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n Arzneimittel mit immunoregulativer und antiphlogistischer
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Wirkung Die Erfindung betrifft den im Anspruch gekennzeichneten Gegenstand.
Bei den erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen handelt es sich um 7-Hydroxycholesterin
und 7-Ketocholesterin. Diese Verbindungen sind bekannt. Sie stellen Katabolismusprodukte
des Cholesterins in lebenden Organismen dar. Die Erfindung beruht auf dem Befund,
daB die Verbindungen der allgemeinen Formel I den immunoregulativen Faktor (IRA)
in humanem Serum darstellen.
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Der vorliegenden Erfindung gingen folgende Arbeiten voraus.
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In der JA-OS 33 421/76 ist ein Verfahren zur Herstellung eines peptidähnlichen
Präparats mit immunoregulativer M;tivität aus Serum und Placentarblut beschrieben.
Die Untersuchung dieser immunoregulativen Substanz konnte fortgesetzt werden, da
diese Substanz aus Cohn IV-1 Paste von humanem Serum isoliert
und
als eine peptidähnliche Substanz mit einem Molekulargewicht von etwa 5000 identifiziert
wurde; vgl. Occhino u. Mitarb., The Journal of Immunology, Bd. 110 (1973), S. 685.
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Diese peptidähnliche Substanz wird zur Zeit mit IRA (immunoregulatives
a-Globulin) bezeichnet.
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Die der vorliegenden Erfindung vorausgehenden Untersuchungen waren
vor allem darauf gerichtet, das aktive Zentrum dieser immunoregulativen Substanz,
die in lebenden Organismen vorliegt zu finden und eine chemische Synthese dieser
Substanz zu entwickeln, die im Vergleich zu den herkömmlichen Extrakten für die
verschiedensten Zwecke in der Medizin eingesetzt werden kann, beispielsweise zur
immunoregulativen Behandlung.
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Das aus der Cohn IV-1 Paste durch Extraktion mit einem organischen
Lösungsmittel erhaltene geringfügig wasserlösliche Material wurde der Säulenchromatographie
unterworfen, um die immunoregulative aktive Substanz abzutrennen. Es wurde festgestellt,
daß diese Substanz ein Cholesterinderivat ist.
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Auf diesem Befund beruht die Erfindung. Ferner wurde festgestellt,
daß diese Substanz antiphlogistische Wirkung besitzt.
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Zur Gewinnung von 7-Hydroxycholesterin bzw. 7-Ketocholesterin wird
die Cohn TV-1 Paste einer humanen Serfimfraktion mit einen Gemisch aus Chloroform
und Methanol extrahiert. Der erhaltene Extrakt wird an Aluminiumoxid und Kieselsäure
sowie an Cellulose der Chromatographie und schließlich der Flüssigkeitschromatographie
unterworfen. Hierbei werden die Ver-
bindungen der Formel I abgetrennt.
Die Verbindungen werden in kristalliner Form isoliert.
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Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können auch in an sich bekannter
Weise durch Oxidation von Cholesterin hergestellt werden.
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Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können als immunoregulative
Mittel, insbesondere als cytoplasmatische immunoregulative Mittel sowie als Antiphlogistika
eingesetzt werden.
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Die pharmakodynamischen Wirkungen der Verbindungen der allgemeinen
Formel I gehen aus folgenden Versuchen hervor.
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(1) Immunoregulative Wirkung in vitro Die PHA-Reaktion bei 50prozentiger
Hemmkonzentration der Verbindungen der allgemeinen Formel I wird nach der von S.R.
Cooperband u. Mitarb., The Journal of Immunology, Bd.1O9 (1972), S. 154,beschriebenen
Methode bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle I zusammengefaßt. Als
Vergleichsverbindung wird das nach Occhino u. Mitarb., The Journal of Immunology,
Bd. 110 (1973), S. 685, gewonnene IRA verwendet.
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Tabelle 1
| 7-Hydroxycholesterin 5 yg/ml |
| 7-Ketocholesterin 8 vml |
| IRA 20 pgsml |
(2) Immunoregulative Wirkung in vivo FUr die Versuche werden drei
Gruppen von jeweils 5 Mäusen verwendet. Eine Gruppe dient als Kontrollgruppe. Jeweils
5 Mäusen wird in einer Dosis von 8 mg/kg/Tag 7-Hydroxycholesterin bzw. 10 mgZkg/Tag
7-Ketocholesterin intravenös kontinuierlich während eines Zeitraumes von 20 Tagen
verabfolgt.
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Es wird die Wirkung bei der Hautübertragung untersucht.
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Zur Verabfolgung wird jede Verbindung mit einem Netzmittel emulgiert
und als physiologische isotone Lösung mit einer Endkonzentration von 3,0 Gewichtsprozent
hergestellt. Diese Lösung wird jeder Maus der beiden Testgruppen 24 Stunden vor
der HautUbertragung injiziert. Danach wird die Lösung einmal täglich während insgesamt
20 Tagen injiziert.
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Nach dem 20tägigen Versuch zeigte sich, daß bei beiden Tiergruppen
die Hauttibertragungsrate bei 80 bis 90 X liegt, während sie bei der Kontrollgruppe
bei 0 % liegt. Dies zeigt die signifikante pharmakodynamische Wirkung der erfindungsgemäß
verwendeten Verbindungen als Immunoregulativa.
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(3) Antiphlogistische Wirkung Für die Versuche werden vier Gruppen
von jeweils 5 Mäusen verwendet. Den Mäusen von zwei Versuchsgruppen wird intraabdominal
7-Hydroxycholes terin bzw. 7-Ketocholesterin in einer Dosis von 200 mg/kg in Form
einer physiologisch isotonischen 2, Ogewichtspro zenti gen wäßrigen Lösung gegeben.
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Bine Stunde später wird in die Hinterpfoten der Mäuse
0,05
ml einer Iprozentigen Carrageeninlösung subplantar injiziert.
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Das Pfotenvolumen wird volumetrisch vor und nach Ausbildung der entzündlichen
Schwellung gemessen. Einer Kontrollgruppe wurde isotone Kochsalzlösung appliziert.
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Innerhalb 4 Stunden nach der Injektion von Carrageenin beträgt die
Ödeinzunahme bei der Kontrollgruppe 82 s und bei einer mit Cholesterin als Vergleichssubstanz
behandelten Gruppe 70 %. Andererseits beträgt bei der mit 7-Hydroxycholesterin behandelten
Gruppe die Ödemzunahme nur etwa 40 ^> innerhalb 5 Stunden nach der Carragenininjektion.
Bei der mit 7-Ketocholesterin behandelten Gruppe beträgt die Ödemzunahme nur etwa
50 X. Dies zeigt, daß diese beiden Verbindungen eine signifikante antiphlogistische
Wirkung besitzen.
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Die Versuchsergebnisse sind in Fig. 1 graphisch wiedergegeben. Die
Kurven haben folgende Bedeutung: 1 - isotone Kochsalzlösung.
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2 8 Cholesterin 3 3 7-Ketocholesterin 4 3 7-Hydroxycholesterin.
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Das Arzneimittel der Erfindung wird vorzugsweise in Form eines Injektionspräparates
hergestellt. Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen können jedoch auch äußerlich
oder oral eingesetzt werden.
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Zur Herstellung von Injektionspräparaten werden übliche VerdUnnungsmittel
verwendet, Vorzugsweise werden die Verbindungen der allgemeinen Formel I in einer
physiologisch isotonen wäßrigen Lösung zusammen mit einem üblichen Emulgator emulgiert.
Der Emulgator kann in einer Menge von 2 bis 10 Gewichtsprozent verwendet werden.
Ferner können wäßrige Lösungen einen üblichen Stabilisator für Steroide enthalten,
beispielsweise Albumin. Der Stabilisator kann in einer Menge von 0,1 bis 5 Gewichtsprozent
verwendet werden.
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Arzneimittel zur oralen Verabfolgung können zu üblichen Do-¢erungsformen
konfektioniert werden, beispielsweise zu Tabletten oder als Sirup. Ferner können
die Verbindungen der Fllgemeinen Formel I in Form von Salben oder Cremes zur äußerlich
lokalen Behandlung eingesetzt werden.
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Die Verbindungen der allgemeinen Formel I sind praktisch ungiftig,
dies haben Versuche zur Bestimmung der akuten Toxiziteilt an Ratten ergeben.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung der erfindungsgemäß
verwendeten Verbindungen.
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Beispiel 1 25 g Cholesterin werden in 1 Liter heißem Äthanol gelöst.
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Sodann wird die Lösung anteilsweise in eine etwa 700C warme Lösung
von 5 g Natriumstearat in 5 Liter destilliertem Wasser gegossen, deren pH-Wert auf
8,5 + 0,1 eingestellt worden ist.
Auf das Reaktionsgefäß wird ein
Rückflußkühler aufgesetzt, und die Lösung wird auf 85 + 10C erhitzt. Sodann wird
in die Lösung 5 bis 7 Stunden Luft eingeblasen. Nach beendeter Umsetzung wird das
Reaktionsgemisch mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 4 bis 6 eingestellt. Hierauf
wird das Reaktionsgemisch mit Chloroform mehrmals extrahiert. Die Chloroformextrakte
werden vereinigt und unter vermindertem Druck bei etwa 450C eingedampft. Der Rückstand
wird in einer geringen Menge Chloroform gelöst und auf eine mit Chloroform äquilibrierte
Kieselgelsäule aufgesetzt. Die Kieselgelsäule wird mit Chloroform eluiert. Zunächst
wird nicht umgesetztes Cholesterin abgetrennt. Sodann folgt 7-Ketocholesterin, das
im W-Licht erkannt wird. Nach weiterem Eluieren mit einem 5 s Methanol enthaltenden
Chloroformgemisch wird auch 7-Hydroxycholesterin eluiert.
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Die 7-Ketocholesterin und 7-Hydroxycholesterin enthaltenden Eluate
werden eingedampft und nochmals auf eine mit Benzol äquilibrierte Kieselgelsäule
aufgesetzt und auf die vorstehend beschriebene Weise chromatographiert.
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Die Schmelzpunkte des erhaltenen 7-Ketocholesterins und 7-Hydroxycholesterinq
stimmen mit den Literaturwerten überein; vgl. The Journal of Biological Chemistry,
Bd. 141 (1941), S. 597.
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Beiripiel 2 1 kg Paste der bei der Alkoholfraktionierung nach Cohn
erhaltenen IV-1 Fraktion wird in 4 Liter eines 1 : 1-Gemisches von Chloroform und
Methanol suspendiert und extrahiert.
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Der erhaltene Extrakt wird auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule aufgesetzt
und mit Chloroform, das eine geringe Menge Methanol enthält, eluiert. Das Eluat
wird eingedampft und an Cellulose chromatographiert. Zwei Fraktionen mit Hemmwirkung
werden mittels Dunnschichtchromatographie und mit einem 1 : 1 Gemisch von n-Hexan
und Äthylacetat voneinander getrennt. Die Verbindungen werden in kristalliner Form
erhalten. Bei den Verbindungen handelt es sich um 7-Ketocholesterin und 7-Hydroxycholesterin.
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Beispiel 3 Herstellung eines Inj ektionspräpara ts 300 g steriles
7-Hydroxycholesterin werden in 9 Liter dest41-liertem Wasser zusammen mit 300 g
eines Polyoxyäthylen-Polyoxypropylen-Copolymers mit einem Durchs chni ttsmol ekulargewicht
von 8350 versetzt und emulgiert. Sodann wird das Gefisch durch Zusatz von 1 Liter
Milchsäure enthaltender Ringerlösung isotonisch und physiologisch eingestellt. Es
wird eine wäßrige Lösung mit einer Endkonzentration von 3,0 Gewichtsprozent/Voluien
erhalten. Die Lösung wird in Ampullen abgefüllt, die jeweils 100 mg 7-Hydroxycholesterin
enthalten.
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Beispiel 4 Herstellung von Tabletten Zur Herstellung von Tabletten
werden 300 g 7-Hydroxycholesterin, 50 g Calciumphosphat, 600 g Stärke und 150 g
flüssige Gelatine unter Zusatz von Wasser verknetet. Das Gemisch wird granuliert
und unter vermindertem Druck getrocknet. Es wird ein Granulat mit einer Korngröße
von etwa 5 mm erhalten.
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Das Granulat wird in einer Tablettiermaschine zu Tabletten von Jeweils
500 mg verpreßt.
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Beispiel 5 Herstellung eines Injektionspräparats 10 g eines Gemisches
von 7-Ketocholesterin und 7-Hydroxycholesterin sowie 10 g eines Phospholipids werden
in 100 ml Wasser suspendiert. Die Suspension wird mit Ultraschall behandelt und
in Ampullen abgefüllt.
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Beispiel 6 Herstellung eines Injektionspräparats 100 g Sojabohnenöl
werden mit 10 g Phospholipid sowie 4 g 7-Hydroxycholesterin und 400 ml Wasser versetzt.
Das Gemisch wird durch Ultraschallbehandlung homogenisiert und steril in Ampullen
abgefüllt.