DE2641502B2 - Method for determining the α-amylase content of a sample and means for carrying out the method - Google Patents
Method for determining the α-amylase content of a sample and means for carrying out the methodInfo
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Description
1515th
α-Amylase ist ein Enzym, welches die a[l -<-4]-Bindungen zwischen den Glucoseeinheiten in Stärke und >> den niederen Polymeren und Oligomeren von Glucose hydrolytisch spaltet. Dieses Enzym entsteht im menschlichen Körper vorwiegend im Pankreas und in den Speicheldrüsen. Seine Konzentration in verschiedenen Körperflüssigkeiten stellt einen wertvollen Anhalts- jn punkt für die medizinische Diagnose dar. Der Serum-a-Amylasegehalt ist z. B. bei gesunden Individuen relativ konstant, wogegen er bei pathologischen Zuständen, wie akuter Pankreatitis, ansteigt.α-Amylase is an enzyme that the a [l - <- 4] bonds between the glucose units in starch and >> hydrolytically cleaves the lower polymers and oligomers of glucose. This enzyme is produced in the human Body mainly in the pancreas and salivary glands. Its concentration in different Body fluids are a valuable starting point for medical diagnosis. The Serum a-amylase content is e.g. B. in healthy individuals relatively constant, whereas it increases in pathological conditions such as acute pancreatitis.
Es ist bekannt, daß die Gegenwart von Glucose durch r> verschiedene gekoppelte Reaktionen bestimmt werden kann. Es wurden deshalb verschiedene Verfahren zur Messung der Aktivität der Amylase im Zusammenhang mit Maltose vorgeschlagen, wobei deren Fähigkeit zur Umwandlung von Stärke in Glucose ausgenutzt wurde (vgl. z. B. H. W. S c h i w a r a, Ärztl. Lab, Bd. 17 [1971 ], S. 340 bis 343).It is known that the presence of glucose is caused by r> different coupled reactions can be determined. There have therefore been various methods for Proposed measurement of the activity of amylase related to maltose, determining its ability to Conversion of starch into glucose was exploited (cf. e.g. H. W. S c h i w a r a, Ärztl. Lab, Vol. 17 [1971], p. 340 to 343).
Prüfmethoden, bei denen Stärke verwendet wird, erlauben jedoch keine genaue quantitative Amylasebestimmung. Die Amylase reagiert mit allen Stärkebestandteilen zu verschiedenen Umsetzungsprodukten, wobei die Reaktionskinetik nicht vorhersehbar ist. Dies ist besonders bei Geschwindigkeitsbestimmungen nachteilig, bei denen die Messungen innerhalb kurzer Zeitspannen vorgenommen werden, während welchen die Reaktionskinetik noch weniger vorauszusehen ist. Deshalb ergeben Messungen unter Verwendung von Stärke als Substrat für die a-Amylaseaktivität kein richtiges Maß für die «-Amylasekonzentration in der Versuchsprobe. ·>■>However, test methods using starch do not allow an accurate quantitative determination of amylase. The amylase reacts with all starch components to form various conversion products, the kinetics of the reaction being unpredictable. This is particularly disadvantageous for speed determinations, in which the measurements are made within short periods of time, during which the reaction kinetics are even less predictable. Therefore, measurements using Starch as a substrate for α-amylase activity is not a correct measure of the α-amylase concentration in the Test sample. ·> ■>
Die Hauptanmeldung P 24 42 561.4-52 (DT-OS 24 42 561) beschreibt ein Verfahren und ein Diagnostikum zur Bestimmung des a-Amylasegehalts einer Probe, wobei die Oligosaccharide Maltotetraose oder Maltopentaose als Amylasesubstrat verwendet werden, bo Die Reaktion der «-Amylase mit diesen Substraten ergibt eine bestimmte Glucosemenge, welche mit Hilfe eines beliebigen herkömmlichen Glucosebestimmungssystems gemessen werden kann. Gemäß einer bevorzugten, im Patentanspruch 4 der Hauptanmeldung t>5 beschriebenen Ausführungsform des Verfahrens gibt man zu der Probenlösung auch Maltase. Die a-Amylase spaltet das Substrat zu kleineren Bruchstücken, und dieThe main application P 24 42 561.4-52 (DT-OS 24 42 561) describes a method and a diagnostic for determining the α-amylase content of a sample, the oligosaccharides being maltotetraose or Maltopentaose can be used as amylase substrate, bo The reaction of the amylase with these substrates results in a certain amount of glucose, which with the help can be measured by any conventional glucose determination system. According to a preferred, in claim 4 of the main application t> 5 The described embodiment of the method is also added to the sample solution. The α-amylase splits the substrate into smaller fragments, and the
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50 Maltase vervollständigt den Spaltprozeß unter Bildung von Glucoseeinheiten. Bei Verwendung einer Maltase kommt es jedoch aufgrund der Reaktionsfähigkeit letzterer mit dem Substrat zu Nebenreaktionen, welche einen Blindwert verursachen. Dies bedeutet, daß selbst in Abwesenheit von a-Amylase Glucose freigesetzt und registriert wird. 50 maltase completes the cleavage process with the formation of glucose units. When using a maltase, however, due to the reactivity of the latter with the substrate, side reactions occur which cause a blank value. This means that even in the absence of α-amylase, glucose is released and registered.
Die der vorliegenden Zusatzanmeldung zugrunde liegende Aufgabe ist es, diese bei Zusatz von Maltase auftretende Störung zu beseitigen.The task on which the present additional application is based is to achieve this with the addition of maltase eliminate any malfunction.
Die Erfindung ist in den kennzeichnenden Teilen der Patentansprüche 1 und 2 definiert.The invention is defined in the characterizing parts of claims 1 and 2.
Als Maltase wird vorzugsweise «-Glucosidase verwendet -Glucosidase is preferably used as the maltase
Nachstehend werden die Vorteile erläutert, die sich bei Verwendung von Maltohexaose gegenüber den aus der DT-OS 24 42 561 bekannten Substraten Maltotetraose und Maltopentaose ergeben.The following explains the advantages of using maltohexaose over the from the DT-OS 24 42 561 known substrates result in maltotetraose and maltopentaose.
a-Amylase wirkt als Katalysator, unter dessen Einwirkung Polysaccharide zu kurzkettigen Polysacchariden und schließlich zu «-D-Glucose gespalten werden. Gemäß der DT-OS 24 42 561 werden unter allen Polysacchariden Maltotetraose (G4) und Maltopentaose (G5) als Substrate bei Amylasebestimmungen bevorzugt. Die Gn-Nomenklatur stellt eine zweckmäßige Kurzbezeichnung für η «[l-"-4]-verknüpfte Glucosidaseeinheiten dar. Nunmehr wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß Maltohexaose (Gh) allen anderen Substraten vorzuziehen ist, wenn Maltase in der Reaktionslösung vorhanden ist.α-Amylase acts as a catalyst, under the action of which polysaccharides are cleaved to short-chain polysaccharides and finally to «-D-glucose. According to DT-OS 24 42 561, among all polysaccharides, maltotetraose (G4) and maltopentaose (G5) are preferred as substrates for amylase determinations. The G n nomenclature is an appropriate abbreviation for η «[1 -" - 4] -linked glucosidase units. It has now been found according to the invention that maltohexaose (Gh) is to be preferred to all other substrates if maltase is present in the reaction solution.
Die Verwendung der vorgenannten drei Substrate erfolgt aus kinetischen und stöchiometrischen Gründen. Die Bindungskonstante von Λ-Amylase gegenüber Polysacchariden erhöht sich bei ansteigender Zahl von a[l--4]-Bindungen bis zu etwa Ga, wo ihr Wert abzuflachen beginnt. Unterhalb G4 ist die Bindungskonstante zu niedrig, um brauchbare Reaktionsgeschwindigkeiten zu ergeben. Oberhalb Gb sind die Resultate nicht stöchiometrisch, obwohl die Umsetzung rasch abläuft. Es erfolgen unproduktive Reaktionen, so daß bei der Umsetzung von «-Amylase mit Gn nicht η Glucoseeinheiten gebildet werden. Ferner erhöht sich die maximale Geschwindigkeit der Substratfreisetzung von «-Amylase mit abnehmendem n. Wenn das Bestimmungssystem Glucose enthält und Gn als Substrat verwendet wird, sollten innerhalb einer tragbaren Reaktionszeit η Glucoseeinheiten pro a-Amylasereaktion mit Gn entstehen. Ansonsten muß der Prozentanteil der gesamten freigesetzten Glucoseeinheiten im Vergleich zu den verfügbaren bestimmt werden, was zu Fehlern Anlaß gibt.The three substrates mentioned above are used for kinetic and stoichiometric reasons. The binding constant of Λ-amylase towards polysaccharides increases with an increasing number of a [1-4 ] bonds up to about Ga, where its value begins to flatten out. Below G4 the binding constant is too low to give useful reaction rates. Above Gb, the results are not stoichiometric, although the conversion takes place quickly. Unproductive reactions take place, so that when -amylase is reacted with G n, η glucose units are not formed. Furthermore, the maximum rate of substrate release of α-amylase increases with decreasing n. If the determination system contains glucose and G n is used as substrate, η glucose units should be formed per α-amylase reaction with G n within an acceptable reaction time. Otherwise, the percentage of the total released glucose units in comparison to the available must be determined, which gives rise to errors.
Wenn eine Maltase, wie «-Glucosidase, zugegen ist, erfolgen aufgrund ihrer Reaktionsfähigkeit mit dem Substrat Nebenreaktionen, welche zu einem Blindwert führen. Dies bedeutet, daß selbst in Abwesenheit von a-Amylase ein Farbstoff freigesetzt wird. Da die maximale Geschwindigkeit der Produktfreigabe von der Maltase mit abnehmendem η sinkt, erhöht sich der Blindwert langsamer als η ansteigt. Der Blindwert für Gb ist somit geringer als jener für G4 oder G5. Bei der Wahl zwischen höheren und niedrigeren Oligosacchariden (d. h. G4, G5 oder Cb) als Substrat spielt jedoch noch ein weiterer Faktor eine Rolle. Es ist nicht möglich, absolut reine Substrate zu erzeugen; diese enthalten vielmehr stets Verunreinigungen. Bei der Herstellung irgendeines speziellen Gn entstehen kürzere Glucoseketten. Wenn G5 erzeugt wird, ist ein relativ hoher Anteil (5%) von G4 und ein etwas ger ngerer Anteil von Gj vorhanden.If a maltase, such as -glucosidase, is present, side reactions take place due to its reactivity with the substrate, which lead to a blank value. This means that a dye is released even in the absence of α-amylase. Since the maximum rate of product release by the maltase decreases with decreasing η , the blank value increases more slowly than η increases. The blank value for Gb is therefore lower than that for G4 or G5. When choosing between higher and lower oligosaccharides (ie G 4 , G 5 or C b ) as substrate, however, another factor also plays a role. It is not possible to produce absolutely pure substrates; rather, they always contain impurities. The production of any particular G n results in shorter glucose chains. When G5 is generated, there is a relatively high proportion (5%) of G4 and a slightly smaller proportion of Gj.
Sowohl G4 als auch Gj besitzen eine hohe Reaktionsfähigkeit gegenüber Maltase. Wenn Gb erzeugt wird, entsteht ein relativ hoher Anteil von G<s und ein geringerer Anteil von G4, jedoch vor allem ein geringerer Anteil von Gj. G? ist gegenüber Maltase weniger reaktiv als G4 oder Gj. Daher besitzen die Verunreinigungen von Gs (G5 und G4) eine geringere Reaktionsfähigkeit gegenüber Maltase als die Verunreinigungen von G5. Der Blindwert bzw. die Blindprobengeschwindigkeit ist somit im ersteren Falle niedriger.Both G 4 and Gj have a high reactivity to maltase. When Gb is generated, there is a relatively high proportion of G <s and a smaller proportion of G 4 , but above all a smaller proportion of Gj. G? is less reactive with maltase than G 4 or Gj. Therefore, the impurities of Gs (G5 and G 4 ) have a lower reactivity to maltase than the impurities of G5. The blank value or the blank sample speed is thus lower in the former case.
Die Umsetzung von pankreatischer «-Amylase mit dem Substrat ergibt Maltose, Maltotriose und Glucose. Die aus der Reaktion der pankreatischen «-Amylase mit dem Substrat hervorgehende Glucose kann nach den verschiedensten herkömmlichen Methoden bestimmt werden, wie nachstehend erläutert wird. Speichel-«- Amylase bildet jedoch keine Glucose. Die Reaktion der Speichel-a-Amylase mit dem Substrat führt anscheinend nur zu Maltose. Wenn die Reaktionslösung eine Maltase (vorzugsweise Λ-Glucosidase) enthält, werden die durch Umsetzung des Substrats mit der a-Amylase gebildete Maltose und Maltotriose in Glucose übergeführt, welche nach den verschiedensten herkömmlichen Methoden bestimmt werden kann.The conversion of pancreatic α-amylase with the substrate results in maltose, maltotriose and glucose. The glucose resulting from the reaction of the pancreatic amylase with the substrate can after the various conventional methods can be determined as explained below. Saliva-"- However, amylase does not form glucose. The reaction of the salivary α-amylase with the substrate appears to result only to maltose. If the reaction solution contains a maltase (preferably Λ-glucosidase), be the maltose and maltotriose formed by the reaction of the substrate with the a-amylase are converted into glucose, which can be determined by various conventional methods.
Da a-Amylase im menschlichen Körper ausschließlich aus dem Pankreas und den Speicheldrüsen stammt, kann der Gesamt-a-Amylasegehalt mittels einer Lösung Ί bestimmt werden, die sowohl das Substrat als auch d<e Mdltase enthält Die Bestimmung der pankreatischen «-Amylase kann gemäß der Hauptanmeldung mittels einer Lösung erfolgen, die keine Maltase enthält, während die Speichel-Ä-Amylase berechnet werdenSince α-amylase in the human body comes exclusively from the pancreas and the salivary glands, the total α-amylase content can be determined by means of a solution Ί can be determined which includes both the substrate and d <e Mdltase contains The determination of the pancreatic «-amylase can according to the main application by means of a solution containing no maltase can be carried out while the salivary-amylase is being calculated
1« kann, indem man die Differenz zwischen der Gesamt-«- Amylase und der pankreatischen «-Amylase bildet.1 «by taking the difference between the total -« - Amylase and the pancreatic «amylase.
Die aus der Maltohexaose gebildete Glucose kann bestimmt werden, indem man die Glucosebildungsgeschwindigkeit mißt Bevorzugt wird dabei /3-GIyzerin-τ phosphat als Puffer verwendet. Ebenso können auch alle anderen herkömmlichen Puffer eingesetzt werden, die nicht die Fähigkeit der a-Glucosidase, Maltose in Glucose umzuwandeln, beeinträchtigen.The glucose formed from the maltohexaose can be determined by measuring the rate of glucose formation Measures / 3-Glycerin-τ is preferred phosphate used as a buffer. All other conventional buffers that does not affect the ability of α-glucosidase to convert maltose into glucose.
Ein besonders geeigneter Weg zur Bestimmung der gebildeten Glucose besteht darin, eine gekoppelte Enzymbestimmung für Glucose anzuwenden. Ein geeignetes Pafir gekoppelter Enzymreaktionen wird nachstehend wiedergegeben:A particularly suitable way of determining the glucose formed is to use a coupled To apply enzyme determination for glucose. A suitable Pafir of coupled enzyme reactions is reproduced below:
Hexokinase
Glucose + ATP ► Glucose-6-phosphat + ADP Glucose-6-phosphat + NADHexokinase
Glucose + ATP ► Glucose-6-phosphate + ADP Glucose-6-phosphate + NAD
MG1 MG 1
G-6-PDHG-6-PDH
o-Phosphogluconolacton + NADHo-phosphogluconolactone + NADH
Hierbei bedeutet ATP Adenosintriphosphat, ADP Aclenosindiphosphat, NAD jS-Nicotinamid-adenindinucleotid, NADH die reduzierte Form von /?-Nicotinamidadenindinucleotid und G-6-PDH Glucose-6-phosphatdehydrogenase. Da die reduzierte Form von /?-Nikotinamidadenindinucleotid — im Gegensatz zur oxidierten Form — Licht sehr stark bei 340 ιημ absorbiert, ist die Bildungsgeschwindigkeit von NADH dem Anstieg der Lichtabsorption bei 340 πιμ bei konstanter Temperatur (üblicherweise 15 bis 500C) und konstantem pH-Wert direkt proportional. Dieser Anstieg kann vom Fachmann in einfacher Weise mit Hilfe eines herkömmlichen Spektrophotometers bestimmt werden. Da die Bildungsgeschwindigkeit von NADH der Glucosebildungsgeschwindigkeit proportional ist, kann der Anstieg der Absorption bei 340 ιημ als direktes Maß für die ursprüngliche «-Amylasekonzentration in der Probe herangezogen werden. Es sei festgestellt, daß für den gleichen Zweck auch Licht anderer Wellenlängen (z. B. von 366 ιτιμ) benutzt werden kann.Here, ATP means adenosine triphosphate, ADP aclenosine diphosphate, NAD jS-nicotinamide adenine dinucleotide, NADH the reduced form of /? - nicotinamide adenine dinucleotide and G-6-PDH glucose-6-phosphate dehydrogenase. Since the reduced form of /? - nicotinamide adenine dinucleotide - in contrast to the oxidized form - absorbs light very strongly at 340 ιημ, the rate of formation of NADH is the increase in light absorption at 340 πιμ at constant temperature (usually 15 to 50 0 C) and constant pH -Value directly proportional. This increase can be determined in a simple manner by the person skilled in the art with the aid of a conventional spectrophotometer. Since the rate of formation of NADH is proportional to the rate of glucose formation, the increase in absorption at 340 μm can be used as a direct measure of the original α-amylase concentration in the sample. It should be noted that light of other wavelengths (e.g. from 366 ιτιμ) can also be used for the same purpose.
Ein anderes Paar von gekoppelten Enzymreaktionen, welches zur Bestimmung der Anwesenheit von Glucose herangezogen werden kann, ist folgendes:Another pair of coupled enzyme reactions used to determine the presence of glucose can be used is the following:
Glucose-Glucose + O2 * Gluconsäure + H2O2 Glucose-Glucose + O 2 * Gluconic Acid + H 2 O 2
+ Chrqmogen
(Tarbios)+ Chromogen
(Tarbios)
Oxidase Peroxidase -* oxidiertes Chromogen + H2OOxidase Peroxidase - * oxidized chromogen + H 2 O
Es gibt eine Anzahl anderer derartiger Reaktionen, die ebenfalls zur Bestimmung des Glucosegehalts herangezogen werden können; ebenso kann der Glucosegehalt direkt bestimmt werden.There are a number of other such reactions that are also used to determine glucose levels can be used; the glucose content can also be determined directly.
Obwohl a-Glucosidase als die für die erfindungsgemäße Verwendung bevorzugte Maltase erwähnt wurde, wird festgestellt, daß auch andere Formen von Maltase erfindungsgemäß geeignet sind. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform werden das Substrat und die Maltase der Lösung zuletzt einverleibt. Dies geschieht zu dem Zweck, daß die in der Probe enthaltene Glucose durch die anderen Materialien aufgebraucht wird, bevor das Substrat zugesetzt wird. Dadurch wird erreicht, daß jegliche Glucose, welche nach Zugabe des Substrats zur Lösung bestimmt wird, auf die *' 2senheii von (%-Ämyiase in der Probe zurückzuführen ist.Although α-glucosidase as that for the invention Using preferred maltase has been mentioned, it is found that other forms of maltase can also be used are suitable according to the invention. According to the preferred embodiment, the substrate and the Maltase is incorporated into the solution last. This is done for the purpose that the glucose contained in the sample is consumed by the other materials before the substrate is added. It is thereby achieved that any glucose which after adding the substrate to the Solution is determined on the * '2senheii of (% Amyiasis in the sample is due.
Die Erfindung soll nun anhand des folgendenThe invention will now be based on the following
Beispiels näher erläutert werden; es wird die SpezifitätExample are explained in more detail; it becomes the specificity
S5 von Maltopentaose mit jener von Maltotetraose und Maltohexaose unter Verwendung der nachstehenden Reagentien verglichen:S5 of maltopentaose with that of maltotetraose and Compare maltohexaose using the following reagents:
1. Eine Tablette mit einem Gehalt von /?-Glyzerinphosphat,
NAD, Mg(C2HjO2J2 und Polyäthylenglykol
wird unter Verwendung folgender Anteile hergestellt: 0,25 Millimol ß-Glyzerinphosphat,
7,85 mg NAD, 3,75 mg Mg(C2HjO2J2 und 4,5 mg
Polyäthylenglykol.
b5 2. 3,5 mg ATP.? 1. A tablet with a content of / - glycerolphosphate, NAD, Mg (C 2 HaO 2 J 2 and polyethylene glycol is prepared using the following proportions: 0.25 millimoles beta-glycerolphosphate, 7.85 mg NAD, 3.75 mg mg (C 2 HaO 2 J 2 and 4.5 mg of polyethylene glycol.
b5 2. 3.5 mg ATP.
3. 7 mg Maltotetraose, 8,7 mg Maltopentaose oder 10,4 mg Maltohexaose.3. 7 mg of maltotetraose, 8.7 mg of maltopentaose or 10.4 mg of maltohexaose.
4. 84 IU Hexokinase.4. 84 IU hexokinase.
5. 12 IUGlucose-ö-phosphatdehydrogenase.5. 12 IUGlucose-δ-phosphate dehydrogenase.
6. ^OIUoe-Glucosidase.6. ^ OIUoe-Glucosidase.
Die Tablette wird in 4,9 ml einer Lösung, welche bezüglich CaCl2 2millimolar und bezüglich NaN3 0,3 millimolar ist, gelöst. Die übrigen vorgenannten Reagentien werden der erhaltenen Lösung einverleibt. Es wird eine Blindreaktion in Abwesenheit der Probe vorgenommen. Anschließend werden der Lösung 0,1 ml einer Kontrollprobe von pankreatischer Amylase (auf Serumgrundlage) zugesetzt. Man bestimmt die Geschwindigkeit (in Millivolt/min) bei 340 nm nach 4minütiger Inkubation in einem Gilford-2400-Spektrophotometer bei 37° C. Es werden fo'gcnde Resultate erzielt:The tablet is dissolved in 4.9 ml of a solution which is 2 millimolar with respect to CaCl 2 and 0.3 millimolar with respect to NaN 3. The other aforementioned reagents are incorporated into the resulting solution. A blank reaction is carried out in the absence of the sample. Then 0.1 ml of a control sample of pancreatic amylase (based on serum) is added to the solution. The speed is determined (in millivolts / min) at 340 nm after incubation for 4 minutes in a Gilford 2400 spectrophotometer at 37 ° C. The following results are obtained:
Claims (1)
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| DE2641502A1 (en) | 1978-03-16 |
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