DE2733923C3

DE2733923C3 - Process for the production of human albumin

Info

Publication number: DE2733923C3
Application number: DE2733923A
Authority: DE
Inventors: Yorihiko Amagasaki Murata; Eizo Hirakata Tsutsui
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1977-04-12
Filing date: 1977-07-27
Publication date: 1980-02-07
Also published as: YU186077A; FR2387240A1; JPS53127808A; YU40170B; FR2387240B1; ATA549977A; AT365074B; HU174149B; SU1127525A3; JPS572689B2; DE2733923B2; DE2733923A1; BG31214A3

Description

Der Transfusion von Humanalbumin, insbesondere von thermostabilen, hitzebehandelnten Humanplasmaproteinlösungen mit einem Gehalt an Humanalbumin kommt in jüngster Zeit eine ständig steigende Bedeutung bei der Behandlung von akuter Hämorrhagie, Schock/uständen, Verbrennungen, Protein-Fehlernährung, Hypoproteinämie und dergl. zu.The transfusion of human albumin, especially thermostable, heat-treated human plasma protein solutions with a content of human albumin has recently become increasingly important in the treatment of acute hemorrhage, Shock conditions, burns, protein malnutrition, hypoproteinemia and the like.

Es wurden eine Reihe von Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem Albumin für Infusionszwecke aus Plasma (oder Serum) von menschlichem Blut vorgeschlagen. Keines dieser Verfahren hat sich jedoch als wirtschaftlich bei der Gewinnung von medizinisch sicher anzuwendendem Albumin erwiesen, wenn das Ausgangsmaterial große Mengen an freiem Hämoglobin bzw. große Mengen an Zellwänden von roten Blutkörperchen mit einem Gehalt an bei der Hämolyse freigesetztem Glycoproiein enthält. Mit Hilfe der bekannten Verfahren gelingt es entweder überhaupt nicht oder nur unter großen Kosten, die Blutgruppensubstanzen, die unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen können, von den Zellwänden der roten Blutkörperchen /u entfernen. Plazenta ist ein wertvolles Ausgangsmaterial zur Herstellung von fraktionierten Plasmapräparaten, da sie große Mengen an Blut enthält und leicht zugänglich ist. Jedoch enthält Plazenta aufgrund der Verarbeitung von gefrorenem Material 50 Prozent oder mehr freies Hämoglobin, dessen Entfernung ein wichtiges Problem bei der Gewinnung von Albumin aus Plazenta darstellt.A number of methods have been used to obtain purified albumin for infusion purposes Plasma (or serum) from human blood is suggested. However, none of these procedures has proven to be proven to be economical in the production of medically safe albumin, if that Starting material large amounts of free hemoglobin or large amounts of red cell walls Contains blood cells containing glycoproinin released during hemolysis. With the help of known methods either do not succeed at all or only at great cost, the blood group substances, which can cause undesirable side effects from the red blood cell walls / u remove. Placenta is a valuable starting material for the production of fractionated Plasma because it contains large amounts of blood and is easily accessible. However, it contains placenta due to the processing of frozen material, 50 percent or more free hemoglobin, its removal poses an important problem in the recovery of albumin from placenta.

Die bisherigen Verfahren zur Reinigung von Albumin für Infusions/wecke aus menschlichem Blut sind nachstehend zusammengestellt:The previous methods for purifying albumin for infusion / wake from human blood are compiled below:

1. Sechstes Verfahren gemäß Cohn unter Fraktionier rung mit Äthäfiol bei niedrigen Temperaturen sowie eine Modifikation dieses Verfahrens: vgl. JP-PS 2 65 704 und JP/AS 5 297/60.1. Sixth procedure according to Cohn under fractionation tion with Äthäfiol at low temperatures and a modification of this process: cf. JP-PS 2 65 704 and JP / AS 5 297/60.

2. Verfahren, bei dem die lotienstärke von Plasma durch ein lonenaustauschcrharz verringert wird,2. Procedure in which the lot strength of plasma is reduced by an ion exchange resin,

um instabiles Globulin zu fällen und anschließend zu entfernen; vgl. Vox Sanguinis, Bd. 3(]956), S,84. 3_r Zugabe einer Fettsäure mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen zu einer fraktionierten Lösung von Blutbestandteilen und Erwärmen der Lösung auf etwa 5b"C bei einem pH-Wert von etwa 5,2, um unstabiles Globulin zu fällen und anschließend zu entfernen; vgl. JP-AS 4 22 934 und JP-AS 24 895/63.to precipitate and then remove unstable globulin; see Vox Sanguinis, Vol. 3 (] 956), p. 84. 3 _r addition of a fatty acid with 12 to 18 carbon atoms to a fractionated solution of blood components and heating the solution to about 5 ° C at a pH of about 5.2 in order to precipitate and then remove unstable globulin; see JP- AS 4 22 934 and JP-AS 24 895/63.

4. Zugabe von Zinkionen beim Fraktionierungsverfahren unter Fällung mit Äthanol bei niedrigen Temperaturen; vgl. Vox Sanguinis, Bd. 5 (1960), S. 272.4. Addition of zinc ions in the fractionation process with precipitation with ethanol at low levels Temperatures; See Vox Sanguinis, Vol. 5 (1960), p. 272.

5. Stufenweise Abtrennung von Hämoglobin durch kombinierte Fraktionierung mit Ammoniumsulfat und mit Äthanol bei niedrigen Temperaturen; vgl. j P-AS 2 869/72.5. Gradual separation of hemoglobin by combined fractionation with ammonium sulfate and with ethanol at low temperatures; see j P-AS 2 869/72.

6. Zusatz von Buttersäure zu einer fraktionierten Lösuhg von Blutbestandteilen und Erwärmen der Lösung auf etwa 60°C bei einem pH-Wert von etwa 5,0, um Hämoglobin zusammen mit unstabilem Globulin auszufällen und anschließend zu entfernen; vgl. JP-PS 5 34 921 und JP-AS 16 041/68.6. Adding butyric acid to a fractionated solution of blood components and heating the Solution to about 60 ° C at a pH of about 5.0 to hemoglobin along with unstable Precipitate and then remove globulin; see JP-PS 5 34 921 and JP-AS 16 041/68.

7. Zusatz von Mandelsäure zu einer fraktionierten Lösung von Blutbestandteilen und Erwärmen der Lösung auf etwa 60⁰C bei einem pH-Wert von etwa 4,9, um unstabiles Globulin zusammen mit Hämoglobin auszufällen und anschließend zu entfernen; vgl. J P-OS 66 810/74.7. Addition of mandelic acid to a fractionated solution of blood constituents and heating the solution to about 60 ^° C. at a pH of about 4.9 in order to precipitate and then remove unstable globulin together with hemoglobin; see J P-OS 66 810/74.

8. Zusatz von Trichloressigsäure bei einer Äthanolkonzentration von mindestens 55 Prozent, bezogen auf die gesamte Lösungsmenge, bei einer Temperatur von -5 bis -10⁰C, um die Blutgruppensubstanz zu entfernen; vgl. JP-OS 85 218/74 und 85 219/74.8. Addition of trichloroacetic acid at an ethanol concentration of at least 55 percent, based on the total amount of solution, at a temperature of -5 to -10 ⁰ C, in order to remove the blood group substance; see JP-OS 85 218/74 and 85 219/74.

Die drei erstgenannten Verfahren sind nicht auf Blut anwendbar, das eine Hämolyse erfahren hat und große Mengen an freigesetztem Hämoglobin und Blutgruppensubstanz wie Plazentablut, enthält, da diese Verfahren keine spezifische Wirkung auf die Fällung von Hämoglobin und die Blutgruppensubstanz aufweisen. Somit ergibt sich eine unzureichende Ablrennung des Albumins vom Hämoglobin und der Blutgruppensubstanz. The first three methods are not applicable to blood that has undergone hemolysis and is large Amounts of released hemoglobin and blood group substance such as placental blood, contains, as this procedure have no specific effect on the precipitation of hemoglobin and blood group substance. This results in insufficient separation of the albumin from the hemoglobin and the blood group substance.

Die Verfahren 4. und 5. sind nicht nur unwirtschaftlich, da eine Reihe von komplizierten Verfahrensschritten und somit ein kompliziertes Fraktionierungsverfahren erforderlich ist. sondern sie sind auch schwierig durchzuführen, da leicht entzündlicher Alkohol verwendet wird und da eine Kühlung auf niedrige Temperatu ren erforderlich ist.Processes 4 and 5 are not only uneconomical, because a series of complicated process steps and thus a complicated fractionation process is required. but they are also difficult to perform because of the highly flammable alcohol used and since cooling to low temperatures is required.

Bei den Verfahren 6. und 7. wird die gesamte Behandlung bei normalen Temperaturen durchgeführt. Diese Verfahren eignen sich gut zur Entfernung von π Hämoglobin aus menschlichem Plasma, wie Plazentaextrakt mit einem großen Gehalt an Hämoglobin. Außerdem sind diese Verfahren wirtschaftlich durchzuführen, lecloch gelingt es mit diesen Verfahren nicht, die Blutgruppensubsianzen zu entfernen.In procedures 6 and 7, the entire treatment is carried out at normal temperatures. These methods are well suited for removing π hemoglobin from human plasma, such as placenta extract, which is high in hemoglobin. In addition, these processes can be carried out economically; Lecloch does not succeed in removing the blood group subsidences with these processes.

Das Verfahren Nr. 8 bewirkt eine Entfernung von Hämoglobin Und Blutgruppensubstanzen, es bringt jedoch die Gefahr einer Protdndcnaturierung durch die Wirkung der Trichloressigsäure, einem Deriaturierurigs^ mittel für Proteine (Fällmittel), mit sich. Eine Schwierigkeit bei diesem Verfahren besteht auch in der Sicherheil der Verfahrensdurchführung, da hochkonzentrierter leicht entzündlicher Alkohol verwendet wird, Außerdem ist dieses Verfahren unwirtschaftlich, da eineProcedure # 8 causes removal of the hemoglobin and blood group substances it brings however, there is a risk of protdnaturation through the Effect of trichloroacetic acid, a deriaturierurigs ^ means for proteins (precipitants), with itself. A difficulty with this method is also security the implementation of the process, since highly concentrated highly flammable alcohol is used, In addition this process is uneconomical because a

Kühlung auf niedrige Temperaturen von -5 bis -IQ⁰C erforderlich ist.Cooling to low temperatures from -5 to -IQ ⁰ C is required.

Aus der DE-OS 24 15 079 ist ein Verfahren zum Isolieren von hitzestabilen Eiweißfraktionen, insbesondere Albumin aus Blut oder Blutprodukten bekannt, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:DE-OS 24 15 079 discloses a method for isolating heat-stable protein fractions, in particular Albumin known from blood or blood products, which is characterized by the following steps:

a) Abtrennen des Plasmas von den festen Bestandteilen des Blutes sowie Gewinnung der gerinnungsfördernden gelösten Bestandteile aus dem Plasma;a) Separation of the plasma from the solid components of the blood and extraction of those that promote coagulation dissolved components from the plasma;

b) Erhitzen des Plasmas in Anwesenheit von Alkohol und stabilisierenden Substanzen, bevorzugt Natriumcaprylat, auf Temperaturen zwischen etwa 60 bis 75° C, Ausfällen und Abtrennen der Globuline undb) heating the plasma in the presence of alcohol and stabilizing substances, preferably sodium caprylate, to temperatures between about 60 to 75 ° C, precipitation and separation of the globulins and

c) Anreichern des Albumins, vorzugsweise durch Ausfällen mit etwa 20 bis 30prozentigem Polyäthylenglykol 4000 bis 6000. Dieses Produkt enthält noch unerwünschte Blutgruppensubstanzen uwd Substanzen λ .it blutdrucksenkender und pyrogener WirV.iner .... ..~..._o. c) Enrichment of the albumin, preferably by precipitation with about 20 to 30 percent polyethylene glycol 4000 to 6000. This product still contains undesirable blood group substances and substances with antihypertensive and pyrogenic WirV.iner .... .. ~ ... _o .

Aufgabe der Erfindung ist es, Humanalbumin zur Verfügung zu stellen, das praktisch frei von Blutgruppensubstanzen und Substanzen mit blutdrucksenkender pyrogener Wirkung ist und eine sichere klinische Anwendung gestattet. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.The object of the invention is to provide human albumin which is practically free from blood group substances and substances with antihypertensive pyrogenic effects and safe clinical Application permitted. This object is achieved by the invention.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiertThe subject matter of the invention is defined in the claims

Die wäßrige Losung von Albumin menschlichen Ursprungs, die als Ausgangsmaterial im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, kann entweder eine hochgereinigte Lösung oder eine in einem frühen Reinigungszustand befindliche Lösur._o' sein. Derartige Albuminlösungen erhält man durch Entfernen von Globulin. Hämoglobin und alkalischer Phosphatase aus Plasma oder Serum des Menschen. Der Albumingehalt dieser Lösungen beträgt mindestens 50 Prozent und vorzugsweise 80 Prozent des enthaltenen Gesamtproteins. Für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich beliebige wäßrige Lösungen, die eine partielle Hämolyse erlitten haben und Albumin als Hauptbestandteil sowie Blutgruppensubstanzen sowie blutdrucksenkend wirkende und pyrogene Substanzen enthalten. Diese Lösungen können aus Blut, Plazentaextrakt, retroplazentalem Blut oder Plasma aus menschlichem Blut erhalten worden sein. Ein bevorzugtes Verfahren zur Vorbehandlung besteht darin, daß man zur Entfernung von Hämoglobin und alkalischer Phosphatase eine wäßrige Lösung von Plasmaprotein, die von y-GIobulin befreit worden ist. in Gegenwart von 2 bis 6 Prozent (Gewicht/Volumen) Buttersäure oder Mandelsäure und 0.5 bis l,5millimolar Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) auf 50 bis 65°C erwärmt. Vorzugsweise wird das Dinatriumsal/ von EDTA bei einem pH-Wert von 4,5 bis 5,5 verwendet. Der nach dem Entfernen des gebildeten Niederschlags erhaltene Überstand kann dann im erfindungsgemäßen Verfahren eingeset/t werdenThe aqueous solution of albumin of human origin which is used as starting material in the process according to the invention can either be a highly purified solution or a solution which is in an early stage of purification. _o 'be. Such albumin solutions are obtained by removing globulin. Hemoglobin and alkaline phosphatase from human plasma or serum. The albumin content of these solutions is at least 50 percent and preferably 80 percent of the total protein contained. Any aqueous solutions which have suffered partial hemolysis and which contain albumin as the main component and blood group substances as well as blood pressure-lowering and pyrogenic substances are suitable for the process according to the invention. These solutions can be obtained from blood, placenta extract, retroplacental blood, or plasma from human blood. A preferred method of pretreatment is that to remove hemoglobin and alkaline phosphatase, an aqueous solution of plasma protein from which γ-globulin has been removed. in the presence of 2 to 6 percent (weight / volume) butyric acid or mandelic acid and 0.5 to 1.5 millimolar ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) heated to 50 to 65 ° C. Preferably the disodium salt / EDTA is used at a pH of 4.5 to 5.5. The supernatant obtained after removing the precipitate formed can then be used in the method according to the invention

Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Pölyäthyleriglykol weist ein durchschnittliähes MolektH iargewicht Von 2000 bis 10 000 auf. Besonders wirksam erweist sich Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 4000 bis 8000. Beim Zusatz Von Polyäthylenglykol zu einer wäßrigen, als Ausgangsmaterial verwendeten Albumirilösurig bildet sich ein Nieder* schlag. Die wirksame Endkonzentration von Polyäthylenglykol in der wäßrigen Lösung hängt zwar von der Natur der als Ausgangsmaterial verwendeten wäßrigen Lösung ab, liegt aber im allgemeinen bei 10 bis 30 Prozent (Gewicht/Volumen). Es können aber auch wäßrige Lösungen mit einer Konzentration von etwa 50 Prozent (Gewicht/Volumen) verwendet werden, wenn eine überschüssige Behandlungskapazität des Reaktors zur Verfügung steht. Bevorzugt wird eine Konzentration von 13 bis 20 Prozent (Gewicht/Volumen; beiThe polyethyl glycol used in the process according to the invention has an average molecular weight Weight from 2000 to 10,000. Polyethylene glycol with a molecular weight proves to be particularly effective from 4000 to 8000. When adding polyethylene glycol to an aqueous one, as a starting material A precipitate forms. The effective final concentration of polyethylene glycol in the aqueous solution depends on the nature of the aqueous used as starting material Solution, but is generally 10 to 30 percent (weight / volume). But it can also Aqueous solutions at a concentration of about 50 percent (weight / volume) can be used, if an excess treatment capacity of the reactor is available. Concentration is preferred from 13 to 20 percent (weight / volume; at

ίο einem pH-Bereich von 6,6 bis 8,0 und eine Konzentration von 15 bis 30 Prozent (Gewicht/Volumen) bei einem pH-Bereich von 8^0 bis 9,6. Vorzugsweise wird die Proteinkonzentration in der Lösung der Reaktionsteilnehmer auf 5 bis 40 g/Liter eingestellt Die Konzentraticn an anorganischen Salzen beträgt vorzugsweise höchstens 50 g/Liter, ausgedrückt als Natriumchlorid. Die Reaktionstemperatur kann innerhalb eines weiten Bereichs von 2 bis 30⁰C gewählt werden, wobei keine übermäßig intensive Kühlung erforderlich ist. Als allgemeine Vorsichtsmaßnahme beim Arbeiten mit Proteinlösungen wird die Umsetzung jedoch vorzugsweise innerhalb des vorgenannten Bereichs bei möglichst geringen Temperaturen durchgeführt.ίο a pH range of 6.6 to 8.0 and a concentration of 15 to 30 percent (weight / volume) with a pH range of 8 ^ 0 to 9.6. The protein concentration in the solution of the reactants is preferably adjusted to 5 to 40 g / liter. The concentration of inorganic salts is preferably at most 50 g / liter, expressed as sodium chloride. The reaction temperature can be chosen within a wide range from 2 to 30 ^° C., with no excessively intensive cooling being necessary. As a general precautionary measure when working with protein solutions, however, the reaction is preferably carried out within the aforementioned range at the lowest possible temperatures.

Durch die vorgenannte Behandlung wird Albumin kaum ausgefällt, während die Blutgruppensubstanzen mit einem Gehalt an Glycoprotein ausgefällt werden. Wenn verunreinigende Proteine, wie Hämoglobin, hypotensiv wirkende Substanzen mit einem Gehalt an niedermolekularen Peptiden mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 10 000 und dergl. vorhanden sind, werden diese zusammen mit den Blutgruppensubstanzen ausgefällt und aus der wäßrigen Albuminlösung entfernt.With the aforementioned treatment, albumin is hardly precipitated while the blood group substances with a content of glycoprotein are precipitated. When contaminating proteins, such as hemoglobin, hypotensive substances with a content of low molecular weight peptides with a molecular weight from 1,000 to 10,000 and the like exist, they become substances along with the blood group substances precipitated and removed from the aqueous albumin solution.

Die Bedingungen für das vorstehend erwähnte Verfahren zur Entfernung der Blutgruppensubstanzen lassen sich nach Durchführung von Vergleichsversuchen über die Beziehungen zwischen Molekulargewicht und Endkonzentration an Polyäthylenglykol und dem pH-Wert des Reaktionsgemisches 'eicht ermitteln.The conditions for the above-mentioned method for removing the blood group substances can be after carrying out comparative experiments on the relationships between molecular weight and Determine the final concentration of polyethylene glycol and the pH of the reaction mixture.

Beispielsweise wurden bei der Behandlung einer als Ausgangsmaterial verwendeten wäßrigen Albuminlösung mit einem Gehalt an jeweils 1 Prozent (Gewicht/Volumen) Proteinen und Salzen (ausgedrückt als Natriumchlorid) mit Polyäthylenglykol vom durchschnittlichen Molekulargewicht 4000 oder 8000 die Mengen an zugesetztem Polyäthylenglvkol und der pH-Wert des Reaktionsgemisches variier!. Die Ergebnisse bezüglich der Entfernung von Blutgruppensubstanzen sind in der Tabelle zusammengestellt.For example, in the treatment of an aqueous solution of albumin used as a starting material each containing 1 percent (weight / volume) proteins and salts (expressed as sodium chloride) with polyethylene glycol with an average molecular weight of 4000 or 8000 the Amounts of polyethylene glycol added and the pH of the reaction mixture vary !. The results regarding the removal of blood group substances are summarized in the table.

Die Bestimmung der Blutgruppensubstan/en wird unter Verwendung eines blutgruppenspe/ifischen AntiSerums gemäß dem Hämagglutinations-Hemmtest nach EA. Kabat und M. M. Mexer. Experimental Immunochemistry. Bd. 2 (1961). S 97 bis 1 52, b/w nach einem derartigen, leicht modifizierten Verfahren durch geführt. Die Ergehnisse sind als Minimalmengc (maximales Verdünnungsverhältnis) von Antiserum angegeben, die eine Agglutination von I rythro/yten hervorruft, wobei das Antiserum bei dieser Kon/entrüThe determination of the blood group substance / s will using a blood group specific anti-serum according to the hemagglutination inhibition test EA. Kabat and M. M. Mexer. Experimental Immunochemistry. Vol. 2 (1961). S 97 to 1 52, b / w after such a slightly modified procedure carried out. The results are as a minimum (maximum dilution ratio) of antiserum indicated that agglutinate I rythro / ytes elicits, the antiserum in this con / entr

(,o tion in der Lage ist. die in der Probe vorhandenen Blutgrüpperisubstanzen vollständig zu neutralisieren lind noch eine Agglutination der Erythrozyten hervor^ zurufen,(, o tion is able. those present in the sample To completely neutralize blood group substances and there is still an agglutination of the erythrocytes to call out

Die Angabe »Prozent (Gewicht/Volumen)« bezieht sich durchwegs auf die Konzentration eines gelösten Bestandteils in einer Lösung, Wobei die gelösten Bestandteile in Gewichtseinheiten und die Lösung in Voltimeneinheiten angegeben wird.The specification "percent (weight / volume)" always refers to the concentration of a dissolved one Constituent in a solution, where the dissolved constituents in weight units and the solution in Voltimen units is specified.

Tabel

Durchschnittliches Konzentration des
Molekulargewicht PqlySthylenglykols
des PolySthyknglykols in der Lösung der
Reaktionsteilnehmer,
%(Gew./VoI.)Average concentration of the
Molecular Weight Polyethylene Glycol
of PolySthyknglykols in the solution of
Respondents,
% (W / v) pH-Wert der
LösungpH of the
solution Verdünnungsver
hältnis von Blut-
gruppen-Antiserum,
bei dem eine wirk
same Entfernung der
Blutgruppensubstan
zen erfolgtDiluent
ratio of blood
group antiserum,
with the one working
same distance of
Blood group substance
zen takes place 4000 104000 10 55 X 64X 64 77th X 128X 128 99 X 64X 64 1010 X 64X 64 2020th 55 X 64X 64 77th x 256x 256 99 X 256X 256 1010 X 128X 128 3030th 55 X 64X 64 77th X 256X 256 99 X 256X 256 1010 X 128X 128 3535 55 X 16X 16 77th X 64X 64 99 X 124X 124 1010 X 128X 128 8000 108000 10 55 X 64X 64 77th X 128X 128 99 x 64x 64 1010 X 64X 64 2020th 55 X 128X 128 77th x 256x 256 99 X 256X 256 1010 X 256X 256 3030th 55 x 32x 32 77th x 256x 256 99 X 256X 256 1010 x 128x 128 3535 55 X 32X 32 77th x 128x 128 99 X 128X 128 IÜIÜ X 128X 128 Unbehandeltes AusgangsmaterialUntreated raw material X 4X 4 Normale KochsalzlösungNormal saline solution x 256x 256

Nach der Entfernung der verunreinigenden Proteine in Form eines Niederschlags wird der Überstand zur Gewinnung des Albumins fraktioniert Da fast sämtliche verunreinigenden Proteine entfernt worden sind, ist zur Gewinnung des Albumins keine spezielle Technik erforderlich, es wird vielmehr eine Fällung des Gesamlproteins gemäß der bekannten Fraktionierung mit AmmoniümsüliiU oder mit Alkohol vorgenommen. Ein bevorzugtes Verfahren besteht in der Frakfionic-After removing the contaminating proteins in the form of a precipitate, the supernatant becomes Fractional extraction of albumin Since almost all contaminating proteins have been removed, it is necessary to Extraction of the albumin does not require any special technology, it is rather a precipitation of the Total protein carried out according to the known fractionation with AmmoniümsüliiU or with alcohol. A preferred method is the fracfionic

rung mit Polyäthylenglykol.tion with polyethylene glycol.

Eine wirksame Gewinnung der AlbuminJraktion läßt sich bei Verwendung von Polyäthylenglykol Unter sauren Bedingungen, vorzugsweise beim pH-Wert 4,5 bis 5,6 und bei einer Endkonzentration des Polyäthy-Effective recovery of the albumin fraction can be achieved when using polyethylene glycol acidic conditions, preferably at pH 4.5 to 5.6 and at a final concentration of the polyethylene

lenglykols von 20 bis 30 Prozent (Gewicht/Volumen) erreichen. Auf diese Weise läßt sich das Albumin aus dem Überstand leicht gewinnen, indem man gegebenenfalls eine weitere Menge an Polyäthylenglykol zusetztlenglycols of 20 to 30 percent (weight / volume). In this way the albumin can be left out The supernatant can easily be obtained by optionally adding a further amount of polyethylene glycol

und den pH-Wert des Überstands innerhalb des vorgenannten Bereichs hall.and the pH of the supernatant within the aforementioned area hall.

Plasmaprotein, das nicht das Risiko einer Heplatitisvifusirifektion mit sich bringt, läßt sich herstellen, indem man zusätzlich die auf diese Weise erhaltene Albuminfraktion einer üblichen Hilzebehandlung durch lOstün» dige Behandlung bei 60°C in Gegenwart eines entsprechenden Stabilisators unterwirft.Plasma protein that does not reduce the risk of heplatitis vifus infection entails, can be prepared by additionally using the albumin fraction obtained in this way a customary handle treatment by treatment for 10 hours at 60 ° C. in the presence of a subject to appropriate stabilizer.

Für medizinische Zwecke ist es wünschenswert, das am Schluß in Form eines Niederschlags erhaltene Albumin zur Entfernung von Salzen der Dialyse zu unterwerfen und anschließend durch ein Bakterienfilter zu filtrieren. Eine Verringerung des Gehalts an Polyäthylenglyko! kann erreicht werden, indem man den Niederschlag mit destilliertem Wasser mit saurem pH Wert und einem geringen Gehalt an Polyäthylenglykol wäscht. Auf diese Weise erhält man Albuminprotein mit einem geringen Oehalt an KOIyälhylenglykol. Gegebenenfalls kann das Albuminprotein zusätzlich der Elektrodialyse unterworfen werden. Anschließend wird das Pmdukt auf geeignete Weise dehydratisicrt. um ein trockenes Standardpräparat für Vergleichszwecke zu erhalten.For medical purposes it is desirable to have what is finally obtained in the form of a precipitate Albumin is subjected to dialysis to remove salts and then passed through a bacterial filter to filter. A reduction in the content of polyethylene glycol! can be achieved by the precipitate with distilled water with acidic pH and a low content of polyethylene glycol washes. In this way, albumin protein is obtained with a low content of KOIyälhyleneglykol. If necessary, the albumin protein can also be subjected to electrodialysis. Then will dehydrate the product in a suitable manner. around a to obtain a dry standard preparation for comparison purposes.

Überraschenderweise ergibt sich durch das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur eine Entfernung der Blutgruppensubstanzen, sondern auch eine Verringerung an blutdrucksenkend wirkenden und pyrogenen Substanzen, die gelegentlich im Ausgangsmaterial enthalten sein können. Diese Verunreinigungen sind im Niederschlag enthalten, der sich bei Zusatz von Polyäthylenglykol bildet, und werden mit diesem entfernt.Surprisingly, the method according to the invention not only results in a removal of the Blood group substances, but also a decrease in antihypertensive and pyrogenic Substances that may occasionally be contained in the starting material. These impurities are in the Contain precipitate, which forms with the addition of polyethylene glycol, and are with this removed.

Bei elektrophoretischer Analyse (vgl. T. K a w a i und N. Aoki, »Fractionation of serum proteins by cellulose acetate elektrophoresis«. Yagi Publishing Co, Tokyo, 1972, S. 35) weist das Standardalbuminpräparat eine Proteinzusammensetzung von 95 bis 98 Prozent Albumin und 2 bis 5 Prozent α-Globulin und ^-Globulin auf. Bei der Analyse in der Ultrazentrifuge (vgl. T. Isemura u. Mitarb, J. Biochem, Bd. 44 (1957), S.443).In the case of electrophoretic analysis (cf. T. K a w a i and N. Aoki, "Fractionation of serum proteins by cellulose acetate electrophoresis «. Yagi Publishing Co, Tokyo, 1972, p. 35) the standard albumin preparation has a protein composition of 95 to 98 percent Albumin and 2 to 5 percent α-globulin and γ-globulin. When analyzing in the ultracentrifuge (see T. Isemura et al., J. Biochem, Vol. 44 (1957), p.443).

DmA,,Vt »mo« „;.,,;..„., D_n DmA ,, Vt »mo« ";. ,,; .."., D _n

reines Protein hindeutet Der Gehalt an Blutgruppensubstanzen wird gemäß dem Hämagglutinations-Hemmtest unter Verwendung eines blutgruppenspezifischen Antiserums (a.a.O.) bestimmt. Es wurde festgestellt, daß die Blutgruppensubstanzen bis zu einer Konzentration, die der von normaler Kochsalzlösung vergleichbar ist, entfernt worden sind; vgl. Tabelle L Der Gehalt an blutdrucksenkend wirkenden Substanzen wird bestimmt, -!,-/dem man eine Probe des Präparats einem erwachsenen Hund verabfolgt und die prozentuale Senkung des Blutdrucks im Vergleich zurr, arteriellen Druck vor der Verabfolgung mißt. Die prozentuale Blutdruckerniedrigung beträgt höchstens 10 Prozent, was anzeigt, daß die Probe in ausreichendem Maße frei von blutdrucksenkend wirkenden Substanzen ist und somit für medizinische Zwecke geeignet ist.pure protein indicates the content of blood group substances is determined according to the hemagglutination inhibition test using a blood group-specific antiserum (loc. cit.). The blood group substances were found to have been removed to a concentration comparable to that of normal saline; See Table L The content of blood pressure-lowering substances is determined -!, - / to which a sample of the preparation is administered to an adult dog and the percentage lowering of blood pressure in comparison to the arterial pressure is measured before administration. The percentage lowering of blood pressure is at most 10 percent, which indicates that the sample is sufficiently free from substances that lower blood pressure and is therefore suitable for medical purposes.

Wie vorstehend erläutert, lassen sich erfindungsgemäß Blutgruppensubstanzen vollständig und auf wirtschaftliche Weise gleichzeitig mit blutdrucksenkend wirkenden Substanzen entfernen. Erfindungsgemäß erhält man somit ein Plasmaprotein mit Albumin als Hauptbestandteil, wobei Nebenwirkungen aufgrund der Anwesenheit der vorstehend erwähnten Verunreinigungen nicht zu befürchten sind. Bei einer kombinierten Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zusammen mit herkömmlichen Verfahren zur Gewinnung von Albumin ergibt sich ein Weg zur Gewinnung von Albuminpräparaten für Infusionszwccke, die sich bei der klinischen Anwendung als sehr wertvoll erweisen,
Die Beispiele erläutern die Erfindung.As explained above, according to the invention, blood group substances can be removed completely and economically at the same time as substances having an antihypertensive effect. According to the invention, a plasma protein with albumin as the main component is thus obtained, and side effects due to the presence of the above-mentioned impurities are not to be feared. A combined application of the method according to the invention together with conventional methods for obtaining albumin results in a way of obtaining albumin preparations for infusion purposes, which have proven to be very valuable in clinical use,
The examples illustrate the invention.

example 1

Aüsgesloßene Plazenta wird sofort in sauberen Künstsioffsäcken verschlossen und bei — 20⁰C in der Gefriertruhe gelagert. Derartige von Krankenhäusern erhaltene Plazenlasäcke mit einem Gehalt an 1000 gefrorenen Plazenten werden von außen mit pyrogenfreiem, destilliertem Wasser gewaschen und mittels einer Eismühle grob zerkleinert. Dieses Produkt wird sodann mit Hilfe eines Fleischwolfs weiter zerkleinert.Aüsgesloßene placenta is immediately sealed in clean Künstsioffsäcken and stored at - 20 ⁰ C in the freezer. Such placenta glass bags obtained from hospitals with a content of 1000 frozen placentas are washed from the outside with pyrogen-free, distilled water and coarsely comminuted using an ice mill. This product is then further chopped up with the help of a meat grinder.

Etwa 600 kg dieses fein zerteilten Produkts werden mit 700 Liter lprozentigcr Kochsalzlösung versetzt. Das Gemisch wird zur Entfernung des Blutanteils 45 Minuten bei 12" C bewegt. Der Extrakt wird zur Entfernung der Plazentarückstände und zur Abtrennung der überstehenden Lösung (Plazentacxtrakt) zentrifugiert. Der Plazentaextrakt enthält 3.5 Prozent Gesamtprotein, davon 2,3 Prozent Hämoglobin und 1.2 Prozent andere Plasmaproteinc.About 600 kg of this finely divided product are mixed with 700 liters of 1 percent saline solution. The mixture is agitated for 45 minutes at 12 ° C to remove the blood. The extract is used to Removal of placenta residues and separation of the supernatant solution (placenta extract) centrifuged. The placenta extract contains 3.5 percent total protein, of which 2.3 percent is hemoglobin and 1.2 percent Percent other plasma proteins c.

I L.iter dieses Extrakts werden mit 285 g Ammoniumsaulfat versetzt. Der erhaltene Niederschlag mit einem Gehalt an y-Globulin wird entfernt. Im Überstand verbleiben Hämoglobin, der Großteil der Blutgruppensubstanzen und Albumin. Da die Proteinkonzentration im Überstand gering ist, wird das gesamte Protein nach Zugabe von 200 g/Liter Ammomumsulfat und Einstellen des pH-Werts auf 6 bis 7 in Form eines Niederschlags gewonnen. Der Niederschlag wird soweit wie möglich entwässert und in pyrogenfreiem. destilliertem Wasser in einem Verhältnis von 4 bis 7 Liter/kg Niederschlag gelöst. Unabhängig von der Menge hat das Ammoniumsulfat, das während der vorgenannten Vorbehandlung am Protein haftet und vom Protein mitgeschleppt wird, keine Wirkung auf die nachfolgenden Behandlungsstufen. Die erhaltene Lösung wird unter Rühren auf üblicheI liter of this extract are mixed with 285 g of ammonium sulfate. The resulting precipitate with a Y-globulin content is removed. In the supernatant what remains are hemoglobin, most of the blood group substances and albumin. As the protein concentration is low in the supernatant, the total protein after adding 200 g / liter of ammonium sulfate and adjusting the pH value to 6 to 7 obtained in the form of a precipitate. The precipitation will be as much as possible dehydrated and in pyrogen free. distilled water in a ratio of 4 to 7 liters / kg of precipitate solved. Regardless of the amount, the ammonium sulfate has that during the aforementioned pretreatment adheres to the protein and is carried along by the protein, no effect on the subsequent treatment stages. The solution obtained is stirred in the usual way

U:- A ~— C—Jl.« —U: - A ~ - C — Jl. «-

zentration 4 Prozent beträgt. Sodann wird die Lösung bei einem pH-Wert von 4.9 bis 5.0 1 Stunde bei 58 bis 60⁰C stehengelassen, um für eine gründliche Fällung von thermolabilen Proteinen zu sorgen. Durch diese Behandlung wird ein Großteil des Hämoglobins zusammen mit thermolabilem Globulin entfernt, während die entwickelte Aktivität von Blutgruppensubstanzen, blutdrucksenkend wirkende Substanzen und Albumin in den Überstand gelangen. Das Protein im Überstand enthält 1,5 Prozent Albumin. Um Blutgruppensubstanzen und blutdruckwirkende Substanzen zu •entfernen, wird der Überstand auf eine Proteinkonzentration von 5 bis 40 g/Liter und eine Salzkonzentration von höchstens 5 Prozent, ausgedrückt als Natriumchlorid, eingestellt Jeweils 1000 ml des erhaltenen Überstands werden mit 220 g Festem Polyäthylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 6000 versetzt Der pH-Wert des Überstands wird zur Fällung von einigen Proteinen auf 8,0 eingestellt Der Niederschlag wird entfernt Man erhält einen Überstand, der nur Protein mit dem gewünschten Albumin als Hauptbestandteil enthält
_ Da die Proteinkoitzentration im vorgenanntencentering is 4 percent. The solution is then left to stand at 58 to 60 ^° C. for 1 hour at a pH of 4.9 to 5.0 in order to ensure thorough precipitation of thermolabile proteins. This treatment removes a large part of the hemoglobin together with thermolabile globulin, while the developed activity of blood group substances, antihypertensive substances and albumin get into the supernatant. The protein in the supernatant contains 1.5 percent albumin. To remove blood group substances and substances that affect blood pressure, the supernatant is adjusted to a protein concentration of 5 to 40 g / liter and a salt concentration of at most 5 percent, expressed as sodium chloride Molecular weight of 6000 added. The pH of the supernatant is adjusted to 8.0 to precipitate some proteins. The precipitate is removed. A supernatant is obtained which only contains protein with the desired albumin as the main component
_ Since the protein concentration in the aforementioned

Überstand gering ist, werden die Proteine darin wieder in Form eines Niederschlags gewonnen, indem man einfach den pH-Wert auf die saure Seite verschiebt Bei einem Polyäthyienglykolgehalt in einer KonzentrationIf the supernatant is low, the proteins in it will be restored obtained in the form of a precipitate by simply shifting the pH to the acidic side a polyethylene glycol content in one concentration

Von mindestens 20 Prozent liißl sich das gewünschte Protein ausfällen, indem man den pH-Wert des Überstands lediglich auf 4,5 bis 5,6 einstellt. Nach dem Entwässern des Niederschlags erhält man ein gereinigtes Plcisniapfotein, das als Hauptbestandteil Albumin enthält und weder durch Blutgruppensubstanzen noch durch blutdrucksenkend wirkende Substanzen verunreinigt ist.The desired can be achieved from at least 20 percent Precipitate protein by adjusting the pH of the supernatant to only 4.5-5.6. After this Dehydrating the precipitate gives a purified Plcisniapfotein, the main component of which is albumin contains and is not contaminated by blood group substances or substances that lower blood pressure is.

Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wird in pyrogenfreiem, destilliertem Wasser gelöst und elektrophoretisch analysiert. Das Protein weist folgende Zusammensetzung auf: 95 bis 98 Prozent Albumin und 2 bis 5 Prozent Λ-Globulin und ß-Globulin. In der analytischen Ultrazentrifuge ergibt sich ein einziger Älbuminpcak.dcrauf ein reines Protein hindeutet.The precipitate obtained in this way is dissolved in pyrogen-free, distilled water and electrophoresed analyzed. The protein has the following composition: 95 to 98 percent albumin and 2 up to 5 percent Λ-globulin and ß-globulin. In the The analytical ultracentrifuge yields a single albuminpcak.d that is indicative of a pure protein.

Dieses reine Protein zeigt keine Anzeichen Von benaturierung, wie Bildung eines Niederschlags oder Auftreten von Trübungen. Bei der Verabfolgung an Mäuse, Meerschweinchen, Kaninchen oder Hunde zeigt dieses Produkt keine toxische Wirkung und keine unerwünschten Eigenschaften, wie eine Aktivität von Blutgruppensubstanzen oder blutdrucksenkende Wir^ kung.This pure protein shows no evidence of denaturation, such as the formation of a precipitate or the appearance of opacities. At the administration Mice, guinea pigs, rabbits or dogs, this product shows no toxic effects and none undesirable properties such as activity of blood group substances or antihypertensive agents kung.

Die auf diese Weise erhaltene Ausbeute an Plasmaprotcin beträgt 2,3 g pro Plazenta.The yield of plasma protcin obtained in this way is 2.3 g per placenta.

Example 2

Gemäß dem Verfahren von Beispiel I läßt sich reines Plasniaprolcin mit einem Gehalt an Albumin als Hauptbestandteil auch aus Serum aus retroplazentalem Blut oder aus venösem Blut, in dem Hämolysc eingetreten ist, herstellen. Die Ausbeute beträgt 11 g bzw. 17 g aus I Liter retroplancztalem Serum bzw. Serum aus venösem, der Hämolyse unterworfenem Blut.Following the procedure of Example I can be pure Plasniaprolcin containing albumin as Main component also from serum from retroplacental blood or from venous blood, in the Haemolysc has occurred. The yield is 11 g or 17 g from 1 liter retroplancztalem serum or serum from venous, hemolytic blood.

Example 3

Man verfährt wie in Beispiel I, versetzt aber die Lösung mit EDTA in einer Endkonzentration von I millimolar in der Stufe, in der Mandelsäure bis zu einer Endkonzcntration von 4 Prozent zugesetzt wird und die Lösung etwa I Stunde auf 58 bis 60⁰C erwärmt wird. Dabei wird der pH-Wert der Lösung im sauren Bereich (4,5 bis 5,5) gehalten. Das Plasmaprotein mit einem Gehalt an Albumin als Hauptbestandteil ist nicht nurThe procedure is as in Example I, but the solution is treated with EDTA at a final concentration of I mM in the stage is added in the mandelic acid to a Endkonzcntration of 4 percent and the solution is heated for about I hour at 58 to 60 ⁰ C. The pH of the solution is kept in the acidic range (4.5 to 5.5). The plasma protein containing albumin as the main component is not only

ίο frei Von Blutgruppensubstanzen, blutdrucksenkend wirkenden Substanzen und Hämoglobin sondern auch von alkalischer Phosphatasc.ίο Free of blood group substances, substances that lower blood pressure and hemoglobin but also of alkaline phosphatasc.

Die enzymatischc Aktivität der alkalischen Phosphatase wird gemäß Journal of Biological Chemistry, Bd.The enzymatic activity of alkaline phosphatase according to Journal of Biological Chemistry, Vol.

164 (1946). S. 32i bestimmt.164 (1946). P. 32i determined.

Claims

Palent claims:

1. A process for the preparation of human albumin by treating an aqueous solution of Albumin of human origin with polyethylene glycol, characterized in that one an aqueous albumin solution with at least 50% albumin, based on the total protein, a Protein concentration of 5 to 40 g / liter and containing a blood group substance a pH of 6.6 to 9.6 with polyethylene glycol with an average molecular weight of 2000 to 10,000 at a concentration of 13 to 30% (weight / volume) treated the obtained supernatant from the blood group substance containing Separates protein precipitation and the albumin is obtained from the supernatant in a manner known per se.

2. Verfanren according to claim 1, characterized in that that one uses an aqueous solution of albumin, which from human placenta or human retroplacental blood.

3. The method according to claim 1, characterized in that the aqueous albumin solution 50 g / liter or less, calculated as sodium chloride, of an inorganic salt.