DE2717965C2

DE2717965C2 - Process for the production of porous cellulose beads

Info

Publication number: DE2717965C2
Application number: DE19772717965
Authority: DE
Inventors: Li Fu Lafayette Ind. Chen; George Tsu-Ning Tsao
Original assignee: Purdue Research Foundation
Current assignee: Purdue Research Foundation
Priority date: 1976-04-22
Filing date: 1977-04-21
Publication date: 1986-06-26
Also published as: JPS638121B2; SE7704338L; DK158005B; SE8204400L; FR2348942A1; FR2348942B3; GB1575700A; SE452161B; CA1076047A; SE434848B; SE8204400D0; JPS52129788A; DK158005C; DE2717965A1; DK175777A

Description

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man in Stufe (b) die Lösung durch Versprühen verteilt.2. The method according to claim 1, characterized in that in step (b) the solution is sprayed distributed.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß man als Zellulosederivat Zelluloseacetat verwendet und die Hydrolyse in einer kaustischen Lösung durchführt.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that there is cellulose acetate as the cellulose derivative is used and the hydrolysis is carried out in a caustic solution.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel eine Mischung von4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the solvent is a Mix of

(a) Aceton, eine Mischung von Aceton und Methanol oder Ethanol, Methylacetat, Methylendichlorid und Methanol, Methylethylketon, Formamid und/oder Dimethylsulfoxid und(a) Acetone, a mixture of acetone and methanol or ethanol, methyl acetate, and methylene dichloride Methanol, methyl ethyl ketone, formamide and / or dimethyl sulfoxide and

(b) Dimethvlsalfoxid, Formamid, Methylacetat Cyclohexanon, Methylendichlorid, Ethylendichlorid, eine Mischung von Methylendichlorid und Methanol und/oder eine Mischung von Ethylendichlorid und Methanol(b) dimethyl sulfoxide, formamide, methyl acetate, cyclohexanone, methylene dichloride, ethylene dichloride, a Mixture of methylene dichloride and methanol and / or a mixture of ethylene dichloride and Methanol

verwendet.used.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4. dadurch gekennzeichnet, daß man Perlen mit einem Porenvolumen von 75 bis 95% herstellt.5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that beads with a Produces pore volume of 75 to 95%.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vernetzungsmittel Diisocyanat verwendet.6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the crosslinking agent Diisocyanate used.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Diisocyanat Tolylen-2,4-diisocyanat oder Hexamethylendiisocyanat verwendet.7. The method according to claim 6, characterized in that the diisocyanate is tolylene-2,4-diisocyanate or hexamethylene diisocyanate is used.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vernetzungsmittel Epichlorhydrin in einer Natriumhydroxidlösung verwendet.8. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that one is used as a crosslinking agent Epichlorohydrin used in a sodium hydroxide solution.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vernetzungsmittel Formaldehyd in einer Salzsäurelösung verwendet.9. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the crosslinking agent Formaldehyde used in a hydrochloric acid solution.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vernetzungsmittel Glutaraldehyd verwendet.10. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the crosslinking agent Glutaraldehyde is used.

11. Verwendung der nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 hergestellten porösen Zelluloseperlen, gegebenenfalls nach einer Vorbehandlung, zur Immobilisierung von Enzymen und anderen biologisch aktiven Agentien und zur Trennung und Reinigung von Enzymen, Proteinen und Nukleinsäuren.11. Use of the porous produced by the method according to any one of claims 1 to 10 Cellulose beads, if necessary after a pretreatment, for the immobilization of enzymes and others biologically active agents and for the separation and purification of enzymes, proteins and nucleic acids.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von porösen Zelluloseperlen, die sich als Träger für Enzyme und andere biologisch aktive Agentien eignen. Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Zelluloseperlen zur Immobilisierung von Enzymen und anderen biologisch aktiven Agentien und zur Trennung und Reinigung von Enzymen, Proteinen und Nukleinsäuren. Die erfindungsgemäß hergestellten Zelluloseperlen können auch zur Entfernung von Metallionen aus Lösungen verwendet werden.The invention relates to a process for the production of porous cellulose beads which can be used as a carrier suitable for enzymes and other biologically active agents. The invention also relates to the use of the cellulose beads produced according to the invention for the immobilization of enzymes and others biologically active agents and for the separation and purification of enzymes, proteins and nucleic acids. According to the invention Manufactured cellulose beads can also be used to remove metal ions from solutions will.

(tV, Poröse Zelluloseperlen stellen ein verhältnismäßig billiges stabiles Material mit vielseitigen chemischen(tV, porous cellulose beads represent a relatively cheap stable material with versatile chemical

'y Eigenschaften dar. So eignen sie sich z. B. als Träger für immobilisierte Enzyme und andere aktive biologische'y properties. So they are z. B. as a carrier for immobilized enzymes and other active biologicals

!>.; Agentien.!> .; Agents.

Jv' Wenngleich gewöhnliche Zelluloseteilchen und regenerierte Zellulosepulver die meisten der an gute TrägerJv 'Although ordinary cellulose particles and regenerated cellulose powder most of the good carriers

' 65 für immobilisierte Enzyme gestellten Anforderungen erfüllen, weisen sie strukturelle Nachteile auf, die bewirken, daß die Packung von Reaktoren zu fest wird, was wiederum zu einer Verringerung des Durchflußcs und .; manchmal zu Kanalbildung und somit zu einem unzulänglichen Kontakt zwischen den immobilisierten Enzymen'65 meet the requirements set for immobilized enzymes, they have structural disadvantages that cause that the packing of reactors becomes too tight, which in turn leads to a reduction in flow and .; sometimes channeling and hence insufficient contact between the immobilized enzymes

und dem strömenden Reaktionsmedium fürt. Die Immobilisierung von Enzymen auf einem unlöslichen Träger istand the flowing reaction medium fort. The immobilization of enzymes on an insoluble support is

eine weit verbreitete Verfahrensweise zur praktischen Anwendung von Enzymen, um zu vermeiden, daß bei jedem Einsatz frische Enzyme verwendet werden müssen. Durch die Immobilisierung der Enzyme wird eine Stabilisierung erreicht, die eine effektive Verwendung von Enzymen und den Einsatz von kontinuierlich arbeilenden Enzymreaktoren ermöglicht.a widely used technique for the practical use of enzymes to avoid that at Fresh enzymes must be used every time. The immobilization of the enzymes creates a Stabilization achieved the effective use of enzymes and the use of continuously working Enzyme reactors made possible.

Die erfolgreiche Anwendung von immobilisierten Enzymen hängt zu einem großen Teil von den Eigenschaften des für die Immobilisierung verwendeten Trägers ab. Dementsprechend soll ein guter Träger billig sein und eine solche Form besitzen, die für die Vewendung in Reaktoren geeignet ist Hinsichtlich dieser Erfordernisse sind kugelförmige Perlen besonders erwünscht, da sie sich besonders für Festbetten, Wirbelbetten, expandierte Betten, Rührkessel und andere übliche Reaktortypen eignen. Ein solcher Träger soll außerdem eine geeignete physikalische und mechanische Festigkeit besitzen, so daß er nicht zerbricht oder deformiert wird, wenn er in eine hohe Säule gepackt wird. Das Zerfallen und die Deformation des Trägers in der Säule führen zu einem zu fest gepackten Bett, wodurch der Durchfluß flüssiger Reagenzien durch die Säule behindert wird und die Effektivität des Reaktors sich vermindert Geeignete Träger sollen ferner vielseitige chemische Eigenschaften besitzen, so daß die Immobilisierung von Enzymen und anderen biologischen Agentien auf dem Träger durch ionische oder kovalente Bindung oder auch durch Obeflächenadsorption leicht erreicht werden kann. Dementsprechend soll der Träger eine hohe Kapazität zur Bildung einer großen Zahl von Bindungen besitzen, so daß jede Trägereinheit große Mengen des gewünschten Enzyms immobilisieren kann. Besonders geeignet, ist also ein Träger mit hoher Porosität und gleichmäßig verteilten inneren Poren. Eine solche Porosität erlaubt eine gute Diffusion von chemischen Reagentien oder Reaktionsprodukten in die inneren Poren er Zelluloseperlen und ebenfalls aus diesen heraus. Träger sollen chemisch stabil, physikalisch fest und aus einem inerten Material hergestellt sein, das mikrobiologischen Angriffen, die eine Zerstörung des Trägers bewirken, v.derstehen, um ein immobilisiertes Enzymsystem mit einer verlängerten Lebensdauer zu liefern.The successful application of immobilized enzymes depends in large part on the properties of the carrier used for the immobilization. Accordingly, a good support should be inexpensive and have a shape suitable for use in reactors. In view of these requirements, spherical beads are particularly desirable as they are particularly suitable for fixed beds, fluidized beds, expanded beds, stirred kettles and other common types of reactors. Such a carrier should also have adequate physical and mechanical strength so that it will not be broken or deformed when packed in a tall column. The disintegration and deformation of the carrier in the column lead to a too tightly packed bed, whereby the flow of liquid reagents is hindered by the column and the efficiency of the reactor decreases Suitable carriers are also versatile chemical properties have, so that the immobilization of enzymes and other biological agents on the support can be easily achieved by ionic or covalent bonding or by surface adsorption. Accordingly, the carrier should have a high capacity to form a large number of bonds so that each carrier unit can immobilize large amounts of the desired enzyme. A carrier with high porosity and evenly distributed internal pores is therefore particularly suitable. Such porosity allows good diffusion of chemical reagents or reaction products into and out of the internal pores of the cellulose beads. Carriers should be chemically stable, physically strong and made of an inert material that is resistant to microbiological attack, which causes destruction of the carrier, in order to provide an immobilized enzyme system with an extended lifespan.

Zur Zeit werden für die Immobilisierung von Enzymen poröse Glas- und Keramikteilchen verwendet Wenngleich solche Teilchen die meisten Anfordei ungen erfüllen, sind sie jedoch verhältnismäßig teuer. Darüber hinaus ist die Zahl der chemischen Reaktionen, die für die Immobilisierung von Enzymen auf Glas- und Keramikträgern verwendet werden können, begrenztPorous glass and ceramic particles are currently used to immobilize enzymes, albeit however, such particles meet most of the requirements, but are relatively expensive. About that addition is the number of chemical reactions necessary for the immobilization of enzymes on glass and glass Ceramic supports can be used, limited

In den US-Patentschriften 39 47 325,39 05 954,35 73 277, 35 05 299, 35 01 419, 33 97 198, 32 96 000, 32 51 824, 32 36 669,28 43 583,27 73 027,25 43 928 und 24 65 343 wird die Herstellung einer Vielzahl von Zellulosematerialien in einer Vielzahl von Formen beschrieben, von denen einige für die Fixierung biologisch aktiver Materialien wie Enzyme oder von lonenaustauschgruppen geeignet sein sollen. Diese Verfahren haben jedoch auch den Nachteil, daß sie teuer sind und die Produkte eine für die Verwendung in solchen chemischen Reaktoren wie Fesibetten und Wirbelbetten unerwünschte Körperform besitzen. Insbesondere liefern die bekannten Verfahren keine kugelförmigen Zelluloseperlen mit einer gleichmäßigen Porenverteilung über die gesamte Oberfläche und einem großen, aus gleichförmigen Poren bestehenden, inneren Porenvolumen. Darüber hinaus besitzen die bekannten Zelluloseteilchen und -pulver im allgemeinen so kleine Teilchengrößen, daß sie für die Vewendung in chemischen Reaktoren nicht geeignet sind. Außerdem besitzen die bekannten Zellulosepulver und -teilchen oft eine harie Oberfiächenschicht, die eine ernsthafte Behinderung der Diffusion und eine uneffektive Verwendung in chemischen Reaktoren bewirkt.In US patents 39 47 325, 39 05 954, 35 73 277, 35 05 299, 35 01 419, 33 97 198, 32 96 000, 32 51 824, 32 36 669.28 43 583.27 73 027.25 43 928 and 24 65 343 will manufacture a variety of cellulosic materials described in a variety of forms, some for the fixation of biologically active materials how enzymes or ion exchange groups should be suitable. However, these methods also have the Disadvantage that they are expensive and the products are one for use in such chemical reactors as Fesi beds and fluidized beds have undesirable body shapes. In particular, the known methods provide no spherical cellulose beads with a uniform pore distribution over the entire surface and a large internal pore volume consisting of uniform pores. In addition, the known cellulose particles and powder are generally so small that they are suitable for use in chemical reactors are not suitable. In addition, the known cellulose powders and particles often have a harie surface layer that seriously hinders diffusion and ineffective use causes in chemical reactors.

Der Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, billige, hochporöse, stabile Teilchen mit vielseitigen chemischen Eigenschaften, die sie als Träger für immobilisierte Enzyme oder andere biologisch aktive Materialien geeignet machen, zu liefern. Ferner liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, poröse Zelluloseperlen mit verbesserter physikalischer und mechanischer Stabilität und ausreichend großer Oberfläche für eine hohe Immobilisierungskapazität für Enzyme zu liefern.The invention is now based on the object of cheap, highly porous, stable particles with versatile chemical properties that make them a carrier for immobilized enzymes or other biologically active materials make suitable to deliver. A further object of the invention is to provide porous cellulose beads with improved physical and mechanical stability and a sufficiently large surface for a high To provide immobilization capacity for enzymes.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß manThe inventive method is characterized in that one

(a) ein hvdrolysierbares Zelluloserterivat in einem inerten, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel in einem Verhältnis von 1 :20 bis 1 :3 Gewicht/Volumen zu einer Lösung mit größerer Dichte als die Ausfällungslösung auflöst,(a) a hydrolyzable cellulose derivative in an inert, water-miscible solvent in one Ratio of 1:20 to 1: 3 weight / volume to a solution with a greater density than the precipitation solution dissolves,

(b) die so hergestellte Lösung in Form von Tröpfchen in einer aus Wasser, einer wäßrigen Lösung von nicht-ionischen odor ionischen Tensiden, einer Mischung von Wasser und Ethanol oder Methanol oder einem Kohlenwasserstoff oder Kohlenwasserstoffgemisch bestehenden Aisfällungslösung verteilt und dadurch das Zellulosederivat in Form von gleichmäßig porösen Perlen ausfällt,(b) the solution thus prepared in the form of droplets in one of water, an aqueous solution of non-ionic or ionic surfactants, a mixture of water and ethanol or methanol or a hydrocarbon or hydrocarbon mixture existing precipitation solution distributed and thereby the cellulose derivative precipitates in the form of uniformly porous beads,

(c) die ausgefällten Perlen von der Lösung abtrennt,(c) separating the precipitated beads from the solution,

(d) die abgetrennten porösen Perlen mit Wasser wäscht,(d) washing the separated porous beads with water,

(e) die gewaschenen Perlen zur Umwandlung in Zellulose und zur Vermehrung der aktiven Stellen für die Kopplung mit Enzymen und anderen biologisch aktiven Agentien hydrolysiert,(e) the washed beads to convert to cellulose and to increase the active sites for the Coupling with enzymes and other biologically active agents hydrolyzed,

(f) die hydrolysierten Perlen unter Erhalt poröser Zelluloseperlen mit gleichmäßig verteilten Poren und einem Porenvolumen von mehr als 50 Vol.-% wäscht und(f) the hydrolyzed beads to obtain porous cellulose beads with evenly distributed pores and a Washes pore volumes of more than 50% by volume and

(h) gegebenenfalls die porösen Zelluloseperlen zur Herstellung vernetztet "oröser Zelluloseperlen vor oder nach der Hydrolyse mit mindestens einem Vernetzungsmittel vernetzt.(h) if necessary, the porous cellulose beads for the production of crosslinked orous cellulose beads before or crosslinked after hydrolysis with at least one crosslinking agent.

Die erfindungsgemäß hergestellten hochporösen Zelluloseperlen mit einer gleichförmigen Porosität eignen sich besonders für die Immobilisierung von Enzymen. Darüber hinaus sind sie auch geeignet zur Reinigung und Trennung von Enzymen, Proteinen, Nukleinsäuren und ähnlichen Verbindungen sowie zur Abtrennung von Mctallionen aus verdünnten Lösungen. Aufgrund ihrer Porosität und ihrer guier mechanischen Stabilität liefern die erfindungsgemäü hergestellten Zelluloseperlen bei Verwendung in Festbettreaktoren einen hervorragenden Durchgang von Flüssigkeiten und unterliegen keinen Zerfalls- und Deformierungserscheinungen.The highly porous cellulose beads produced according to the invention and having a uniform porosity are suitable particularly suitable for the immobilization of enzymes. In addition, they are also suitable for cleaning and Separation of enzymes, proteins, nucleic acids and similar compounds as well as for the separation of Metal ions from dilute solutions. Provide due to their porosity and their good mechanical stability the cellulose beads produced according to the invention, when used in fixed bed reactors, have an excellent result The passage of liquids and are not subject to any signs of disintegration or deformation.

Das erfindungsgemäße Verfahren liefert poröse ZelluloseDerlen, die sich als Träeer für Enzvme und andereThe process of the invention provides porous cellulosic beads which are useful as carriers for enzymes and others

biologisch aktive Agentien eignen. Ferner ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die Veränderung der chemischen und physikalischen Eigenschaften von aus Zellulosederivaten hergestellten porösen Perlen. Wenngleich gewöhnlich mikrokristalline Zellulose- und andere aus Zellulose hergestellte Teilchen viele der wesentlichen Erfordernisse für geeignete Enzymträger erfüllen, neigen diese Teilchen jedoch dazu, unter Druck eine zu dichte Packung zu ergeben und liefern außerdem keine ausreichende Porosität, um ausreichend große Enzymmengen daran zu koppeln. Zellulosederivate sind im allgemeinen billig und liefern bei erfindungsgemäBer Verarbeitung ein sehr vielseitiges, im allgemeinen biologisch inertes Material für chemische Reaktionen. Dementsprechend besitzen die erfindungsgemäß hergestellten Zelluloseperlen viele für die Verwendung als Träger von immobilisierten Enzymen erwünschte Eigenschaften.biologically active agents are suitable. Furthermore, the method according to the invention enables the change in the chemical and physical properties of porous beads made from cellulose derivatives. Although usually microcrystalline cellulose and other particles made from cellulose, many of the essential However, to meet requirements for suitable enzyme carriers, these particles tend to become one under pressure to give close packing and also do not provide sufficient porosity to accommodate sufficiently large amounts of enzyme to couple to it. Cellulose derivatives are generally inexpensive and provide the invention Processing a very versatile, generally biologically inert material for chemical reactions. Accordingly the cellulose beads produced according to the invention have many for use as a carrier properties desired by immobilized enzymes.

Durch das erfindungsgemäße Auflösen eines Zellulosederivats in einem ausgewählten Lösungsmittel und das Verteilen desselben in einer ausgewählten Ausfällungslösung ist es möglich, Zelluloseperlen mit sehr gleichförmiger Porosität und überlegenen chemischen und physikalischen Eigenschaften herzustellen. Die erfindungsgemäß hergestellten Perlen sind hochporös, wobei die Poren im allgemeinen gleichmäßig über die Oberfläche und im Inneren der Perlen verteilt sind. Durch geeignete Auswahl der Lösungsmittel und der Ausfällungslösungen kann die Porengröße reguliert werden. Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß sowohl die Porengröße als auch die Porenverteilung kontrolliert werden kann. Aus den F i g. 2, 4a und b gehtBy dissolving a cellulose derivative in a selected solvent according to the invention and that Distributing the same in a selected precipitation solution it is possible to produce cellulose beads with a very uniform Porosity and superior chemical and physical properties. According to the invention The pearls produced are highly porous, with the pores being generally uniform over the surface and are distributed inside the pearls. By appropriate selection of solvents and precipitation solutions the pore size can be regulated. A particular advantage of the method according to the invention is that both the pore size and the pore distribution can be controlled. From the F i g. 2, 4a and b goes

hervor, daß die Porenöffnungen gleichmäßig über die Perlenoberfläche verteilt sind und etwa 1000 Ä groß sind, was eine geeignete Größe für die Bewegung von Enzym- und Reagenzmolekülen in den Poren ist.shows that the pore openings are evenly distributed over the pearl surface and are about 1000 Å in size, what is a suitable size for the movement of enzyme and reagent molecules in the pores.

Das inerte, organische, mit wasser mischbare Lösungsmittel kann eine einzige Fiüssigkeii ouci cine Kornbination von Flüssigkeiten sein. Es ist wichtig, daß man eine richtige Kombination von inertem, organischem Lösungsmittel und Ausfällungslösung verwendet, um poröse Zelluloseperlen mit der gewünschten Form und Porosität zu erhalten. Das inerte, organische, mit Wasser mischbare Lösungsmittel kann eine Kombination von Flüssigkeiten sein, die zusammen mit dem Zellulosederivat eine Lösung liefern, die beim Vermischen mit der Ausfällungslösung zu einer Phaseninversion führt, wodurch das Zellulosederivat in Form von porösen Perlen koaguliert. Das inerte organische Lösungsmittel enthält dementsprechend eine Komponente (a), die gekennzeichnet ist als eine Flüssigkeit, die in der Lage ist, das Zellulosederivat, wie beispielsweise Zelluloseacetat, aufzulösen und in der Ausfällungslösung löslich ist.The inert, organic, water-miscible solvent can be a single liquid or combination of liquids of liquids. It is important that you get the right combination of inert and organic Solvent and precipitation solution used to make porous cellulose beads with the desired shape and shape Maintain porosity. The inert, organic, water-miscible solvent can be a combination of Be liquids that, together with the cellulose derivative, provide a solution that when mixed with the Precipitation solution leads to a phase inversion, causing the cellulose derivative in the form of porous beads coagulates. The inert organic solvent accordingly contains a component (a) which is identified is as a liquid that is capable of the cellulose derivative, such as cellulose acetate, dissolve and is soluble in the precipitation solution.

Eine zweite Komponente (b) des Lösungsmittelsystems ist eine rlüssigkeit, die in der Komponente (a) und auch in der Ausfällungslösung löslich ist und die in der Lösungsmittellösung in einer ausreichenden Menge vorhanden ist, so daß die Dichte der fertigen Lösungsmittellösung (einschließlich des Zellulosederivats) ausreichend höher als die Dichte der Ausfällungslösung ist und beim Verteilen der Lösungsmittellosung in Form von Tröpfchen in der Ausfällungslösung die Zellulose koaguliert und als poröse Perlen mit der gewünschten Größe und Porosität ausfällt. Die Komponente (b) des Lösungsmittels wird zur Regulierung der Oberflächenaktivität der Lösungsmittellösung verwendet, so daß die Lösungsmittellösungstropfen ihre Form beim Kontakt mit der Ausfällungslösung behalten. Die Komponente (b) dient ferner dazu, Porengröße und die Porosität der ausgefällten Perlen zu regulieren. In einigen Fällen können die Komponente (a) und die Komponente (b) gleich sein. In anderen Fäüen kann es von Vorteil sein, zur Herstellung von Komponente (a) und/oder Komponente (b) eine oder mehrere Flüssigkeiten zu verwenden.A second component (b) of the solvent system is a liquid contained in component (a) and is also soluble in the precipitating solution and that in the solvent solution in a sufficient amount is present so that the density of the finished solvent solution (including the cellulose derivative) is sufficient is higher than the density of the precipitation solution and when distributing the solvent solution in the form of Droplets in the precipitation solution coagulate the cellulose and form porous beads of the desired size and porosity fails. The component (b) of the solvent is used to regulate surface activity the solvent solution used so that the solvent solution droplets their shape upon contact with the Keep precipitation solution. The component (b) also serves to determine the pore size and the porosity of the precipitated Regulate pearls. In some cases, component (a) and component (b) may be the same. In other Fäüen it may be advantageous to produce component (a) and / or component (b) a or to use multiple liquids.

Der Begriff »Ausfällungslösung« ist definiert als eine flüssige Lösung, die kein Lösungsmittel für das Zellulosederivat und mit dem obigen inerten, organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel mischbar ist. Die Ausfällungslösung kann beispielsweise Wasser oder eine wäßrige Lösung sein. Die Ausfällungslösung ist also sowohl mit der Komoponente (a) als auch mit der Komponente (b) mischbar. Wenn man also das Zellulosederivat in dem organischen Lösungsmittel auflöst und anschließend einen Tropfen der resultierenden Lösungsmittellösung zu der Ausfällungslösung gibt, koaguliert das Zellulosederivat und fällt aufgrund der Phaseninversion unter Bildung der gewünschten porösen Zelluloseperie aus.The term "precipitation solution" is defined as a liquid solution that is not a solvent for the cellulose derivative and is miscible with the above inert, organic, water-miscible solvent. the Precipitation solution can be, for example, water or an aqueous solution. So the precipitation solution is Miscible with both component (a) and component (b). So if you look at the cellulose derivative dissolves in the organic solvent and then one drop of the resulting solvent solution is added to the precipitation solution, the cellulose derivative coagulates and falls due to the phase inversion with the formation of the desired porous cellulose series.

Natürlich kann das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung poröser Zelluloseperlen in verschiedener Weise variiert werden. Außer Zelluloseacetat können auch andere Zellulosederivate als Ausgangsmaterial für die Herstellung von porösen Perlen, wie z. B. Zellulosenitrat und Methylzellulose, verwendet werden. Die Bezeichnungen »Zeiiuiosederivat« und »hydroiisierbares Zeliuiosederivat« schließen solche Materialien ein, a<js denen Zellulose beispielsweise durch Hydrolyse oder Hydrierung regeneriert werden kann.Of course, the above-described method of making porous cellulose beads can be used in various Way can be varied. In addition to cellulose acetate, other cellulose derivatives can also be used as a starting material for the production of porous beads, such as. B. cellulose nitrate and methyl cellulose can be used. the Terms "cell derivative" and "hydriatable cell derivative" include such materials as a <js which cellulose can be regenerated, for example, by hydrolysis or hydrogenation.

Die organischen Lösungsmittelkomponenten (a) und (b) für das Zellulosederivat müssen gegenüber dem Zellulosederivat chemisch inert sein und vollständig oder im wesentlichen mit der Ausfällungslösung mischbar sein. Es ist von besonderer Bedeutung, daß die Dichte der durch Zugabe des Zellulosederivats zum inerten Lösungsmittel gebildeten Lösungsmittellösung größer ist als die der Ausfällungslösung, in der sie verteilt wird, so daß beim Verteilen der Lösungsmittellösungströpfchen in der Ausfällungslösung die Tröpfchen nach unten sinken, wenn die wäßrige Lösung nicht gerührt wird. Geeignete einzelne Lösungsmittel bei Verwendung einer wäßrigen Ausfällungslösung sind u. a. Dimethylsulfoxid und Methylacetat. Es sei darauf hingewiesen, daß im Handel erhältliche Materialien als Lösungsmittelkomponenten (a) und/oder (b) verwendet werden können und daß diese Materialien Feuchtigkeit enthalten können, was sich in einigen Fällen als vorteilhaft erwiesen hat.The organic solvent components (a) and (b) for the cellulose derivative must be compared to the Cellulose derivative be chemically inert and completely or substantially miscible with the precipitation solution be. It is of particular importance that the density of the inert by adding the cellulose derivative The solvent solution formed by the solvent is greater than that of the precipitation solution in which it is distributed, so that when the solvent solution droplets are dispersed in the precipitation solution, the droplets go down decrease if the aqueous solution is not stirred. Suitable single solvents when using a aqueous precipitation solution are inter alia. Dimethyl sulfoxide and methyl acetate. It should be noted that im Commercially available materials can be used as solvent components (a) and / or (b) and that these materials can contain moisture, which has proven advantageous in some cases.

Bei Verwendung einer wäßrigen Ausfällungslösung kann man vorteilhafterweise als Lösungsmittelkomponente (a) Aceton, Formamid, eine Mischung von Aceton und Methanol oder Ethanol, Methylacetat, eine Mischung von Methylendichlorid und Methanol, Methylethylketon und/oder Dimethylsulfoxid verwenden. Die Lösungsmittelkomponente (b) kann dementsprechend aus folgenden Lösungsmitteln gewählt werden: Dimethylsulfoxid, Formamid. Methylacetat, Cyclohexanon, Methylendichlorid, Ethylendichlorid. eine Mischung von Methylendichlorid und Metanno! und/oder eine Mischung von Ethyiendichiorid und Methanol.If an aqueous precipitation solution is used, it can advantageously be used as the solvent component (a) Acetone, formamide, a mixture of acetone and methanol or ethanol, methyl acetate, a mixture use of methylene dichloride and methanol, methyl ethyl ketone and / or dimethyl sulfoxide. the Solvent component (b) can accordingly be selected from the following solvents: dimethyl sulfoxide, Formamide. Methyl acetate, cyclohexanone, methylene dichloride, ethylene dichloride. a mixture of Methylene dichloride and Metanno! and / or a mixture of ethylene dichloride and methanol.

Eine bevorzugte Lösungsmittelkomponente (a) ist Aceton, aber auch andere Lösungsmittel sind geeignet. Bei Verwendung einer wäßrigen Ausfällungslösung kann man eine Lösungsmittelkomponente (a) aus den folgenden Materialien auswählen (die Verhältnisse der Mischungen sind das jeweils erwünschte minimale Verhältnis aufA preferred solvent component (a) is acetone, but other solvents are also suitable. at Using an aqueous precipitating solution, one can choose a solvent component (a) from the following Select materials (the proportions of the mixes are the minimum ratio desired in each case

Volunicnbiisis):Volunicnbiisis):

Komponente (a)Component (a) Minimales VerhältnisMinimal ratio (Volumen)(Volume) Acetonacetone __ Aceton + MethanolAcetone + methanol 60:4060:40 Aceton + EthanolAcetone + ethanol 60:4060:40 MethylacetatMethyl acetate —- Methylendichlorid + MethanolMethylene dichloride + methanol 80:2080:20 DimethylsulfoxidDimethyl sulfoxide —- MethylethylketonMethyl ethyl ketone —- FormamidFormamide

IOIO

Komponente (b)Component (b) Minimales VerhältnisMinimal ratio (Volumen)(Volume) DimethylsulfoxidDimethyl sulfoxide Ethylendichlorid + MethanolEthylene dichloride + methanol 60:4060:40 Methylendichlorid + MethanolMethylene dichloride + methanol 60:4060:40 EthylendichloridEthylene dichloride —- MethylendichloridMethylene dichloride —- FormamidFormamide —- CyclohexanonCyclohexanone —-

Wie schon oben angegeben, besteht die Hauptfunktion der Komponente (a) darin, das Zellulosederivat
aufzulösen. Der Zusatz der Komponente (b) ist notwendig, um eine Lösungsmittellösung mit der erforderlichen
Dichte zu liefern, so daß das Zellulosederivat in der Ausfällungslösung ausfällt. Die Komponente (b) ermöglicht
außerdem die Kontrolle der Porengröße und der gleichmäßigen Porosität der Perlen.As stated above, the main function of component (a) is the cellulose derivative
dissolve. The addition of component (b) is necessary to make a solvent solution with the required
To provide density so that the cellulose derivative precipitates in the precipitation solution. Component (b) enables
in addition, the control of the pore size and the uniform porosity of the pearls.

Die Lösungsmittelkompoiiente (b) liefert also das gewünschte spezifische Gewicht der Lösungsmittellösung. 20
Bei Verwendung einer wäßrigen Ausfällungslösung wird bevorzugt Dimethylsulfoxid als Komponente (b)
verwendet. In einigen Fällen können Komponente (a) und Komponente (b) gleich sein, d. h. Dimethylsulfoxid,
Formamid oder Methylacetat, wenn wäßrige Ausfällungslösungen verwendet werden. Verschiedene Materialien, die bei Verwendung einer wäßrigen Ausfällungslösung in geeigneter Weise als Komponente (b) verwendet
werden können, sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben: 25The solvent component (b) thus provides the desired specific weight of the solvent solution. 20th
When using an aqueous precipitation solution, dimethyl sulfoxide is preferred as component (b)
used. In some cases component (a) and component (b) can be the same, i.e. dimethyl sulfoxide,
Formamide or methyl acetate if aqueous precipitation solutions are used. Various materials suitably used as component (b) when an aqueous precipitation solution is used
are shown in the following table: 25

3030th 3535

Die Lösung von Zellulosederivat und inertem Lösungsmittel soll ein kontrolliertes Zellulosederivat-Lösungsmittel-Verhältnis besitzen, da dieses einen Effekt auf die endgültige Porosität der hergestellten Perlen hat. Im 40
allgemeinen führt ein kleines Verhältnis (größerer Gehalt an Lösungsmittel) zu Perlen mit einer größeren
Porosität. Ein Zellulose-Lösungsmittel-Verhältnis von 1 :20 und 1 :3 (Gewicht/Volumen: einschließlich der j; Komponenten (a) und (b) hat sich als geeignet für die Herstellung von Zelluloseperlen mit verschiedenen
bestimmten Anwendungsmöglichkeiten erwiesen. Vorzugsweise wird ein Zellulosederivat-Lösungsmittel-Ver- ^ hältnis von I : 10 bis 1 :6 (Gewicht/Volumen) verwendet, um eine leicht handhabbare Lösung zu erhalten, die zu 45 X Zellulosepcrlen mit den gewünschten Eigenschaften und mit einem Porenvolumen von mindestens 50 Vol.-%, >':. vorzugsweise 75 bis 95 und insbesondere 75 bis 80 VoI.-% führt. Perlen mit höherer Porosität haben im $, allgemeinen einen größeren Anteil an gleichmäßig verteilten inneren Poren und somit geringerer Diffusionsbe- ßhinderung, sind allerdings etwas schwächer hinsichtlich der physikalischen Festigkeit als Perlen mit geringerer 'd Porosität. 50 ;'i The solution of cellulose derivative and inert solvent should have a controlled cellulose derivative-solvent ratio as this has an effect on the final porosity of the beads produced. In the 40
in general, a small ratio (larger solvent content) results in pearls with a larger one
Porosity. A cellulose-solvent ratio of 1:20 and 1: 3 (weight / volume: including j; components (a) and (b) has been found to be suitable for the production of cellulose beads with various
proven certain applications. Preferably, a cellulose derivative-solvent encryption ^ ratio of I: 10 to 1: used 6 (weight / volume), in order to obtain an easily manageable solution to 45 X Zellulosepcrlen with the desired properties and with a pore volume of at least 50 Vol .-%, >':. preferably 75 to 95 and in particular 75 to 80% by volume. Beads with higher porosity have generally hindrance ß in $ a greater proportion of uniformly distributed internal pores and thus lower diffusion-are somewhat d weaker in terms of physical strength as beads with less' porosity. 50 ; 'i

Die bevorzugte Ausfällungslösung, in der die Lösung des Zellulosederivats verteilt wird, besteht im allgemei- gThe preferred precipitation solution in which the solution of the cellulose derivative is distributed is generally g

nen aus Wasser, kann aber auch eine wäßrige Lösung sein, die geeignete Mengen an nichtionischen oder ||nen from water, but can also be an aqueous solution, the appropriate amounts of nonionic or ||

ionischen Tensiden enthält, um die Oberflächenspannung zu verringern und die Bildung der porösen Perlen zu jacontains ionic surfactants to reduce the surface tension and the formation of the porous beads to yes

erleichtern. Die Ausfällungslösung kann außerdem eine Mischung von Wasser und Metahnol oder Ethanol igfacilitate. The precipitation solution can also be a mixture of water and Metahnol or Ethanol ig

(Volumenverhältnis 50 :50) enthalten. Es ist auch möglich, daß die Ausfällungslösung nicht wäßrig ist, solange 55 ΐϊ(Volume ratio 50:50) included. It is also possible that the precipitation solution is not aqueous as long as 55 ΐϊ

das Zellulosederivat darin unlöslich ist und die Erefordernisse hinsichtlich der Dichte erfüllt sind. Demgemäß M the cellulose derivative is insoluble therein and the density requirements are met. Accordingly, M

können Kohlenwasserstoffe wie Cyclohexan, Hexan, Octan, Decan, Benzol und ähnliche so lange verwendet %, hydrocarbons such as cyclohexane, hexane, octane, decane, benzene and similar can be used for as long as %,

werden, wie sie flüssig sein, eine geringere Dichte als das inerte organische Lösungsmittel besitzen und mit Sjwill, as they are liquid, have a lower density than the inert organic solvent and with Sj

letzterem mischbar sind. Wenn die Zellulosederivatlösung durch Sprühen mittels einer geeigneten Vorrichtung jythe latter are miscible. When the cellulose derivative solution is sprayed by means of a suitable device jy

wie einer Sprühdüse verteilt wird, führen der Druckabfall und die Mischbarkeit des inerten Lösungsmittels mit 60 % how a spray nozzle is distributed, the pressure drop and the miscibility of the inert solvent with 60 %

der wäßrigen Lösung zu einer Dispersion und schließlich zur Ausfällung poröser Zellulosederivatperlen. pjthe aqueous solution to a dispersion and finally to the precipitation of porous cellulose derivative beads. pj

Natürlich muß eine ausreichende Menge an Lösungsmittelkomponente (b) vorhanden sein, damit das das ΐ|Of course, a sufficient amount of solvent component (b) must be present for the ΐ |

Zellulosederivat enthaltende Lösungsmittel die erforderliche höhere Dichte als die Ausfälungslösung hat. In s|Cellulose derivative containing solvent has the required higher density than the precipitation solution. In s |

Tabelle 1 sind eine Reihe von inerten organischen Lösungsmitteln für die Ausfällung eines Zellulosederivats in ffTable 1 shows a series of inert organic solvents for the precipitation of a cellulose derivative in ff

einer wäßrigen Lösung angegeben. Die angegebenen Verhältnisse sind die minimalen erforderlichen Verhältnis- 65 % indicated in an aqueous solution. The specified ratios are the minimum required ratio - 65 %

se, um eine Lösungsmitteiiösung zu erhalten, die eine größere Dichte als Wasser hat Je größer das spezifische % to obtain a solvent solution that has a greater density than water. The greater the specific %

Gewicht der Komponente (b) ist, desto weniger Komponente (b) ist erforderlich, um die minimale Dichte zu U Weight of component (b) is, the less the component (b) is required to the minimum density to U

27 17 96527 17 965 MinimalesMinimal Tabelle ITable I. Vnlumcnvcrhältni.s a : bVnlumcnvcrhalteni.s a: b Lösungsmittelsolvent 70:3070:30 Komponente(a)Component (a) Komponente (b)Component (b) 80:2080:20 Acetonacetone DimethylsulfoxidDimethyl sulfoxide 80:2080:20 Acetonacetone EthylendichloridEthylene dichloride 75:2575:25 Acetonacetone MethyiendichloridMethylene dichloride 45:5545:55 Acetonacetone FormamidFormamide 35 :6535:65 Acetonacetone CyclohexanonCyclohexanone Acetonacetone MethylacetatMethyl acetate

Nach Herstellung der porösen Perlen wird die Zellulose durch Hydrolyse aus dem Derivat regeneriert, um mehr aktive Stellen für die Enzymankopplung zu schaffen. Zur Regenerierung der Zellulose aus dem Zellulosederivat nach der Bildung der Perlen kann man die substituierten Gruppen (wei Acetat bei Zelluloseacetat) entfernen, um alle normalerweise im Zellulosematerial vorhandenen Hydroxylgruppen zu regenerieren. Je höher der Regenerationsgrad ist, desto stabiler erweisen sich die resultierenden Perlen. In einigen Fällen, in denen Enzyme auf den Zelluloseperlenträgern immobilisiert werden sollen, ist es erwünscht, die Hydroxy- oder andere Substituentengruppen in lunktioneüe chemische Gruppen wie Aminogruppen umzuwandein, die die Ankopplung von Enzymen erleichtern.After the production of the porous beads, the cellulose is regenerated from the derivative by hydrolysis to create more active sites for enzyme coupling. For the regeneration of cellulose from the cellulose derivative after the formation of the pearls, the substituted groups (white acetate for cellulose acetate) to regenerate any hydroxyl groups normally present in the cellulosic material. Ever The higher the degree of regeneration, the more stable the resulting pearls are. In some cases, in which enzymes are to be immobilized on the cellulose bead supports, it is desirable to use the hydroxy or converting other substituent groups into functional chemical groups such as amino groups that Facilitate the coupling of enzymes.

Im folgenden soll die Erfindung anhand der Figuren näher erläutert werden; es zeigtIn the following the invention will be explained in more detail with reference to the figures; it shows

F i g. 1 eine graphische Darstellung der Teilchengrößeverteilung der porösen Perlen,F i g. 1 is a graph showing the particle size distribution of the porous beads;

F i g. 2 eine elektronenmikroskopische Rasteraufnahme einer porösen Zelluloseperle,F i g. 2 is an electron microscope raster image of a porous cellulose bead,

F i g. 3 eine graphische Darstellung der Druckabfalleigenschaften der porösen Zelluloseperlen,F i g. 3 is a graph showing the pressure drop properties of the porous cellulose beads;

Fig.4(A) eine eiektronenmikroskopische Rasteraufnahme der Oberfläche einer porösen Zelluloseperle (20 000 x),Fig. 4 (A) is an electron microscopic raster image of the surface of a porous cellulose bead (20,000 x),

Fig.4(B) eine elektronenmikroskopische Rasteraufnahme des Inneren einer porösen Zelluloseperle (20 000 x).Fig. 4 (B) is a raster electron microscope image of the interior of a porous cellulose bead (20,000 x).

Die Graphik in F i g. 1 zeigt die Teilchengrößeverteilung der fertigen porösen Perlen, die erhalten werden, wenn man eine Zellulosederivatlösung mittels einer Sprühdüse gemäß dem weiter unten ausführlich beschriebenen Verfahren verteilt. Perlen, die je nach vorgesehener Verwendung zu groß oder zu klein sind, können gesammelt werden und gegebenenfalls wieder in dem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst werden. Für die Verwendung in einem Säulenreaktor werden im allgemeinen Perlen mit gleichnamiger Größe bevorzugt. Die gewünschte Teilchengröße kann je nach vorgesehener Verwendung der Perlen, z. B. je nach dem zu iir.mobilisierenden Enzym, verschieden sein.The graph in FIG. 1 shows the particle size distribution of the finished porous beads that are obtained, when using a cellulose derivative solution by means of a spray nozzle according to that described in detail below Procedure distributed. Beads that are too big or too small depending on their intended use can be are collected and, if necessary, redissolved in the appropriate solvent. For the For use in a column reactor, beads of the same size are generally preferred. the desired particle size may vary depending on the intended use of the beads, e.g. B. depending on the one to be mobilized Enzyme, be different.

Die nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellten porösen Zelluloseperlen haben im allgemeinen eine sehr hohe Porosität und eine kontrollierte Porengröße irn Bereich von 0,05 bis 30 μ. Wenn ein Zellulose-Lö sungsmittel-Verhältnis von 1 : 10 (Gewicht/Volumen) zur Herstellung der Zellulose/Lösungsmittel —Lösung verwendet wird, besitzen die fertigen Perlen eine hohe Porosität mit einem Porenvolumen von etwa 90%. Eine elektronenmikroskopische Rasteraufnahme einer nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten porösen Zelluloseperle ist in den F i g. 2, 4 (A) und 4 (B) gezeigt. Aus diesen Aufnahmen sind verschiedene wichtige Merkmale der erfindungsgemäß hergestellten Zelluloseperlen ersichtlich. Erstens sind die Perlen im allgemeinen kugelförmig, und die Porenöffnungen sind gleichmäßig über die Perlenoberfläche verteilt. Für die meisten Anwendungen ist dies erwünscht, da man einen immobilisierten Enzymkatalysator mit gleichmäßiger Aktivität erhält. Die Hohlraumphase der Zelluloseperlen ist kontinuierlich. Dies ist ein erwünschtes Merkmal, da eine diskontinuierliche, diskrete »Blase« zu einem unbrauchbaren und nicht zugänglichen toten Raum in einem immobilisierten Enzymsystem führen würde. Drittens ist auf der Perlenoberfläche keine harte Schicht vorhanden. Eine harte Oberflächenschicht würde die Diffusion ernsthaft behindern. Schließlich sind die Porengrößen sehr gleichmäßig, so daß die gesamte innere Oberfläche des inneren Porenvolumens der Perlen für die Enzymimmobilisierung und für enzymkatalysierte Rekationen zugänglich ist. Sowohl die hohe Porosität als auch die anderen genannten Merkmale verleihen den erfindungsgemäß hergestellten porösen Zelluloseperlen eine einzigartige Eignung zur Immobilisierung von Enzymen und anderen biologisch aktiven Agentien.The porous cellulose beads made by the above-described process generally have a very high porosity and a controlled pore size in the range from 0.05 to 30 μ. If a cellulose lo solvent ratio of 1:10 (weight / volume) for the preparation of the cellulose / solvent solution is used, the finished beads have a high porosity with a pore volume of about 90%. One Electron microscopic raster image of a porous produced by the method according to the invention Cellulose bead is shown in FIGS. 2, 4 (A) and 4 (B). From these recordings there are several important ones Features of the cellulose beads produced according to the invention can be seen. First, the pearls in general spherical, and the pore openings are evenly distributed over the pearl surface. For the most Applications this is desirable because you have an immobilized enzyme catalyst with uniform activity receives. The void phase of the cellulose beads is continuous. This is a desirable feature as a discontinuous, discrete "bubble" into an unusable and inaccessible dead space in one immobilized enzyme system. Third, there is no hard layer on the pearl surface. A hard surface layer would seriously hinder diffusion. Lastly, the pore sizes are very uniform, so that the entire inner surface area of the inner pore volume of the beads is available for enzyme immobilization and is accessible for enzyme-catalyzed reactions. Both the high porosity and the other features mentioned give the porous cellulose beads produced according to the invention a unique character Suitable for immobilizing enzymes and other biologically active agents.

Eine wichtige Eigenschaft eines Enzymträgers ist der Druckverlust, den er bei verschiedenen Flüssigkeitsdurchsätzen durch einen den Träger enthaltenden Enzymreaktor hervorruft. Industriell wird zur Zeit beispicls- weise DEAE-Zellulose als Enzymträger bei der Umwandlung von Glucose in Fructose verwendet. Bei DEAE-Zellulose ist der Druckabfall jedoch sehr hoch, und dementsprechend können nur flache Betten verwendet werden, um einen vernünftigen Flüssigkeitsdurchsatz zu erhalten. Die Druckabfalleigenschaften der erfindungsgemäß hergestellten porösen Zelluloseperlen bei Verwendung in einer gepackten Säule sind in F i g. 3, Kurve A. wiedergegeben. Die nominale lineare Durchflußgeschwindigekit ist berechnet durch Division des volumetrisehen Durchsatzes an Einsatzflüssigkeit durch die Säule durch die Säulenquerschnittsfläche. In der Praxis beträgt die nominale lineare Durchflußgeschwindigkeit in industriellen Säulenreaktoren weniger als 0,5 cm/Sekunde. Bei einem Reaktor mit einem Durchmesser von 60,96 cm entspricht eine lineare Durchflußgeschwindigkeit von 0,5 cm/Sekunge beispielsweise einem volumetrischen Durchsatz von 5254 I/Std. Bei einer typischen industriellen Verfahrensdurchführung zur Herstellung von Fructose aus Glucose beträgt die Zuckerkonzentration im Einsatzstrom etwa 0,5 kg/i. Die obige Durchflußgeschwindigkeit ergibt mehr ais 27 Mio kg Produkt je 61 cm Säule pro Jahr. Aufgrund der erforderlichen Verweilzeit bei der enzymatischen Reaktion beträgt die lineare Durchflußgeschwindigkeit gewöhnlich weniger als 0,5 cm/Sekunde. Daraus ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäß hergestellten porösen Zelluloseperlen hinsichtlich des Druckabfalls keine ernsten verfahrenstech-An important property of an enzyme carrier is the pressure loss which it causes at different liquid throughputs through an enzyme reactor containing the carrier. DEAE cellulose is currently used industrially as an enzyme carrier in the conversion of glucose into fructose. With DEAE cellulose, however, the pressure drop is very high and accordingly only flat beds can be used to obtain reasonable liquid throughput. The pressure drop properties of the porous cellulose beads made in accordance with the present invention when used in a packed column are shown in FIG. 3, curve A. The nominal linear flow rate is calculated by dividing the volumetric flow rate of feed liquid through the column by the column cross-sectional area. In practice, the nominal linear flow rate in industrial column reactors is less than 0.5 cm / second. For example, for a 60.96 cm diameter reactor, a linear flow rate of 0.5 cm / sec corresponds to a volumetric flow rate of 5254 l / hour. In a typical industrial process for producing fructose from glucose, the sugar concentration in the feed stream is about 0.5 kg / l. The above flow rate results in more than 27 million kg of product per 61 cm column per year. Because of the residence time required in the enzymatic reaction, the linear flow rate is usually less than 0.5 cm / second. It can be seen from this that the porous cellulose beads produced according to the invention do not have any serious procedural

nischun Probleme mit sich bringen, wenn sie als Träger für Enzyme und andere biologisch aktive Agentien in .Süulenrcakioren verwendet werden. Wenn die erfindungsgemäß hergestellten porösen Zelluloseperlen nach entsprechender Derivatbildung für andere mögliche Anwendungen (z. B. Entfernung von Tannin aus Furchtsaft, Wein oder Bier sowie von Metallionen aus verdünnten Lösungen) verwendet werden, kann die Durchflußgeschwindigkeit durch einen Säulenreaktor sehr viel größer als die bisher angegebenen 0.5 cm/Sekunde sein.nischun pose problems when used as carriers for enzymes and other biologically active agents in .Süulenrcakioren are used. If the porous cellulose beads produced according to the invention after corresponding derivative formation for other possible applications (e.g. removal of tannin from fear juice, Wine or beer as well as metal ions from dilute solutions) can be used, the flow rate can a column reactor can be much larger than the previously specified 0.5 cm / second.

Die Strömungseigenschaften und andere physikalische und mechanische Eigenschaften der porösen Zelluloseperlen können durch Vernetzung mit bi- und/oder multifunkuonalen Verbindungen verbessert werden. Kurve B in F i g. 3 zeigt den Druckabfall bei den porösen Zelluloseperlen nach Behandlung mit Tolylen-2,4-diisocyanai und anschließender Enzymimmobilisierung. Oberhalb einer nominalen linearen Durchflußgeschwindigkeit von 2cm/Sckunde werden die unbehandelten Zelluloseperlen (Kurve A) zusammengepreßt und erheblicgh deformiert, was zu einer drastischen Zunahme des Druckabfalls führt. Kurve B hingegen zeigt nur eine geringe Krümmung, was. wenn überhaupt vorhanden, eine nur geringe Deformation der behandelten Perlen anzeigt.The flow properties and other physical and mechanical properties of the porous cellulose beads can be improved by crosslinking with bi- and / or multifunctional compounds. Curve B in FIG. 3 shows the pressure drop in the case of the porous cellulose beads after treatment with tolylene-2,4-diisocyanai and subsequent enzyme immobilization. Above a nominal linear flow rate of 2 cm / second, the untreated cellulose beads (curve A) are compressed and significantly deformed, which leads to a drastic increase in the pressure drop. Curve B, however, shows only a slight curvature, what. if any, indicates little deformation of the treated beads.

Die Behandlung der porösen Zelluloseperlen mit einem Vernetzungsmittel, entweder vor oder nach der Hydrolyse der Perlen, führt zu einer Erhöhung ihrer physikalischen Festigkeit. Auch die Ankopplung von F.n/.ymen erhöht ihre physikalische Festigkeit. Nach der Behandlung mit beispielsweise einem Diisocyanat (ζ. Β. Tolylcn-2,4-Diisocyanat oder Hexamethylendiisocyanat) werden die Perlen in der Tat sehr hart und fest. Die Vernetzung mit Epichlorhydrin verbessert die physikalischen Eigenschaften der porösen Zelluloseperlen ebenfalls. Die Chemie der Vernetzung von Polysacchariden, einschließlich Zellulose und Stärke, ist gut bekannt. Weitere geeignete Vernetzungsmittel sind u. a. Formaldehyd in Salzsäurelösung oder Glutaraldehyd. Viele andere Vernetzungsmittel für Kohlehydrate sind bekannt und z. B. in der US-PS 39 05 954 berschrieben.Treatment of the porous cellulose beads with a crosslinking agent, either before or after Hydrolysis of the pearls increases their physical strength. Also the coupling of F.n / .ymen increases their physical strength. After treatment with, for example, a diisocyanate (ζ. Β. Tolylene-2,4-diisocyanate or hexamethylene diisocyanate) the pearls are indeed very hard and strong. the Crosslinking with epichlorohydrin also improves the physical properties of the porous cellulose beads. The chemistry of the crosslinking of polysaccharides, including cellulose and starch, is well known. Other suitable crosslinking agents include. Formaldehyde in hydrochloric acid solution or glutaraldehyde. Many other crosslinking agents for carbohydrates are known and e.g. B. in US-PS 39 05 954 overwritten.

Im allgemeinen weden die erfindungsgemäß hergestellten porösen Zelluloseperlen nach folgenden Verfahrcnsstiifen hergestellt:In general, the porous cellulose beads produced according to the invention are made according to the following process principles manufactured:

a) Zellulose in einer hydrolysierbaren Form wird in einem inerten, organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel gelöst, wobei das Verhältnis von Zellulosederivat zu Lösungsmittel im allgemeinen im Berich von 1 :20 bis 1:3 (Gewicht: Volumen) liegt, um eine Lösungsmittellösung herzustellen. Das vewendete Lösungsmittel soll ganz oder im wesentlichen mischbar sein mit der Ausfällungslösung, und die Dichte der Lösungsmittellösung soll ausre'chend sein, so daß beim Kontakt mit der Ausfällungslösung das Lösungsmittel leicht mit dieser mischbar ist und das Zellulosederivat ausfällt.a) Cellulose in a hydrolyzable form turns into an inert, organic, water-miscible Solvent dissolved, the ratio of cellulose derivative to solvent in general in the range from 1:20 to 1: 3 (weight: volume) to make a solvent solution. That used Solvent should be wholly or essentially miscible with the precipitation solution, and the density of the Solvent solution should be sufficient so that on contact with the precipitation solution the solvent is easily miscible with this and the cellulose derivative precipitates.

b) Eine Lösungsmittellösung wird in Form von Tröpfchen (z. B. durch Sprühen) in einer Ausfällungslösung verteilt. Beim Kontakt mit der Ausfällungslösung, die ein Tensid enthalten kann, wird das Lösungsmittel in der Ausfällungslösung dispergiert, und es bilden sich poröse Zelluloseperlen durch Koagulation. Diese sinken auf den Boden des Behälters für die Ausfällungslösung. Die Zellulosederivatlösung kann geeigneterweise unter Druck durch eine Sprühdüse in ein Ausfällungslösungsbad gesprüht werden. Falls erwünscht, kann das Bad zur Beschleunigung der Perlenbildung gerührt werden.b) A solvent solution is in the form of droplets (e.g. by spraying) in a precipitation solution distributed. Upon contact with the precipitation solution, which may contain a surfactant, the solvent becomes in dispersed in the precipitating solution, and porous cellulose beads are formed by coagulation. These sink to the bottom of the container for the precipitation solution. The cellulose derivative solution may suitably sprayed under pressure through a spray nozzle into a precipitation solution bath. If desired, the bath can be stirred to accelerate bead formation.

c) Nach erfolgtem Waschen werden die ausgefällten Perlen zur Regenerierung von Zellulose hydrolisiert, wobei poröse Zelluloseperlen mit aktiven Stellen für die Enzymankopplung erhalten werden. Falls erwünscht, können die Perlen zur Verbesserung der Stabilität oder für den Erhalt geeigneter Reaktionssteilen in verschiedener Weise chemisch modifiziert werden. So können die Perlen z. B. «ernetzt werden, um eine größere Stabilität und eine vergrößerte physikalische Festigkeit zu erhalten. Man kann auch zur Veränderung der Oberflächenabsorptionseigenschaften der Zelluloseperlen entweder positiv geladene oder negativ geladene Gruppen durch Substitution in die Perlen einbringen. Die Zellulose selbst ist im allgemeinen hydrophil, und dementsprechend kann man durch Veränderung der Reaktionsstellen deren hydrophile Eigenschaften verändern.c) After washing, the precipitated pearls are hydrolyzed to regenerate cellulose, porous cellulose beads with active sites for enzyme coupling are obtained. If desired, can use the beads to improve the stability or to obtain suitable reaction parts chemically modified in various ways. So the pearls z. B. «be renewed to a obtain greater stability and increased physical strength. You can also change the surface absorption properties of the cellulose beads are either positively charged or negatively Introduce charged groups into the beads by substitution. The cellulose itself is generally hydrophilic, and accordingly, changing the reaction sites can make them hydrophilic Change properties.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten porösen Zelluloseperlen zur Immobilisierung von Enzymen und anderen biologisch aktiven Agentien durch Ankopplung.The invention also relates to the use of the porous cellulose beads produced according to the invention for Immobilization of enzymes and other biologically active agents by coupling.

So kann man z. B. die porösen Zellulcseperlen zu Diethylaminoethyl(DEAE-)Zellulose umwandeln, indem man die Perlen mit N.N-DietHyl^-rhlorethylamJnhydrochlorid in herkömmlicher Weise umsetzt. Die so erhaltenen Perlen enthalten DEAE-Zellulose und sind erfolgreich zur Ankopplung von Glucoseisomerase verwendet worden, die aus Streptomyces-Kulturen erhalten wurde. Es ist ebenfalls eine Verfahrensweise unter Verwendung von Bromcyan zur Immobilisierung von Glucoseisomerase verwendet worden.So you can z. B. convert the porous cellulose beads to diethylaminoethyl (DEAE) cellulose by the beads are reacted in a conventional manner with N.N-DietHyl ^ -rhloroethylamine hydrochloride. The so obtained Pearls contain DEAE cellulose and are successfully used to couple glucose isomerase obtained from Streptomyces cultures. It is also a method of using of cyanogen bromide has been used to immobilize glucose isomerase.

Bei einer anderen Verfahrensweise zur Enzymimmobilisierung auf porösen Zelluloseperlen wird Tolylen-2,4-diisocyanat verwendet. Diisocyanat wurde zur Vernetzung der Zellulose eingesetzt, um die physikalische Festigkeit der porösen Perlen zu verbessern. Es wurde jedoch gefunden, daß erfindungsgemäß hergestellte poröse Zelluloseperlen nach Behandlung mit Diisocyanat Enzyme auf ihre Oberfläche immobilisieren können, indem man einfach die mit Diisocyanat behandelten Perlen und eine Enzymlösung zusammenmischt. Wenn beispielsweise Glucoamylase verwendet wurde, wurden mehr als 1000 internationale Einheiten des Enzyms je g trockene Perlen an den mit Diisocyanat behandelten Perlen angekoppelt und immobilisiert. Angesichts der verbesserten physikalischen Festigkeit der Perlen wird angenommen, daß eine erhebliche Vernetzung eintritt, wenn man trockene poröse Zelluloseperlen in trockenem Aceton in Gegenwart eines Katalysators (z. B. Triethylamin) mit ToIylen-2,4-diisocyanat zusammenbringt. Nach einer ausreichend langen Reaktionszeit wurden die Perlen mit trockenem Aceton gewaschen, um die freien Diisocyanatrückstände zu entfernen. Die Zelluloseperlen scheinen eine große Anzahl von gebundenen Isocyanatgruppen zu besitzen. Beim Mischen der behandelten Perlen mit einer wäßrigen Enzymlösung scheinen die Enzymmoleküle durch die Isocyanatgruppen kovalent an die Zelluloseperlen gebunden zu werden. Es wurde weiterhin gefunden, daß beim Waschen der Perlen mit Wasser die Isocyanatgruppen zu Aminogruppen umgewandelt werden. Auf diese Weise gelang die Immobilisierung eines Enzyms, Glucoamylase, auf Aminozelluloseperlen mit Glutaraldehyd. der bekannt ist für seineAnother approach to enzyme immobilization on porous cellulose beads is tolylene-2,4-diisocyanate used. Diisocyanate was used to cross-link the cellulose in order to reduce the physical To improve the strength of the porous beads. However, it has been found that produced according to the invention porous cellulose beads can immobilize enzymes on their surface after treatment with diisocyanate, by simply mixing together the diisocyanate treated beads and an enzyme solution. if for example glucoamylase was used, more than 1000 international units of the enzyme per g dry beads coupled and immobilized on the beads treated with diisocyanate. Given the improved physical strength of the beads, it is believed that significant crosslinking occurs, when placing dry, porous cellulose beads in dry acetone in the presence of a catalyst (e.g. triethylamine) with tolylene-2,4-diisocyanate. After a sufficiently long reaction time, the Beads washed with dry acetone to remove free diisocyanate residues. The cellulose beads appear to have a large number of isocyanate groups attached. When mixing the treated The enzyme molecules appear covalently on beads with an aqueous enzyme solution through the isocyanate groups the cellulose beads to be tied. It was also found that when washing the pearls with Water the isocyanate groups are converted to amino groups. The immobilization succeeded in this way of an enzyme, glucoamylase, on aminocellulose beads with glutaraldehyde. who is known for his

Fähigkeit, mit Aminogruppen (auf den Perlen und in den Enzymen) zu reagieren und diese zu vernetzen.Ability to react with and crosslink amino groups (on the beads and in the enzymes).

Die erfindungsgemäß hergestellten porösen Zelluloseperlen eignen sich außerdem zur Trennung und Reinigung von Enzymen. Proteinen, Nukleinsäuren und ähnlichen Verbindungen. Die erfindungsgemäß hergestellten Zelluloseperlen könen zur Herstellung von porösen DEAE-Zelluloseperlen derivatisiert werden. Derartige Perien besitzen ausgezeichnete Durchflußeigenschaften und sind dennoch in der Lage, Enzyme, Proteine, Nukleinsäuren und ähnliche Verbindungen wirksam zu trennen. Die Wirksamkeit solcher Verfahren entspricht ohne weiteres den zur Zeit üblichen säulenchromatographischen Verfahren.The porous cellulose beads produced according to the invention are also suitable for separation and cleaning of enzymes. Proteins, nucleic acids and similar compounds. The manufactured according to the invention Cellulose beads can be derivatized to produce porous DEAE cellulose beads. Such Peries have excellent flow properties and are still able to process enzymes, proteins, Effective separation of nucleic acids and similar compounds. The effectiveness of such procedures equates readily the currently customary column chromatographic method.

Man kann die erfindungsgemäß hergestellten porösen Zelluloseperlen auch mit anderen als DEAE-GruppenThe porous cellulose beads produced according to the invention can also have groups other than DEAE

in situ derivatisieren. Dadurch sind die erfindungsgemäß hergestellten Zelluloseperlen für eine Vielzahl vonderivatize in situ. As a result, the cellulose beads produced according to the invention are suitable for a large number of

Λ spezifischen Anwendungen geeignet. So kann man z. B. eine spezielle funktioneile Gruppe an die porösen Zelluloseperlen ankoppeln und die so derivatisierten Perlen dann verwenden, um z. B. Tannin aus Fruchtsaft zu entfernen, indem man Fruchtsaft durch ein Bett von derivatisierten, porösen Zelluloseperlen mit Protein leitet. Λ suitable for specific applications. So you can z. B. couple a special functional group to the porous cellulose beads and then use the thus derivatized beads to z. B. Remove tannin from fruit juice by passing fruit juice through a bed of derivatized, porous cellulose beads containing protein.

Auf ähnliche Weise kann man Metallionen aus verdünnten Lösungen entfernen. Solche Verfahren können z. B. zur Gewinnung von wertvollen Metallionen (z. B. Kupfer- und Goldionen) aus verdünnten Minenlösungen und is -abwassern dienen und würden sich insbesondere für heute übliche Lösungstechniken eignen, bei denen Metalle mittels Säurelösungen aus Erzen extrahiert werden.Metal ions can be removed from dilute solutions in a similar manner. Such methods can e.g. B. for the extraction of valuable metal ions (e.g. copper and gold ions) from dilute mine solutions and is wastewater and would be particularly suitable for solution techniques that are common today, in which metals extracted from ores using acid solutions.

example 1

50 g Zelluloseacetat wurden in 400 ml Lösungsmittel A (zusammengesetzt aus Aceton und Dimethylsulfoxid in einem Volumenverhältnis von 6 :4) unter Bildung einer 12^>%igen (Gewicht/Volumen) Lösung aufgelöst. Die Zelluloselösung wurde dann mit einer Spritzpistole (Farbspritzpistole) unter einem Luftdruck von 1,41 bar in Form feiner Tröpfchen in einen Wassertank gesprüht, der 151 1 Wasser und 4 Tropfen eines üblichen Haushaltsspülmittels enthielt Beim Kontakt mit der Wasseroberfläche koagulieren die Zelluloseacetattröpfchen zu porösen Perlen und sinken auf den Behälterboden. Die porösen Perlen wurden dann gesammelt und gewaschen. Die gewaschenen Perlen wurden dann über Nacht bei Raumtemperatur mit einer etwa 0,15 η Natriumhydroxidlösung deacetyliert Die deacetylierten Perlen wurden dann gewaschen und sauggetrocknet. Die so erhaltenen pcrösen Zelluloseperlen besaßen ein Porenvolumen von mehr als 50 VoL-% ur.d waren für die Enzymimmobilisierung einsatzbereit. F i g. 1 gibt die Teilchengrößeverteilung der erhaltenen porösen Perlen wieder. Elektronenmikroskopische Aufnahmen ergaben, daß die Perlen im allgemeinen kugelförmig waren und das Innere und die Oberfläche der Kugeln die gleiche Struktur besaßen. Die Porengrößen waren sehr gleichmäßig, und die Poren waren gleichmäßig über die gesamten Perlen, wie in den Fig.2. 4(A) und 4(B) gezeigt, verteilt. Die Porengröße der Perlen wurde mit Hilfe von elektronenmikroskopischen Rasteraufnahmen bestimmt. Die Aufnahme von elektronenmikroskopischen Rasteraufnahmen erfordert trockene Proben, und da das Trocknen der Perlen in Luft zu einer Schrumpfung führt, wurden die Perlen nach der kritischen Punkt-Technik mit flüssigem Kohlendioxid getrocknet. Die Porengröße wurde zu etwa iööO Λ bestimmt.50 g of cellulose acetate were dissolved in 400 ml of solvent A (composed of acetone and dimethyl sulfoxide in a volume ratio of 6: 4) to form a 12 ^>% (weight / volume) solution. the Cellulose solution was then sprayed with a spray gun (paint spray gun) under an air pressure of 1.41 bar in Sprayed into a water tank in the form of fine droplets, containing 151 liters of water and 4 drops of a common household detergent When in contact with the surface of the water, the cellulose acetate droplets coagulate to become porous Pearls and sink to the bottom of the container. The porous beads were then collected and washed. the Washed beads were then washed overnight at room temperature with an approximately 0.15 η sodium hydroxide solution deacetylated The deacetylated beads were then washed and suction dried. The so obtained Porous cellulose beads had a pore volume of more than 50% by volume and were used for enzyme immobilization ready to use. F i g. 1 shows the particle size distribution of the porous beads obtained. Electron microscopic Photographs indicated that the beads were generally spherical in shape and the interiors and the surface of the spheres had the same structure. The pore sizes were very uniform, and the Pores were uniform over the entire beads, as in Figure 2. 4 (A) and 4 (B). the The pore size of the pearls was determined with the aid of electron microscopic raster images. The recording of electron micrographs requires dry samples, and since the drying of the Pearls in air lead to shrinkage, the pearls were liquid according to the critical point technique Carbon dioxide dried. The pore size was determined to be about iööO Λ.

Example 2

Gemäß der Verfahrensweise von Beispiel 1 wurden unter Verwendung einer 10%igen (Gewicht/Volumen) Zelluloseacetatlösung in Lösungsmittel A ebenfalls poröse Perlen hergetellt. Auch diese Perlen eigneten sich gut für die Enzymimmobilisierung.Following the procedure of Example 1, using a 10% (weight / volume) Cellulose acetate solution in solvent A also produces porous beads. These pearls worked well too for enzyme immobilization.

Example 3

Es wurde eine 10%ige (Gewicht/Volumen) Zelluloseacetatlösung in Lösungsmittel B (Aceton und Formamid in einem Volumenverhältnis von 7 :3) hergestellt. Die Zelluloseacetatlösung wurde dann nach der Verfahrensweise gemäß Beispiel 1 versprüht und hydrolysiert. Es wurden hochporöse Zelluloseperlen mit einem Porenvolumen von mehr als 50 Vol.-% erhalten.A 10% (w / v) cellulose acetate solution in solvent B (acetone and formamide) was used in a volume ratio of 7: 3). The cellulose acetate solution was then made according to the procedure sprayed according to Example 1 and hydrolyzed. There were highly porous cellulose beads with a pore volume of more than 50% by volume.

Example 4

Beispiel 2 wurde wiederholt mit dem Unterschied, daß eine Lösung mit einem anderen im Handel erhältlichen Zelluloseacetat hergestellt wurde. Die erhaltenen porösen Perlen besaßen ausgezeichnete Eigenschaften für die Enzymimmobilisierung.Example 2 was repeated with the difference that one solution with another commercially available Cellulose acetate was produced. The obtained porous beads had excellent properties for Enzyme immobilization.

Example 5

Die Verfahrensweise gemäß Beispiel 2 wurde unter Verwendung einer 10%igen (Gewicht/Volumen) Lösung von Zellutosetriaeetat in Lösungsmittel A wiederholt. Die resultierenden Perlen besaßen eine ausgezeichnete Porosität für die Enzymimmobilisierung.The procedure of Example 2 was carried out using a 10% (weight / volume) solution of Zellutosetriaeetat in solvent A repeated. The resulting pearls were excellent Porosity for enzyme immobilization.

Wie schon mehrfach erwähnt, kann Zellulose als Trägermaterial für die Immobilisierung von Enzymen undAs already mentioned several times, cellulose can be used as a carrier material for the immobilization of enzymes and

anderen biologisch aktiven Agentien verwendet werden. Zellulose ist oft als Träger gewählt worden, weil sie billig, chemisch stabil und gegenüber mikrobiologischer Verunreinigung resistent ist. Außerdem besitzt ZcIIuIose drei Hydroxylgruppen in jeder Glucoseanhydrideinheit. die die Vielseitigkeit der Zellulose und auch die große Kapazität für die Immobilisierung einer gewünschten Substanz liefern.other biologically active agents can be used. Cellulose has often been chosen as a carrier because of it cheap, chemically stable and resistant to microbiological contamination. In addition, ZcIIuIose three hydroxyl groups in each glucose anhydride unit. which is the versatility of cellulose and also the great Provide capacity for the immobilization of a desired substance.

Der Hauptnachteil bei der Verwendung von Zellulose als ein Trägermaterial ist der. daß Zellulose eine faserige Form besitzt und ihr die erforderliche mechanische Festigkeit fehlt. Mit Zellulose gepackte Rcnkiori:nThe main disadvantage of using cellulose as a carrier material is that. that cellulose is a has a fibrous form and lacks the required mechanical strength. Backs packed with cellulose: n

besitzen schlechte Durchflußeigenschaften, weisen einen hohen Druckverlauft auf und führen zur Kanalbildung. Diese Probleme sind durch die erfindungsgemäß hergestellten Zeüuloseperlen, die eine größere mechanische Festigkeit und verbesserte Durchflußeigenschaften als bekannte Materialien besitzen, gelöst. Da jedoch die Slrukliir der erfindungsgemäß hergestellten Zelluloscperlen sich von normaler Zellulose unterscheidet, kann auch die Beladung mit Enzymen und die Stabilität der immobilisierten Enzyme anders sein als bei normaler Zellulose. Die chemischen Vorgänge bei der Herstellung von immobilisierten Enzymen beeinflussen nicht nur die Beladung und die Stabilität des Enzyms auf den Zelluloseperlen, sondern auch deren mechanische Festigkeit Jede chemische Verfahrensweise für die Immobilisierung von Enzymen, die die mechanische Festigkeit von Zelluloseperlen erhöht, verbessert gleichzeitig die Durchflußeigenschaften in einem Reaktor. Dies ergibt sich auch aus den folgenden Beispielen:have poor flow properties, have a high pressure profile and lead to channel formation. These problems are caused by the cellulose beads produced according to the invention, which have a greater mechanical Have strength and improved flow properties than known materials, solved. However, since the The structure of the cellulose beads produced according to the invention differs from normal cellulose also the loading of enzymes and the stability of the immobilized enzymes may be different from normal Cellulose. The chemical processes involved in the production of immobilized enzymes not only influence them the loading and the stability of the enzyme on the cellulose beads, but also their mechanical strength Any chemical process for the immobilization of enzymes that reduce the mechanical strength of Cellulose beads increases, at the same time improves the flow properties in a reactor. This arises also from the following examples:

Example 6

1 g poröse Zelluloseperlen wurden bei 50°C mit 10 ml Acrylnitril (CH₂ = CH-C=N) cyanethyliert Die so behandelten Zelluloseperlen wurden dann bei einem pH—Wert von 6,5 bis 6,7 bei 50 bis 100°C 4 Stunden lang mit Hydroxylamin behandelt Das resultierende modifizierte, poröse Perlenprodukt enthielt1 g of porous cellulose beads were cyanoethylated at 50 ° C. with 10 ml of acrylonitrile (CH ₂ = CH-C = N) Treated with hydroxylamine for hours. The resulting modified, porous bead product contained

NH₂ NH ₂

I
— C = NOH-GruppenI.
- C = NOH groups

und eignet sich zur Absorption von schweren Ionen wie Eisen(II), Eisen(III) und K.upfer(II)-Ionen.and is suitable for the absorption of heavy ions such as iron (II), iron (III) and copper (II) ions.

Example 7

Eine Suspension von 2,5 g porösen Zelluloseperlen wurde mit 2,5 ml Hexamethylendiisocyanat und Triäthylamin behandelt und anschließend in Wasser hydrolysiert Das Produkt wurde dann bei einem pH-Wert von 5 mit 50 ml 0,5 m O-Methylisoharnstoff behandelt Das erhaltene Produkt besitzt die folgende funktionell Gruppe:A suspension of 2.5 g of porous cellulose beads was mixed with 2.5 ml of hexamethylene diisocyanate and triethylamine treated and then hydrolyzed in water. The product was then at a pH of 5 with 50 ml of 0.5 m O-methylisourea treated The product obtained has the following functional group:

NH₂ ^θ NH ₂ ^θ

I poröse Zelluloseperlen —N — C — NH₂ I porous cellulose beads —N - C - NH ₂

die sich als Anionenaustauscher eignet.which is suitable as an anion exchanger.

Example 8

5 g poröse, gemäß Beispiel 1 hergestellte Zelluloseperlen wurden zu 100 ml 36% Formaldehyd und 200 ml 37% Salzsäure gegeben. Nach l'^stündigem Stehen bei Raumtemperatur wurden die Perlen abfiltriert und anschließend mit Wasser und 0,2% Natriumcarbonatlösung gewaschen. Dann wurden die Perlen bei 75 bis 8O⁰C getrocknet. Die resultierenden vernetzten, porösen Zelluloseperlen zeigten eine große physikalische Festigkeit.5 g of porous cellulose beads produced according to Example 1 were added to 100 ml of 36% formaldehyde and 200 ml of 37% hydrochloric acid. After standing for 1.5 hours at room temperature, the beads were filtered off and then washed with water and 0.2% sodium carbonate solution. Then, the beads were dried at 75 to 8O ⁰ C. The resulting crosslinked, porous cellulose beads exhibited great physical strength.

Example 9

3 g poröse Zelluloseperlen wurden gemäß Beispiel 8 mit Formaldehyd vernetzt. Die Perlen wurden dann mit 3 g 2-Chlortriäthylamin behandelt. Nach 35minütigem Erhitzen der Mischung auf eine Temperatur von 80 bis 85°C wurden die Perlen nacheinander mit Natriumchloridlösung, Natriumhydroxidlesung, Salzsäure, Wasser und Ethanol gewaschen. Die so erhaltenen vernetzten porösen DEAE-Zelluloseperlen besaßen eine ausgezeichnete Porosität bei einem Porenvolumen von mehr als 50 Vol.-%.3 g of porous cellulose beads were crosslinked according to Example 8 with formaldehyde. The pearls were then using Treated 3 g of 2-chlorotriäthylamine. After heating the mixture for 35 minutes at a temperature of 80 to 85 ° C the beads were successively with sodium chloride solution, sodium hydroxide reading, hydrochloric acid, water and washed with ethanol. The crosslinked porous DEAE cellulose beads thus obtained were excellent in quality Porosity with a pore volume of more than 50% by volume.

Beispiel 10Example 10

0,5 g poröse Zelluloseperlen wurden in 5 ml 0,2 η Natriumhydroxid und 5 ml Epichlorhydrin dispergiert. Die Dispersion wurde dann für mehrere Minuten auf eine Temperatur von 80°C erwärmt. Anschließend wurden die Perlen gewaschen. Die so behandelten vernetzten porösen Perlen besaßen eine größere Festigkeit als die porösen Perlen vor der Vernetzung. Nasse, gemäß Beispiel 1 hergestellte Zelluloseperlen wurden in Aceton gewaschen. Die gewaschenen Perlen wurden dann in trockenem Aceton suspendiert, das 0,6 ml Triethylamin je g Zellulose enthielt. Zu dieser Suspension wurden bei O⁰C 1,6 ml TolyIen-2,4-diisocyanat je g Zelluloseperlen gegeben. Nach 30 Minuten wurden die Perlen mit trockenem Aceton gewaschen und anschließend abfiltriert. Die resultierenden porösen Zelluloseperlen enthielten reaktive Isocyanatgruppen. die dann durch Zusatz von Wasser zu Aminogruppen hydrolisiert werden konnten.0.5 g of porous cellulose beads were dispersed in 5 ml of 0.2 η sodium hydroxide and 5 ml of epichlorohydrin. The dispersion was then heated to a temperature of 80 ° C. for several minutes. The pearls were then washed. The crosslinked porous beads thus treated had a strength greater than that of the porous beads before crosslinking. Wet cellulose beads produced according to Example 1 were washed in acetone. The washed beads were then suspended in dry acetone containing 0.6 ml of triethylamine per g of cellulose. 1.6 ml of 2,4-tolyene-2,4-diisocyanate per g of cellulose beads were added to this suspension at ^{0 ° C.} After 30 minutes the beads were washed with dry acetone and then filtered off. The resulting porous cellulose beads contained reactive isocyanate groups. which could then be hydrolyzed to amino groups by adding water.

Beispiel 11Example 11

Die porösen Zelluloseperlen gemäß Beispiel 6 wurden zu einer 0,05 m Natriumacetatlösung (pH =5,2) gegeben, die 1600 ppm Kupfer(ll)lonen enthielt. Nach 1 Stunde hatten die Zelluloseperlen, bezogen auf ihr Gewicht, 6,3% Kupfer(ll)lonen aufgenommen.The porous cellulose beads according to Example 6 were added to a 0.05 M sodium acetate solution (pH = 5.2), which contained 1600 ppm copper (II) ions. After 1 hour, the cellulose beads, based on their weight, 6.3% copper (II) ions added.

Es wurde ferner gefunden, daß, wenn die erfindungsgemäß hergestellten porösen Zelluloseperlen vor ihrer Verwendung getrocknet und/oder erhitzt (z.B. auf 100°C) werden, die resultierenden Perlen eine erhöhte physikalische Festigkeit besitzen.It has also been found that if the porous cellulose beads produced according to the invention before their Using dried and / or heated (e.g. to 100 ° C), the resulting pearls are increased possess physical strength.

Anwendungsbeispiel 1Application example 1

1 g poröse, gemäß Beispiel 1 hergestellte Zelluloseperlen wurden in 15 ml Wasser dispergiert, das mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 11,5 eingestellt worden war und auf einer konstanten Temperatur von ?0°C gehalten wurde. Zu dieser Dispersion wurde 1 g Bromcyan gegeben. Der pH-Wert wurde mit 1 η NaOH auf 11,5 ίο gehalten. Nach 15 Minuten wurden die Perlen mit einem Phosphatpuffer (0,1 n) bei pH 7,0 und 0°C gewaschen. Dann wurden 15 ml Glucoamylaselösung (30 mg/ml) zu den Perlen gegeben. Die Mischung wurde über Nacht stehengelassen. Die so hergestellten Perlen enthielten bei 60⁰C und unter Verwendung von 5% Maltose als Substrat 1830 Enzymaktivitätseinheiten je g Trockengewicht an Zelluloseperlen. Eine Enzymaktivitätseinheit ist definiert als diejenige Menge, die 1 Mikromol Produkt pro Minute erzeugt.1 g of porous cellulose beads produced according to Example 1 were dispersed in 15 ml of water which had been adjusted to a pH of 11.5 with sodium hydroxide and was kept at a constant temperature of −0 ° C. 1 g of cyanogen bromide was added to this dispersion. The pH was kept at 11.5 o with 1 η NaOH. After 15 minutes the beads were washed with a phosphate buffer (0.1N) at pH 7.0 and 0 ° C. Then 15 ml of glucoamylase solution (30 mg / ml) was added to the beads. The mixture was left to stand overnight. The beads produced in this way contained 1830 enzyme activity units per g dry weight of cellulose ^{beads at 60 ° C. and using 5% maltose as substrate.} A unit of enzyme activity is defined as the amount that produces 1 micromole of product per minute.

Anwendungsbeispiel 2Application example 2

Gemäß Beispiel 1 hergestellte poröse Zelluloseperlen (0,2 g) wurden in 5 ml Aceton dispergiert. Zu dieser Dispersion wurden 0,2 ml Triethylamin und 0,2 ml Tolylen-2,4-diisocyanat gegeben. Nach 30 Minuten wurden die Perlen mit Aceton und dann mit einem Acetatpuffer bei einem pH-Wert von 4,75 gewaschen. Die Perlen wurden dann mit 5 ml Glucoamylaselösung (25 mg/ml) versetzt Das dadurch auf den Perlen immobilisierte Enzym ergab eine Aktivität von 2000 Einheiten/g Zelluloseperlen.Porous cellulose beads (0.2 g) prepared according to Example 1 were dispersed in 5 ml of acetone. To this 0.2 ml of triethylamine and 0.2 ml of tolylene-2,4-diisocyanate were added to the dispersion. After 30 minutes the Beads washed with acetone and then with an acetate buffer at pH 4.75. The pearls were then 5 ml of glucoamylase solution (25 mg / ml) were added. This resulted in the enzyme immobilized on the beads an activity of 2000 units / g cellulose beads.

Anwendungsbeispiel 3Application example 3

200 mg Glucoseisomerase in Nialeinsäurepufferlösung wurden auf 2 g gemäß Anwendungsbeispiel 2 hergestellten Zelluloseperlen immobilisiert. Die Zelluloseperlen enthielten bei 60° C unter Verwendung von 9% Fructose als Substrat 90 Enzymaktivitätseinheiten pro g Zelluloseperlen.200 mg of glucose isomerase in nialeic acid buffer solution were produced per 2 g according to application example 2 Cellulose beads immobilized. The cellulose beads contained at 60 ° C using 9% Fructose as substrate 90 enzyme activity units per g cellulose beads.

Anwendungsbeispiel 4Application example 4

300 mg Invertase in 5 R/l Acete<puffer wurden auf 05 g porösen, gemäß Anwendungsbeispiel 2 hergetelltcn Zelluloseperlen immobilisiert. Die Zelluloseperlen enthielten 3000 Aktivitätseinheiten pro g verwendete Zellulose. 300 mg invertase in 5 R / l acetate buffer were immobilized on 05 g of porous cellulose beads produced according to application example 2. The cellulose beads contained 3000 units of activity per g of cellulose used.

Anwendungsbeispiel 5Application example 5

50 mg Lactase in einem Phosphatpuffer (pH = 7,0) wurden auf 0,5 g gemäß Anwendungsbeisp'el 1 hergestellten Zelluioseperlen immobilisiert. Die resultierenden Zelluloseperlen enthielten bei 30°C unter Verwendung von 1 % Lactose als Substrat etwa 80 Enzymaktivitätseinheiten pro g Zelluloseperlen.50 mg of lactase in a phosphate buffer (pH = 7.0) were prepared to 0.5 g according to application example 1 Cellulose beads immobilized. The resulting cellulose beads contained at 30 ° C using from 1% lactose as substrate about 80 enzyme activity units per g cellulose beads.

, Anwendungsbeispiel 6, Application example 6

500 mg Glucoseisomerase wurden in 15OmI Maleinsäurepuffer (0,01 m, pH = 5.5) gelöst. Die Enzymlösung wurde durch 5 g poröse, gemäß Anwendungsbeispiel 11 hergestellte vernetzte Zelluloseperlen gepumpt. Die DEAE-Zelluloseperlen enthielten daraufhin 100 Enzymaktivitätseinheiten pro g Zelluloseperlen.500 mg of glucose isomerase were dissolved in 150 ml of maleic acid buffer (0.01 M, pH = 5.5). The enzyme solution was pumped through 5 g of porous, crosslinked cellulose beads produced according to Application Example 11. the DEAE cellulose beads then contained 100 enzyme activity units per g of cellulose beads.

Anwendungsbeispiel 7Application example 7

0,25 g poröse, gemäß Beispiel 1 hergetellte Zelluloseperlen wurden in eine 3%ige Glutaraldehyd- und 0.1 m MgCb-Lösung eingeweicht. Nach dem Trocknen durch Absaugen in einem Büchner-Trichter wurden die Proben 30 Minuten auf 8O⁰C erwärmt. Dann wurden 5 ml Glucoamylaselösung (25 mg/ml) zu den Perlen gegeben. Nach Stehenlassen über Nacht enthielten die so hergestellten Perlen etwa 200 Enzymaktivitätseinheiten pro g trockene Zelluioseperlen.0.25 g of porous cellulose beads produced according to Example 1 were soaked in a 3% glutaraldehyde and 0.1 M MgCb solution. After drying by suction on a Buchner funnel, the samples were heated for 30 minutes at 8O ⁰ C. Then 5 ml of glucoamylase solution (25 mg / ml) was added to the beads. After standing overnight, the beads so produced contained about 200 units of enzyme activity per g of dry cellulose beads.

Anwendungsbeispiel 8Application example 8

0,2 g gemäß Beispiel 1 hergestellte Zelluioseperlen wurden in 10 ml destilliertem Wasser suspendiert, der pH-Wert wurde bei 20°C durch Zusatz von 1 η NaOH auf 11,5 eingestellt. 0,2 g CNBr wurden zu der Zeliuloscperlensuspension gegeben. Dies geschah in kleinen Portionen, und der pH-Wert wurde mit Hilfe einer automati-•|. sehen Tariervorrichtung unter Verwendung von 1 η NaOH konstant gehalten. Nach 20 Minuten wurden die0.2 g of cellulose beads produced according to Example 1 were suspended in 10 ml of distilled water, the The pH was adjusted to 11.5 at 20 ° C. by adding 1 η NaOH. 0.2 g of CNBr was added to the cellulose bead suspension given. This was done in small portions, and the pH was checked with the help of an automatic • |. see taring device kept constant using 1 η NaOH. After 20 minutes the

:j; Perlen mit eiskaltem destilliertem Wasser und einer geeigneten Pufferlösung gewaschen. In einer geeigneten: j; Wash beads with ice-cold distilled water and a suitable buffer solution. In a suitable

]§ Pufferlösung gelöste Enzyme wurden zu den gewaschenen Zelluioseperlen gegeben. Die bei diesem Verfahren ] § Buffer solution, dissolved enzymes were added to the washed cellulose beads. The in this procedure

; ' verwendete Zellulose wurde 4 Stunden mit 18% (Gewicht/Volumen) NaOH mercerisiert und dann mit dcstillier-; The cellulose used was mercerized for 4 hours with 18% (weight / volume) NaOH and then with distilled

;. 65 tem Wasser gewaschen.;. 65 tem water washed.

27 Yl 96527 yl 965

Anwendungsbeispiel 9Application example 9

2 g sauggetrocknete, gemäß Beispiel 1 hergestellte Zelluloseperlen wurden zur Entfernung von feuchtigkeit mit Aceton gewaschen und in 10 ml Aceton suspendiert. Dann wurden 0,1 ml Triäthylamin oder Dibutylzinndiacetat als Katalysator zugesetzt Anschließend wurde die Zelluloseperlensuspension mit 0,1 ml ToIylen-2,4-diisocyanat oder Hexamethylendiisocyanat versetzt Nach 45minütiger Reaktion bei Raumtemperatur wurden die Zelluloseperlen zur Entfernung von überschüssigem Diisocyanat mit Aceton gewaschen und anschließend zur Entfernung des Acetons mit Wasser gewaschen. In einer geeigneten Pufferlösung gelöste Enzyme wurden zu den Zelluloseperlen gegeben. Die Zelluloseperlen wurden bei 4° C über Nacht gelagert2 g of suction-dried cellulose beads produced according to Example 1 were used to remove moisture washed with acetone and suspended in 10 ml of acetone. Then 0.1 ml of triethylamine or dibutyltin diacetate were added added as a catalyst. The cellulose bead suspension was then added with 0.1 ml of ethylene-2,4-diisocyanate or hexamethylene diisocyanate added. After 45 minutes of reaction at room temperature, the Cellulose beads washed with acetone to remove excess diisocyanate and then used for Removal of the acetone washed with water. Enzymes dissolved in a suitable buffer solution became too given to the cellulose beads. The cellulose beads were stored at 4 ° C. overnight

10 Anwendungsbeispiel 10 10 Application example 10

Aryldiisocyanat wurde an gemäß Anwendungsbeispiel 9 hergestellte Zelluloseperlen angekoppelt Bevor die Enzymlösung zugesetzt wurde, wurden die Zelluloseperlen in destilliertem Wasser suspendiert Es wurden 0,1 ml Triethylamin zugesetzt, um die Reaktion zwischen Isocyanat und Wasser zur Bildung von Arylaminzelluloseperlen zu katalysieren. Das Arylaminderivat wurde dann diacetiert mit NaNOj in HCl. In einer geeigneten Pufferlösung suspendierte Enzyme wurden dann an die Zelluloseperlen angekoppeltAryl diisocyanate was coupled to cellulose beads produced according to Application Example 9 Enzyme solution was added, the cellulose beads were suspended in distilled water. There were 0.1 ml Triethylamine is added to prevent the reaction between isocyanate and water to form arylamine cellulose beads to catalyze. The arylamine derivative was then diacetated with NaNOj in HCl. In a suitable buffer solution suspended enzymes were then coupled to the cellulose beads

Anwendungsbeispiel 11Application example 11

Gemäß Anwendungsbeispiel 9 an Zellulose angekoppeltes Diisocyanat reagiert mit Wasser n<it oder ohne Zusatz eines tertiären Amins als Katalysator tu Aminogruppen. Glutaraldehyd wird verwendet, um uas Enzym durch Vernetzung der Aminogruppen des Enzyms und der Zelluloseperlen an die Zelluloseperlen zu koppeln.According to application example 9, diisocyanate coupled to cellulose reacts with or without water Addition of a tertiary amine as a catalyst for amino groups. Glutaraldehyde is used to make uas an enzyme by crosslinking the amino groups of the enzyme and the cellulose beads to couple to the cellulose beads.

Anwendungsbeispiel 12Application example 12

2 g sauggetrocknete, gemäß Beispiel 1 hergestellte Zelluloseperlen wurden in 10 ml 3% Glutaraldehyd suspendiert Die Konzentration der Suspension an MgCb betrugt 0,1 m. Die Suspension wurde dann 30 Minuten auf 100⁰C erhitzt Dann wurden die Zelluloseperlen mit destilliertem Wasser gewaschen. Die gewaschenen Zelluloseperlen wurden mit in einer geeigneten Pufferlösung gelösten Enzymen versetzt Die Reaktionsmischung wurde bei 4° C über Nacht stehengelassen.2 g sauggetrocknete, according to Example 1 Cellulose beads produced were suspended in 10 ml of 3% glutaraldehyde, the concentration of the suspension to 0.1 m MgCl Con t The suspension was then for 30 minutes at 100 ⁰ C. Then the heated cellulose beads were washed with distilled water.. The washed cellulose beads were treated with enzymes dissolved in a suitable buffer solution. The reaction mixture was left to stand at 4 ° C. overnight.

Anwendungsbeispiel 13Application example 13

1 g gemäß Beispiel 1 hergestellte Zelluloseperlen wurden mit 10 ml 10% 3-AminopropyltriethoxysiIan in Toluol 4 Stunden am Rückfluß gekocht Die Zelluloseperien wurden dann filtriert und mit Aceton gewaschen. Die Zelluloseperien wurden dann mit ener 2,5%igen (Gewicht/Volumen) Glutaraldehydlösung in 0,1 m Phosphatpuffer (pH = 7,0) versetzt und unter gelegentlichem Rühren 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wurden die Zelluloseperien sorgfältig mit Wasser und einer geeigneten Pufferlösung gewaschen, !n einer geeigneten Pufferlösung aufgelöste Enzyme wurden dann zu den Zelluloseperien gegeben. Die Reaktionsmischung wi—de bei 4°C über Nacht stehengelassen. 1 g of cellulose beads produced according to Example 1 were mixed with 10 ml of 10% 3-aminopropyltriethoxysilane in Toluene refluxed for 4 hours. The cellulose series was then filtered and washed with acetone. The cellulose series were then with a 2.5% (weight / volume) glutaraldehyde solution in 0.1 m Phosphate buffer (pH = 7.0) was added and the mixture was left to stand for 1 hour at room temperature with occasional stirring. Then the cellulose series were carefully washed with water and a suitable buffer solution,! N Enzymes dissolved in a suitable buffer solution were then added to the cellulose series. The reaction mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight.

Anwendungsbeispiei 14Application example 14

Gemäß Beispiel 1 hergestellte poröse Zelluloseperlen wurden zuerst mit 36% Formaldehyd und 37% HCI in einem Volumenverhältnis von 5 :1 vernetzt. Die vernetzten Zelluloseperien (5 g Trockengewicht) wurden in 50 ml kalter 1,5 η NaOH-Lösung suspendiert Dann wurden 6 g 2-Chlortriethylaminhydrochlorid zugesetzt, und die Mischurg wurde 35 Minuten lanj auf 80 bis 85°C erwärmt. Dann wurde die Mischung in einem Eisbad abgekühlt und filtriert. Die Zelluloseperien wurden dann 3mal abwechselnd mit 500 ml 2 m NaCl-Lösung, 200 ml 1 η NaOH und 200 ml 1 η NaOH gewaschen. Nach nochmaligem Waschen mit 200 ml 1 η NaOH wurden die Zelluloseperien mit destilliertem Wasser gewaschen, bis der pH-Wert des Waschwassers neutral war. Die Reaktion mit 2-Chlortrielhylaminhydrochlorid wurde wiederholt, um einen höheren Substitutionsgrad zu erzielen. In einer geeigneten Pufferlösung gelöste Enzyme wurden zu den Zelluloseperien gegeben. Die Reaktionsmischung wur^e bei 4 ^JC über Nacht stehengelassen.Porous cellulose beads produced according to Example 1 were first crosslinked with 36% formaldehyde and 37% HCl in a volume ratio of 5: 1. The crosslinked cellulose series (5 g dry weight) were suspended in 50 ml of cold 1.5 η NaOH solution. Then 6 g of 2-chlorotriethylamine hydrochloride were added and the mixer was heated to 80 to 85 ° C. for 35 minutes. Then the mixture was cooled in an ice bath and filtered. The cellulose series were then washed 3 times alternately with 500 ml of 2 M NaCl solution, 200 ml of 1 η NaOH and 200 ml of 1 η NaOH. After washing again with 200 ml of 1 η NaOH, the cellulose series were washed with distilled water until the pH of the washing water was neutral. The reaction with 2-chlorotrielhylamine hydrochloride was repeated in order to achieve a higher degree of substitution. Enzymes dissolved in a suitable buffer solution were added to the cellulose series. The reaction mixture was left to stand at 4 ^° C. overnight.

Anwendungsbeispiel 15Application example 15

Hexamethylendiisocyanat wurde an Zelluloseperien, wie in Beispiel 7 beschrieben, angekoppelt, und dann wurden die Isocyanatgruppen, wie in Anwendungsbeispiel 10 beschrieben, zu Aminogruppen hydrolisiert O-Methylisoharnstoff wurde zu den Zellu'oseperlen gegeben, um die Guanidinfunktion in die derivatisierten Perlen einzubringen.Hexamethylene diisocyanate was coupled to cellulose series as described in Example 7, and then the isocyanate groups were, as described in Application Example 10, hydrolyzed to amino groups O-methylisourea was added to the cellulose beads to convert the guanidine function into the derivatized Bring in pearls.

Die Enzymimmobilisierung in den Anwendungsbeispielen 8—13 erfolgt durch kovalente Bindungen, während in den Anwendungsbeispielen 14 und 15 eine ionische Adsorption stattfindet. Die Perlen gemäß Anwendungsbeispielen 13 bis 15 wurden mit Glucoamylase, Glucoseisomerase und Invertase beladen, und es wurde die jeweilige Enzymbeladung gemessen.The enzyme immobilization in Application Examples 8-13 takes place through covalent bonds, while in the application examples 14 and 15 an ionic adsorption takes place. The beads according to Application Examples 13 to 15 were loaded with glucoamylase, glucose isomerase and invertase, and it was the respective enzyme load measured.

Die durch kovalente Bindungen immobilisierten Enzyme wurden mit 2 m NaCl-Lösung zur Entfernung der adsorbierten Enzyms gewaschen. Einige Eigenschaften der immobilisierten Enzyme sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Daraus geht hervor, daß die für normale Zellulose verwendete Chemie auch für Zelluloseperien verwendet werden kann. Die 'Ursache, daß die Zelluloseperien eine höhere Enzymbeladungskapazität als normale Zellulose besitzen, deutet darauf hin, daß die porösen Zelluloseperien eine größere Oberfläche besitzen.The enzymes immobilized by covalent bonds were treated with 2 M NaCl solution to remove the adsorbed enzyme washed. Some properties of the immobilized enzymes are shown in Table 2. It can be seen that the chemistry used for normal cellulose is also used for cellulose series can be. The 'cause that the cellulose series has a higher enzyme loading capacity than normal Having cellulose indicates that the porous cellulose series have a larger surface area.

27 M 27 M.

AnwendungsbeispielApplication example

Proteine und Enzyme können nach der folgenden Verfahrensweis getrennt und gereinigt werden. 2 g Glucoseisomerase (Strep, albus) wurden in 20 ml einer 0,01 m Phosphatpufferlösung (pH = 7,0) suspendiert, und die Suspension wurde zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde in eine mit gemäß Beispiel 9 hergestellten porösen DEAE-Zelluloseperlen gepackte Säule gegeben. Das Bettvolumen betrug 30 ml und der Säulendurchmesser 1,5 cm. Die Säule wurde mit 0.01 m Phosphatpuffer (pH = 7,0) gewaschen. Die Säule wurde dann mit einer NaCI-Gradientlösung in 0,01 m Phosphatpuffer eluiert. Die Konzentration an Glucoseisomerase in den aus der Säule austretenden Fraktionen betrug 0,25 bis 0,45 m.Proteins and enzymes can be separated and purified using the following procedure. 2 g of glucose isomerase (Strep, albus) were suspended in 20 ml of a 0.01 M phosphate buffer solution (pH = 7.0), and the Suspension was centrifuged. The supernatant solution was prepared according to Example 9 in a porous DEAE cellulose beads packed column. The bed volume was 30 ml and the column diameter 1.5 cm. The column was washed with 0.01 M phosphate buffer (pH = 7.0). The column was then fitted with a NaCl gradient solution eluted in 0.01 M phosphate buffer. The concentration of glucose isomerase in the from the Fractions emerging from the column were 0.25 to 0.45 m.

Tabel

Enzymbeladung von porösen ZelluloseperlenEnzyme loading of porous cellulose beads

EnzymeEnzymes ImmobilisierungsImmobilization Hierzu 3 BlattFor this purpose 3 sheets Enzymbelaclung derEnzymbelaclung der Zeichnungendrawings VersuchsbedingungenTest conditions verfahren:procedure: Zellulose. IU*)/gCellulose. IU *) / g AnwendungsbeispielApplication example (berechnet aus der(calculated from the AnfangsreaktionsInitial reaction geschwindigkeit)speed) normale porösenormal porous Zellulose ZelluloseCellulose cellulose perlenpearls Glucoamyiase (A. Oryzae)Glucoamyias (A. oryzae) 88th 800 1800800 1800 10% M al tose, 60° C10% maltose, 60 ° C 99 550550 10% Maltose, 60° C10% maltose, 60 ° C 1010 275275 10% Maltose,40°C10% maltose, 40 ° C 1111th 530530 5% Maltose,60°C5% maltose, 60 ° C 1212th 80 19080 190 10% M al tose, 60° C10% maltose, 60 ° C 1313th 200200 10% M al tose, 60° C10% maltose, 60 ° C 1414th 3000 90003000 9000 10% MaItOSe₁OO⁰C10% MaItOSe ₁ OO ⁰ C Glucoamylase (A. Niger)Glucoamylase (A. Niger) 1515th 10001000 10% MaItOSe₁OO¹C10% MaItOSE ₁ OO ¹ C GlucoseisomeraseGlucose isomerase 99 9090 0,5 M Fructose, b0° C0.5 M fructose, b0 ° C (Strep, albus)(Strep, albus) 1414th 300300 0,5 M Fructose. 60° C0.5 M fructose. 60 ° C 1515th 160160 0,5 M Fructose. 60° C0.5 M fructose. 60 ° C Invertase (Candida utilis)Invertase (Candida utilis) 99 11401140 0.125 M Sucrose. 45°C0.125 M sucrose. 45 ° C 1414th 20002000 0,125 M Sucrose. 45° C0.125 M sucrose. 45 ° C 1515th 18401840 0,125 M Sucrose. 45" C0.125 M sucrose. 45 "C ·) IU = Internationale Einheiten·) IU = international units

1212th

Claims

Patent claims:

1. Process for the production of porous cellulose beads, which can be used as a carrier for enzymes and others Biologically active agendas are suitable, characterized in that one

(a) a hydrolyzable cellulose derivative in an inert, water-miscible solvent in one Ratio of 1:20 to 1: 3 weight / volume to a solution with a greater density than the precipitation solution dissolves

(b) the solution thus prepared in the form of droplets in one of water, an aqueous solution / on ίο non-ionic or ionic surfactants, a mixture of water and ethanol or methanol or

a hydrocarbon or hydrocarbon mixture existing precipitation solution distributed and as a result, the cellulose derivative precipitates in the form of uniformly porous beads,

(c) separating the precipitated beads from the solution,

(d) washing the separated porous beads with water,

(e) the washed beads to convert to cellulose and to increase the active sites for the

Coupling with enzymes and other biologically active agendas hydrolyzed,
(f) the hydrolyzed beads to obtain porous cellulose beads with evenly distributed pores and a pore volume of more than 50 vol.% washes and

(h) if appropriate, the porous cellulose beads for the production of crosslinked porous cellulose beads before or k ** A \ the hydrolysis crosslinked with at least one crosslinking agent