform substrate would be required which produces reliable results in the split delivers.

Einen Schritt vorwärts in Richtung auf ein einheitlicheres Substrat brachte die Verwendung der Maltopentaose. Diese wird von der o(-Amylase zu Maltotriose und Maltose gespalten, Maltotriose und Maltose werden durch die oC-Glucosidase in Glucose überführt, die dann nach beliebigen Methoden, beispielsweise mit der bekannten Hexokinase-Methode bestimmt werden kann.One step forward towards a more uniform substrate brought the use of the maltopentaose. This is transformed by the o (amylase into maltotriose and maltose are split, maltotriose and maltose are converted into Glucose transferred, which then by any method, for example with the known Hexokinase method can be determined.

Neben der Maltopentaose wurde auch bereits die Maltotetraose und die Maltohexaose als Substrat vorgeschlagen (US-PS 3 879 263, 4 000 042). Dabei wurden jedoch mit der Tetraose deutlich schlechtere Ergebnisse als mit der Pentaose, und mit der Hexaose noch schlechtere Resultate als mit der Tetraose erzielt. So wird für die Maltotetraose und -pentaose noch eine stöchiometrische Reaktion angegeben, während für die Hexaose bereits gerade noch tolerierbare Abweichungen von der stöchiometrischen Reaktion festgestellt wurden.In addition to the maltopentaose, the maltotetraose and the Maltohexaose proposed as a substrate (US Pat. No. 3,879,263, 4,000,042). There were however with the Tetraose significantly worse results than with the Pentaose, and obtained even worse results with the hexaose than with the tetraose. So will a stoichiometric reaction is given for maltotetraose and pentaose, while for the hexaose deviations from the stoichiometric are just tolerable Response were detected.

Ein Nachteil der Maltopentaose, der auch bei der Tetraose gefunden wurde, ist jedoch, daß ein erheblicher Schleich auftritt, d. h. die Meßreaktion bereits läuft, bevor die zu bestimmende Probe zugesetzt wird. Hinzu kommt, daß auch diese Schleichreaktion bei höheren Substratkonzentrationen nicht konstant ist, sondern sich mehr als 25 Minuten lang verändert, ehe Konstanz dieser Nebenreaktion erreicht wird. Außerdem sind die Reagenzienleerwerte dabei unerwünscht hoch. Auch stellte sich heraus, daß die angenommene unterschiedliche Spaltung der Maltopentaose durch Pankreas-o(-amylase und SalivaQX-amylase, die eine Unterscheidung ermöglicht hätte, tatsächlich nicht gegeben ist (J. BC, 1970, 245, 3917 bis 3927; J. Biochem.A disadvantage of the maltopentaose, which is also found with the tetraose is, however, is that significant creep occurs; H. the measurement reaction is already running before the sample to be determined is added. On top of that too this creeping reaction is not constant at higher substrate concentrations, but rather changes for more than 25 minutes before this side reaction becomes constant will. In addition, the reagent blank values are undesirably high. Also posed it turns out that the assumed different cleavage of the maltopentaose by Pancreatic o (-amylase and SalivaQX-amylase, which would have enabled a distinction, is actually not given (J. BC, 1970, 245, 3917 to 3927; J. Biochem.

51, p. XVIII 1952).51, p. XVIII 1952).

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und ein Reagenz zur Bestimmung der t-Amylase zu schaffen, bei welchem ein Substrat verwendet wird, welches eine bessere Reinheit und Einheitlichkeit aufweist als die bekannten Substrate, leicht zugänglich ist und hinsichtlich Leerwert ohne Serum, Dauer der Lag-phase und erreichbarer Maximalaktivität den Forderungen entspricht.The invention is therefore based on the object of a method and to provide a reagent for determining t-amylase using a substrate which has a better purity and uniformity than the known Substrates, easily accessible and with regard to blank value without serum, duration of the Lag phase and achievable maximum activity corresponds to the requirements.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Bestimmung von q-Amylase durch enzymatische Spaltung eines O< -Amylasesubstrats und Messung eines Spaltproduktes, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als Substrat Maltoheptaose verwendet wird.This object is achieved according to the invention by a method for Determination of q-amylase by enzymatic cleavage of an O <-amylase substrate and measurement of a fission product, which is characterized in that as a substrate Maltoheptaose is used.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß die Maltoheptaose überlegene Eigenschaften als Substrat der o(-Amylase besitzt, obwohl bei den für diesen Zweck bereits vorgeschlagenen Oligomaltosen von der Maltopentaose zur Maltohexaose ein wesentlicher Abfall der Eignung festgestellt wurde, da mit ihr wesentlich schlechtere Resultate als mit der Pentaose erzielt werden.Surprisingly, it has been shown that maltoheptaose is superior Properties as a substrate of o (-amylase possesses, although it is used for this purpose already proposed oligomaltoses from maltopentaose to maltohexaose a significant decrease in suitability was found, since with it much worse Results than can be achieved with the Pentaose.

Es war daher zu erwarten gewesen, daß mit einer weiteren Verlängerung der Maltose-oligosaccharidkette nicht mehr tolerierbare Fehler auftreten würden. Überraschenderweise werden jedoch bessere Ergebnisse als mit der Pentaose erzielt. So beträgt der Reagenzienleerwert bei 0,02 ml Probe mit Maltopentaose als Substrat 73 %, mit Maltoheptaose dagegen nur 13 %, bezogen auf den Endwert der Bestimmung.It was therefore to be expected that with a further extension the maltose oligosaccharide chain would no longer tolerate errors. Surprisingly, however better results than with the Pentaose scored. For example, the reagent blank for 0.02 ml sample with maltopentaose is as substrate 73%, with maltoheptaose on the other hand only 13%, based on the final value of Determination.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich in besonderem MaBe bei der Bestimmung der Spaltprodukte mittels <-Glucosidase oder Maltosephosphorylase.The method according to the invention is particularly suitable the determination of the cleavage products using <-glucosidase or maltose phosphorylase.

Bei der Bestimmung mit o(-Glucosidase werden die Spaltprodukte der Maltoheptaose, Maltotetraose und Maltotriose, weitergespalten zu Glucose und letztere dann in an sich bekannter Weise gemessen. Für die Messung der gebildeten Glucose wird dabei in Gegenwart der6(-Glucosidase besonders das Hexokinaseverfahren bevorzugt. Das Prinzip dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich durch nachstehende Gleichungen wiedergeben: Maltoheptaose + H2 0 Maltotriose + Maltotetraose Maltotriose + 2H20 3 Glucose Maltotetraose + 3H20 4 Glucose 7 Glucose + 7 ATP 7 Glucose-6-P 7 Glucose-6-P + 7NAD+ 7 Gluconat-6-P+7NADH + 7H+ Für die oben beschriebene Ausführungsform können diejenigen Puffer verwendet werden, die im Hauptaktivitätsbereich der eingesetzten Enzyme, d. h. zwischen pH 6,2 und 7,8, wirksam sind. Bevorzugt wird Phosphatpuffer, pH 6,8 bis 7,2, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 50 mM als Natriumphosphatpuffer. Ebenfalls sehr gute Eignung zeigten Glycylglycinpuffer, insbesondere in einer Konzentration von 150 mM oder Hepespuffer in einer Konzentration von 100 mM.In the determination with o (-glucosidase, the cleavage products of maltoheptaose, maltotetraose and maltotriose are broken down further to glucose and the latter is then measured in a manner known per se. The hexokinase method is particularly preferred for measuring the glucose formed in the presence of6 (-glucosidase. The principle of this embodiment of the method according to the invention can be represented by the following equations: Maltoheptaose + H2 0 Maltotriose + Maltotetraose Maltotriose + 2H20 3 glucose maltotetraose + 3H20 4 glucose 7 glucose + 7 ATP 7 Glucose-6-P 7 Glucose-6-P + 7NAD + 7 Gluconate-6-P + 7NADH + 7H + For the embodiment described above, those buffers can be used which are effective in the main activity range of the enzymes used, ie between pH 6.2 and 7.8. Phosphate buffer, pH 6.8 to 7.2, particularly preferably in a concentration of 50 mM, is preferred as the sodium phosphate buffer. Glycylglycine buffers, in particular in a concentration of 150 mM or Hepes buffer in a concentration of 100 mM, were also very suitable.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung erfolgt die Bestimmung der Spaltprodukte durch Umsetzung mit Maltosephosphorylase unter Bildung von Glucose-1-phosphat, welches dann in an sich bekannter Weise bestimmt wird. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestimmung des Glucose-1-phosphats durch Umwandlung in Glucose-6-phosphat mittels ß-Phosphoglucosemutase, Oxidation des gebildeten Glucose-6-phosphats mit NAD in Gegenwart von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase unter Bildung von Gluconat-6-phosphat und NADH, wobei die Bildung des letzteren photometrisch leicht verfolgt werden kann. Das Meßsignal läßt sich noch verstärken durch Weiteroxidation mit NAD in Gegenwart von 6-Phosphogluconat-dehydrogenase unter Bildung von Ribulose-5-phosphat und einem weiteren Molekül NADH.In a further preferred embodiment of the method of In the invention, the cleavage products are determined by reaction with maltose phosphorylase with the formation of glucose-1-phosphate, which is then determined in a manner known per se will. According to a particularly preferred embodiment, the is determined Glucose-1-phosphate by conversion into glucose-6-phosphate by means of ß-phosphoglucose mutase, Oxidation of the glucose-6-phosphate formed with NAD in the presence of glucose-6-phosphate dehydrogenase with the formation of gluconate-6-phosphate and NADH, with the formation of the latter can be easily traced photometrically. The measurement signal can still be amplified by further oxidation with NAD in the presence of 6-phosphogluconate dehydrogenase under Formation of ribulose-5-phosphate and another molecule of NADH.

Das Prinzip dieser Ausführungsform geben die nachfolgenden Gleichungen wieder: Maltoheptaose + H20 Maltose Maltotriose + Maltotetraose Maltose + P04 Glucose + ß-Glucose-1-P ß-Glucose-1-P Glucose-6-P Glucose-6-P + NAD+ Gluconat-6-P + NADH + H Gluconat-6-P+NAD+ Ribulose-5-P+NADH + Ein Vorteil dieser Ausführungsform der Erfindung liegt darin, daß Maltosephosphorylase spezifischer ist als o( -Glucosidase und daher endogene Glucose nicht stört.The principle of this embodiment is shown in the following equations: maltoheptaose + H20 maltose Maltotriose + maltotetraose Maltose + P04 Glucose + ß-glucose-1-P ß-glucose-1-P Glucose-6-P Glucose-6-P + NAD + Gluconate-6-P + NADH + H Gluconate-6-P + NAD + Ribulose-5-P + NADH + An advantage of this embodiment of the invention is that maltose phosphorylase is more specific than o (-glucosidase and therefore does not interfere with endogenous glucose.

Hinsichtlich der Puffer gilt das zu der Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem o( -Glucosidaseverfahren Ausgeführte in gleicher Weise.With regard to the buffers, this applies to the embodiment of the invention Procedure with the o (-glucosidase procedure carried out in the same way.

Außer den beiden oben aufgeführten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Bestimmung der gebildeten Bruchstücke der Maltoheptaose, also Maltotetraose, Maltotriose und daraus gebildete Maltose auch nach anderen hierfür bekannten Methoden erfolgen.In addition to the two embodiments of the invention listed above Method can determine the formed fragments of maltoheptaose, ie Maltotetraose, maltotriose and maltose formed therefrom also according to others for this purpose known methods.

Substratsättigung der O(-Amylase mit Maltoheptaose liegt bei einer Konzentration von 8 bis 10 mM vor. Zweckmäßigerweise wird daher im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Mindestkonzentration von 8 mM an Maltoheptaose verwendet, falls unter Bedingungen der Substratsättigung gearbeitet werden soll, was in der Regel der Fall ist.The substrate saturation of O (-amylase with maltoheptaose is one Concentration of 8 to 10 mM before. Expediently, therefore, within the scope of the invention Procedure a minimum concentration of 8 mM of maltoheptaose, if used should be worked under conditions of substrate saturation, which is usually the case is.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur Bestimmung der %-Amylase enthaltend ein O(-Amylasesubstrat und ein System zur Bestimmung eines aus dem i-Amylasesubstrat durch die α-Amylase gebildeten Spaltproduktes, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das Substrat aus Maltoheptaose besteht.Another object of the invention is a reagent for determination of% -amylase containing an O (-amylase substrate and a system for determining a cleavage product formed from the i-amylase substrate by the α-amylase, which is characterized in that the substrate consists of maltoheptaose.

Bevorzugte Systeme für die Bestimmung der Spaltprodukte sind das O(-Glucosidasesystem, bei welchem als Enzyme noch Hexckinase (HK) und Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (G6PDH) sowie NAD, ATP, Magnesium, Alkalichlorid und Puffer benötigt werden.Preferred systems for the determination of the cleavage products are the O (-glucosidase system, in which the enzymes are hexkinase (HK) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) as well as NAD, ATP, magnesium, alkali chloride and buffer are required.

Besonders bevorzugt besteht ein Reagenz auf Basis des o( -Glucosidasesystems aus 5 x 103 bis 3 x 104 U/l Z -Glucosidase, 103 bis 5 x 104 HK, 10 bis 5 x 10 G6PDH, 0,5 bis 8 mM/l NAD, 0,5 bis 5 mM/l ATP, 1 bis 3 mM/l Mg 25 bis 100 mM/l NaCl oder KCl, 25 bis 200 mM/l Puffer, pH 6,2 bis 7,8 und 8 bis 100 mM/l Maltoseheptaose oder einem Vielfachen oder Bruchteil davon, in trockener oder gelöster Form.A reagent based on the o (-glucosidase system) is particularly preferred from 5 x 103 to 3 x 104 U / l Z -glucosidase, 103 to 5 x 104 HK, 10 to 5 x 10 G6PDH, 0.5 up to 8 mM / l NAD, 0.5 to 5 mM / l ATP, 1 to 3 mM / l Mg 25 to 100 mM / l NaCl or KCl, 25 to 200 mM / l buffer, pH 6.2 to 7.8 and 8 to 100 mM / l maltoseheptaose or one Multiples or fractions thereof, in dry or dissolved form.

Ein anderes bevorzugtes System zur Bestimmung der Spaltprodukte ist das Maltosephosphorylasesystem, welches im wesentlichen aus Maltosephosphorylase, ß-Phosphoglucomutase (ßPMG), Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (G6PDH), Glucose-1,6-diphosphat (G1 ,6DP) NAD, Puffer, Maltoheptaose und gegebenenfalls 6-Phosphogluconatdehydrogenase (6PGDH) besteht.Another preferred system for determining the fission products is the maltose phosphorylase system, which consists essentially of maltose phosphorylase, ß-Phosphoglucomutase (ßPMG), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), glucose-1,6-diphosphate (G1, 6DP) NAD, buffer, maltoheptaose and optionally 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGDH) exists.

Ein besonders bevorzugtes Reagenz mit diesem Nachweis system besteht aus 0,5 x 10³ bis 20 x 10³ U/l Maltosephosphorylase, 1 x 10² bis 1 x 104 ß-PGluM, 2 x 103 bis 3 x 104 U/l Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, 0,5 bis 10 mM/l NAD, 0,001 bis 1 mM/l Glucose-1,6-diphosphat, 0,5 bis 50 mM/l Puffer, pH 6,0 bis 7,5, 5 bis 50 mM/l Maltoheptaose und gegebenenfalls 1 x 102 bis 1 x 10 U/l 6-Phosphogluconat-dehydrogenase.There is a particularly preferred reagent with this detection system from 0.5 x 10³ to 20 x 10³ U / l maltose phosphorylase, 1 x 10² to 1 x 104 ß-PGluM, 2 x 103 to 3 x 104 U / l glucose-6-phosphate dehydrogenase, 0.5 to 10 mM / l NAD, 0.001 to 1 mM / l glucose-1,6-diphosphate, 0.5 to 50 mM / l buffer, pH 6.0 to 7.5, 5 to 50 mM / l maltoheptaose and optionally 1 x 102 to 1 x 10 U / l 6-phosphogluconate dehydrogenase.

Das erfindungsgemäße Reagenz kann in trockener oder gelöster Form vorliegen, es kann auch auf einem blattförmigen Träger, z. B. einer Folie, einem saugfähigen Papier oder dergleichen, imprägniert vorliegen. Im letzteren Falle besteht es zweckmäßig aus wenigstens drei Schichten bzw. Lagen, wobei eine erste Schicht die Maltoheptaose enthält, die zweite Schicht als Sperrschicht dient und die dritte Schicht das System zur Bestimmung der Spaltprodukte enthält. Wird ein derartiges mehrschichtiges Reagenzmaterial, welches sich für einen einfachen Schnelltest auf «-Amylase eignet, mit einer flüssigen, o( -Amylasehaltigen Probe in Berührung gebracht, so spaltet die t -Amylase das Substrat und die Bruchstücke diffundieren durch die Zwischenschicht in die dritte, das Bestimmungssystem enthaltende Schicht. Als Nachweisreaktion wird in diesem Falle zweckmäßig eine farbbildende Reaktion verwendet, um anhand der auftretenden Verfärbung die Konzentration der OC-Amylase visuell sichtbar zu machen.The reagent according to the invention can be in dry or dissolved form shape it can also be on a sheet-like carrier, e.g. B. a slide, a absorbent paper or the like, impregnated. In the latter case there is it expediently consists of at least three layers or plies, with a first layer which contains maltoheptaose, the second layer acts as a barrier and the third Layer contains the system for determining the fission products. Will be such a thing multilayer reagent material, which can be used for a simple rapid test «-Amylase is suitable, brought into contact with a liquid, o (-amylase-containing sample, so the t -amylase cleaves the substrate and the fragments diffuse through the Intermediate layer in the third layer containing the determination system. As a detection reaction in this case, a color-forming reaction is expediently used in order to use the resulting discoloration increases the concentration of OC amylase visually do.

Das erfindungsgemäße Verfahren und Reagenz ermöglichen eine rasche und zuverlässige Bestimmung der Y a(-Amylase. Das Verfahren zeichnet sich aus durch kurze Lag-Phase, geringeren Reagenzienleerwert als bei bisher bekannten Substraten, gute Empfindlichkeit bezüglich des Meßsignals, so daß mit geringen Probemengen ausgekommen wird und der Möglichkeit, verschiedene Nachweissysteme für die Bruchstücke des Substrats mit gleich guten Ergebnisse einzusetzen. Das erfindungsgemäße eingesetzte Substrat ist gut und in hoher Reinheit zugänglich. Ein einfaches Verfahren zur seiner Herstellung ist in der gleichzeitig unter der internen Nr. 2157 eingereichten deutschen Patentanmeldung P .. ..... ..... beschrieben. Das Verfahren eignet sich zur Bestimmung der «-Amylase in biologischen Flüssigkeiten, wie Serum, Heparinplasma, Urin und dergleichen, oder in anderen flüssigen oder festen Materialien.The method and reagent according to the invention enable a rapid and reliable determination of Y a (amylase. The method is characterized by short lag phase, lower reagent blank value than with previously known substrates, good sensitivity with regard to the measurement signal, so that small amounts of sample can be used and the possibility of different detection systems for the fragments of the substrate to use with equally good results. The substrate used according to the invention is accessible well and in high purity. A simple method of making it is in the German patent application filed at the same time under internal no. 2157 P .. ..... ..... described. The method is suitable for the determination of α-amylase in biological fluids such as serum, heparin plasma, urine and the like, or in other liquid or solid materials.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.The following examples illustrate the invention.

Beispiel 1 Maltogene Methode (i-Glucosidase-system) Eine Reagenzienmischung, enthaltend «-Glucosidase, G6PDH, HK, NAD, ATP, Maltoheptaose, Mg NaCl und Phosphatpuffer, wird in 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Haltbarkeit des Reagenz bei Zimmertemperatur beträgt etwa 1 Stunde, bei Temperaturen unter 8 0C 6 Stunden.Example 1 Maltogenic method (i-glucosidase system) A reagent mixture, containing «-glucosidase, G6PDH, HK, NAD, ATP, maltoheptaose, Mg NaCl and phosphate buffer, is dissolved in 2.0 ml of distilled water. The shelf life of the reagent at room temperature is about 1 hour, at temperatures below 8 0C 6 hours.

Die erhaltene Lösung weist folgenden Konzentration der Reagenzien auf: Phosphatpuffer 50 mMol/l; pH 7,0 NaCl 50 mMol/l Mg2+ 2 mMol/l Maltoheptaose 10 mMol/l ATP 1,2 mMol/l NAD 2 mMol/l HK \ 2 U/l G6PDH # 2 U/l α-Glucosidase #10 U/l Die Lösung wird bei 25°C mit 0,02 ml Serumprobe versetzt, in eine Küvette von 1 cm Schichtdicke gemessen und dann die Extinktion bei Hg 365 nm, 340 nm oder Hg 334 nm in einem Photometer bestimmt. Nach 10 Minuten wird die Extinktion abgelesen und dann in Abständen von je einer Minute fünfmal die Ablesung wiederholt.The solution obtained has the following concentration of the reagents on: phosphate buffer 50 mmol / l; pH 7.0 NaCl 50 mmol / l Mg2 + 2 mmol / l maltoheptaose 10 mmol / l ATP 1.2 mmol / l NAD 2 mmol / l HK \ 2 U / l G6PDH # 2 U / l α-glucosidase # 10 U / l The solution is mixed with 0.02 ml of serum sample at 25 ° C, in a cuvette measured from 1 cm layer thickness and then the extinction at Hg 365 nm, 340 nm or Hg 334 nm determined in a photometer. The absorbance is read off after 10 minutes and then repeated the reading five times at one minute intervals.

Aus den so ermittelten Extinktionsdifferenzen pro Minute (hE/min) wird der Mittelwert gebildet, der Reagenzienleerwert subtrahiert und der korrigierte Wert wird in die Berechnung eingesetzt.From the absorbance differences determined in this way per minute (hU / min) the mean value is formed, the reagent blank subtracted and the corrected one Value is used in the calculation.

Die Berechnung erfolgt wie folgt: U/l 250C = 4244 x#E 365 nm/min = 2290 x # E 340 nm/min = 2335 x tiE 334 nm/min Fig. 1 der Zeichnung zeigt die Ergebnisse einer Verdünnungsreihe von Humanserum mit physiologischer Kochsalzlösung, die nach dieser Methode erhalten werden.The calculation is carried out as follows: U / l 250C = 4244 x # E 365 nm / min = 2290 x # E 340 nm / min = 2335 x tiE 334 nm / min Fig. 1 of the drawing shows the results a dilution series of human serum with physiological saline solution, which according to this method can be obtained.

Wird das Reagenz in zwei Chargen aufgeteilt, von denen eine die Maltoheptaose und die andere die Mischung aller übrigen Reagenzien enthält, so läßt sich die Haltbarkeit der damit hergestellten Lösungen erhöhen. Sie beträgt für die Mischung der Reagenzien bei Temperaturen bis 8 0C 30 Stunden, bei Zimmertemperatur etwa 8 Stunden. Die Haltbarkeit der Maltoheptaoselösung beträgt entsprechend 6 Wochen bzw. ca. 1 Woche.The reagent is split into two batches, one of which is the maltoheptaose and the other contains the mixture of all other reagents, the shelf life can be reduced of the solutions produced with it. It amounts to for the mixture of the reagents at temperatures up to 8 0C 30 hours, at room temperature about 8 hours. The durability the maltoheptaose solution is accordingly 6 weeks or approx. 1 week.

B e i s p i e l 2 Bestimmung mit dem Maltosephosphorylate-system Es wurden zwei Reagenzien hergestellt, bestehend aus dem Amylasesubstrat und dem Maltosephosphorylase-system. Das eine Reagenz enthielt Maltoheptaosesubstrat, das andere entsprechend dem Stand der Technik lösliche StArke. Die Reagenzienkonzentration nach dem Auflösen in Wasser war wie folgt: Erfindung Vergleich Phosphatpuffer 20 mM; pH 6,5 20 mM; pH 6,5 NAD 2 mM 2 mM Maltoheptaose 10 mM lösliche Stärke - 5 mg/ml Glucose-1,6-diphosphat Spuren Spuren Naltosepho.phorylase 3 V/ml 3 U,,1.EXAMPLE 2 Determination with the maltose phosphorylate system Es two reagents were prepared consisting of the amylase substrate and the maltose phosphorylase system. One reagent contained maltoheptaose substrate, the other according to the status starch soluble in technology. The reagent concentration after dissolving in water was as follows: invention comparison phosphate buffer 20 mM; pH 6.5 20 mM; pH 6.5 NAD 2 mM 2 mM maltoheptaose 10 mM soluble starch - 5 mg / ml glucose-1,6-diphosphate traces Traces of naltosepho.phorylase 3 V / ml 3 U ,, 1.

(Mikroorg.) Erfindung Vergleich ß-Phosphoglucomutase 1 U/ml 1 U/ml (Mikroorg.) G6PDH (Leuconostoc mesent) 9 U/ml 9 U/ml 6PGDH (Leuconostoc mesent) 1 U/ml 1 U/ml Die erhaltene Lösung wurde bei 300C inkubiert, mit der Probelösung versetzt und in einem Photometer die Extinktionsdifferein: bei Hg 334 n1 bestimmt. Nach der 10-minttigen Vorinkubation wird die Extinktionsdifferenz über 10 Minuten gemessen.(Micro org.) Invention comparison of ß-phosphoglucomutase 1 U / ml 1 U / ml (microorgan.) G6PDH (Leuconostoc mesent) 9 U / ml 9 U / ml 6PGDH (Leuconostoc mesent) 1 U / ml 1 U / ml The solution obtained was incubated at 30 ° C. with the sample solution offset and the extinction difference in a photometer: determined at Hg 334 n1. After the 10-minute preincubation, the extinction difference becomes over 10 minutes measured.

Fur 2,0 ml Reagens und 0,10 ml Probe ergibt sich dann folgendc Berechnungsformel: #E/min x 2,1 x 1000 6,18 x 0,1 x 0,2 = #E/min x 1699 U/l Bei Einsatz von fünf verschiedenen Humanseren wurden mit den obigen Reagenzien folgende Werte gefunden: Serum Erfindung Stärke 1 37,4 U/l 15,3 Ull 2 *1,2 U/l 27,3 U/l 3 95,1 U/l 39,1 U/l 4 114 U/1 44,2 U/l 5 374 U/l 161 U/l LeerseiteFor 2.0 ml of reagent and 0.10 ml of sample, the following calculation formula results: # E / min x 2.1 x 1000 6.18 x 0.1 x 0.2 = # E / min x 1699 U / l When using five different The following values were found in human sera with the above reagents: Serum Invention Strength 1 37.4 U / l 15.3 Ull 2 * 1.2 U / l 27.3 U / l 3 95.1 U / l 39.1 U / l 4 114 U / 1 44.2 U / l 5,374 U / l 161 U / l Blank page

Claims (10)

Patentansprüche Verfahren zur Bestimmung von α-Amylase durch enzymatische Spaltung eines c(-Amylasesubstrats und Messung eines Spaltproduktes, dadurch gekennzeichnet, daß als Substrat Maltoheptaose verwendet wird. Method for the determination of α-amylase by enzymatic cleavage of a c (amylase substrate and measurement of a cleavage product, characterized in that maltoheptaose is used as the substrate. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Spaltprodukte durch «-Glucosidase in Glucose überführt in an sich bekannter Weise bestimmt wird. 2. The method according to claim 1, characterized in that the cleavage products converted into glucose by -glucosidase is determined in a manner known per se. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Spaltprodukte durch Maltosephosphorylase umgesetzt werden unter Bildung von Clucose-1-phosphat und letzteres bestimmt wird. 3. The method according to claim 1, characterized in that the cleavage products be converted by maltose phosphorylase to form clucose-1-phosphate and the latter is determined. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung des gebildeten Glucose-1-phosphats dieses mit Phosphoglucomutase in Glucose-6-phosphat umgewandelt und mit letzterem NAD in Gegenwart von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase zu NADH reduziert wird, welches gemessen wird. 4. The method according to claim 3, characterized in that the determination of the glucose-1-phosphate formed this with phosphoglucomutase in glucose-6-phosphate converted and with the latter NAD in the presence of glucose-6-phosphate dehydrogenase is reduced to NADH, which is measured. 5. Reagenz zur Bestimmung der O(-Amylase, enthaltend ein o( -Amylasesubstrat und ein System zur Bestimmung eines aus dem Amylasesubstrat durch die OC -Amylase gebildeten Spaltproduktes, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat aus Maltoheptaose besteht. 5. Reagent for the determination of O (-amylase, containing an o (-amylase substrate and a system for determining one of the amylase substrate by the OC -amylase formed cleavage product, characterized in that the substrate consists of maltoheptaose consists. 6. Reagenz nach Anspruch 5, bestehend im wesentlichen aus Dc -Glucosidase, Hexokinase, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, NAD, ATP, Mg, NaCl, Phosphatpuffer und Substrat, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat aus Maltoheptaose besteht. 6. Reagent according to claim 5, consisting essentially of Dc -glucosidase, Hexokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, NAD, ATP, Mg, NaCl, phosphate buffer and substrate, characterized in that the substrate consists of maltoheptaose. 7. Reagenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es aus 5 x 103 bis 3 x 10 U/Liter d( -Glucosidase, 103 bis 5 x 10 U/Liter Hexokinase, 103 bis 5 x 104 U/Liter Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, 0,5 bis 8 mMol/Liter NAD, 0,5 bis 5 mM.ol/Liter ATP, 1 bis 3 mMol/Liter Mg 25 bis 100 mMol/Liter NaCl oder KC1, 25 bis 100 mM.ol/Liter Puffer, pH 6,2 bis 7,8 und 8 bis 100 mMol/Liter Maltoheptaose oder einem Vielfachen oder Bruchteil davon in trockener oder gelöster Form besteht. 7. Reagent according to claim 6, characterized in that it consists of 5 x 103 to 3 x 10 U / liter d (-glucosidase, 103 to 5 x 10 U / liter hexokinase, 103 up to 5 x 104 U / liter glucose-6-phosphate dehydrogenase, 0.5 to 8 mmol / liter NAD, 0.5 to 5 mmol / liter ATP, 1 to 3 mmol / liter Mg 25 to 100 mmol / liter NaCl or KC1, 25 to 100 mmol / liter buffer, pH 6.2 to 7.8 and 8 to 100 mmol / liter maltoheptaose or a multiple or fraction thereof in dry or dissolved form. 8. Reagenz nach Anspruch 5, bestehend im wesentlichen aus Maltosephosphorylase, ß-Phospho-gluco-mutase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Glucose-1,6-diphosphat, NAD, Puffer, Substrat und gegebenenfalls 6-Phospho-gluconat-dehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat aus Maltoheptaose besteht.8. Reagent according to claim 5, consisting essentially of maltose phosphorylase, ß-phospho-gluco-mutase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glucose-1,6-diphosphate, NAD, buffer, substrate and optionally 6-phospho-gluconate dehydrogenase, thereby characterized in that the substrate consists of maltoheptaose. 9. Reagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es aus 0,5 x 103 bis 2 x 104 U/Liter Maltose-phosphorylase, 1 x 102 bis 1 x to4 U/Liter ß-Phospho-gluco-mutase, 2 x 103 bis 3 x 104 U/Liter Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, 0,5 bis 10 mMol/Liter NAD, 0,001 bis t mMol/Liter Glucose-1,6-diphosphat, 0,5 bis 50 rnMol/Liter Puffer, pH 6,0 bis 7,5 5 bis 50 mMol/Liter Maltoheptaose und gegebenenfalls 1 x 102 bis 1 x 104 U/Liter 6-Phospho-gluconat-dehydrogenase besteht.9. Reagent according to claim 8, characterized in that it consists of 0.5 x 103 to 2 x 104 U / liter of maltose phosphorylase, 1 x 102 to 1 x to 4 U / liter of ß-phospho-gluco-mutase, 2 x 103 to 3 x 104 U / liter of glucose-6-phosphate dehydrogenase, 0.5 to 10 mmol / liter NAD, 0.001 to t mmol / liter glucose-1,6-diphosphate, 0.5 to 50 nmol / liter buffer, pH 6.0 to 7.5 5 to 50 mmol / liter maltoheptaose and optionally 1 x 102 bis 1 x 104 U / liter 6-phospho-gluconate dehydrogenase. 10. Reagenz nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es in einem blattförmigen Trägermaterial imprägniert oder inkorporiert vorliegt.10. Reagent according to one of claims 5 to 9, characterized in that that it is present impregnated or incorporated in a sheet-like carrier material.
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