DE2717333A1 - HEAT- AND ACID-RESISTANT ALPHA AMYLASE ENZYME, METHOD FOR ITS MANUFACTURING AND USE - Google Patents
HEAT- AND ACID-RESISTANT ALPHA AMYLASE ENZYME, METHOD FOR ITS MANUFACTURING AND USEInfo
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Description
DR. WOLFGANG MÜLLER-BORE (PATENTANWALTVON IM7-I97S) DR. PAUL DEUFEL. DIPL.-CH EM. DR. ALFRED SCHÖN. DIPL.-CHEM. WERNER HERTEL. DIPL.-ΡΗΥβ.DR. WOLFGANG MÜLLER-BORE (PATENT ADVERTISER FOR IM7-I97S) DR. PAUL DEUFEL. DIPL.-CH EM. DR. ALFRED SCHÖN. DIPL.-CHEM. WERNER HERTEL. DIPL.-ΡΗΥβ.
C 2999C 2999
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International Plaza, Englewood Cliffs, New Jersey O7632, USAInternational Plaza, Englewood Cliffs, New Jersey O7632, USA
Hitze- und säurebeständiges Oi--Amylaseenzym, Verfahren zu seiner Herstellung und seine VerwendungHeat and acid resistant Oi - amylase enzyme, Process for its manufacture and its use
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β MÜirCHSir ββ · SIXBXRTSTH. 4 · ΡΟβΤϊΑΟΒ ββΟΠΟ · KABEL: MUXBOPAT · TXL. (Μ·) 47«000 · TSLXX S-MSMβ MÜirCHSir ββ · SIXBXRTSTH. 4 ΡΟβΤϊΑΟΒ ββΟΠΟ CABLE: MUXBOPAT TXL. (Μ ·) 47 «000 · TSLXX S-MSM
Die Erfindung betrifft ein hitze— und säurebeständiges «<—Amylaseenzym, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung bei Verfahren zum Hydrolysieren, Verflüssigen und/oder Umwandeln von Stärke enthaltenden Materialien in Stärkehydrolysate.The invention relates to a heat and acid-resistant amylase enzyme, a process for its preparation and its use in processes for hydrolyzing, liquefying and / or Converting starch containing materials into starch hydrolysates.
0(.-Amylaseenzympräparate wurden seit geraumer Zeit zum Hydrolysieren, Verflüssigen und/oder Umwandeln stärkehaltiger Materialien in Stärkehydrolysate, sowie in Detergentien- bzw. Waschmittelgemischen verwendet. Wenn man oC—Amylaseenzyme zur Behandlung von Stärkematerialien verwendet, so werden sie dabei in der ersten Stufe von Verfahren zur Herstellung einer Reihe synthetischer Stärkehydrolysatmaterialien, wie Maltodextrine, Maissirup, Dextrose, Levulose, Maltose und dergleichen eingesetzt. <X-Amylaseenzyme hydrolysieren Stärkemoleküle, die dabei in eine Vielzahl verschiedener Bruchstücke mit mittlerem Molekulargewicht gespalten werden, die als Maltodextrine bekannt sind. Die Maltodextrine werden nachfolgend mit einem oder mehreren weiteren Enzympräparaten, u.a. Glucamylase, ß-Amyläse und Glucoseisomerase behandelt, um die gewünschten Endprodukte herzustellen. Wahlweise können mehrere dieser Enzympräparate gleichzeitig einer Aufschlämmung des Stärkematerials einverleibt werden, um auf diese Weise direkt das als Endprodukt erwünschte Stärkehydrolysat herzustellen.0 (.- Amylase enzyme preparations have been used for some time to hydrolyze, liquefy and / or convert starchy materials into starch hydrolysates, as well as in detergent mixtures in the first stage of processes for the manufacture of a range of synthetic starch hydrolyzate materials, such as maltodextrins, Corn syrup, dextrose, levulose, maltose and the like are used. <X-amylase enzymes hydrolyze starch molecules that do so split into a variety of different medium molecular weight fragments known as maltodextrins. The maltodextrins are subsequently given a or several other enzyme preparations, including glucamylase, β-amylase and glucose isomerase are treated to produce the desired end products. Optionally, several of these enzyme preparations can be incorporated into a slurry of the starch material at the same time, in order in this way directly to produce the starch hydrolyzate desired as the end product.
o(—Amyläseenzyme können aus einer großen Vielzahl verschiedener Quellen gewonnen werden. Die meisten <X-Amylaseenzyme werden von bzw. aus bakteriellen Quellen, wie Bacillus subtiIi3. Bacillus lichenifortnis, Bacillus stearothermophilus und anderen Mikroorganismenstämmen erzeugt, die in einem geeigneten Nährmedium kultiviert werden, worauf man die dabei erzeugten Zellen zerstört und das Enzympräparat hierauf aus der Kulturbrühe abtrennt und reinigt.Amylase enzymes can be obtained from a wide variety of different sources. Most <X amylase enzymes are produced from or from bacterial sources such as Bacillus subtili3, Bacillus lichenifortnis , Bacillus stearothermophilus and other strains of microorganisms that are cultivated in a suitable nutrient medium. whereupon the cells produced are destroyed and the enzyme preparation is then separated from the culture broth and purified.
Viele der derzeit im Handel erhältlichen <X-Amylaseenzyme werden aus Bacillus subtilis-Mikroorganismen hergestellt. Bei der Verwendung dieser Enzyme zur Umwandlung von Stärke inMany of the <X amylase enzymes currently available on the market are made from Bacillus subtilis microorganisms. When using these enzymes to convert starch into
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Stärkehydrolysate weisen sie in der Regel eine optimale Temperatur im Bereich von etwa 80 bis 85 C und einen optimalen pH-Wert von etwa 6,0 auf. Diese Temperatur- und pH-Bedingungen, die für eine effiziente Nutzung des Enzyms erforderlich sind, haben zwei Nachteile. Erstens wird ein Teil der reduzierenden Endgruppen der Stärke isomerisiert, wenn die Stärke mit dem Enzym bei einem pH von etwa 6 und einer Temperatur von etwa 80 bis 85 C konvertiert wird, wobei dann im Verlauf des nachfolgenden Umwandlungsverfahrens Maltolose erzeugt wird, wodurch sich die Ausbeute an dem gewünschten Endprodukt, z.B. Dextrose, Levulose oder Maltose, verringert. Zweitens liegt das pH-Optimum von Glucamylase, die beim Konversions— und Verzuckerungsverfahren eingesetzt wird, in der Regel bei etwa kt5 bei aus Aspergillus niger gewonnenen Enzymen und bei etwa 5,0 im Fall von aus Rhizopus Mikroorganismen gewonnenen Enzymen. Deshalb muß nach Vollendung der unter Verwendung von o(—Amylase— enzym durchgeführten Verflüssigungsstufe der pH-Wert von etwa 6 auf etwa k,5 oder 5»0 gesenkt werden. Durch diese pH-Einstellung wird die Ionenkonzentration erhöht, wodurch die Belastung der bei der Reinigung des Endprodukts verwendeten Ionenaustauscherharze und folglich auch die Raffinations— kosten steigen.As a rule, starch hydrolysates have an optimal temperature in the range from about 80 to 85 ° C. and an optimal pH of about 6.0. These temperature and pH conditions, which are necessary for efficient use of the enzyme, have two disadvantages. First, when the starch is converted with the enzyme at a pH of about 6 and a temperature of about 80 to 85 C, a portion of the reducing end groups of the starch is isomerized, and then in the course of the subsequent conversion process, maltolose is produced, thereby increasing the yield in the desired end product, e.g. dextrose, levulose or maltose. Second, the optimum pH of glucamylase used in the conversion and saccharification process is typically around k t 5 for enzymes derived from Aspergillus niger and around 5.0 for enzymes derived from Rhizopus microorganisms. Therefore, after completion of the liquefaction step carried out using the o (—amylase “enzyme, the pH must be lowered from about 6 to about k, 5 or 5» 0. This pH adjustment increases the ion concentration, thereby reducing the burden on the The ion exchange resins used in the purification of the end product and, consequently, the refining costs increase.
In den letzten Jahren wurden verschiedene hitzestabile d-Amy-1 aseenzyme entwickelt. Beispiele derartiger oC—Amylaseenzyme sind u.a. die aus Mikroorganismen der Spezies Bacillus stearothermophilus hergestellten Enzympräparate (vgl. Ogasawara und Mitarbeiter, J^ Biol. Chem.. 67» 65» 77 und 83 (197O); G.B. Manning und L. L. Campbell, J^ Biol. Chem., 236, 2952, 2958 und 2962 (1961); S. L. Pfueller und W. H. Elliot, J. Biol. Chem.. 2kk , k8 (1969)). Seit noch kürzerer Zeit sind cX-Amylaseenzyme mit guter Hitzestabilität in neutralen oder schwach-alkalischen Lösungen erhältlich. Diese hitze- und alkalibeständigen Ot-Atay— laseenzyme werden unter dem Markennamen "Thermamyl" vertreten. Sie werden durch Kultivieren von Mikroorganismen der Spezies Bacillus licheniformis erzeugt (vgl. GB-PS 1 296 839, Madaen und Mitarbeiter, Die Stärke, 2£, 304, 305 und 308 (1973) und Narimasa Saito, ABB, J_5J>, 290 (1973)) S Aus Bacillus licheni- Various heat-stable d-Amy-1 ase enzymes have been developed in recent years. Examples of such α-amylase enzymes include the enzyme preparations produced from microorganisms of the species Bacillus stearothermophilus (cf. Ogasawara and coworkers, J. Biol. Chem . 67, 65, 77 and 83 (1970); GB Manning and LL Campbell, J. Biol Chem. , 236 , 2952, 2958 and 2962 (1961); SL Pfueller and WH Elliot, J. Biol. Chem . 2kk , k8 (1969)). For even more recently, cX-amylase enzymes with good heat stability have been available in neutral or weakly alkaline solutions. These heat and alkali-resistant Ot-Ataylase enzymes are represented under the brand name "Thermamyl" . They are produced by cultivating microorganisms of the species Bacillus licheniformis (cf. GB-PS 1 296 839, Madaen and coworkers, Die Starke, 2 £, 304, 305 and 308 (1973) and Narimasa Saito, ABB, J_5J>, 290 ( 1973)) S From Bacillus licheni-
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form!3 erzeugte Ot-Amylaseenzyme besitzen zwar eine gute Hitzestabilität in neutralen und schwach—alkalischen Lösungen, sind jedoch unter sauren Bedingungen nicht stabil genug, um wirtschaftlich eingesetzt werden zu können. Form! 3 generated Ot-amylase enzymes have good heat stability in neutral and weakly alkaline solutions, but are not stable enough under acidic conditions to be economical.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, °(-Ainylaseenzyme zu schaffen bzw. zur Verfügung zu stellen, die sowohl eine gute Hitzebeständigkeit als auch eine gute Stabilität unter sauren Bedingungen, und insbesondere bei pH-Werten besitzen, die es ermöglichen, sie unter Bedingungen einzusetzen, die für andere Amylasen, wie Glucamylase, verträglich sind.The invention was therefore based on the object ° (-Ainylaseenzyme to create or make available that both a have good heat resistance as well as good stability under acidic conditions, and especially at pH values, which make it possible to use them under conditions that are compatible with other amylases such as glucamylase.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein hitze- und säurebeständiges o(-Amylaseenzym gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es in der Lage ist,According to the invention, this object is achieved by a heat-resistant and acid-resistant o (-Amylase enzyme dissolved, which is characterized by the fact that it is able to
1. mindestens etwa 70 °/o seiner anfänglichen Λ-Amylaseaktivität zu behalten, wenn man es in Abwesenheit zugesetzter Calciumionen 10 Minuten bei 90 C und einem pH von 6,0 hält,1. to retain at least about 70 % of its initial Λ-amylase activity if it is kept in the absence of added calcium ions for 10 minutes at 90 C and a pH of 6.0,
2. mindestens etwa 50 % seiner anfänglichen &-Amylaseaktivität zu behalten, wenn man es in Abwesenheit zugesetzter Calciumionen 60 Minuten bei 90 C und einem pH von 6,0 hält,2. to retain at least about 50 % of its initial & -amylase activity when held in the absence of added calcium ions for 60 minutes at 90 C and a pH of 6.0,
3. mindestens etwa 50 # seiner anfänglichen Ot-Amylaseaktivität zu behalten, wenn man es in Gegenwart von 5 mMol Calcium— ionen 10 Minuten bei 80°C und einem pH von k,55 hält.3. at least about 50 # to keep its initial Ot-amylase activity, if one in the presence of 5 mM calcium ion for 10 minutes at 80 ° C and a pH of k, 55 holds.
Bevorzugte erfindungsgemäße Enzyme sind außerdem dazu befähigt, mindestens etwa 50 ?6 ihrer anfänglichen Aktivität bei einer Temperatur von 85 C und einem pH von 4,55 in Gegenwart von 5 mMol Calciumionen und 22,5 Gewichtsprozent Stärke, Trockensubstanz, zu behalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Enzyme sind weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß sie befähigt sind, mindestens etwa 95 % ihrer anfänglichen oi-Amylaseaktivitat bei einer Temperatur von 800C und einem pH-Wert im Bereich von etwa k bis 6,0 zu behalten. Diese Enzyme stammen vorzugsweise von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus und ins- Preferred enzymes according to the invention are also capable of retaining at least about 50-6 of their initial activity at a temperature of 85 ° C. and a pH of 4.55 in the presence of 5 mmol calcium ions and 22.5 percent by weight starch, dry matter. Preferred enzymes according to the invention are further characterized in that they are able to retain at least about 95% of their initial α-amylase activity at a temperature of 80 ° C. and a pH in the range from about k to 6.0. These enzymes are preferably derived from a microorganism of the genus Bacillus and in particular
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besondere von einem Mikroorganismus der Spezies Bacillus stearothermophilus.in particular from a microorganism of the species Bacillus stearothermophilus .
Bevorzugte erfindungsgemäße Ci-Amylaseenzyme besitzen ein durch SDS-Scheibenelektrophorese bestimmtes Molekulargewicht von mindestens etwa 90 000 und sind dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen frei von Proteaseaktivität sind. Sie weisen beispielsweise in der Regel ein Protease/ct-Amylase-Verhältnis von weniger als 3 und insbesondere weniger als 1 auf.Preferred Ci-amylase enzymes according to the invention have a through SDS disk electrophoresis determined molecular weight of at least about 90,000 and are characterized by the fact that they are essentially free of protease activity. For example, they usually have a protease / ct-amylase ratio of less than 3 and in particular less than 1.
Die neuen oi-Amylaseenzyme der Erfindung werden vorzugsweise hergestellt, indem man einen Mikroorganismus der Spezies Bacillus stearothermophilus und insbesondere einen Mikroorganismenstamm aus der Gruppe Bacillus stearothermophilus ATCC Nr. 31 195, 31 196, 31 197, 31 198 und 31 199, einschließlich der Varianten, Mutanten und Submutanten der genannten Stämme kultiviert und dann das dabei erzeugte oC-Amylase enzym gewinnt.The new α-amylase enzymes of the invention are preferably prepared by treating a microorganism of the species Bacillus stearothermophilus and in particular a microorganism strain from the group Bacillus stearothermophilus ATCC No. 31 195, 31 196, 31 197, 31 198 and 31 199, including the variants, Mutants and submutants of the strains mentioned are cultivated and then the oC-amylase enzyme produced thereby wins.
In der Zeichnung zeigt:In the drawing shows:
Figur 1 ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Restaktivität und dem pH-Wert für zwei erfindungsgeroäße Enzyme und, zum Vergleich,bei Thermamyl-öf-Amylase erläutert;Figure 1 is a diagram showing the relationship between residual activity and the pH value for two enzymes according to the invention and, for comparison, for Thermamyl-öf-amylase explained;
Figur 2 ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der relativen Aktivität und der Temperatur bei zwei erfindungsge— mäßen Enzymen sowie, zum Vergleich, bei Thermamyl-Ot-Amylase erläutert;Figure 2 is a graph showing the relationship between relative activity and temperature for two of the present invention. moderate enzymes and, for comparison, Thermamyl-Ot-amylase explained;
Figur 3 ein Diagramm, das die Thermostabilität anhand der Beziehung zwischen der Restaktivität und der Inkubationszeit bei 8O0C und einem pH von 4,55 in Gegenwart von 5 mMol Calciumionen für die beiden erfindungsgemäßen Enzyme sowie, zum Vergleich, Thermamyl-(A-Amylaee erläutert; Figure 3 is a graph showing the thermal stability in terms of the relationship between the residual activity and the incubation time at 8O 0 C and a pH of 4.55 in the presence of 5 mM calcium ion for the two according to the invention enzymes, as well as, for comparison, Thermamyl- (A-Amylaee explained;
Figur 4 ein Diagramm, das die Thermostabilität bei 900C undFigure 4 is a diagram showing the thermal stability at 90 0 C and
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einem pH von 6,0 anhand der Beziehung zwischen der Restaktivität und der Inkubationszeit für zwei erfindungsgemäße Enzyme sowie, zum Vergleich, bei Thermamy 1-<X-Amy läse erläutert;a pH of 6.0 based on the relationship between the Residual activity and the incubation time for two enzymes according to the invention and, for comparison, at Thermamy 1- <X-Amy read explained;
Figur 5 ein Diagramm, in dem die Hitzebeständigkeit von zwei erfindungsgemäßen Enzymen und, zum Vergleich, von Thermamyl-oC- Amy läse, jeweils bei 900C, einem pH von 6,0 und in Gegenwart von 1 mMol Calciumionen dargestellt ist;Figure 5, is shown in each case at 90 0 C, pH 6.0 and in the presence of 1 mM calcium ion, a diagram in which the heat resistance of two inventive enzymes and were reading for comparison, of Termamyl-OC- Amy;
Figur 6 ein Diagramm, das die Hitzebeständigkeit von zwei erfindungsgemäßen Enzymen sowie, zum Vergleich, von Thermamyl, jeweils bei 85°C und einem pH von ^,55 in Gegenwart von 1 mMol Calcium!onen und 22,5 "h Stärke, Trockensubstanz, erläutert;FIG. 6 is a diagram showing the heat resistance of two enzymes according to the invention and, for comparison, of Thermamyl, each at 85 ° C. and a pH of 1.55 in the presence of 1 mmol of calcium ions and 22.5 hours of starch, dry substance, explained;
Figur 7 ©in Diagramm, das die Hitzebeständigkeit zweier erfindungsgemäßer Enzyme sowie,zum Vergleich, von Thermamyl-od-Amylase, jeweils bei 85 C, einem pH von 4,55 sowie in Gegenwart von 22,5 # Stärke und 5 mMol Calciumionen erläutert;FIG. 7 © in a diagram showing the heat resistance of two enzymes according to the invention and, for comparison, of Thermamyl-od-Amylase, each at 85 ° C., a pH of 4.55 as well as illustrated in the presence of 22.5 # starch and 5 mmol calcium ions;
Figur 8 ein Diagramm, in dem die Bestimmung des Molekulargewichts zweier erfindungsgemäßer Enzyme durch SDS-Scheibenelektrophorese graphisch dargestellt und erläutert ist;FIG. 8 is a diagram in which the determination of the molecular weight of two enzymes according to the invention by SDS disk electrophoresis is graphically represented and explained;
Figur 9 ein Diagramm, das die Beziehung zwischen dem pH-Wert und der Enzymaktivität bei einem erfindungsgemäßen Enzym sowie, zum Vergleich, bei bekannten, von Mikroorganismen der Spezies Bacillus stearothermophilus stammenden <X-Amylasen erläutert;FIG. 9 shows a diagram which explains the relationship between the pH value and the enzyme activity in an enzyme according to the invention and, for comparison, in known <X amylases derived from microorganisms of the species Bacillus stearothermophilus;
Figur 10 ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Temperatur und der Aktivität für ein erfindungsgemäßes EnzymFigure 10 is a graph showing the relationship between temperature and activity for an enzyme of the invention
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und, zum Vergleich.einer bekannten, von Bacillus stearothermophilus stammenden σί-Amy läse erläutert}and, for comparison, a known σί-Amy läse from Bacillus stearothermophilus explained}
Figur 11 ein Diagramm, das die Desaktivierungskurven eines erfindungsgemäßen Enzyms sowie, zum Vergleich, zweier bekannter, von Bacillus subtilis bzw. Bacillus licheniformis stammender o(-Amylasen, jeweils bei 80 C und pH 4,5 in Gegenwart von 5 mMol Calciumionen darstellt;FIG. 11 shows a diagram which shows the deactivation curves of an enzyme according to the invention and, for comparison, two known o (amylases derived from Bacillus subtilis or Bacillus licheniformis , each at 80 ° C. and pH 4.5 in the presence of 5 mmol of calcium ions;
Figur 12 ein Diagramm, in dem die Desaktivierungskurven eines erfindungsgemäßen Enzyms sowie, zum Vergleich, zweier bekannter, von Bacillus licheniformis bzw. Bacillus stearothermophilus stammender cfcrAmylasen, jeweils bei 90°C und einem pH von 6,0 ohne Calciumionen, darstellt»FIG. 12 shows a diagram in which the deactivation curves of an enzyme according to the invention and, for comparison, two known cfcr amylases originating from Bacillus licheniformis or Bacillus stearothermophilus , each at 90 ° C. and a pH of 6.0 without calcium ions.
Verschiedene Arten von Mikroorganismen wurden unter verschiedenen Bedingungen, wie Wachstums- bzw. Kultivierungstemperatur (37°C, 45°C, 55°C und 70°C), pH-Wert (5,0 und.7,0) und Kulturmedien, bezüglich der Erzeugung von Λ-Amylase und der thermischen Stabilität des gebildeten Enzyms gesichtet. Dabei wurde gefunden, daß thermophile, bei 55°C isolierte Strahlenpilze (ray fungi) und thermophile Fungi bei 45°C OC-Amy läse in hohen Ausbeuten erzeugen, die jedoch nicht hitzebeständig ist, während thermophile Bakterien bei 70°C hitzebeständige oL-Amyl&aef jedoch nur in niedrigen Ausbeuten erzeugen. Von diesen Voruntersuchungen ausgehend wurde die weitere Sichtung von Mikroorganismen bezüglich ihrer Fähigkeit säure- und hitzebeständige oC-Amylase zu erzeugen, durch Kultivierung bei 55 und 70°C durchgeführt. Insgesamt wurden 550 Proben Mikroorganismenquellen, unter anderem Bodenproben, Wasser aus heißen Quellen, Kompostproben usw. von verschiedenen Stellen gesammelt·Different kinds of microorganisms were treated under different conditions such as growth and cultivation temperature (37 ° C, 45 ° C, 55 ° C and 70 ° C), pH (5.0 and 7.0) and culture media the generation of Λ-amylase and the thermal stability of the enzyme formed. It was found that thermophilic ray fungi (ray fungi) isolated at 55 ° C and thermophilic fungi at 45 ° C produce OC-Amy läse in high yields, which, however, is not heat-resistant, while thermophilic bacteria at 70 ° C heat-resistant oil-amyl & ae however, only produce f in low yields. On the basis of these preliminary investigations, the further screening of microorganisms with regard to their ability to produce acid- and heat-resistant oC-amylase was carried out by cultivation at 55 and 70 ° C. A total of 550 samples of microorganism sources, including soil samples, water from hot springs, compost samples, etc., were collected from various locations
Die Säure- und Hitzebeständigkeit wurde jeweils bestimmt, indem jeweils die öG-Amylaseaktivität vor und nach einer 10-minütigen Hitzebehandlung der KuIturfilträte bei 8O0C und pH 5»0 in Gegenwart von 10 mMol Calciumionen bestimmt wurde.The acid and heat resistance was determined in each case by the OEG-amylase activity was determined before and after a 10-minute heat treatment of the KuIturfilträte at 8O 0 C and pH 5 »0 in the presence of 10 mM calcium ions, respectively.
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-Vb--Vb-
Die oC-Amylaseaktivität wurde wie folgt bestimmt:The oC-amylase activity was determined as follows:
Eine 0,2#ige Lösung löslicher Stärke wurde wöchentlich wie folgt hergestellt: 200 mg lösliche Stärke wurden in etwa 50 ml 0,2molarer Acetatpufferlösung (pH ^,5), die 0,013 Mol CaCl2 #2H20 enthielt, in siedendem Wasser auf 100°C erhitzt, worauf die dabei erhaltene Lösung mit der gleichen Pufferlösung auf 100 ml ergänzt wurde. Das 0,1 ml Enzymlösung und 0,3 ml 0,2#ige Stärkelösung enthaltende Proberohr wurde jeweils 5 Minuten bei . 60 C inkubiert. Dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 1,0 ml 0,5normaler Essigsäure abgestoppt· Hierauf wurden 3»0 ml 0,015$iger Jodlösung zugesetzt und eingerührt, worauf die . optische Dichte bei 700 mu gegen H-O als Standard gemessen wurde. Das Rohr ohne Enzym diente als Blindprobe. Seine optische Dichte bei 700 mu wurde als OD, bezeichnet. Eine Enzym— ( aktivitäts)einheit wurde als die Enzymmenge definiert, die unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen zu einer Abnahme des Blauwertes um 10 Ji pro Minute führt.A 0.2 # solution of soluble starch was prepared weekly as follows: 200 mg of soluble starch was dissolved in about 50 ml of 0.2 molar acetate buffer solution (pH 1.5) containing 0.013 mol of CaCl 2 # 2H 2 O in boiling water 100 ° C, whereupon the resulting solution was made up to 100 ml with the same buffer solution. 0.1 ml enzyme solution and 0.3 ml 0.2 # starch solution containing the sample tube was in each case 5 minutes. Incubated at 60 ° C. The reaction was then stopped by adding 1.0 ml of 0.5 normal acetic acid. 3 »0 ml of 0.015% iodine solution were then added and stirred in, whereupon the. optical density was measured at 700 mu against HO as a standard. The tube without enzyme served as a blank. Its optical density at 700 µm was called OD. One enzyme (activity) unit was defined as the amount of enzyme which, under the conditions described above, leads to a decrease in the blue value of 10 Ji per minute.
NML-Einheiten = (0D, - OD) χ 100NML units = (0D, - OD) χ 100
0Db χ 5 x 100D b χ 5 x 10
Soweit nichts Gegenteiliges ausdrücklich angegeben ist, wurden die nachfolgend angegebenen ct-Amylaseaktivitäten jeweils in der vorstehend beschriebenen Weise bestimmt (NML-Einheiten). Wo die Ot-Amylaseaktivität in CPC-Ä-Amylaseeinheiten angegeben ist, ist zu beachten, daß die CPC-Einheiten etwa i/i*K> der NML-Einheiten sind.Unless expressly stated otherwise, the ct-amylase activities indicated below were each determined in the manner described above (NML units). Where the Ot-amylase activity is given in CPC-λ-amylase units, it should be noted that the CPC units are about i / i * K> the NML units.
Die CPC-o(-Amylaseaktivitätseinheiten wurden nach folgender Methode bestimmt:The CPC-o (-amylase activity units were determined according to the following Method determined:
Ein ml einer entsprechend verdünnten Enzymlösung wird 10 ml einer 1,0% lösliche Stärke enthaltenden, 0,3molaren Essigsäurepuff er lösung (pH 6,0)zugesetzt, worauf man das Gemisch 10 Minuten bei 6o°C reagieren läßt. Dann wird 1 ml der Reak-One ml of an appropriately diluted enzyme solution becomes 10 ml of a 0.3 molar acetic acid buffer containing 1.0% soluble starch He solution (pH 6.0) was added, whereupon the mixture was added Allowed to react for 10 minutes at 6o ° C. Then 1 ml of the reac-
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tionslösung in einen 100 ml Meßkolben gegeben, in dem 50 ml 0,02normaler Salzsäure vorgelegt sind, worauf man 3 ml 0,05#ige Jodlösung zugibt und den Kolbeninhalt dann mit Wasser auf 100 ml ergänzt. Die sich entwickelnde Blaufärbung wird durch Messen der Absorption bei 620 mu bestimmt. Eine CPC-Einheit ist als die Menge Enzym definiert, die erforderlich ist, um unter den angegebenen Bedingungen in einer Minute 10 mg Stärke abzubauen.tion solution is placed in a 100 ml volumetric flask in which 50 ml of 0.02 normal hydrochloric acid are placed, whereupon 3 ml of 0.05% iodine solution is added and the contents of the flask are then made up to 100 ml with water. The blue color that develops is determined by measuring the absorbance at 620 μm. One CPC unit is defined as the amount of enzyme that is required to break down 10 mg of starch in one minute under the specified conditions.
1 CPC-Einheit = Dq - Dg χ 50 χ (Verdünnungsfaktor) ;1 CPC unit = D q - D g χ 50 χ (dilution factor);
D 10 χ 10 οD 10 χ 10 ο
D = Absorption der Vergleichslösung (statt der Enzymlösung wird Wasser zugesetzt) ;D = absorption of the reference solution (instead of the enzyme solution water is added);
D = Absorption der ReaktionslösungD = absorption of the reaction solution
Die bei den "screening"— bzw. Sdc htungsversuchen angewandten Kulturbedingungen und -medien sind in der nachfolgenden Tabelle X zusammengefaßt.The culture conditions and media used in the screening tests are summarized in Table X below .
Die Ergebnisse der ersten und der zweiten Sichtungsversuchsreihen (1. bzw. 2. Sichtung) sind in der nachfolgenden Tabelle II wiedergegeben.The results of the first and second series of screening tests (1st and 2nd screening) are shown in Table II below .
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Kulturbedingungen und -medien Culture conditions and media
Platten-Kultur*1' Schräg-Agar-Kultur'2' Kolben-Kultur*3'Plate culture * 1 'Slant agar culture' 2 'Flask culture * 3 '
a) 55°C /pH 5 55°C /pH 5 50°C /pH 6a) 55 ° C / pH 5 55 ° C / pH 5 50 ° C / pH 6
b) 55°C /pH 7 55°C /pH 7 500C /pH 7b) 55 ° C / pH 7 55 ° C / pH 7 50 0 C / pH 7
c) 700C /pH 5 70°C /pH 5 60°C /pH 6c) 70 0 C / pH 5 70 ° C / pH 5 60 ° C / pH 6
d) 700C /pH 7 700C /pH 7 600C /pH 7d) 70 0 C / pH 7 70 0 C / pH 7 60 0 C / pH 7
(1) Medium für die Plattenkultur(1) Medium for plate culture
Cb^bJCb ^ bJ
Amylopectin 0,02 96 (NH^)2HPO 0,025Amylopectin 0.02 96 (NH ^) 2 HPO 0.025
Hefeextrakt 0,025 Na-Ci trat 0,01 96 MgSO. ·7HO 0,05 96Yeast extract 0.025 Na Ci joined 0.01 96 MgSO. · 7HO 0.05 96
KCl 0,15 96KCl 0.15 96
CaCl2*2H2O 0,05 96 Agar - 2,0 96CaCl 2 * 2H 2 O 0.05 96 agar - 2.0 96
(2) Medium für die (3) Medium für die Schräg-Agar - Kultur (B-D) Kolben-Kultur (B-M)(2) medium for the (3) medium for the Agar slant culture (B-D) Flask culture (B-M)
Lösliche Stärke 1,096 3,0 96Soluble starch 1.096 3.0 96
Bacto-trypton (Difco) 0,5 # °»5 #Bacto-trypton (Difco) 0.5 # ° »5 #
Hefeextrakt 0,5 # 1»° #Yeast extract 0.5 # 1 »° #
CaCl2»2H20 0,05 96 °tO5 %CaCl 2 »2H 2 0 0.05 96 ° tO5%
• 4H 0 0,05• 4H 0 0.05
•7H20 - °t°5 96• 7H 2 0 - ° t ° 5 96
k 0,1 96 0.1 # k 0.1 96 0.1 #
Agar 2,0Agar 2.0
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11 . Sichtung. Sighting
Isolierungs- Isolierte bedingungen. StämmeIsolation- Isolated conditions. Tribes
Sichtungsergebnis (Screening)Screening result 2. Sichtung2nd sighting
100-200 ~500 ~1000 -2000 ~2500 E/ml E/ml E/ml E/ml E/ml100-200 ~ 500 ~ 1000 -2000 ~ 2500 U / ml U / ml U / ml U / ml U / ml
(Ray fungi)
503 StämmeRay mushrooms
(Ray fungi)
503 tribes
OO
O 46
O
O 34
O
OO
292 StämmeBacteria
292 tribes
O 9
O
11
22
OO
OO
(Ray fungi)
629 StämmeRay mushrooms
(Ray fungi)
629 tribes
OO
OO
O34
O
OO
O 5
O
769 StämmeBacteria
769 tribes
k 5
k
33
3
OO
OO
OO
841 StämmeBacteria
841 tribes
7 O
7th
11
11
3 O
3
OO
1326 Stämme Bacteria
1326 tribes
1515th
22
OO
OO
OO
RA: Verbleibende Aktivität bzw. Restaktivität nach 10-minütiger Wärmebehandlung bei 8O0C und pH 5,0. Alle RA-positiven Stämme wiesen etwa 100 # Restaktivität auf·RA: Remaining activity and residual activity after 10-minute heat treatment at 8O 0 C and pH 5.0. All RA positive strains had about 100 # residual activity
Etwa 25 96 der bei 55 C isolierten thermophilen Strahlenpilze erzeugten 100 bis 2500 Einheiten Λ-Amylase pro ml Kulturbrühe, jedoch war nach der Wärmebehandlung (1O Minuten bei 80°C und pH 5»0) keine Restaktivität mehr vorhanden.About 25 96 of the thermophilic ray fungi isolated at 55 C produced 100 to 2500 units of Λ-amylase per ml of culture broth, however, after the heat treatment (10 minutes at 80 ° C. and pH 5 »0) there was no longer any residual activity.
Von insgesamt IO61 bei 55 C isolierten thermophilen Bakterienstaminen erzeugten insgesamt 35 Stämme oi-Amylase in einer zwischen 100 und 1000 Einheiten pro ml Kulturbrühe liegenden Menge, wobei 10 dieser Stämme eine hitzebeständige oC-Amylase erzeugten. Fast alle von bei 70°C isolierten thermophilen Bakterien erzeugten oc-Amylasen waren säure- und hitzebeständig. Dabei wurden die größten (X-Amylasemengen von Bakterienstänunen erzeugt, die bei pH 5*0 isoliert worden waren.From a total of 1061 thermophilic bacterial amines isolated at 55 ° C generated a total of 35 strains of oi-amylase in one between 100 and 1000 units per ml of culture broth, with 10 of these strains being a heat-resistant oC-amylase generated. Almost all of the oc-amylases produced by thermophilic bacteria isolated at 70 ° C were acid and heat resistant. The largest amounts of (X-amylase were produced by bacterial stenunas that had been isolated at pH 5 * 0.
Bei den letztgenannten 219 Stämmen, die bei 700C und pH 5,0 isoliert worden waren, wurde die Beziehung zwischen der Aktivität und der Klarzonengröße untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle IXX wiedergegeben, aus der zu ersehen ist, daß 90 $ dieser Stämme Klarzonen mit einem Durchmesser von weniger als 3 cm ergaben und 0 bis 200 Einheiten d—Amy läse erzeugten. Die höchste Ot-Amylaseproduktion wurde bei den Stämmen erreicht, die eine Klarzone mit einem Durchmesser von mehr als 3 cm ergaben, jedoch waren dies nur 10 # der geprüften Stämme.In the latter 219 strains were isolated at 70 0 C and pH 5.0, the relationship between the activity and the clear zone size was investigated. The results of this study are shown in Table IXX, from which it can be seen that 90% of these strains gave clear zones less than 3 cm in diameter and produced 0 to 200 units of d- amyase. The highest Ot-amylase production was achieved in the strains that gave a clear zone with a diameter of more than 3 cm, but this was only 10 # of the strains tested.
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Beziehung zv/ischen Aktivität und Klarzonengröße des isolierten Stamms Relationship between activity and clear zone size of the isolated strain
Aktivität KlarzonengröOe auf der Isolierunga-Activity clear zone size on the insulation
ira platteira plate
Kolben (Durchmesser in cm) Piston (diameter in cm)
Gesamt 156 k2 20 1 219Total 156 k2 20 1 219
Aufgrund der vorstehenden Versuche wurde gefunden, daß die
Isolierung von Bakterienkolonien mit einer Klarzone mit einem Durchmesser von mehr als 3 cm auf dem bei diesen Versuchen verwendeten
Plattenmedium bei 70°C und einem pH von 5,0 eine
ausgezeichnete Methode zur Sichtung von. bzw. Suche nach Mikroorganismen
darstellt, die befähigt sind, säure- und thermostabile ei—Amylaseenzyme in hohen Ausbeuten zu erzeugen.Based on the above experiments, it was found that the isolation of bacterial colonies with a clear zone with a diameter of more than 3 cm on the plate medium used in these experiments at 70 ° C and a pH of 5.0 a
excellent method of sighting . or the search for microorganisms which are capable of producing acid- and thermostable egg-amylase enzymes in high yields.
Als Ergebnis dieser Sichtung wurden 5 Stämme als beste bzw. leistungsfähigste Erzeuger säure- und hitzebeständiger Ct-Amylaae· enzyme ausgewählt.As a result of this screening, 5 strains were selected as the best or most efficient producer of acid- and heat-resistant Ct-Amylaae enzymes selected.
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-Vt--Vt-
Jeder dieser fünf Stämme wurde in wie nachstehend beschrieben gereinigter Form in der dauernden Sammlung der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, hinterlegt. Die ATCC bewahrt und erhält diese Stämme aufgrund einer vertraglichen Vereinbarung mit der CPC International Inc..Each of these five strains was described in as follows purified form in the permanent collection of the American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA. The ATCC preserves and receives these logs on the basis of a contractual agreement of CPC International Inc ..
Der Vertrag zwischen der ATCC und der CPC International Inc. sieht vor, daß die Kulturen oder Subkulturen der Allgemeinheit nachThe contract between the ATCC and CPC International Inc. provides that the cultures or subcultures of the general public after
1) Erteilung eines US-Patents, das die fraglichen Hinterlegungen beschreibt und identifiziert und die ihnen zugeteilten ATCC-Nr. offenbart1) Grant of a US patent describing and identifying the deposits in question and those assigned to them ATCC no. disclosed
oderor
2) Bekanntmachung oder Offenlegung einer US- oder ausländischen Patentanmeldung, die die fraglichen Hinterlegungen beschreibt und identifiziert und die ihnen zugeteilten ATCC-Nr. offenbart, ·«2) Notice or disclosure of a US or foreign Patent application describing and identifying the deposits in question and the ATCC no. disclosed, · «
ständig zur Verfügung stehen. Die CPC International Inc. hat sich für den Fall, daß irgendeine dieser hinterlegten Kulturen während der Laufzeit des Patents absterben oder zerstört werden sollte, verpflichtet, diese durch eine lebende Kultur des gleichen Organismus zu ersetzen. Außerdem hat die CPC International Inc. die ATCC authorisiert, dem United States Patent and Trademark Office und dem Patentamt der Bundesrepublik Deutschland durch einen authorisierten Angehörigen der genannten Behörden die Kulturen oder Subkulturen auf Anfrage jederzeit zugänglich zu machen.are always available. CPC International Inc. has contacted any of these deposited cultures during Should the patent die or be destroyed during the term of the patent, this is bound by a living culture of the same organism to replace. In addition, CPC International Inc. has authorized the ATCC, the United States Patent and Trademark Office and the Patent Office of the Federal Republic of Germany by an authorized member of the named authorities To make cultures or subcultures accessible at any time upon request.
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Bacillus stearothermophilus B-501 31 195 Bacillus stearothermophilus B-501 31 195
Bacillus stearothermophilus B-63k 31 196 Bacillus stearothermophilus B-63k 31 196
Bacillus stearothermophilus B-781 31 197 Bacillus stearothermophilus B-781 31 197
Bacillus stearothermophilus B-905 31 198 Bacillus stearothermophilus B-905 31 198
Bacillus stearothermophilus B-968 31 199 Bacillus stearothermophilus B-968 31 199
Außerdem wurden die NML-Stämme B-501 und B-781 beim Fermen tation Research Institute, Industrial Technology Agency, MITI, unter den FRI-Nummern 3389 und 3390 hinterlegt.In addition, the NML strains B-501 and B-781 have been deposited with the Fermentation Research Institute, Industrial Technology Agency, MITI, under FRI numbers 3389 and 3390.
Die fünf (5) bei der ATCC hinterlegten, ausgewählten Stämme weisen folgende bakteriologische. Merkmale auf:The five (5) selected strains deposited with the ATCC exhibit the following bacteriological. Features on:
(1) Morphologische Merkmale; (1) morphological features;
A. Form und Größe der Zellen: 0,6 χ 2 - 3 p» einzelne A. Shape and size of cells: 0.6 χ 2 - 3 p »individual
Stäbchen, selten in Ketten (alle Stämme)Chopsticks, rarely in chains (all stems)
B. Pleomorphie: Negativ (alle Stämme)B. Pleomorphism: Negative (all tribes)
C. Beweglichkeit: Beweglich und begeißelt (alle Stämme) C. Agility: Agile and flagellated (all tribes)
D. Sporen: 0,6 χ 1,0 - 1,5 ρ» eiförmig; keulenförmiges D. Spores: 0.6 χ 1.0 - 1.5 ρ »ovoid; club-shaped
Sporengehäuse (alle Stämme)Spore casing (all trunks)
E. Gram -Flecken: Positiv (alle Stämme)E. Gram stains: Positive (all strains)
F. Säurefestigkeit: Negativ (alle Stämme)F. Acid Fastness: Negative (all strains)
(2) Wachstum auf verschiedenen Medien (2) growth on different media
A. Nähr- Agar-Platte: Sich aktiv ausbreitende Kolonien A. Nutrient Agar Plate: Active Colonies Spreading
mit körniger Oberfläche und rauhen Kanten (alle Stämme) with a grainy surface and rough edges (all trunks)
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aktive Ausbreitung, wabenartige Auswüchse (alle Stämme)active spread, honeycomb-like outgrowths (all Tribes)
C. Nährbouillon-Flüssigkultur: Transparent braun, weißerC. Liquid broth culture: Transparent brown, whiter
Oberflächenrasen (alle Stämme)Surface turf (all trunks)
D. Nährgelatine-Stich-Kulturt Verflüssigung (alle Stämme) (Nutrient gelatin stab culture)D. Nutrient Gelatin Stitch Culture Liquefaction (all strains) (Nutrient gelatin stab culture)
E. Nährgelatine-Ag ar-Platte: Breite Klarzone (alleE. Nutrient gelatin agar plate: wide clear zone (all
Stämme)Tribes)
F. Salz-Nährbouillon-Flüssigkultur: WachstumsinhibierungF. Salt Broth Liquid Culture: Growth Inhibition
in 2 % Salz (alle Stämme)in 2 % salt (all strains)
G. Milch-Agar-Platte: Klarzonenbildung durch HydrolyseG. Milk agar plate: clear zone formation by hydrolysis
von Casein (alle Stämme)of casein (all strains)
H. Glucose-Schräg-Agar-Platte: Gutes Wachstum, ähnlicheH. Glucose Agar Slant Plate: Good growth, similar
Kolonien wie auf Nähragar (alle Stämme)Colonies as on nutrient agar (all strains)
I, Proteosepepton -Schräg-Agar-Platte: Kein WachstumI, proteose peptone agar slant plate: no growth
(alle Stamine)(all stamines)
(3) Physiologische Merkmale: (3) Physiological characteristics:
A. Nitratreduktion: Positiv (alle Stämme)A. Nitrate Reduction: Positive (all strains)
B. Katalasetest: Positiv (alle Stämme)B. Catalase test: positive (all strains)
C. Vogues-Proskauer-Reaktion: Positiv (alle Stämme)C. Vogues-Proskauer reaction: Positive (all strains)
D. Verwertung von Citronensäure: Positiv (alle Stämme)D. Utilization of Citric Acid: Positive (all strains)
E. Schwefelwasserstoffbildung: Positiv (alle Stämme)E. Hydrogen sulfide formation: Positive (all strains)
F. Schwefelwasserstoffbildung: Positiv (alle Stämme)F. Hydrogen Sulphide Formation: Positive (all strains)
G. Stärkehydrolyse: Starke Hydrolyse (alle Stämme)G. Starch hydrolysis: Strong hydrolysis (all strains)
H. Bildung von Säure und Gas: Positiv bzgl. Säure, jedochH. Formation of acid and gas: Positive for acid, however
keine Gasbildung aus no gas formation from
709845/0838 Glucose> Xylose, Arabinose709845/0838 glucose > xylose, arabinose
und Mannit (alle Stämme)and mannitol (all strains)
*0* 0
I, Temperatur- und pH-Bedingungen!I, temperature and pH conditions!
37°C37 ° C
50 - 70 C50-70 C.
pH-Bereich für WachstumpH range for growth
optimaler pHoptimal pH
ATCC Nr. 31 195 (B-501)ATCC No. 31 195 (B-5 01)
ATCC Nr. 31 197 (B-781)ATCC No. 31 197 (B- 781)
kein Wachstum schwaches Wachstum schwaches Wachstum mäßiges Wachstum gutes Wachstum gutes Wachstumno growth weak growth weak growth moderate growth good growth good growth
5-8
6-75-8
6-7
5-8 6-75-8 6-7
Die vorstehenden Tests wurden entsprechend "Laboratory Methods in Microbiology11 von W. F. Harrigan und Mitarb, und den von der American Bacteriological Association herausgegebenen "Manual of Microbiological Methods" durchgeführt.The above tests were carried out in accordance with "Laboratory Methods in Microbiology 11 by WF Harrigan et al. And the" Manual of Microbiological Methods "published by the American Bacteriological Association.
Anhand der vorstehenden Charakter!stika wurden die fünf ausgewählten Stämme in Übereinstimmung mit Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, als Bacillus stearo— thermophilus identifiziert.On the basis of the above characteristics, the five selected strains were identified as Bacillus stearo-thermophilus in accordance with Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition.
Diese fünf Stämme wurden nach der Plattenstreifmethode weiter gereinigt. Die Ergebnisse der Isolierung, Kultivierung und Reinigungsbedingungen bezüglich der fünf ausgewählten Stämme sind in der nachfolgenden Tabelle IV zusammengefaßt. Wie aus Tabelle IV zu ersehen ist, war der gereinigte Stamm ATCC Nr. 31 199 (B-968), der Öf-Amylase in einer einer Aktivität von 2111 NML-Einheiten/ml Kulturbrühe entsprechenden Menge (etwa 15 CPC-Einheiten) erzeugte, der beste der fünf ausgewählten Stämme.These five strains were further processed by the plate-strip method cleaned. The results of the isolation, cultivation and purification conditions on the five selected strains are summarized in Table IV below. As As can be seen from Table IV, the purified strain was ATCC No. 31 199 (B-968), the Öf amylase in one activity of 2111 NML units / ml of culture broth corresponding amount (about 15 CPC units) produced the best of the five strains selected.
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Übersicht über die ausgewählten StämmeOverview of the selected strains
bedingun
genCulture
condition
gene
bedingun
genCulture
condition
gene
bedingungen
Temp. pHIsolation
conditions
Temp. PH
bzw· (E/ml) zeit
Quelle (h)Origin activity culture
or (U / ml) time
Source (h)
(B/ml) zeitActivity cultural
(B / ml) time
Stärkeabsetz
beckenFloor off
Starch deposition
pool
heißer QuelleFloor off
hot spring
Hafer in SiloFermented
Oats in silo
I
I
I
I
I fl7333
I.
I.
I.
I.
I.
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen <X—Amyläseenzyme wird ein zur Erzeugung eines säure- und hitzebeständigen d-Amylaseenzyms befähigter Mikroorganismenstamm, z.B. ein Stamm, der den in Tabelle III angegebenen Testanforderungen genügt, beispielsweise Bacillus stearothermophilus Stamm ATCC Nr. 31 195t 31 196, 31 197, 31 198 oder 31 199 in einem zum Kultivieren thermophiler Bakterien bekannten Nährmedium kultiviert. Diese Kulturmedien sollten eine assimilierbare Kohlenstoff— und Stickstoffquelle sowie andere wesentliche Nährstoffe enthalten.In the production of the <X -amylase enzymes according to the invention, a microorganism strain capable of producing an acid- and heat-resistant d-amylase enzyme, e.g. a strain which meets the test requirements specified in Table III, for example Bacillus stearothermophilus strain ATCC No. 31 195t 31 196, 31 197, 31 198 or 31 199 cultivated in a nutrient medium known for cultivating thermophilic bacteria. These culture media should contain an assimilable source of carbon and nitrogen as well as other essential nutrients.
Geeignete assimilierbare Kohlenstoffquellen sind u.a. Kohlenhydrate, wie Stärken, hydrolysierte Stärken, Maismehl, Weizenmehl usw.. Die Kohlenhydratkonzentration im verwendeten Nähr— medium kann innerhalb weiter Grenzen schwanken und beispielsweise zwischen etwa 1 und 25 und vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis 20 ?£ (Gewicht/Volumen), berechnet als Dextrose, liegen. Bevorzugte assimilierbare Kohlenhydrate sind Stärke oder partiell hydrolysierte Stärke, die, wenn sie auf Gewichts— basis verwendet werden, in Mengen in einem Bereich von 1 bis 5 Gewichtsprozent vorhanden sein sollen.Suitable assimilable carbon sources include carbohydrates, such as starches, hydrolyzed starches, corn flour, wheat flour, etc. The carbohydrate concentration in the nutrient used medium can vary within wide limits and for example between about 1 and 25 and preferably in the range from about 10 to 20 pounds (weight / volume) calculated as dextrose, lie. Preferred assimilable carbohydrates are starch or partially hydrolyzed starch, which when put on weight- base, in amounts ranging from 1 to 5 Weight percent should be present.
Die Stickstoffquelle im Nährmedium kann anorganisch und/oder organisch sein. Geeignete anorganische Stickstoffquellen sind u.a. Ammoniumsalze und anorganische Nitrate usw.. Geeignete organische Stickstoffquellen sind u.a. Pepton, Fleischextrakt, Enzymextrakt, Casein, Maisquellwasser, Malzextrakt, Sojabohnen— mehl, Magermilch usw..The nitrogen source in the nutrient medium can be inorganic and / or organic. Suitable inorganic nitrogen sources include ammonium salts and inorganic nitrates, etc. Suitable Organic nitrogen sources include peptone, meat extract, enzyme extract, casein, corn steep liquor, malt extract, soybeans flour, skimmed milk, etc.
Außerdem sollte das Nährmedium die üblichen Spurenstoffe, z.B. anorganische Salze, die u.a. Calciumchlorid, Magnesiumsulfat, Phosphate, Natriumchlorid, Kaliumchlorid usw. umfassen, enthalten. Die vorstehenden Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganischen Salze können einzeln oder in geeigneten Kombinationen verwendet werden. Außerdem können kleine Mengen von Metallsalzen, Vitaminen, Aminosäuren usw. verwendet werden, um das Wachstum und die Produktivität der Bakterien zu fördern.In addition, the nutrient medium should contain the usual trace substances, e.g. inorganic salts, including calcium chloride, magnesium sulfate, Phosphates, sodium chloride, potassium chloride, etc. The above carbon sources, nitrogen sources and inorganic salts can be used singly or in appropriate combinations. You can also use small amounts of metal salts, vitamins, amino acids, etc. can be used to promote the growth and productivity of bacteria.
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Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen CV-Amyläseenzyme wird bei den gleichen Kultivierungsbedingungen gearbeitet, die normalerweise bei der Kultivierung thermophiler Bakterien angewandt werden. Vorzugsweise wird der Stamm in einem tiefen flüssigen Kulturmedium unter Rühren und Belüftung zwei bis fünf Tage bei 50 bis 70°C und einem pH-Wert von 5 bis 9 kultiviert. Das Enzym sammelt sich in dem kultivierten Medium an.In the preparation of the CV amylase enzymes according to the invention the same cultivation conditions are used as those normally used for cultivating thermophilic bacteria can be applied. Preferably, the strain is in a deep liquid culture medium with stirring and aeration two to cultured for five days at 50 to 70 ° C and a pH of 5 to 9. The enzyme accumulates in the cultured medium.
Nach der Erzeugung bzw. Bildung des erfindungsgemäßen O^-Amylaseenzyms werden die Mikrobenzellen in herkömmlicher Weise, z.B. durch Zentrifugieren, abgetrennt. Das Filtrat wird dann vorzugsweise durch Zugabe anorganischer Salze, wie Ammoniumsulfat, Natriumsulfat oder Magnesiumsulfat, ausgesalzen und/ oder durch Zusatz wassermischbarer organischer Lösungsmittel, wie Aceton, Äthanol, Propan-2-ol usw., versetzt, um das Enzym auszufällen, so daß dieses konzentriert werden kann. Man kann die ft-Amylase auch dadurch gewinnen, daß man dem Filtrat Stärke zusetzt, so daß die OC-Amylase an die Stärke adsorbiert wird.After the generation or formation of the O ^ -amylase enzyme according to the invention the microbial cells are separated in a conventional manner, e.g., by centrifugation. The filtrate is then preferably by adding inorganic salts such as ammonium sulfate, sodium sulfate or magnesium sulfate, salting out and / or by adding water-miscible organic solvents such as acetone, ethanol, propan-2-ol, etc., added to the enzyme precipitate so that it can be concentrated. The ft-amylase can also be obtained by adding to the filtrate Starch adds so that the OC-amylase adsorbs to the starch will.
Eine bevorzugte Methode zur Reinigung und Abtrennung des Enzyms aus dem Filtrat besteht darin, daß man das Filtrat mit dem doppelten Volumen kaltem Aceton versetzt, um das Enzym auszufällen. Das ausgefällte Enzym wird dann in 0,05molarer Tris-Salzsäurepufferlösung (pH 8,5) gelöst und dann durch eine DEAE-Zellulosesäule, die mit der gleichen Pufferlösung ins Gleichgewicht gebradi t ist, beschickt. Bei einem pH-Wert von 8,5 werden die Nicht-öG-Amylaseproteine, Pigmente usw. an der DEAE-Zellulose adsorbiert, während der größte Teil der OC-Amy läse in Lösung bleibt. Das das it—Amy läse enzym enthaltende Filtrat wird nachfolgend als "partiell raffiniertes Enzym11 bezeichnet. Das partiell raffinierte Enzym kann weiter gereinigt werden, indem man es gegen eine 0,01m Tris-Salzsäurepufferlösung (pH 7»0) dialysiert und dann durch eine Hydroxylapatitsäule schickt, die mit der gleichen Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht ist. Dabei wird das Enzym an die Säule adsorbiert.A preferred method of purifying and separating the enzyme from the filtrate is to add twice the volume of cold acetone to the filtrate in order to precipitate the enzyme. The precipitated enzyme is then dissolved in 0.05 molar Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.5) and then fed through a DEAE cellulose column equilibrated with the same buffer solution. At a pH of 8.5, the non-ÖG amylase proteins, pigments, etc. are adsorbed on the DEAE cellulose, while most of the OC amylase remains in solution. The filtrate containing the it-Amy-lase enzyme is hereinafter referred to as "partially refined enzyme 11. The partially refined enzyme can be further purified by dialyzing it against a 0.01 M Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 7» 0) and then through a Hydroxyapatite column, which is equilibrated with the same buffer solution, and the enzyme is adsorbed onto the column.
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Das adsorbierte Enzym wird eluiert, indem man die Ammoniumsulfatkonzentration stetig von 0 auf 0,05molax* steigert.The adsorbed enzyme is eluted by increasing the ammonium sulfate concentration steadily from 0 to 0.05 molax *.
Das so erhaltene partiell raffinierte Enzym wird,nachdem man es konzentriert hat, durch eine Ionenaustauscherharzsäule (Sephadex G-150) geschickt, wobei das Enzym schwach an das Ionenaustauscherharz adsorbiert wird. Das Enzym wird in der Fraktion mit einem Molekulargewicht unter 10 000 eluiert. Die Aktivität des auf diese Weise erhaltenen raffinierten Enzyms ist zwar 100 mal höher als im ursprünglichen Filtrat, jedoch sind bei der Scheibenelektrophorese außer dem des QC-Amylaseenzyms auch Streifen einiger weniger anderer Proteine zu beobachten, und außerdem ist das Enzym noch nicht kristallisiert. Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung und sind in keiner Weise als Beschränkung zu verstehen. Angaben bezüglich der Anteile oder Mengenverhältnisse beziehen sich, soweit nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist, stets auf das Gewicht.The partially refined enzyme thus obtained is after one concentrated it, passed it through an ion exchange resin column (Sephadex G-150), whereby the enzyme weakly binds to the Ion exchange resin is adsorbed. The enzyme is eluted in the fraction with a molecular weight below 10,000. The activity of the refined enzyme obtained in this way is indeed 100 times higher than in the original filtrate, however, on disk electrophoresis, besides that of the QC amylase enzyme, there are also strips of a few other proteins and the enzyme has not yet crystallized. The following examples illustrate the invention and are in no way to be understood as limiting. Information on the proportions or proportions relate to Unless expressly stated otherwise, always based on weight.
Ein 3,0 Gew.-# lösliche Stärke, 0,5 Gew.~# Bactotrypton, 1,0 Gew.-96 Enzymextrakt, 0,05 Gew.-# Calciumchlorid, 0,05 Gew.-# Magnesiumsulfat und 0,1 Gew.-# Kaliumdihydrogenphosphat enthaltendes Kulturmedium wurde auf pH 7 eingestellt. 50 ml dieses Mediums wurden in einen 500 ml fassenden konischen Kolben gegossen und Minuten bei 121 C sterilisiert. Das sterilisierte Medium wurde mit Bacillus stearothermophilus Stamm ATCC Nr. 31 195 (B-501) beimpft und dann h Tage bei 60 C unter Rühren bebrütet. Nach dem Kultivieren wurden die Mikrobenzellen abzentrifugiert· Die enzymatische Aktivität des Filtrats betrug 10 CPC-o<--Amylaseeinheiten/ml (bestimmt nach der vorstehend beschriebenen CPC-Methode). Dieses Filtrat wurde mit dem zweifachen Volumen Aceton versetzt, um das Enzym auszufällen, das dann in einer 0,05mola— ren Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,5) gelöst wurde. Diese Lösung wurde dann durch eine DEAE-Zellulosesäule geschickt, die mitA 3.0 wt. # Soluble starch, 0.5 wt. ~ # Bactotrypton, 1.0 wt. # 96 enzyme extract, 0.05 wt. # Calcium chloride, 0.05 wt Culture medium containing wt .- # potassium dihydrogen phosphate was adjusted to pH 7. 50 ml of this medium was poured into a 500 ml conical flask and sterilized at 121 ° C. for minutes. The sterilized medium was inoculated with Bacillus stearothermophilus strain ATCC No. 31 195 (B-501) and then incubated for hours at 60 ° C. with stirring. After culturing, the microbial cells were centrifuged off. The enzymatic activity of the filtrate was 10 CPC-o <-amylase units / ml (determined according to the CPC method described above). Two times the volume of acetone was added to this filtrate in order to precipitate the enzyme, which was then dissolved in a 0.05 molar Tris-HCl buffer solution (pH 8.5). This solution was then passed through a DEAE cellulose column containing
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der gleichen Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden war. Das ji-Amylaseenzym wurde nicht an die DEAE-Zellulose adsorbiert, während die meisten anderen Proteine, Pigmente usw. adsorbiert und somit abgetrennt wurden. Das so erhaltene partiell raffinierte Enzym wurde dann zuerst konzentriert und hierauf durch eine Sephadex~G-150-Säule geschickt. Dabei wurde das Enzym schwach an das Ionenaustauscherharz adsorbiert und in der Fraktion mit einem Molekulargewicht von weniger als 10 000 eluiert. Das so erhaltene gereinigte Enzym wurde dann durch Gefriertrocknen zu einem raffinierten Enzympulverpräparat aufgearbeitet, dessen relative Aktivität etwa. 200 CPC-Einheiten/mg Protein betrug.the same buffer solution has been equilibrated was. The ji-amylase enzyme was not attached to the DEAE cellulose adsorbed, while most of the other proteins, pigments, etc. were adsorbed and thus separated. The partially refined enzyme thus obtained was then concentrated first and then sent through a Sephadex ~ G-150 column. Included the enzyme was weakly adsorbed on the ion exchange resin and in the fraction having a molecular weight of less eluted than 10,000. The purified enzyme thus obtained was then worked up by freeze-drying to give a refined enzyme powder preparation, the relative activity of which is about. Was 200 CPC units / mg protein.
Ein Kulturmedium, das 3 % Maisstärke, 0,5 % Pepton, 1 # Maisquellwasser, 0,05 °fa Calciumchlorid, 0,05 % Manganchlorid, 0,05 # Magnesiumchlorid und 0,05 # Kaliumchlorid enthielt, wurde auf pH 7»5 eingestellt. 50 ml dieses Kulturmediums wurden in einen 500 ml fassenden konischen Kolben gefüllt und 15 Minuten bei 121°C sterilisiert. Das sterilisierte Medium wurde mit Bacillus stearothermophilus Stamm ATCC Nr. 31 196 (B-781) beimpft und k Tage bei 55°C gerührt. Nach dem Kultivieren wurden die Mikrobenzellen durch Zentrifugieren abgetrennt. Die °i-Amylaseaktivität im Filtrat betrug 1^ CPC-Einheiten/ml. Die oC-Amylase wurde durch Zusatz von Propan-2-ol in einer dem doppelten Filtratvolumen entsprechenden Menge ausgefällt. Die Fällung wurde durch Gefriertrocknen zu einem trockenen Pulver aufgearbeitet. Die Aktivität des rohen Enzympulvers betrug 3 CPC-Einheiten/mg. Aus diesem rohen Enzympulver wurde durch Reinigung analog Beispiel 1 ein raffiniertes Enzympulver mit einer Aktivität von 230 Einheiten/mg erhalten.Containing a culture medium containing 3% corn starch, 0.5% peptone, 1 # corn steep liquor, 0.05 ° fa calcium chloride, 0.05% manganese chloride, magnesium chloride and 0.05 # 0.05 # of potassium chloride, was adjusted to pH 7 »5 set. 50 ml of this culture medium was placed in a 500 ml conical flask and sterilized at 121 ° C. for 15 minutes. The sterilized medium was inoculated with Bacillus stearothermophilus strain ATCC No. 31 196 (B-781) and stirred at 55 ° C. for k days. After the cultivation, the microbial cells were separated by centrifugation. The i-amylase activity in the filtrate was 1 ^ CPC units / ml. The oC-amylase was precipitated by adding propan-2-ol in an amount corresponding to twice the volume of the filtrate. The precipitate was worked up to a dry powder by freeze drying. The activity of the crude enzyme powder was 3 CPC units / mg. A refined enzyme powder with an activity of 230 units / mg was obtained from this raw enzyme powder by purification as in Example 1.
31 195, 31 196, 31 197, 31 198 und 31 199, wurden bezüglich des31 195, 31 196, 31 197, 31 198 and 31 199 have been modified with respect to the
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θί-Amylase geprüft. Die <X-Amylaseaktivität wurde bei diesen Versuchen durch den Mittelwert des jeweiligen Aktivitäts— maximums in bzw. bei drei Kolben bzw. Parallelversuchen ausgedrückt. Die Zusammensetzung des Kulturmediums für sowohl die Vorkultur als auch die Hauptkultur wies die in der Tabelle I angegebene Zusammensetzung (B-M-Medium) auf. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der nachfolgenden Tabelle V zusammengefaßt .θί-amylase checked. The <X-amylase activity was found in these Tests expressed as the mean value of the respective maximum activity in or for three flasks or parallel tests. The composition of the culture medium for both the preculture and the main culture was as shown in Table I. specified composition (B-M medium). The results of these tests are summarized in Table V below .
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CO co
CO
coco
co
Temp.Temp.
Aktivität E/ml (Kulturzeit)Activity U / ml (culture time)
ATCC Nr. ( C) pH 5,5 pH 6,0 pH 6,5 pH 7,0 pH 7,5 pH 8,0ATCC No. (C) pH 5.5 pH 6.0 pH 6.5 pH 7.0 pH 7.5 pH 8.0
31 198 50 184 (68) 272 (68) 480 (68) 352 (68) 152 (68)31 198 50 184 (68) 272 (68) 480 (68) 352 (68) 152 (68)
55 768 (44) 752 (68) 832 (44) 880 (44) 955 (44)55 768 (44) 752 (68) 832 (44) 880 (44) 955 (44)
60 621 (44) 675 (44) 739 (44) 1 104 (44) 1 123 (44)60 621 (44) 675 (44) 739 (44) 1 104 (44) 1 123 (44)
65 1 340 (68) 782 (44) 776 (44) 698 (44) 661 (44)65 1 340 (68) 782 (44) 776 (44) 698 (44) 661 (44)
Os 31 199 45 143 (139) 133 (139) 113 (139) 115 (139) 86 (139)Os 31 199 45 143 (139) 133 (139) 113 (139) 115 (139) 86 (139)
£ 50 686 (139) 663 (139) 543 (139) 493 (139) 491 (139)£ 50 686 (139) 663 (139) 543 (139) 493 (139) 491 (139)
Q 55 1 608 (43) 1 365 (43) 1 267 (43) 1 025 (43) 946Q 55 1 608 (43) 1 365 (43) 1 267 (43) 1 025 (43) 946
00 60 1 485 (43) 1 457 (43) 1 295 (43) 1 154 (43) 1 117 00 60 1 485 (43) 1 457 (43) 1 295 (43) 1 154 (43) 1 117
ο» 65 0 (65) 0 (65) 0 (65) 0 (65) 0 (65) ο »65 0 (65) 0 (65) 0 (65) 0 (65) 0 (65)
Aus der Tabelle V ist zu ersehen, daß die optimalen Bedingungen für die Stämme ATCC Nr. 31 195 und 31 196 60°C und pH 7,0 bzw. 7,5 betragen. Die Stämme ATCC Nr. 31 197 und 31 198 erzeugten beträchtliche Mengen .X-Amylase, wenn sie bei 65 C kultiviert wurden, jedoch war die Kultivierung bei dieser hohen Temperatur bei den anderen Stämmen nicht für die Erzeugung guter Λ-Amylaseaktivität geeignet. Bei einer Kultivierungstemperatur von 55 bis 60°C betrug der für die öt-Amylaseerzeugung optimale pH-Wert des Kulturmediums 8,0 beim Stamm ATCC Nr. 31 198 und 5,5 beim Stamm ATCC Nr. 31 199.From Table V it can be seen that the optimal conditions for the strains ATCC No. 31 195 and 31 196 60 ° C and pH 7.0 and 7.5. ATCC Nos. 31197 and 31198 strains produced significant amounts of .X-amylase when at 65 ° C were cultivated, but the cultivation at this high temperature was not suitable for the production of the other strains good Λ-amylase activity suitable. At a cultivation temperature from 55 to 60 ° C, the optimal pH of the culture medium for ot amylase production was 8.0 ATCC No. 31,198 strain and 5.5 to ATCC No. 31,199 strain.
Die nachfolgende Tabelle VI gibt zusammengefaßt die Ergebnisse bzgl. der <X-Amylaseerzeugung der fünf isolierten Stämme unter Verwendung wiederholt übertragener Schräg-Agar—Kulturen (jeder Stamm wurde mehrmals (9-11 mal) auf zwei verschiedenen Arten von Schräg-Agar-Kulturmedien übertragen bzw. überimpft und dann in einem flüssigen Nährmedium kultiviert, um ein geeignetes Schräg-Agar-Medium zu finden, das eine - stabile OC-Amylase— produktion aufrechterhalten kann) wieder, während die nachfolgende Tabelle VII die wesentlichsten Daten der Versuche wiedergibt, die zur Bestimmung des Einflusses des Mediumvolumens auf die Λ-Amylaseproduktion (das Mediumvolumen in 500 ml Kolben wurde variiert, um den Einfluß des Belüftungseffekts auf die Qi-Amylaseerzeugung durch den jeweils untersuchten Stamm zu ermitteln) durchgeführt wurden.The following Table VI summarizes the results with regard to the <X-amylase production of the five isolated strains Using repetitively transferred agar slants (each Strain was inoculated and inoculated several times (9-11 times) on two different types of agar slant culture media then cultivated in a liquid nutrient medium in order to find a suitable agar slant medium which contains a - stable OC amylase - production can be maintained) again, while the following Table VII shows the most important data of the experiments reproduces those used to determine the influence of the medium volume on Λ-amylase production (the medium volume in 500 ml flasks was varied in order to assess the influence of the aeration effect on Qi-amylase production by the particular strain examined determine) have been carried out.
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lolo
Temp. pH
( c)conditions
Temp. PH
( c )
(Kulturzeit /~"h__7)Activity, E / ral
(Culture time / ~ "h__7)
Plattenwech
selNo. number of
Plate change
sel
1«1"
*2 Nähr-Schräg-Agar -Medium* 2 nutrient slant agar medium
Bacto-Pepton (Difco) 0,5 Bacto-Rindfleischextr.Bacto-Pepton (Difco) 0.5 Bacto-Beef Extra.
(Difco) 0,3(Difco) 0.3
Agar 2,0Agar 2.0
PH 7,2PH 7.2
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: Kolbenkultur: Flask culture
Zahl dernumber of
ATCC Nr. Plattenwechsel ATCC No. plate change
Bed ingungenConditions
Temp.Temp.
(°C) H Mediumvolumen Aktivität E/ml ml/500 ml Kulturzeit £λ/ Kolben(° C) H medium volume activity E / ml ml / 500 ml culture time £ λ / flask
31 19531 195
BD-11BD-11
6060
7,07.0
50
60
7050
60
70
150 127150 127
1 192 1 192
790790
(65) (65)(65) (65)
(41) (65)(41) (65)
31 19631 196
BD-2BD-2
6060
7,5 30
40
50
60
707.5 30
40
50
60
70
954 966. 976 1 236 651954 966, 976 1 236 651
(26) (26) (26) (26)(26) (26) (26) (26)
31 19731 197
BD-3BD-3
5555
7,5 30
40
50
60
707.5 30
40
50
60
70
1 435 1 435
1 590 1 590
1 510 1 510
1 380 1,380
840840
(41) (41)(41) (41)
(41) (41)(41) (41)
31 19831 198
BD-4BD-4
6060
8,0 30
40
50
60
708.0 30
40
50
60
70
689689
651 736 939 777651 736 939 777
(44(44
(44)(44)
(44)(44)
(44)(44)
(44)(44)
31 199 BD-2 55 5,531 199 BD-2 55 5.5
709845/0838709845/0838 30 4o 50 60 7030th 4o 50 60 70
1 1311 131
1 2401 240
1 1631 163
1 0541 054
1 2241 224
(44) (44) (44) (68) (68)(44) (44) (44) (68) (68)
Es wurden zwei Stämme der Erfindung (ATCC Nr. 31 195 und 31 199) gereinigt und die Eigenschaften der von ihnen erzeugten OC-Amylase nach der nachfolgend beschriebenen Arbeitsweise mit denjenigen eines handelsüblichen Enzyms (Thermamyl Liquid 6O, Batch AN IOO5) verglichen.Two strains of the invention (ATCC No. 31 195 and 31 199) and the properties of the OC-amylase produced by them according to the procedure described below with those of a commercially available enzyme (Thermamyl Liquid 6O, Batch AN IOO5) compared.
OC-Amylaseenzym wurde aus den Kulturfiltraten der Stämme ATCC Nr. 31 195 und 31 199 oder aus dem Thermamyl-Ä-Amylase-Präparat (zweifach verdünnt) durch Versetzen mit 2 Volumina kalten Acetons ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen und in O,025molarer Calciumacetatlösung gelöst. Dann wurde der so erhaltenen Lösung so viel lösliche Stärke zugesetzt, daß eine 20^ige Stärkesuspension erhalten wurde. Diese Suspension wurde 30 Minuten auf 85 C erhitzt, worauf der Niederschlag abzentrifugiert wurde. Dann wurde die Lösung gegen 0,05molare Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,5)» die 1OmMoI Clciumionen enthielt, dialysiert, wobei die Pufferlösung zweimal erneuert wurde. Das Dialysat wurde einer DEAE-Zellulosesäule zugeführt, die mit der Dialysepufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die ok-Amyläse wurde in der Säule nicht adsorbiert und mit der gleichen Pufferlösung eluiert. Die Ci-Amylaseaktivität aufweisenden Fraktionen wurden gesammelt, worauf das θί-Amylaseenzym durch Ausfällen mit Aceton konzentriert wurde. Die Λ-Amylaseaktivität wurde nach der vorstehend beschriebenen CPC-Methode bestimmt. Die wesentlichen Daten des Reinigungsverfahrens bzw. der danach durchgeführten Versuche sind in der nachfolgenden Tabelle VIII zusammengefaßt.OC-amylase enzyme was precipitated from the culture filtrates of the strains ATCC No. 31 195 and 31 199 or from the Thermamyl-λ-amylase preparation (diluted twice) by adding 2 volumes of cold acetone. The precipitate was collected by centrifugation and dissolved in 0.025 molar calcium acetate solution. Then enough soluble starch was added to the solution thus obtained that a 20% starch suspension was obtained. This suspension was heated to 85 ° C. for 30 minutes, after which the precipitate was centrifuged off. The solution was then dialyzed against 0.05 molar Tris-HCl buffer solution (pH 8.5) containing 10 mmol of calcium ions, the buffer solution being renewed twice. The dialysate was fed to a DEAE cellulose column which had been equilibrated with the dialysis buffer solution. The ok-amylase was not adsorbed in the column and eluted with the same buffer solution. The fractions exhibiting Ci-amylase activity were collected, whereupon the θί- amylaseenzym was concentrated by precipitation with acetone. The Λ-amylase activity was determined by the CPC method described above. The essential data of the cleaning process and the tests carried out afterwards are summarized in Table VIII below.
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Tabelle VIII *"Table VIII * "
fällungAcetone-
precipitation
behand—
lung Heat-
treat-
lung
Zellulose DEAE-
cellulose
, . - Verfahren
c\ —AmylaseCleaning
,. - Procedure
c amylase
od. rohes
EnzympräparatCulture broth
or raw
Enzyme preparation
2 0168 640
2 016
1 4508 420
1 450
15,715.7
(CPC-Einheiten)
Gesamtprotein
(mg)Total activity
(CPC units)
Total protein
(mg)
7 9909 870
7 990
tät (Einheit./mg)Specific activi
ity (unit / mg)
(CPC-Einheiten)Total activity
(CPC units)
tät (Einheiten/mg)Specific activi
strength (units / mg)
(CPC-Einheiten)Total activity
(CPC units)
tät (Einheiten/mg)Specific activi
strength (units / mg)
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Die Säure- und Hitzebeständigkeit der partiell gereinigten tf-Amylasepräparate von den Stämmen ATCC Nr. 31 195 und 31 199t sowie der Thermamyl-O-Amylase mit einer Aktivität von 7 Einh./ml wurde durch 1-stündiges Inkubieren unter folgenden Bedingungen bestimmt:The acid and heat resistance of the partially cleaned tf amylase preparations from ATCC No. 31 195 and 31 199t strains as well as Thermamyl-O-amylase with an activity of 7 units / ml was determined by incubating for 1 hour under the following conditions:
(a) 90°C, pH 6,0, Ca++ 0 oder 1 mMol;(a) 90 ° C, pH 6.0, Ca ++ 0 or 1 mmol;
(b) 80°C, pH 4,55, Ca++ 5 mMol;(b) 80 ° C, pH 4.55, Ca ++ 5 mmol;
(c) 85°C, pH 4,55, Ca+* 1 mMol oder 5 mMol, 22,5 # lösliche Stärke.(c) 85 ° C, pH 4.55, Ca + * 1 mmol or 5 mmol, 22.5 # soluble starch.
5 ml des rt-AmylasePräparats wurden in einem Visking-8/32-Zelluloserohr 3 Stunden bei 4°C gegen 0,05molare Calciumacetatpufferlösung (pH 4,5 bis 6,0) dialysiert, die 0 bis 5 mMol Calciumacetat enthielt, wobei die Pufferlösung zweimal gewechselt wurde. Dann wurden h ml des Dialysats in kleine Proberöhrchen gegeben und bei der angegebenen Temperatur im -Wasserbad inkubiert. Die Proberöhrchen wurden hierauf rasch in einem Eiswasserbad abgekühlt, worauf die verbliebene (X-Amylaseaktivität (Restaktivität) bestimmt wurde.5 ml of the rt-amylase preparation were dialyzed in a Visking 8/32 cellulose tube for 3 hours at 4 ° C. against 0.05 molar calcium acetate buffer solution (pH 4.5 to 6.0) which contained 0 to 5 mmol calcium acetate, the buffer solution was changed twice. Then h ml of the dialysate were placed in small test tubes and incubated at the specified temperature in a water bath. The test tubes were then rapidly cooled in an ice water bath, whereupon the remaining (X-amylase activity (residual activity) was determined.
** 0,3 ml einer dialysierten <X-Amylaseenzymlösung, 0,5 ml einer 1-molaren Calciumacetatpufferlösung, 0,2 ml einer 0,5mo— laren Calciumchloridlösung und 3,0 ml einer 3Obigen Aufschlämmung löslicher Stärke wurden in ein Proberohr pipettiert. Das Gemisch wurde dann unter ständigem Rühren 30 Minuten bei 85 C inkubiert. Dann wurden die Proberöhrchen in einem Eiswasserbad rasch abgekühlt und hierauf die Restaktivität bestimmt. ** 0.3 ml of a dialyzed <X-amylase enzyme solution, 0.5 ml a 1 molar calcium acetate buffer solution, 0.2 ml of a 0.5 mo- lar calcium chloride solution and 3.0 ml of the above slurry soluble starch were pipetted into a sample tube. The mixture was then stirred for 30 minutes Incubated at 85 C. Then the sample tubes were placed in an ice water bath rapidly cooled and then the residual activity determined.
Die Ä-Amylase-Restaktivitäten wurden jeweils nach Inkubationszeiten von 5» 10, 20, 30 und 60 Minuten bestimmt.The residual amylase activities were determined after each incubation period of 5 »10, 20, 30 and 60 minutes.
Der optimale pH-Wert und die optimale Temperatur wurden für die oC-Amylasen aus den Stämmen ATCC Nr. 31 195 und 31 199, sowie die Thermamyl-OC-Amylase nach den vorstehend beschriebenenThe optimal pH value and the optimal temperature were determined for the oC-amylases from the strains ATCC No. 31 195 and 31 199, as well as the Thermamyl-OC-amylase according to those described above
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CPC-Versuchsbedingungen bestimmt, wobei Jedoch natürlich entweder der pH-Wert oder die Temperatur variiert wurde. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in den Figuren 1 und 2 graphisch dargestellt. Das pH-Optimum lag bei den beiden (X-Amylasen aus den Stämmen ATCC 31 195 und 31 199 bei 4,0 bis 5,2 und bei der handelsüblichen ^(-Amylase (Thermamyl) bei 4,5. Es wurde festgestellt, daß die handelsübliche C(-Amy läse auch in einem neutralen und alkalischen pH-Bereich eine hohe enzymatische Aktivität behält.CPC experimental conditions were determined, but of course either the pH or the temperature was varied. the Results of these tests are shown graphically in FIGS. The pH optimum was with the two (X-amylases from ATCC 31 195 and 31 199 strains at 4.0 to 5.2 and the commercially available ^ (- amylase (Thermamyl) at 4.5. It was found that the commercially available C (-Amy läse retains high enzymatic activity even in a neutral and alkaline pH range.
Die optimale Temperatur lag bei der Ot-Amy läse aus dem Stamm ATCC Nr. 31 199 bei 75°C, bei der aus dem Stamm ATCC Nr. 31 bei 800C und bei der handelsüblichen öt-Amylase (Thermamyl) bei 85 C. Die Beziehung zwischen der enzymatischen Aktivität und der Reaktionstemperatur war bei den o(-Amylasen aus den Stämmen ATCC 31 195 und ATCC 31 199 sehr ähnlich, während der Verlauf bei der handelsüblichen rt-Amylase (Thermamyl) davon beträchtlich abwich. Es wurde gefunden, daß die Ot-Amylaseaktivität bei der handelsüblichen Oi-Amylase (Thermamyl) um 20 bis 30 i» gesteigert wurde, wenn das Enzym bei 85 C und pH 6,0 in Gegenwart von Stärke und Calciumionen inkubiert wurde. Diese Tatsache kann den Unterschied zwischen den erfindungsgemäßen Λ-Amylaseenzymen aus den Stämmen ATCC 31 195 und ATCC 31 199 einerseits und der handelsüblichen Λ-Amyläse (Thermamyl) andererseits bezüglich des Verlaufs der enzymatischen Aktivität in Abhängigkeit von der Reaktionstemperatur erklären.The optimum temperature was at the Ot-Amy were reading from the strain ATCC no. 31199 at 75 ° C, in which from the strain ATCC no. 31 at 80 0 C and in the commercial öt-amylase (Termamyl) at 85 C. The relationship between the enzymatic activity and the reaction temperature was very similar for the o (-amylases from the strains ATCC 31 195 and ATCC 31 199, while the course for the commercially available rt-amylase (Thermamyl) differed considerably. It was found that the Ot-amylase activity in the commercial Oi-amylase (Thermamyl) were increased by 20 to 30 i "when the enzyme at 85 C and pH was incubated in the presence of starch and calcium ions 6.0. This fact can be the difference between the inventive Explain Λ-amylase enzymes from the strains ATCC 31 195 and ATCC 31 199 on the one hand and the commercially available Λ-amylase (Thermamyl) on the other hand with regard to the course of the enzymatic activity as a function of the reaction temperature.
Figur 3 gibt die Inaktivierungskurven für die erfindungsgemäßen Öt-Amylasen aus den Stämmen ATCC 31 195 und 31 199 sowie für die handelsübliche <X-Amylase (Thermamyl) beim Inkubieren bei 80°C und pH 4,55 in Gegenwart von 5 mMol Calciumchlorid wieder. Die Cf-Amylase aus dem Stamm ATCC 31 199 wies die höchste Thermostabilität auf, gefolgt von der tt-Amyläse aus dem Stamm ATCC 31 195· Die handelsübliche Ä-Amylase (Thermamyl) war den beiden erfindungsgemäßen A-Amylaseenzymen aus den Stämmen ATCC 31 195 und ATCC 31 199 bezüglich der Hitzebeständigkeit unter den genannten Bedingungen beträchtlich unterlegen·FIG. 3 gives the inactivation curves for the Öt-amylases according to the invention from the ATCC strains 31 195 and 31 199 as well for the commercially available <X-amylase (Thermamyl) during incubation at 80 ° C and pH 4.55 in the presence of 5 mmol calcium chloride again. The Cf amylase from strain ATCC 31 199 had the highest thermal stability, followed by the tt amylase off the strain ATCC 31 195 · The commercially available Ä-amylase (Thermamyl) was the two A-amylase enzymes according to the invention from the Inferior to strains ATCC 31 195 and ATCC 31 199 in terms of heat resistance under the conditions mentioned.
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Figur k git)* die Inaktivierungskurven für die erfindungagemäßencX-Amylaseenzyme aus den Stämmen ATCC 31 195 und 31 199, sowie für eine handelsübliche Ä-Amylase (Thermamyl) und eine weitere bekannte cC-Amylase, nämlich die von Ogasawara und Mitarbeitern in J_z. Biochem.. 67, 65, 77, 83 (197O) beschriebene Öi-Amylase aus Bacillus stearothermophilus beim Inkubieren bei 90 C und pH 6,0 in Abwesenheit von Calcium!onen wieder (die Inkubationsbedingungen entsprechen den von Ogasawara und Mitarb, hierfür angegebenen Bedingungen).Figure k git) * the inactivation curves for the cX-amylase enzymes according to the invention from the strains ATCC 31 195 and 31 199, as well as for a commercially available-amylase (Thermamyl) and another known cC-amylase, namely that of Ogasawara and coworkers in J_z. Biochem. . 67 , 65, 77, 83 (197O) described oil amylase from Bacillus stearothermophilus when incubated at 90 ° C. and pH 6.0 in the absence of calcium ions (the incubation conditions correspond to those of Ogasawara and colleagues, conditions given for this).
Wie aus Figur h zu ersehen ist, wiesen die Ot-Amylaseenzyme der Erfindung eine wesentlich höhere Hitzebeständig^ it auf als sowohl die handelsübliche ÖL-Amylase (Thermamyl) als auch die von Ogasawara und Mitarb, beschriebene, bekannte <?l-Amy läse, was deswegen als besonders überraschend anzusehen ist, weil die erfindungsgemäßen OC-Amylasen ebenso wie das letztgenannte bekannte Enzym von Bacillus stearothermophilus stammen.As can be seen from Figure h , the Ot-amylase enzymes of the invention had a significantly higher heat resistance than both the commercially available oil amylase (Thermamyl) and the well-known <? L-Amy lase described by Ogasawara and colleagues, which is to be regarded as particularly surprising because the OC-amylases according to the invention as well as the last-mentioned known enzyme originate from Bacillus stearothermophilus.
Figur 5 gibt die Inaktivierungskurven der erfindungsgemäßen (X-Amylaseenzyme aus den Stämmen ATCC 31 195 und ATCC 31 199, sowie, zum Vergleich, der handelsüblichen Λ-Amylase (Thermamyl) unter den vorstehend für Figur k angegebenen Bedingungen (z.B. 900C und pH 6,0) wieder, wobei jedoch abweichend davon das Medium 1 mMol Calciumionen enthielt. Dabei wiesen die erfindungsgemäOen A-Amylasen immer noch eine höhere Hitzebeständigkeit als Thermamyl-ft-Amylase auf, jedoch war der Unterschied nicht so groß wie ohne zugesetzte Calciumionen. Dieser Sachverhalt läßt darauf schließen, daß die erfindungsgemäßen Ct-Amylasen aus den Stämmen ATCC 31 195 und 31 199 Calciumionen fester als die handelsübliche flt-Amy läse (Thermamyl) binden, so daß ihr Bedarf an Calciumionen zum Stabilisieren des Proteinmoleküls geringer ist als der von Thermarayl-ÖL-Amylase. Figure 5 shows the inactivation of the (X-amylase enzymes of the invention from strains ATCC 31195 and ATCC 31199, as well as, for comparison, the commercial Λ-amylase (Termamyl) among the above for FIG k specified conditions (for example 90 0 C and pH 6.0) again, although, unlike this, the medium contained 1 mmol calcium ions The facts suggest that the Ct-amylases according to the invention from the ATCC 31 195 and 31 199 strains bind calcium ions more tightly than the commercially available flt-Amy lase (Thermamyl), so that their calcium ion requirement to stabilize the protein molecule is lower than that of Thermarayl - OIL amylase.
Die Figuren 6 und 7 geben die Inaktivierungskurven der erfindungsgemäßen Cf-Amylaseenzyme aus den Stämmen ATCC 31 195 und 31 199» sowie, zum Vergleich der handelsüblichen Oi-Amy läseFigures 6 and 7 give the inactivation curves of the invention CF amylase enzymes from the strains ATCC 31 195 and 31 199 »as well as, for comparison, the commercially available Oi-Amy läse
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itit
(Thermamyl) beim Inkubieren bei 85 C und einem pH von 4,55 in Gegenwart von löslicher Stärke (22,5 %t T.S.) und Calciumionen wieder, und zwar Figur 6 bei einer Calciumionenkonzentratlon von 1 mMol und Figur 7 bei einer Calciumionenkonzentratxon von 5 mMol. Die erfindungsgemäßen Ot-Amy lasen aus den Stämmen ATCC 31 195 und 31 199 wiesen sowohl unter den Bedingungen von Figur 6 als auch unter denen von Figur 7 eine höhere Hitzebeständigkeit auf als die handelsübliche ΰί-Amylase (Thermamyl). Die Bedingungen bei den vorstehenden Versuchen, deren Ergebnisse in den Figuren 6 und 7 graphisch dargestellt sind, gleichen den bei vielen großtechnischen Verflüssigungsverfahren angewandten Arbeitsbedingungen, so daß zu erwarten ist, daß die erfindungsgemäßen Ci-Amylaseenzyme bei der industriellen Verflüssigung und Konversion von Stärke bei sauren pH—Werten eine höhere Hitzebeständigkeit als bislang bekannte Enzyme aufweisen werden.(Thermamyl) when incubated at 85 C and a pH of 4.55 in the presence of soluble starch (22.5 % TS) and calcium ions, namely FIG. 6 with a calcium ion concentration of 1 mmol and FIG. 7 with a calcium ion concentration of 5 mmol. The Ot-Amy according to the invention from the ATCC 31 195 and 31 199 strains had a higher heat resistance than the commercially available ΰί-amylase (Thermamyl) both under the conditions of FIG. 6 and under those of FIG. The conditions in the above experiments, the results of which are shown graphically in FIGS. 6 and 7, are similar to the working conditions used in many large-scale liquefaction processes, so that it is to be expected that the Ci-amylase enzymes according to the invention will be used in the industrial liquefaction and conversion of starch in acidic pH values will have a higher heat resistance than previously known enzymes.
Das Molekulargewicht der erfindungsgemäßen df-Amylaseenzyme aus den Stämmen ATCC 31 195 und 31 199 wurde durch SDS-Scheibenelektrophorese nach der von Weber und Osborn (J^ Biöl. Chem., 244« 14O6 (1969)) beschriebenen Methode jeweils mit 96 000 bestimmt. Als Markierungsproteine wurden Albumin (Molekulargewicht 67 OOO), Ovalbumin (Molekulargewicht 45 OOO), Chymotrypsin (Molekulargewicht 25 OOO) und Cytochrom C (Molekulargewicht 12 5OO) verwendet. Die Lage der erfindungsgemäßen Λ-Amylasen auf dem Polyacrylamidgel wurde bestimmt, indem das Gel auf eine Amylose-Azuragarplatte gebracht und bei 37°C bebrütet wurde. Die Ergebnisse dieses Tests sind in der Figur graphisch dargestellt.The molecular weight of the df-amylase enzymes of the invention from strains ATCC 31195 and 31199 were each determined by SDS disc electrophoresis method described by Weber and Osborn (J ^ Biöl. Chem., 244, "14O6 (1969)) by the method described 96 000. The labeling proteins used were albumin (molecular weight 67,000), ovalbumin (molecular weight 45,000), chymotrypsin (molecular weight 25,000) and cytochrome C (molecular weight 12,500). The position of the Λ-amylases according to the invention on the polyacrylamide gel was determined by placing the gel on an amylose azure agar plate and incubating it at 37.degree. The results of this test are shown graphically in the figure.
Das so ermittelte Molekulargewicht der erfindungsgemäßen cC- Amylasen ist mit 96 000 viel höher als das von Ogasawara und Mitarb, (j. Biochem.. 67, 65, 77, 83 (197O)) bzw. Manning und Mitarb. (J. Biol. Chem.. 236. 2952, 2958, 2962 (1961)) für von Bacillus stearothermophilus stammende C(-Amy las en angegebene Molekulargewicht von 48 000 bzw. 15 6OO. The molecular weight of the cC amylases according to the invention determined in this way, at 96,000, is much higher than that of Ogasawara and colleagues (J. Biochem . 67 , 65, 77, 83 (197O)) and Manning and colleagues. (J. Biol. Chem. 236. 2952, 2958, 2962 (1961)) for C (-Amy reads given molecular weights of 48,000 and 15,600, respectively, derived from Bacillus stearothermophilus.
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Die fünf isolierten Stämme bzw. die daraus gewonnenen Ä-Al sen wurden auf das Vorhandensein von Proteaseaktivität geprüft, da die Anwesenheit von Protease oder proteolytischem Enzym in «χ—Amylaseenzymen dazu führt, daß die Enzyme dazu neigen, mit verschiedenen Proteinmaterialien, die in vielen Stärkematerialien vorhanden sind, unter Bildung wasserlöslicher Proteinhydrolysate» z.B. Aminosäuren, zu reagieren. Aue diesem Grund ist die Anwesenheit von Proteaseenzym als Verunreinigung in «X-Amylaseenzymen im Hinblick auf die wirtschaftliche und effiziente Hydrolyse von Stärkematerialien nachteilig. Die Proteaseaktivitäten der erfindungsgemäßen, aus den fünf isolierten Stämmen gewonnenen OC-Amylaseenzyme wurden nach einer modifizierten Anson-Hagiwara-Methode an Präparaten bestimmt, die durch Ausfällen mit Aceton aus nitraten von Kulturen im Stadium der maximalen oC-Amylaseproduktion gewonnen worden waren.The five isolated strains or the Ä-Al sen were checked for the presence of protease activity, since the presence of protease or proteolytic enzyme in «χ-amylase enzymes causes the enzymes to do so tend to make water soluble with various protein materials that are present in many starch materials Protein hydrolysates »e.g. amino acids to react. Aue this Reason is the presence of protease enzyme as an impurity in «X-amylase enzymes in terms of economic and efficient hydrolysis of starch materials is disadvantageous. The protease activities of the invention, isolated from the five OC-amylase enzymes obtained from strains were after a modified Anson-Hagiwara method on preparations determined by precipitation with acetone from nitrates of cultures was obtained at the stage of maximum oC amylase production was.
Die bei diesen Versuchen erhaltenen Ergebnisse wurden mit denen von Enzympräparaten aus handelsüblicher #-Amyläse (Thermamyl) und einer bakteriellen Ot-Amylase der CPC verglichen. Wie nachfolgend gezeigt, enthielten Thermamyl und die Kulturfiltrate von isolierten thermophilen Strahlenpilzen (ray fungi) große Mengen Protease, wogegen die hitzebeständige 01-Amy läse erzeugenden Stämme der Erfindung keine nennenswerten Proteasemengen erzeugten.The results obtained in these experiments were compared with those of enzyme preparations from commercially available # -amylase (Thermamyl) and a bacterial Ot-amylase from CPC. As shown below, Thermamyl and the culture filtrates of isolated thermophilic ray fungi contained large amounts of protease, whereas the heat-resistant 01-Amy reads producing strains of the invention do not show any appreciable amounts of protease generated.
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MoMon
von c(. -Amy läse by c (. -Amy läse
Enzymenzyme
Protease^C-Amylase— VerhältnisProtease ^ C-Amylase- relationship
ATCC Nr. 31 195ATCC No. 31 195
ATCC Nr. 31 196ATCC No. 31 196
ATCC Nr. 31 197ATCC No. 31 197
ATCC Nr. 31 198ATCC No. 31 198
ATCC Nr. 31 199 CPC-BLA Thermamyl 60ATCC No. 31 199 CPC-BLA Thermamyl 60
0,06 0,170.06 0.17
2,35 0,08 0,06 6,22.35 0.08 0.06 6.2
36,5 109,0 36.5 109.0
1)1)
Thermophile Strahlenpilze (ray fungi), isoliert bei 55°C und pH 7,0.Thermophilic ray fungi, isolated at 55 ° C and pH 7.0.
Wie aus den vorstehenden Versuchsergebnissen zu ersehen ist, enthalten die tf-Amylaseenzyme der Erfindung keine signifikante Proteaseaktivität, d.h., daß sie ein Protease/it-Amylaee-Verhältnis von weniger als 3 und in der Regel sogar weniger ale 1 aufweisen. Dies ist ein bedeutender Vorteil, wenn man das Enzym zum Hydrolysieren von Stärkematerialien verwendet.As can be seen from the above test results, the tf-amylase enzymes of the invention do not contain any significant ones Protease activity, i.e. having a protease / it-Amylaee ratio of less than 3 and usually even less 1 have. This is a significant advantage when using the enzyme to hydrolyze starch materials.
Das nachfolgende Beispiel erläutert die Verwendung der erfindungsgemäOen flf-Amylaseenzyme zum Verflüssigen von Stärke bei der Herstellung von Stärkehydrolysaten mit hohen OE-Werten.The following example explains the use of the flf-amylase enzymes according to the invention for liquefying starch in the production of starch hydrolyzates with high OE values.
von Starkehydrolof starch hydrol
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«Μ«Μ
In 70 ml Wasser wurden 30 g Kartoffelstärke suspensiert, worauf 75 mg Calciumchloriddihydrat zugegeben wurden und der pH auf k,5 eingestellt wurde. Diese Aufschlämmung wurde mit dem raffinierten, pulverigen, nach Beispiel 2 erhaltenen Enzym in einer 50 CPC-Einheiten entsprechenden Menge versetzt, worauf man das Gemisch zur Verflüssigung der Stärke 30 Minuten bei 850C reagieren ließ. Der DE-Wert der verflüssigten Lösung, die einen pH-Wert von 4,3 aufwies, betrug etwa 21. Nachdem die Temperatur des Reaktionsgemisches auf etwa 60 C abgesunken war, wurde ein von Aspergillus niger stammendes Glucamylaseenzym zugesetzt und die Lösung 48 Stunden bei 6O0C verzuckert und konvertiert. Der DE-Wert der verzuckerten und konvertierten Lösung betrug 97t5 und ihr Dextrosegehalt 96,0 $.In 70 ml of water, 30 g of potato starch were suspended, was added followed by 75 mg of calcium chloride dihydrate, and the pH was adjusted to k; 5. The refined, powdery enzyme obtained according to Example 2 was added to this suspension in an amount corresponding to 50 CPC units, whereupon the mixture was allowed to react at 85 ° C. for 30 minutes to liquefy the starch. The DE value of the liquefied solution, which had a pH of 4.3, was about 21. After the temperature of the reaction mixture had dropped to about 60 ° C., a glucamylase enzyme derived from Aspergillus niger was added and the solution was kept at 60 for 48 hours 0 C saccharified and converted. The DE value of the saccharified and converted solution was 97-5 and its dextrose content was $ 96.0.
Das vorstehende Beispiel 3 zeigt, daß die erfindungsgemäßen Of-Amylaseenzyme Stärke hydrolysieren und verflüssigen. Sie können dazu verwendet werden, lösliche Stärke, Amylose, Amylopectin, Glycogen usw. zu konvertieren, um die Viskosität dieser Substrate abrupt zu verringern. Wenn man die Enzyme der Erfindung bei pH 4,5 und 6O0C mit löslicher Stärke reagieren läßt, so verschwindet die Stärke-Jodid-Reaktion bei einem Hydrolyse— grad (DE) von etwa 15, wonach die Hydrolyse jedoch bis zu einem höchsten Hydrolysegrad bzw. DE-Wert von 32 bis 36 weitergeht... Die in dem hydrolysierten Produkt enthaltenen Zucker wurden analytisch als Maltose, Maltotriose, Maltotetraose und andere Maltooligosaocharide im Gemisch mit einer kleinen Menge Glucose identifiziert. Die Mutarotation des reduzierenden Zuckerprodukts ist, wie festgestellt wurde, negativ. Demzufolge sind die Enzyme der Erfindung äf-Amylaseenzyme des verflüssigenden Typs, die die öt-1,4-Bindungen in Stärke glatt hydrolysieren.Example 3 above shows that the Of-amylase enzymes according to the invention hydrolyze and liquefy starch. They can be used to convert soluble starch, amylose, amylopectin, glycogen, etc. to abruptly reduce the viscosity of these substrates. When allowed to react, the enzymes of the invention at pH 4.5 and 6O 0 C and the soluble starch, the starch-iodine reaction disappears at a degree of hydrolysis (DE) of about 15, after which the hydrolysis, however, to a highest degree of hydrolysis or DE value continues from 32 to 36 ... The sugars contained in the hydrolyzed product were analytically identified as maltose, maltotriose, maltotetraose and other maltooligosaocharides mixed with a small amount of glucose. The mutarotation of the reducing sugar product has been found to be negative. Accordingly, the enzymes of the invention are α-amylase enzymes of the liquefying type which smoothly hydrolyze the α-1,4 bonds in starch.
Die Beziehung zwischen der Verflüssigung und der Verwendung eines erfindungsgemäßen Enzyms (relativer Wert) und dem Arbeits-pH-Wert ist in Figur 9 graphisch dargestellt, wobei zum Vergleich die mit den bekannten, von Bacillus stearothermophilus stammenden Ä-Amylaseenzymen erzielten Ergebnisse wiedergegeben sind. Wie aus Figur 9 ersichtlich ist, liegt der opti-The relationship between the liquefaction and the use of an enzyme according to the invention (relative value) and the working pH is shown graphically in FIG. 9, the results obtained with the known λ-amylase enzymes derived from Bacillus stearothermophilus being shown for comparison. As can be seen from Figure 9, the optimal
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male pH-Wert für die Enzyme der Erfindung in einem Bereich von 4,2 bis 5,2. Die bevorzugten erfindungsgemäßen Enzyme verlieren ihre Aktivität selbst dann nicht, wenn man sie bei Raumtemperatur Zh Stunden bei pH-Werten im Bereich von 3 bis stehen läßt.Male pH for the enzymes of the invention in a range of 4.2 to 5.2. The preferred enzymes according to the invention do not lose their activity even if they are left to stand at room temperature for Zh hours at pH values in the range from 3 to.
Die Beziehung zwischen der Verflüssigung durch die erfindungsgemäßen Enzyme (relativer Wert) und der Arbeitstemperatur ist in Figur 10 graphisch dargestellt, wobei zum Vergleich die entsprechende Kurve für die von Ogasawara und Mitarb, beschriebene iC-Amylase aus Bacillus stearothermophilus wiedergegeben ist· Wie aus Figur 10 zu ersehen ist, beträgt die bevorzugte Arbeitstemperatur für die erfindungsgemäßen Enzyme etwa 800C.The relationship between the liquefaction by the enzymes according to the invention (relative value) and the working temperature is shown graphically in FIG. 10, the corresponding curve for the iC-amylase from Bacillus stearothermophilus described by Ogasawara and Mitarb being shown for comparison.As from FIG. 10 can be seen, the preferred working temperature for the enzymes according to the invention is about 80 ° C.
Aus dem vorstehenden ist zu ersehen, daß die erfindungsgemäßen Oi-Amylaseenzyme zur Verflüssigung und Konversion von Stärke in der Stärkeverzuckerungsindustrie, beim Entschlichtungsverfahren in der Textilindustrie und als Zusätze in Wasohmittelgemischen, bzw. auf den üblichen Anwendungsgebieten bakterieller OC-Amylaseenzyme eingesetzt werden können.From the above it can be seen that the invention Oi-amylase enzymes for liquefying and converting starch in the starch saccharification industry, in the desizing process in the textile industry and as additives in detergent mixtures, or in the usual areas of application bacterial OC amylase enzymes can be used.
Die erfindungsgemäßen ö(-Amyl as e enzyme eignen sich besonders zur Verflüssigung und Konversion von Stärke bei der Herstellung von Mal todextrinen, insbesondere mit nachfolgender Erzeugung von Dextrose unter Verwendung von Glucamylase, da die Isomerisierung der Endgruppen des Moleküls vermieden werden kann, weil/das Enzym effizient in einem sauren pH-Bereich, d.h. bei einem pH von 4,5 his 5|0, einsetzen läßt, wodurch die Dextroseausbeute erhöht wird. Die Verwendung dieser neuen Enzyme verringert außerdem die Ionenaustauscherbelastung beim Raffinat ions verfahren, weil vor der Verzuckerung und Konversion mit Glucamylase keine Einstellung des pH-Wert erforderlich ist.The ö (-amyl as e enzymes according to the invention are particularly suitable for the liquefaction and conversion of starch in the production of mal todextrins, in particular with the subsequent production of dextrose using glucamylase, since the isomerization of the end groups of the molecule can be avoided because / that enzyme efficiently in an acidic pH range, ie at a pH of 4.5 his 5 | 0 can, use, thereby increasing Dextroseausbeute the use of these new enzymes also reduces the Ionenaustauscherbelastung the raffinate ions moved because before the saccharification and. Conversion with glucamylase does not require any pH adjustment.
Eine bevorzugte Einsatzmöglichkeit für die erfindungsgenäßen oC-Amylaseenzyme ist deren Verwendung bei Verfahren zum Kon— A preferred application for the inventive oC-amylase enzymes is their use in processes for con—
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- ι* -Vi- ι * -Vi
vertieren von Stärke, bei denen die restliche, nicht-konver— tierte Stärke in körniger Form erhalten bleibt. Derartige Verfahren sind in den US-Patentschriften 3 922 196, 3 922 197, 3 922 198, 3 922 199.3 922 200 und 3 922 201 beschrieben und beansprucht, auf die hier ergänzend Bezug genommen wird.Bei diesen Verfahren zum Konvertieren von Stärke, bei denen die nicht umgewandelte Stärke in körniger Form zurückbleibt, wird die Solubilisierung des Stärkematerials zumindest in der Anfangsphase bei verhältnismäßig niederen Temperaturen, d.h. unter der Temperatur, bei der die Stärke zu verkleistern beginnt, bis hinauf zu der tatsächlichen Anfangsgelatinisierungstemperatur der Stärke, durchgeführt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verfahren wird gleichzeitig mit der ck-Amylase in der anfänglichen Solubilisierungsstuf e Glucamylaseenzym verwendet. Die erfindungsgemäßen Enzyme eignen sich besonders für dieses Verfahren, da ihr optimaler pH—Bereich mit Glucamylase verträglich ist.verting of strength, in which the remaining, non-converting tated starch is retained in granular form. Such methods are described in U.S. Patents 3,922,196, 3,922,197, 3 922 198, 3 922 199, 3 922 200 and 3 922 201 and which is additionally referred to here. In these methods for converting starch, in which the If unconverted starch remains in granular form, the solubilization of the starch material is at least in the The initial phase is carried out at relatively low temperatures, i.e. below the temperature at which the starch begins to gelatinize up to the actual initial gelatinization temperature of the starch. According to a preferred Embodiment of this method is carried out simultaneously with the ck amylase used in the initial stage of solubilization glucamylase enzyme. The enzymes according to the invention are particularly suitable for this process because of their optimal pH range is compatible with glucamylase.
Eine ajidere bevorzugte Einsatzmöglichkeit für die erfindungs— gemäßen 0^-Amylaseenzyme ist deren Verwendung bei Verfahren der aus den US-Patentschriften 3 853 706 und 3 8^9 192* bekannten Art, auf die hiermit ergänzend Bezug genommen wird.A preferred ajidere possible use for the invention of invention 0 ^ amylase enzymes is the use thereof, which is incorporated in addition reference is made in the method of the U.S. Patents 3,853,706 and 3 8 9 19 ^ 2 * known type.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung lassen sich die erfindungsgemäßen tf-Amylaseenzyme bei einem Verfahren der aus der US-PS 3 912 590 bekannten Art verwenden, auf die hier ebenfalls ergänzend Bezug genommen wird. Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen <X—Amylaseenzyme nach diesem bekannten Verfahren wird eine Aufschlämmung von Stärke, z,B. Maisstärke, die mindestens 25 Gew.-# Stärkematerial enthält, mit dem Ct-Amyläseenzym bei einer Temperatur von etwa 100 bis 115 und vorzugsweise etwa 105 bis 110 C etwa 1 bis 60 und vorzugsweise 5 bis 10 Minuten lang behandelt, um die Stärke zu verflüssigen, worauf die Temperatur auf 80 bis 100 und vorzugsweise 90 bis 100°C herabgesetzt wird, wenn die Viskosität der verdünnten Lösung bei 95°C gemessen weniger als 300 beträgt. Der besondere Vorteil, den man dadurch erreicht, daßAccording to a further preferred embodiment of the invention the tf-amylase enzymes according to the invention can be with a Use methods of the type known from US Pat. No. 3,912,590, to which reference is also made here as a supplement. In the Use of the <X -amylase enzymes according to the invention after this known method is a slurry of starch, e.g. Corn starch containing at least 25 wt .- # starch material with the Ct amylase enzyme at a temperature of about 100 to 115 and preferably about 105 to 110 C for about 1 to 60 and preferably 5 to 10 minutes in order to increase the strength liquefy, whereupon the temperature is reduced to 80 to 100 and preferably 90 to 100 ° C when the viscosity of the diluted solution measured at 95 ° C less than 300 amounts to. The special advantage that one achieves in that
jre Vorteil, denjre advantage den
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man bei einem Verfahren, bei dem nach dem vorstehend genannten Temperaturprofil gearbeitet wird, die erfindungsgemäßen ct-Amylaseenzyme verwendet, ist darin zu sehen, daß ein niedrigerer pH-Wert angewandt werden kann, so daß bei einem nachfolgenden Verzuckerungsverfahren mit Glucamylase keine oder allenfalls eine geringe Nachstellung des pH-Werts erforderlich ist.in a process in which the temperature profile mentioned above is used, the process according to the invention ct-amylase enzymes used can be seen in that a lower pH can be used so that no or in a subsequent saccharification process with glucamylase at most a slight adjustment of the pH value is necessary.
Ganz besonders vorteilhaft und daher bevorzugt ist die Verwendung der erfindungsgemäßen PC-Amylaseenzyme bei einem Verfahren zum Konvertieren von Stärke, bei dem eine Stärkeauf— schlämmung der Einwirkung des Enzyms bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 3,5 bis 6,5 und vorzugsweise etwa h bis 5» einer Temperatur im Bereich von etwa 50 bis 100 und vorzugsweise etwa 60 bis 95 C ausgesetzt wird, um die Stärke zu verflüssigen. Im Falle der vorstehend beschriebenen Verfahren zur Hydrolyse körniger Stärke wird die Temperatur in dem Bereich zwischen der normalen Gelatinisierungsbeginntemperatur bis zur tatsächlichen Gelatinisierungstemperatur der Stärke, also etwa 60 C bei Maisstärke, liegen. Im Falle des Verfahrens zur direkten Verflüssigung wird die das Enzym enthaltende Stärkeaufschlämmung, z.B. mittels eines Düsenerhitzers, vorzugsweise auf eine Temperatur im Bereich von etwa 85 bis 95 und insbesondere etwa 90 bis 92 C erhitzt, um die Stärke zu verflüssigen. Nach der anfänglichen Solubilisierung, wie bei der Hydrolyse körniger Stärke, oder Verflüssigung wird die Aufschlämmung vorzugsweise einer "Hitzeschockbehandlung" bei einer Temperatur über 100 und vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von etwa 110 bis 150 C unterworfen, um sämtliche noch gegebenenfalls vorhandenen Stärkekörner zu verflüssigen. Darauf wird die verflüssigte Stärkeaufschlämmung abgekühlt und vorzugsweise mit weiterer rf-Amylase allein oder in Kombination mit anderen Enzymen, wie Glucamylase, ß-Amylase, Pullulanase, Glucoseisomerase, nacheinander oder in Kombination behandelt. Wenn Of-Amyläse allein verwendet wird, wird die Temperatur in der zweiten Enzymbehandlungsstufe vorzugsweiseVery particularly advantageous and therefore preferred to use the inventive PC-amylase enzymes in a process for converting starch in which a Stärkeauf- slurry to the action of the enzyme at a pH in the range of about 3.5 to 6.5 and preferably about h to 5 »is exposed to a temperature in the range of about 50 to 100 and preferably about 60 to 95 C in order to liquefy the starch. In the case of the above-described processes for the hydrolysis of granular starch, the temperature will be in the range between the normal gelatinization start temperature and the actual gelatinization temperature of the starch, that is to say about 60 ° C. in the case of corn starch. In the case of the method for direct liquefaction, the starch slurry containing the enzyme is preferably heated to a temperature in the range from about 85 to 95 and in particular about 90 to 92 ° C., for example by means of a nozzle heater, in order to liquefy the starch. After the initial solubilization, as in the hydrolysis of granular starch, or liquefaction, the slurry is preferably subjected to a "heat shock treatment" at a temperature above 100 and preferably at a temperature in the range of about 110 to 150 C to liquefy any starch granules that may still be present . The liquefied starch slurry is then cooled and preferably treated with further rf-amylase alone or in combination with other enzymes, such as glucamylase, β-amylase, pullulanase, glucose isomerase, one after the other or in combination. When Of-Amylase is used alone, the temperature in the second enzyme treatment step becomes preferred
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in einem Bereich von etwa 80 bis 90 und insbesondere bei etwa 85 C, der optimalen Temperatur für die erfindungsgemäOen Enzyme, gehalten. Wenn noch andere Enzyme, wie Glucamylase und/oder Glucoseisomerase anwesend sind, wird die Temperatur etwas niedriger liegen, d.h. bei etwa 55 bis 75 und insbesondere etwa 60 C.in a range from about 80 to 90 and especially at about 85 C, the optimal temperature for the invention Enzymes, kept. If there are other enzymes, like glucamylase and / or glucose isomerase are present, the temperature will be somewhat lower, i.e. about 55 to 75 and especially about 60 C.
Die erfindungsgemäßen Oi-Amylaseenzyme lassen sich von den aus Tieren, Pflanzen, Hefen, Fungi imperfecti und Schimmelpilzen (molds) gewonnenen -~X-Amylasen nach dem Stand der Technik insofern klar unterscheiden, als diese bekannten Enzyme eine so geringe Hitzebeständigkeit aufweisen, daß sie ihre Aktivität bei einer 5-minütigen Behandlung bei 70 C und pH 6 vollständig verlieren. Vergleicht man die Hitzebeständigkeit der erfL ndungsgemäßen ot-Amylasen, die in Figur 12 dargestellt ist (die Arbeitsbedingungen bei den Versuchen, deren Ergebnisse in Figur 12 wiedergegeben sind, stimmen im wesentlichen mit den Durchführungsbedingungen der Versuche überein, deren Ergebnisse in Figur 6 graphisch dargestellt sind), so ist klar zu erkennen, daß die erfindungsgemäßen Ot-Amylaseen«yme bezüglich der Säure- und Hitzebeständigkeit den damit verglichenen <X-Amylaseenzymen nach dem Stand der Technik eindeutig überlegen sind. Aus Figur 12 ist außerdem klar ersichtlich, daß die erfindungs gemäßen <X-Amyl as e enzyme sich dadurch auszeichnen, daß sie in der Lage sind, mindestens etwa 70 und vorzugsweise mindestens etwa 90 $ ihrer Anfangs— aktivität beizubehalten, wenn sie in Abwesenheit zugesetzter Calciumionen 10 Minuten lang bei 90 C und einem pH-Wert von 6,0 gehalten werden, sowie mindestens etwa 50 $> ihrer anfänglichen Λ—Amyläseaktivität zubehalten, wenn man sie 60 Minuten bei 90°C und einem pH von 6,0 hält. Wie aus Figur 11 zu ersehen ist, zeichnen sich die erfindungsgemäßen <*-Amylaseenzyme weiterhin dadurch aus, daß sie befähigt sind, mindestens etwa 50 io ihrer anfänglichen Ot-Amylaseaktivität zu behalten, wenn man sie in Gegenwart von 5 mMol Calciumionen 10 Minuten bei einer Temperatur von 8O0C und einem pH von 4,55 hält.The Oi-amylase enzymes according to the invention can be clearly distinguished from the - ~ X-amylases obtained from animals, plants, yeasts, fungi imperfecti and molds according to the prior art in that these known enzymes have such a low heat resistance that they lose their activity completely after a 5-minute treatment at 70 C and pH 6. If one compares the heat resistance of the ot-amylases according to the invention, which is shown in FIG. 12 (the working conditions in the experiments, the results of which are shown in FIG ), it can be clearly seen that the ot-amylase enzymes according to the invention are clearly superior to the compared <X -amylase enzymes according to the prior art in terms of acid and heat resistance. It can also be clearly seen from FIG. 12 that the X-Amyl as enzymes according to the invention are distinguished by the fact that they are able to maintain at least about 70 and preferably at least about 90% of their initial activity when they are used in the absence of added calcium ions 10 minutes, kept at 90 C and a pH of 6.0, and at least about 50 $> zubehalten its initial Λ-Amyläseaktivität, when held for 60 minutes at 90 ° C and a pH of 6.0. As can be seen from FIG. 11, the <* - amylase enzymes according to the invention are further distinguished by the fact that they are able to retain at least about 50 io of their initial Ot-amylase activity when they are used in the presence of 5 mmol of calcium ions for 10 minutes Maintains temperature of 8O 0 C and a pH of 4.55.
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-H--H-
Tabelle IX gibt eine vergleichende Übersicht über die wesentlichen anwendungstechnischen Kenndaten der erfindungsgemäßen 4-Amylaseenzyme sowie der derzeit großtechnisch verwendeten a-Amylaseenzyme von Bacillus subtilis und Bacillus 1i c heni formi s einerseits sowie der in der Literatur beschriebenen, von Bacillus stearothermophilus stammenden iX-Amylaseenzyme andererseits wieder. Insbesondere werden in der Tabelle IX die genannten Enzyme bezüglich der für sie jeweils optimalen Arbeitsbedingungen hinsichtlich pH-Wert und Temperatur sowie hinsichtlich ihres jeweiligen Molekulargewichts verglichen. Die Figuren 11 und.12 zeigen eine vergleichende Gegenüberstellung der Eigenschaften dieser Enzyme bezüglich der Hitze- und Säurebeständigkeit in graphischer Darstellung.Table IX gives a comparative overview of the essential performance characteristics of the 4-amylase enzymes according to the invention and the α-amylase enzymes currently used on a large scale from Bacillus subtilis and Bacillus 1i c heni formis on the one hand and the iX-amylase enzymes described in the literature and derived from Bacillus stearothermophilus on the other again. In particular, the enzymes mentioned are compared in Table IX with regard to the optimum working conditions for them in terms of pH and temperature and with regard to their respective molecular weights. Figures 11 and 12 show a comparative comparison of the properties of these enzymes with regard to heat and acid resistance in graphical representation.
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Geprüfte EnzymeTested enzymes
Optimaler Arbeits-pHOptimal working pH
Geeignete Molekülar-Arbeitstemp. gewichtSuitable molecular working temp. weight
C\-Ainylaseenzyme der
ErfindungC ainylase enzymes der
invention
01—Amylaso von
B. subtilis1'01 — Amylaso from
B. subtilis 1 '
Ot-Amylase von
B.licheniforraisOt-amylase from
B.licheniforrais
2)2)
h% O - 5,2 h % O - 5.2
^,5 - 6,5 5,0 - 9,0^, 5 - 6.5 5.0 - 9.0
«X-Araylase von
B. stearothermophilus «X-Araylase from
B. stearothermophilus
a) Ogasawara und Mit. '5,0 - 6,0a) Ogasawara and Mit. '5.0 - 6.0
b) Campbell und Mit.b) Campbell and Mit.
3)3)
4,84.8
800C80 0 C
- 60°C- 60 ° C
76 - 78°C76-78 ° C
65 - 70°C
55 - 70°C65 - 70 ° C
55 - 70 ° C
96 000 hs ooo 96,000 hs ooo
22 50022 500
k8 000 15 600 k8 000 15 600
Ogasavara und Mit., J^ Biochem., 67> 65 (197O).Ogasavara and Mit., J ^ Biochem. , 67 > 65 (197O).
2'Shigemasa Saito, ABB, 155, 290 (i973). 2 'Shigemasa Saito, FIG. 155 , 290 (1973).
^'Campbell und Mit., J^ Biol. Chem. , 236, 2958 (1961). ^Campbell und Mit., J^ Biol·. Chem. t 236. 2958 (1961).^ 'Campbell and Mit., J ^ Biol. Chem. , 236 , 2958 (1961). ^ Campbell and Mit., J ^ Biol ·. Chem. T 236 . 2958 (1961).
'In der britischen Patentschrift wird das Molekulargewicht der <X-Amylase von B^ licheniformis mit 18 000 - 20 000 und das der CK. -Amylase von B^ subtilia mit 96 000 angegeben.In the British patent, the molecular weight of the X-amylase of B ^ licheniformis is 18,000-20,000 and that of the CK. Amylase from B ^ subtilia given as 96,000 .
Vergleicht man die erfindungsgemäßen OC-Amylaseenzyme mit den bekannten ct-Amylaseenzymen aus Bacillus subtilis. so fällt auf, daß diese sich, wie aus den Figuren 9 und 11 zu ersehen ist, bezüglich ihres optimalen Betriebs—pH—Werts, der geeigneten Betriebstemperatur, des Molekulargewichts und ihrer Hitze— und Säurebeständigkeit beträchtlich unterscheiden. Dies zeigt, daß die Enzyme der Erfindung von der bekannten C(-Amylase aus Bacillus subtilis grundlegend verschieden sind.If the OC-amylase enzymes according to the invention are compared with the known ct-amylase enzymes from Bacillus subtilis . it is noticeable that, as can be seen from FIGS. 9 and 11, these differ considerably with regard to their optimal operating pH, the suitable operating temperature, the molecular weight and their heat and acid resistance. This shows that the enzymes of the invention are fundamentally different from the known C (amylase from Bacillus subtilis.
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Vergleicht man die oC-Amylaseenzyme der Erfindung mit den o(-Ainyl as e enzymen aus Bacillus licheniformis, so ist auch hier festzustellen, daß sich die Enzyme hinsichtlich ihres optimalen Arbeits-pH-Werts, ihres Molekulargewichts und ihrer Hitze- und Säurebeständigkeit erheblich unterscheiden, wie aus Tabelle IX und den Figuren 11 und 12 zu ersehen ist.If one compares the oC-amylase enzymes of the invention with the o (-Ainyl as e enzymes from Bacillus licheniformis , it can also be found here that the enzymes differ considerably in terms of their optimal working pH value, their molecular weight and their heat and acid resistance as can be seen from Table IX and Figures 11 and 12.
Es versteht sich für den Fachmann von selbst, daß die zur Erzeugung der neuen (K-Arnylaseenzyme der Erfindung verwendeten Stämme nach bekannten Methoden der Einwirkung bekannter rautagener Mittel, wie UV-Licht, einer chemischen Behandlung und dergleichen, unterworfen werden können. Demgemäß umfaßt die Erfindung aus den Stämmen ATCC Nr. 31 195, 31 196, 31 197t 31 198 und 31 199t sowie deren Varianten und Mutanten und/oder aus Submutanten der genannten Varianten und Mutanten gewonnene bzw. von den fraglichen Mikroorganismen erzeugte '3-Amylaseenzyme.It will be understood by those skilled in the art that the strains used to generate the new (K-Arnyl aseenzyme of the invention can be subjected to the action of known antigenic agents, such as UV light, a chemical treatment and the like according to known methods the invention from the strains ATCC No. 31 195, 31 196, 31 197t, 31 19 8 and 31 199t as well as their variants and mutants and / or '3-amylase enzymes obtained from submutants of the said variants and mutants or produced by the microorganisms in question.
Wie auch einige der bekannten Ö(-Amylaseenzyme, werden die Enzyme der Erfindung durch Quecksilber und Äthylendiamintetra— essigsäure inhibiert, durch Calcium dagegen stabilisiert.Like some of the well-known Ö (amylase enzymes, the enzymes of the invention inhibited by mercury and ethylenediaminetetraacetic acid, but stabilized by calcium.
Es versteht sich für den Fachmann von selbst, daß die von den vorstehenden Beispielen erläuterte Erfindung im Rahmen des Erfindungsgedankens in verschiedener Weise abgewandelt werden kann. Zahlreiche Variationen und Modifikationen der Erfindung ergeben sich für den Fachmann ohne weiteres und können von ihm ausgeführt bzw. angewandt werden, ohne von dem vorstehend beschriebenen und offenbarten Erfindungsgedanken abzuweichen.It goes without saying for the person skilled in the art that the invention explained by the above examples can be modified in various ways within the scope of the inventive concept. Numerous variations and modifications of the invention are readily apparent to the person skilled in the art and can be carried out or used by him without departing from the inventive concept described and disclosed above.
Wie bereits erwähnt, lassen sich die neuen CC—Amyläseenzyme der Erfindung in vorteilhafter Weise bei der Hydrolysierung und/oder Verflüssigung von Stärke einsetzen und können aufgrund ihrer Stabilität bei niederen pH-Werten in Kombination mit anderen säurebeständigen Amylasen, wie Glucamylase, verwendet werden, und zwar sowohl in löslicher als auch in immobilisierter Form. 709845/0838 As already mentioned, can be the new CC Amyläse enzyme of the invention in an advantageous manner in the hydrolyzing and / or liquefaction of starch used and, because of their stability at low pH values in combination with other acid-resistant amylases such as are used glucoamylase, both in soluble and in immobilized form. 709845/0838
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Claims (1)
und/oder
mit einem Glucoseisoraeraseenzym behandelt wird.heated to over 100 ° C and then cooled and treated with additional ct-amylase
and or
is treated with a glucose isoraerase enzyme.
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