DE2729619A1

DE2729619A1 - PROCEDURE FOR IDENTIFYING AND / OR CONTROLLING BACTERIA PRESENT IN A MEDIUM

Info

Publication number: DE2729619A1
Application number: DE19772729619
Authority: DE
Inventors: Seppo Kolehmainen
Original assignee: LUMAC INT NV
Current assignee: LUMAC INT NV
Priority date: 1976-06-30
Filing date: 1977-06-30
Publication date: 1978-02-02
Also published as: FR2356724A1; JPS536480A; SE7707475L

Description

51 020-Dr.T51 020-Dr.T

Anmelder: Lumac International N.V. Blenchiweg 4-0 Willemstad, CurasaoApplicant: Lumac International NV Blenchiweg 4-0 Willemstad , Curasao

Verfahren zum Identifizieren und/oder Bekämpfen der in einem Medium vorhandenen BakterienMethod for identifying and / or controlling the bacteria present in a medium

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Beschreibungdescription

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Bekämpfung der in einem Medium vorhandenen Bakterien; sie betrifft insbesondere die schnelle Identifizierung und den Nachweis von Bakterien in Urin und anderen Körperflüssigkeiten, Milchprodukten, Fleisch und anderen Lebensmittelprodukten sowie in Wasser. Sie betrifft ferner die Prüfung der Empfindlichkeit der Bakterien gegenüber verschiedenen Antibiotika.The invention relates to a method for identifying and / or controlling the bacteria present in a medium; it particularly relates to the rapid identification and detection of bacteria in urine and others Body fluids, dairy products, meat and other food products, and in water. It also concerns testing the susceptibility of bacteria to various antibiotics.

Die Bestimmung der Typen und Arten der in den Proben vorhandenen Bakterien beruht auf der Kombination der Empfindlichkeiten und Resistenzen und auf der Fähigkeit der Bakterien, auf selektiven Kulturmedien zu wachsen, sowie auf dem chemotaktischen Verhalten der Bakterien gegenüber bestimmten Chemikalien. Die konventionellen Verfahren zur Bestimmung der Empfindlichkeit von Bakterien bei der Bakteriurie und bei anderen bakteriellen Infektionen der Körperflüsnigkeiten und Körpergewebe können in zwei Gruppen unterteilt werden:The determination of the types and species of bacteria present in the samples is based on the combination of sensitivities and resistances and on the ability of bacteria to grow on selective culture media, as well as on the chemotactic Behavior of bacteria towards certain chemicals. The conventional method of determination the sensitivity of bacteria to bacteriuria and other bacterial infections of the body fluids and body tissues can be divided into two groups:

1.) Die 18 bis 72-stündige Inkubation mit Reinkulturen der Bakterien, die aus den Proben isoliert worden sind. Verschiedene alternative Inkubationsmethoden, die für die oben erwähnte Bestimmung bekannt sind, sind die VVHO/ICS-Agar-Verdünnungsmethode und die Scheiben-Diffusionsmethoden nach Bauer, Kirby, Sherris und Turck und dgl.; 2.) die Verfahren, die auf den LichtStreuungseigenschaften der wachsenden Bakterienkolonien basieren.1.) Incubation for 18 to 72 hours with pure cultures of the Bacteria isolated from the samples. Various alternative incubation methods common to the above are known are the VVHO / ICS agar dilution method and the Bauer, Kirby, Sherris and Turck disc diffusion methods and the like; 2.) the procedures based on the light scattering properties of growing bacterial colonies.

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Bei den Verfahren der Gruppe 1 werden die Tests im allgemeinen durchgeführt durch überimpfen (Inokulieren) einer Reinkultur auf feste oder flüssige bakteriologische Medien, in die abgestufte Mengen an Antibiotika eingearbeitet worden sind. Nach einer 18- bis 72-stündigen Inkubationszeit kann die für die Hemmung des Wachstums oder die Abtö'tung der Testbakterien erforderliche Konzentration bestimmt werden. Das am häufigsten für diesen Zweck angewendete Verfahren ist das Scheiben-Diffusionsverfahren, das als Kirby-Bauer-Verfahren bezeichnet wird, bei dem abgemessene Mengen an Antibiotika enthaltendenFilterpapierscheiben auf ein festes, inokuliertes Kultivierungsmedium gelegt werden. Nach einer 18- bis 72-stündigen Inkubation wird der Durchmesser einer klaren Zone um die Papierscheibe herum bestimmt. Je breiter die klare Zone ist, als um so empfindlicher wird der Testorganismus gegenüber diesem speziellen Antibiotikum beurteilt.In Group 1 procedures, the tests are generally carried out by inoculating one Pure culture on solid or liquid bacteriological media, in which graduated amounts of antibiotics are incorporated have been. After an incubation period of 18 to 72 hours, the growth inhibition or destruction the concentration required for the test bacteria. The most common method used for this purpose is the disk diffusion process known as the Kirby-Bauer process, in which measured quantities of filter paper disks containing antibiotics are placed on a solid, inoculated culture medium. To incubation for 18 to 72 hours, the diameter of a clear zone around the paper disk is determined. Ever The wider the clear zone, the more sensitive the test organism becomes to this particular antibiotic judged.

Diese konventionellen Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß zu ihrer Durchführung eine Reinkultur benötigt wird und daß eine lange Inkubationszeit erforderlich ist. Darüber hinaus hat das Scheibendiffusionsverfahren auch den Nachteil, daß Fehler auftreten, die durch physikalische und chemische Faktoren hervorgerufen werden.However, these conventional methods have the disadvantage that a pure culture is required to carry them out and that a long incubation period is required. In addition, the disc diffusion process also has the disadvantage that errors occur which are caused by physical and chemical factors.

Die Verfahren der Gruppe 2 beruhen auf dem Prinzip der Brechungseigenschaften der Bakterienzellen, wenn sie in einem klaren flüssigen Medium, beispielsweise in Eugonic Broth, wachsen; Bakterien, die nicht wachsen, machen während der Inkubation das Medium nicht trübe und werden somit als empfindlich gegenüber dem Antibiotikum in dem Medium angesehen. Automatische Meßinstrumente, die auf diesem Prinzip beruhen, sind in der Lage, die Empfindlichkeit von Test-The Group 2 procedures are based on the principle of the refractive properties of bacterial cells when they are in a clear liquid medium, for example in Eugonic Broth; Bacteria that don't grow make during the Incubation does not make the medium cloudy and thus are considered sensitive to the antibiotic in the medium. Automatic measuring instruments based on this principle are able to measure the sensitivity of test

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bakterien in Reinkulturen gegenüber Antibiotika innerhalb von 3 bis 5 Stunden zu bestimmen·bacteria in pure cultures versus antibiotics within from 3 to 5 hours to be determined

Ein Nachteil dieser Meßinstrumente besteht jedoch darin, daß auch sie die Verwendung einer Reinkultur des Testorganismus erfordern und daß es insgesamt 21 bis 23 Stunden dauert, um eine Probe zu testen. Beim Test einer Probe aus einem Patienten im Hinblick auf die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika kann diese Verzögerung bis zu Beginn einer wirksamen Behandlung in schweren Fällen von Bakterieninfektionen schicksalhaft sein.However, a disadvantage of these measuring instruments is that that they also require the use of a pure culture of the test organism and that it takes a total of 21 to 23 hours takes to test a sample. When testing a sample from a patient for sensitivity to Antibiotics can delay this until the beginning of effective treatment in severe cases of bacterial infections be fateful.

Zur Identifizierung von Gruppen und Arten von Bakterien nach konventionellen Verfahren werden selektive Medien, biochemische Tests, das Auftreten einer Verfärbung, die Bildung von StoffWechselprodukten, das Mikroskop und dgl. verwendet. Alle diese Verfahren sind jedoch zeitraubend.To identify groups and types of bacteria according to conventional methods, selective media, biochemical tests, the appearance of discoloration, the formation of metabolic products, the microscope and the like. used. However, all of these procedures are time consuming.

Die biochemischen Tests zur Identifizierung von Bakterienarten basieren auf der Fähigkeit bestimmter Arten, spezifische Substrate als Nährmedium zu verwenden. Die Anzahl der spezifischen Substrate variiert bei diesen Tests von bis etwa 20. Bei den konventionellen Verfahren wird zum Inokulieren dieser speziellen Medien, die jeweils ein spezifisches Substrat enthalten, eine isolierte Testbakteriensuspension verwendet. Die Medien enthalten einen Indikatorfarbstoff, um die Änderung des pH-Wertes als Folge des Abbaues des Substrats durch die Stoffwechselaktivität der Bakterien anzuzeigen. Die Erpebnisse werden nach ein- oder mehrtägiger Inkubation visuell abgelesen. Die Inkubation ist so lange, um die Ergebnisse visuell sehen zu können. Das Wachstum der Testbakterien auf dem Substrat wird als positiv beurteilt, wenn der Farbstoff seine Farbe ändert, und es wird als negativ beurteilt, wenn keine Farbänderung auftritt. Unter Verwendung von Standardtest-Buchtabellen,The biochemical tests used to identify bacterial species are based on the ability of certain species to identify specific Use substrates as a nutrient medium. The number of specific substrates in these tests varies from to about 20. The conventional method is used to inoculate these special media, each with a specific Containing substrate, an isolated test bacterial suspension is used. The media contain an indicator dye, the change in pH as a result of the degradation of the substrate by metabolic activity display of bacteria. The results will be or several days of incubation. The incubation is long enough to visually see the results. The growth of the test bacteria on the substrate is assessed as positive if the dye changes its color, and it is judged negative if there is no color change occurs. Using standard test book tables,

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wie sie beispielsweise im Bergey's Manual enthalten sind, oder speziell entworfenen Computer-Programmen, wie sie beispielsweise von der API (API International S.A., Meyrin, Switzerland) zur Bestimmung der Identität der Arten angewendet werden, erfolgt die Bestimmung der Arten mittels der Kombination aus den positiven und negativen Ergebnissen.as they are contained in Bergey's Manual, for example, or specially designed computer programs like them for example used by the API (API International S.A., Meyrin, Switzerland) to determine the identity of the species the species are determined using the combination of positive and negative results.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum beschleunigten Nachweis und zur beschleunigten Identifizierung von Bakterien anzugeben. Ziel der Erfindung ist es ferner, die Möglichkeit zu schaffen, die Zeit bis zum Beginn der wirksamen Behandlung von Patienten, die an einer Bakterieninfektion leiden, abzukürzen. Weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung hervor.The aim of the present invention is therefore to provide a method for accelerated detection and for accelerated identification of bacteria. The aim of the invention is also to create the possibility of the time to the beginning the effective treatment of patients suffering from a bacterial infection. Other goals, characteristics and advantages of the invention will be apparent from the following description.

Die oben genannten Ziele werden erfindungsgemäß erreicht mit einem verbesserten Verfahren zum Identifizieren und/oder Bekämpfen der in einem Medium vorhandenen Bakterien, bei dem man von einer oder mehreren, die Bakterien enthaltenden Proben ausgeht, die Proben mit einem oder mehreren, die Wachstumseigenschaften der Bakterien beeinflussenden Materialien vereinigt, die dabei erhaltenen Mischungen inkubiert, den Wachstumseffekt feststellt und unter Berücksichtigung des Wachstumseffektes die Bakterien identifiziert oder das für die Bekämpfung der Bakterien geeignete Material auswählt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Wachstumseffekt feststellt durch Bestimmung der Anzahl von Bakterien in den Mischungen durch Extrahieren von ATP und Bestimmung seines Gehaltes durch Biolumineszenz auf an sich bekannte Weise.According to the invention, the above-mentioned aims are achieved with an improved method of identification and / or control of the bacteria present in a medium, one or more of the bacteria containing it Samples run out, the samples with one or more materials that affect the growth properties of the bacteria combined, incubated the resulting mixtures, determined the growth effect and taking into account the Growth effect identifies the bacteria or selects the material suitable for combating the bacteria, the characterized in that the growth effect is determined by determining the number of bacteria in the mixtures by extracting ATP and determining its content by bioluminescence in a manner known per se.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bekämpfung der in einem Medium enthaltenen Bakterien wird vorzugsweise direkt in die zu bekämpfenden Bakterien enthaltenden Proben desThe method according to the invention for controlling the bacteria contained in a medium is preferably carried out directly in the samples of the bacteria to be controlled

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Mediums, insbesondere direkt in einer Körperflüssigkeit, beispielsweise direkt im Urin oder in einer anderen Körperflüssigkeit eines Patienten, durchgeführt.Medium, in particular directly in a body fluid, for example directly in the urine or in another body fluid of a patient.

Die Biolumineszenz-Reaktion zum Nachweis von Bakterien mittels Adenosintriphosphat (ATP), das aus Bakterienzellen extrahiert worden ist, ist ein an sich bekanntes Verfahren, das beispielsweise in den US-Patentschriften 3 359 973, 3 423 290 und 3 690 832 sowie in zahlreichen anderen Publikationen (z.B. H.H. Seliger und W.D. McElroy, 1965 in "Light: Physical and Biological Action", Acad. Press. New York und London, Seite 4-17, W.D. McElroy und M. De Luca 1973 in "Chemical and enzymatic mechanism of firefly luminescence", Seite 285 - 311, in "Chemiluminescence and Bioluminescence" von M.J. Cormier, D.M. Hercules und J. Lee, Eds., Plenum Press, New York und Kondon, Seite 515) beschrieben ist, ebenso wie die Anwendung dieses Biolumineszenz-Verfahrens zum Nachweis der Anzahl der in Urin enthaltenen Bakterien (vgl. z.B. R.D. Hamilton und 01 Holm-Hansen, "Limnol. & Ocenog." 12, 319, 1967; A.N. Sharpe, M.N. Woodrow und A.K. Jackson, "J. Appl. Bact.", j£, 758, 1970, A. Those, S. Ansehn, A. Lundin und S. Bergman, "K.Clin.Microb." 1., 1, 1975^.The bioluminescence reaction for the detection of bacteria using adenosine triphosphate (ATP), which is obtained from bacterial cells has been extracted, is a process known per se, which is described, for example, in US Patents 3,359,973, 3,423,290 and 3,690,832 as well as in numerous other publications (e.g. H.H. Seliger and W.D. McElroy, 1965 in "Light: Physical and Biological Action," Acad. Press. New York and London, pp. 4-17, W.D. McElroy and M. De Luca 1973 in "Chemical and enzymatic mechanism of firefly luminescence", pages 285-311, in "Chemiluminescence and Bioluminescence "by M.J. Cormier, D.M. Hercules and J. Lee, Eds., Plenum Press, New York and Kondon, page 515) as is the use of this bioluminescence method to prove the number of bacteria contained in urine (see e.g. R.D. Hamilton and 01 Holm-Hansen, "Limnol. & Ocenog." 12, 319, 1967; AT. Sharpe, M.N. Woodrow and A.K. Jackson, "J. Appl. Bact.", J £, 758, 1970, A. Those, S. Ansehn, A. Lundin and S. Bergman, "K.Clin.Microb." 1., 1, 1975 ^.

Es ist jedoch weder bekannt, das Firefly-Biolumineszenz-Verfahren mitder sdmelLenQiantisierung von Bakterienzellen zu kombinieren, insbesondere die sdaneUe Quantisierung von Bakterienzellen mittels des Firefly-Biolumineszenz-Verfahrens auf den Empfindlichkeitstests, insbesondere direkt in Urin- und anderen Körperflüssigkeitsproben,anzuwenden, noch ist es bekannt, das Biolumineszenzverfahren auf selektive Kulturmedien zum Identifizieren der Arten von Bakterien anzuwenden.However, neither is it known the firefly bioluminescence process with the sdmelLenQiantisierung of bacterial cells to combine, in particular the next quantization of Bacterial cells using the firefly bioluminescence method on the susceptibility tests, especially directly in urine and other body fluid samples, nor is it known to use the bioluminescence method on selective culture media to use to identify the types of bacteria.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung eignet sich besonders gut zum Testen der Empfindlichkeit von Bakterien gegenüber Antibiotika bei der Bakteriurie (einer Bakterien-A preferred embodiment of the invention is suitable especially good for testing the sensitivity of bacteria to antibiotics in bacteriuria (a bacterial

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infektion, bei der der Urin mehr als 100 000 Bakterienzellen pro ml Urin enthält). Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der Empfindlichkeitstest direkt in der Urinprobe durchgeführt werden, ohne daß vorher Reinkulturen isoliert werden müssen. Erfindungsgemäß ist es möglich, die Anzahl der Bakterien und somit eine mögliche bakterielle Infektion sowie die Empfindlichkeit der Bakterien gegenüber Antibiotika innerhalb von 3 bis 5 Stunden zu bestimmen, während diese Tests bei Anwendung der konventionellen Verfahren 24-bis 72 Stunden dauern.infection in which the urine contains more than 100,000 bacterial cells per ml of urine). With the method according to the invention the susceptibility test can be carried out directly in the urine sample without the need to isolate pure cultures beforehand. According to the invention it is possible to increase the number of Bacteria and thus a possible bacterial infection as well as the sensitivity of the bacteria to antibiotics to be determined within 3 to 5 hours while these tests are performed using the 24-bis conventional procedure Take 72 hours.

Selten wird eine Infektion durch mehr als eine Bakterienart hervorgerufen. Aber selbst in dem Fall, daß mehr als eine Art die Infektion hervorruft, liefert das erfindungsgemäße Verfahren genaue Informationen über die Empfindlichkeit dieser Arten, weil der Test in der Körperflüssigkeit anstatt auf einem künstlichen Kultivierungsmedium durchgeführt wird. Bei den konventionellen Empfindlichkeitstests kann die interspezifische Konkurrenz auf einem Kultivierungsmedium fehlerhafte Ergebnisse liefern und aus diesem Grunde müssen bei den konventionellen Verfahren isolierte Reinkulturen der Mikroben verwendet werden.An infection is rarely caused by more than one type of bacteria. But even in the event that more than one The method according to the invention provides precise information about the sensitivity of the nature of the infection of these types because the test is carried out in the body fluid rather than on an artificial culture medium. In the conventional susceptibility tests, the interspecific competition on a cultivation medium deliver incorrect results and for this reason isolated pure cultures must be used with the conventional methods the microbes are used.

Wie oben angegeben, besteht ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens darin, daß die Empfindlichkeitstests in der Körperflüssigkeit selbst, d.h. in dem gleichen physikalischen und chemischen Medium,durchgeführt werden können, in dem die Bakterien in dem Patienten leben. Dies ähnelt besser den Bedingungen, unter denen das antimikrobielle Arzneimittel die Infektionsbakterienarten abtöten soll. Es ist aber auch möglich, in flüssige bakteriologische Medien, die Antibiotika enthalten, einen kleinen aliquoten Anteil der Probe zu inokulieren und später die Empfindlichkeit der Bakterien zu bestimmen aufgrund der Fähigkeit des Testorganismus, auf dem bestimmte Antibiotika enthaltenden Medium zu wachsen.As indicated above, one advantage of the method of the invention is that the susceptibility tests are carried out in the body fluid themselves, i.e. in the same physical and chemical medium in which the Bacteria live in the patient. This more closely resembles the conditions under which the antimicrobial drug is used to kill the infectious bacteria species. But it is also possible to use antibiotics in liquid bacteriological media contain to inoculate a small aliquot of the sample and later determine the susceptibility of the bacteria to be determined by the ability of the test organism to grow on the medium containing particular antibiotics.

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Das Empfxndlichkeitstestverfahren wird wie folgt durchgeführt :The susceptibility testing procedure is carried out as follows :

Eine Urinprobe oder eine andere Flüssigkeitsprobe wird zuerst auf eine mögliche Infektion durch pathogene Bakterien hin getestet unter Anwendung des Firefly-Biolumineszenz-Verfahrens oder eines anderen Verfahrens. Proben, bei denen festgestellt wurde, daß sie eine übermäßig große Anzahl von Bakterien enthalten, d.h. die mehr Bakterien enthalten, als aufgrund der Kontamination der Probe zu erwarten war, werden dann in bezug auf die Empfindlichkeit der Bakterien gegenüber den normalerweise verwendeten Antibiotika getestet. Eine Probe, beispielsweise Urin, wird in kleinen, beispielsweise in Form von 1 ml-Anteilen, auf Teströhrchen, Phiolen oder dgl. verteilt. In diese aliquoten Anteile läßt man konventionelle antibiotische Papierdiffusionsscheiben fallen oder man führt ein kleines Volumen, beispielsweise ein Volumen von 0,1 ml einer flüssigen Antibiotikalösung mit der gleichen antibiotischen Wirksamkeit wie in den Diffusionsscheiben ein.A urine sample or other fluid sample is first checked for possible infection by pathogenic bacteria tested using the firefly bioluminescence method or another procedure. Samples found to have an inordinately large number of Contain bacteria, i.e. which contain more bacteria than expected due to the contamination of the sample, are then tested for the susceptibility of the bacteria to the antibiotics normally used. A sample, for example urine, is in small, for example in the form of 1 ml portions, on test tubes, vials Or the like. Distributed. Conventional antibiotic paper diffusion disks are dropped into these aliquots or a small volume, for example a volume of 0.1 ml, of a liquid antibiotic solution is carried out with the same antibiotic effectiveness as in the diffusion discs.

Die aliquoten Anteile werden 2 bis 5 Stunden lang (einem geeigneten Zeitraum für drei Bakteriengenerationen) bei 37°C inkubiert. Wenn 12 verschiedene Antibiotika getestet werden, werden 13 aliquote Anteile der Probe hergestellt. Der 13. Anteil enthält kein Antibiotika, sondern nur eine Papierscheibe oder es wird 0,1 ml destilliertes Wasser zugesetzt, je nach dem zur Einführung der Antibiotika angewendeten Verfahren. Dieser aliquote Anteil dient als Kontrolle (Fig. 1). Nach der Inkubationszeit wird die Anzahl der Bakterien (oder die Konzentration von ATP) in jedem aliquoten Anteil unter Anwendung des Biolumineszenzverfahrens bestimmt. Die Bestimmung erfolgt durch Extraktion des ATP unter Anwendung eines geeigneten Extraktionsverfahrens, beispielsweise mit einem Reagens für Bakterisn,das beim schnellen Erhitzen der Probe bis zum Siedepunkt des Wassers und 2-minütigem Kochen in einem Tris-EDTA-Puffer ein Nucleotid freisetzt,The aliquots are kept for 2 to 5 hours (one suitable period for three generations of bacteria) incubated at 37 ° C. When 12 different antibiotics are tested, 13 aliquots of the sample are made. The 13th share does not contain antibiotics, just a paper disk or 0.1 ml of distilled water is added, depending on the procedure used to introduce the antibiotics. This aliquot serves as a control (Fig. 1). To The incubation time is using the number of bacteria (or the concentration of ATP) in each aliquot determined by the bioluminescence process. The determination is carried out by extracting the ATP using a suitable extraction method, for example with a reagent for bacteria, which when the sample is heated rapidly up to Boiling point of the water and boiling for 2 minutes in a Tris-EDTA buffer releases a nucleotide,

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oder unter Anwendung anderer Extraktionsverfahren, wie sie für ATP eingesetzt werden.or using other extraction methods such as them be used for ATP.

Nach der Extraktion werden die Proben in einem Photometer auf ATP hin analysiert, nachdem der Probe die geeigneten Luciferin-Luciferase-Reagentien zugesetzt worden sind.After extraction, the samples are placed in a photometer analyzed for ATP after the appropriate luciferin-luciferase reagents have been added to the sample.

Da Urin und andere Körperflüosigkeiten stets Epithelzellen, Blutzellen und andere nicht-mikrobielle Zellen enthalten, müssen die Proben vorbehandelt werden, um vor der Extraktion des ATP aus den Bakterien das nicht-bakterielle ATP zu eliminieren. Diese Vorbehandlung erfolgt durch Zugabe des Detergens-ATPase-Reagens zu den Proben und 10-minütiges Inkubieren der Proben. Durch Sieden der Proben wird die ATPase inaktiviert, bevor sie die bakterielle ATP zerstören kann.Since urine and other body fluids are always epithelial cells, Containing blood cells and other non-microbial cells, the samples must be pretreated before extraction of the ATP to eliminate the non-bacterial ATP from the bacteria. This pretreatment is done by adding the detergent ATPase reagent to the samples and incubating for 10 minutes of the samples. Boiling the samples inactivates the ATPase before it can destroy the bacterial ATP.

In der nachfolgenden Tabelle I und in der beiliegenden Zeichnung (Fig. 1) sind die Ergebnisse angegeben, die bei einem Empfindlichkeitstest erhalten wurden, bei dem der Effekt der Antibiotika auf Populationen von E. Coli-Bakterien (10 Zellen/ ml) in Urin während der Inkubation bei 37°C festgestellt wurde, wobei die Ergebnisse der Biolumineszenzmessung auch mit der Kirby-Bauer«Methode verglichen wurden.In the following Table I and in the accompanying drawing (Fig. 1) the results are given, which for a Susceptibility tests were obtained in which the effect of the antibiotics on populations of E. coli bacteria (10 cells / ml) was found in urine during incubation at 37 ° C, the results of the bioluminescence measurement also with the Kirby-Bauer ”method.

In der Fig. 1 ist auf der Abszisse die Inkubationszeit in Stunden angegeben, während auf der Ordinate die relativenIn FIG. 1, the incubation time is indicated in hours on the abscissa, while the relative time is indicated on the ordinate

Lichteinheiten aufgetragen sind, welche die Abnahme der lebenden ATP-Zellen in den Proben aufzeigen. Die Kurve I der Fig. 1 zeigt die mit der Kontrollprobe erhaltenen Ergebnisse, die Kurve II zeigt die mit Refobacin erhaltenen Ergebnisse, die Kurve III zeigt die mit Furadantin erhaltenen Ergebnisse und die Kurve IV zeigt die mit Colistin erhaltenen Ergebnisse.Light units are applied, which show the decrease in the number of living ATP cells in the samples. the Curve I of FIG. 1 shows the results obtained with the control sample, curve II shows those obtained with Refobacin Results, curve III shows the results obtained with furadantin and curve IV shows those with colistin obtained results.

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Table I.

Antibiotikum Hemmzone Empfindlichkeits- Biolumineszenz-Antibiotic inhibition zone sensitivity bioluminescence

0 mm minimum 0 mm Test0 mm minimum 0 mm test

Colistin 4,5 2 +Colistin 4.5 2+

Refobacin 7 7 +Refobacin 7 7+

Gramaxin 9 7 +Gramaxin 9 7+

Urospasmon 5 7,5 +Urospasmon 5 7.5 +

Furadantin 4· +Furadantin 4 +

Alle verwendeten Antibiotika waren wirksam.All antibiotics used were effective.

Colistin schien das wirksamste Antibiotikum gegenüber dieser Population von E. coli zu sein und Furadantin war das am wenigsten wirksame. Die Kirby-Bauer- und. Biolumineszenz-Verfahren ergaben ähnliche Ergebnisse, in dem Biolumineszenz-Verfahren waren jedoch Urospasmon und Furadantin in Urin wirksamer als bei dem konventionellen Kirby-Bauer-Verfahren auf den Wachstumsmedien.Colistin appeared to be the most effective antibiotic against this population of E. coli and furadantin was the most least effective. The Kirby Bauer and. Bioluminescence process gave similar results, however, urospasmon and furadantin were more effective in urine in the bioluminescence method than with the conventional Kirby-Bauer process on the growth media.

Die Ergebnisse des erfindungsgemäßen Empfindlichkeitstests werden wie folgt bewertet:The results of the sensitivity test according to the invention are rated as follows:

Wenn die Anzahl der Bakterien in einem aliquoten Anteil gleich derjenigen in der Kontrollprobe oder noch größer ist, ist das Antibiotikum unwirksam und der Testorganismus ist gegenüber dem Antibiotikum resistent.If the number of bacteria in an aliquot is equal to or greater than that in the control sample, this is it Antibiotic ineffective and the test organism is resistant to the antibiotic.

Wenn die Anzahl der Bakterien (die Konzentration an ATP) in einem aliquoten Anteil auf 90 bis 50 % derjenigen in der Kontrollprobe abgenommen hat, wird der Testorganismus als mäßig empfindlich gegenüber dem entsprechenden Antibiotikum angesehen.When the number of bacteria (the concentration of ATP) in an aliquot has decreased to 90 to 50% of that in the control sample, the test organism is considered to be moderately sensitive to the corresponding antibiotic.

Wenn die Anzahl der Bakterien auf weniger als 50 % des Wertes in der Kontrollprobe abnimmt, werden diese Bakterienarten als stark empfindlich gegenüber dem entsprechenden Antibiotikum angesehen.When the number of bacteria is less than 50% of the value decreases in the control sample, these types of bacteria are considered highly sensitive to the corresponding antibiotic viewed.

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Wirksame Antibiotika können die Bakterienpopulation innerhalb von 2 bis 3 Stunden vermindern.Effective antibiotics can reduce the bacterial population within 2 to 3 hours.

Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Identifizierung von Gruppen und Arten von Bakterien durchgeführt durch Bestimmung des Wachstums der Testorganismen auf selektiven Kulturmedien und durch Prüfung des chemotaktischen Verhaltens der Mikroben unter Anwendung des schnellen Firefly-Biolumineszenzverfahrens (fast firefly bioluminescence method).In another embodiment of the invention, identification of groups and types of bacteria is performed by determining the growth of the test organisms on selective culture media and by examining the chemotactic Behavior of the microbes using the fast firefly bioluminescence method (fast firefly bioluminescence method).

Im allgemeinen wird eine selektive Kultivierung auf spezifischen Medien durchgeführt, welche das Wachstum von bestimmten Arten begünstigen oder das Wachstum von anderen Arten hemmen oder unterdrücken. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden selektive Medien, wie z.B. SS-Medien.zum Nachweis von Salmonella- und Shigella-Arten, mit der Probe inokuliert, wie z.B. Lebensmittelprodukte, und 2 bis 5 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubationszeit wird das Medium unter Anwendung des Biolumineszenzverfahrens zur Bestimmung der Anzahl der Bakterienzellen getöstet. Wenn die Anzahl beträchtlich zugenommen hat, auf mehr als das Zweifache der ursprünglichen Anzahl, ist zu vermuten, daß die Probe Salmonella- oder Shigella-Arten enthält. Dieser Test ist ebenso wie das konventionelle Verfahren nicht absolut zuverlässig, er gibt jedoch Hinweise auf die Möglichkeiten. Bei diesem Verfahren können auch selektive Inkubationstemperaturen angewendet werden, beispielsweise W³C für thermophile Coli-Formen, die auf ihrem spezifischen Medium gezüchtet worden sind.In general, selective cultivation is carried out on specific media which favor the growth of certain species or inhibit or suppress the growth of other species. In the method according to the invention, selective media such as SS media for the detection of Salmonella and Shigella species are inoculated with the sample, such as food products, and incubated at 37 ° C. for 2 to 5 hours. After the incubation period, the medium is killed using the bioluminescence method to determine the number of bacterial cells. If the number has increased significantly, to more than twice the original number, then the specimen is likely to contain Salmonella or Shigella species. This test, like the conventional method, is not absolutely reliable, but it does give indications of the possibilities. Selective incubation temperatures can also be used in this method, e.g. W ³ C for thermophilic coliforms grown on their specific medium.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die konventionelle visuelle, subjektive Beobachtung ersetzt durch die Biolumineszenzmessung der ATP in den Bakterien, die auf dem spezifischen Substrat kultiviert worden sind. Wenn die Bakterien auf dem Substrat wachsen, kann eine Zunahme der ATP in der Kultur nach 2 oder 3 Generationszeiten, d.h. innerhalb von 2 bis 3 Stunden, nachgewiesen werden, im Vergleich zu 18 bis 72 StundenIn the method according to the invention, the conventional visual, subjective observation replaced by the bioluminescence measurement of the ATP in the bacteria based on the specific Substrate have been cultivated. When the bacteria grow on the substrate, there can be an increase in ATP in the culture after 2 or 3 generation times, i.e. within 2 to 3 hours, compared to 18 to 72 hours

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bei dem konventionellen Verfahren. Dies "bedeutet, daß eine positive Identifizierung innerhalb eines Arbeitstages nach der Isolierung der Testbakterien durchgeführt werden kann.in the conventional method. This "means that one positive identification can be performed within one working day after isolating the test bacteria.

Die selektive Kultivierung, der Empfindlichkeitstest, konventionelle Färbeverfahren unter dem Mikroskop, Gasbildungsverfahren und andere Identifizierungsverfahren können mit dem Firefly-Biolumineszenzverfahren kombiniert werden zur Identifizierung von Gruppen und Arten von Bakterien.The selective cultivation, the susceptibility test, conventional Staining processes under the microscope, gas formation processes and other identification processes can be used with the Firefly bioluminescence techniques can be combined for identification of groups and types of bacteria.

Viele Bakterien sind in einem flüssigen Medium beweglich und sind dafür bekannt, daß sie Chemosensoren haben (vgl. Adler, "J. Sei. Amer." 234, 4O₁ 1976). Es ist deshalb möglich, spezifische Bakterien mit geeigneten Chemikalien, z.B. Escherichia coli mit Serin, aus einer, größeren Probe in eine Kapillare zu ziehen (vgl. Adler, "J. Sei. Amer.", 23.4, 40, 1976). Dadurch ist es möglich, spezifische pathogene Bakterien, wie z.B. die SalmonelIa-Arten, aus einer Lebensmittelprobe in einem geringen Volumen zu konzentrieren, in dem sie leicht mittels des schnellen und empfindlichen Biolumineszenzverfahrens nachgewiesen werden können. Die Empfindlichkeit des Biolumineszenzverfahrens erlaubt den Nachweis von nur 1 bis 10 Bakterien in der Probe unter optimalen Bedingungen, so daß es mit diesem Verfahren möglich ist, beliebige pathogene Bakterien in Lebensmitteln nachzuweisen, wenn es mit einem wirksamen Mikroisolierungsverfahren, beispielsweise der Chemotaxis, verbunden wird.Many bacteria are movable in a liquid medium and are known to have chemical sensors (see FIG. Adler, "J. Sci. Amer." 234, 4O ₁ 1976). It is therefore possible to draw specific bacteria from a larger sample into a capillary using suitable chemicals, for example Escherichia coli with serine (cf. Adler, "J. Sei. Amer.", 23.4, 40, 1976). This makes it possible to concentrate specific pathogenic bacteria, such as the SalmonelIa species, from a food sample in a small volume in which they can easily be detected by means of the rapid and sensitive bioluminescence method. The sensitivity of the bioluminescence method allows the detection of only 1 to 10 bacteria in the sample under optimal conditions, so that it is possible with this method to detect any pathogenic bacteria in food when it is combined with an effective micro-isolation method such as chemotaxis.

Es wurde ein Versuch durchgeführt, um den Nachweis des Wachstums von Mikroorganismen durch ATP_Messung innerhalb einer 6-stündigen Inkubationsperiode auf selektiven Medien zu zeigen,und die Ergebnisse dieser Messung wurden mit den bei konventionellen Verfahren erhaltenen Ergebnissen verglichen. Das bei diesem Versuch angewendete Verfahren umfaßte die Inokulation von Lactose-Bouillon bzw. Lactose-Agar bei 37°C mit zwei SuspensionenAn experiment was carried out to provide evidence of growth of microorganisms by ATP_measurement within a 6-hour incubation period on selective media, and the results of this measurement were compared with the results obtained by conventional methods. That with this one The procedure used in the experiment involved the inoculation of lactose broth and lactose agar, respectively, at 37 ° C. with two suspensions

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von E. coli (1) bzw. (2). Die Suspension (1) war eine alte, gelagerte Kultur, die (5.10) Zellen enthielt, während die Suspension (2) eine neu gezüchtete Kolonie darstellte, die ⁵ Zellen enthielt.from E. coli (1) and (2), respectively. Suspension (1) was an old, stored culture containing (5.10) cells, while suspension (2) was a newly grown colony containing ⁵ cells.

Die Bestimmung des Wachsturas wurde wie folgt durchgeführt:The determination of the growth rate was carried out as follows:

- visuelle Beobachtung der Koloniebildung auf Lactose-Agar,- visual observation of colony formation on lactose agar,

- visuelle Beobachtung der Farbänderung des Lactose-Bouillon-Mediums durch Säurebildung,- visual observation of the change in color of the lactose broth medium through acid formation,

- ATP-Messung in der Lactosebouillon.- ATP measurement in the lactose broth.

Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben.The results obtained are given in Table II below.

Table II

Inkuba
tionszeitIncuba
tion time ΛΤΡ-Werte
relative LichteinheiteΛΤΡ values
relative light unit -ZellsuspensionCell suspension Kr¹-)Kr ¹ -) visuell bestimmte Wachs-
i> tumswertevisually determined wax
i> values (2)(2) ZellsCell c-Acarc-Acar 00 Kontrol
IeControl
Ie (1)(1) l.acLor.c-Boui lion J .ac Losl.acLor.c-Boui lion J .ac Los ( ₊ )( ₊ ) (1)(1) uspensionpension 2 h2 h 0.130.13 0. 110. 11 Zellnur.pensionCell only.pension -- (++)(++) (2)(2) 3h 303h 30 0.130.13 011011 0.970.97 (D(D -- -- (++)(++) 5 h5 h O.OliO.Oli 0.1,1.0.1.1. 1.381.38 (₊)( ₊ ) -- -- -- 7h 307:30 a.m. o.o6o.o6 0.5Ί0.5Ί 2.282.28 -- -- -- -- 2 h h2 h h 0. 110. 11 1.161.16 2.202.20 -- -- -- 1.501.50 -- -- ⁺⁺

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Fußnoten: (+) = keine FarbänderungFootnotes: (+) = no color change

(++) = keine Koloniebildung(++) = no colony formation

Wenn man die Kontrollwerte der ATP-Messungen von den Probe messungen abzieht, stellt man eine beträchtliche Zunahme bei den Ablesungen nach 2 Stunden und 3 V2 Stunden fest, was anzeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren bereits innerhalb von 2 bis 3 Stunden Ergebnisse liefern kann. Bei dem konventionellen Verfahren, das auf einer visuellen Beobachtung beruht, dauert es mindestens 24 Stunden, um das W_achstum des Mikroorganismus nachzuweisen.If one subtracts the control values of the ATP measurements from the sample measurements, one finds a considerable increase in the readings after 2 hours and 3 ½ hours, which indicates that the method according to the invention can provide results within 2 to 3 hours. In the conventional method, which relies on a visual observation, it takes prove to the W _a chstum of the microorganism for at least 24 hours.

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Le e rs eLe e rs e

i tei te

Claims

1. Methods of identification and / or control of the bacteria present in a medium in which one or more of the bacteria is known Samples run out, the samples with one or more that affect the growth properties of the bacteria Combine materials, incubate the resulting mixtures, determine the growth effect and take it into account the growth effect identifies the bacteria or the material suitable for their control selects, characterized in that the growth effect is determined by determining the number the bacteria in the mixtures by extracting ATP and determining its content by bioluminescence in a known way.

2. The method according to claim 1, characterized in that it is used directly in samples of the bacteria to be combated containing medium performs.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that it is carried out directly in a body fluid.

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