DE2658977A1

DE2658977A1 - METHOD FOR MANUFACTURING MOCIMYCIN

Info

Publication number: DE2658977A1
Application number: DE19762658977
Authority: DE
Inventors: Hendrik Jongsma; Hermanus Jacobus Kooreman; Jan Lambert Van Os; Cornelis Vos
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: Gist Brocades NV
Priority date: 1975-05-16
Filing date: 1976-05-14
Publication date: 1977-05-05
Also published as: SE8005599L; IT1070097B; IE43106B1; FI54308B; NL162136C; DK215176A; FR2310760B1; NL7605093A; AU1393076A; CH630411A5; CA1070630A; SE435512B; FR2310760A1; SE7605536L; NZ180860A; DE2658977B2; JPS5522479B2; DE2658977C3; FI761380A; NL162136B

Description

DIPL-CHEM. DR. VOLKER VOSSIUSDIPL-CHEM. DR. VOLKER VOSSIUS

PATENTANWALTPATENT ADVOCATE

MOiJCHSN 86, P.O. ECX 86 07 67 SIEBERTSTRASSE 4 PHONE: (O 89] 47 40 ψ CABLE ADDRESS: B TELEX 5-29453 VOPAT DMOiJCHSN 86, PO ECX 86 07 67 SIEBERTSTRASSE 4 PHONE: (O 89] 47 40 ψ CABLE ADDRESS: B TELEX 5-29453 VOPAT D

u.Z.:. L 689 Div. I Case: DUI-2042u.z .:. L 689 Div. I Case: DUI-2042

Ausscheidung aus P'26 21 615.9-44Elimination from P'26 21 615.9-44

GIST - BROCADES N.V. Delft, NiederlandeGIST - BROCADES N.V. Delft, the Netherlands

Als Anmeldetag gilt der 14.Mai 1976The filing date is May 14, 1976

" Verfahren zur Herstellung von Mocimycin ""Process for the production of mocimycin"

Priorität: 16. Mai 1975, Großbritannien, ITr. 20926/1975 22. Juli 1975,Großbritannien, Hr. 30646/1975Priority: May 16, 1975, UK, ITr. 20926/1975 July 22, 1975, Great Britain, Mr. 30646/1975

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.The invention relates to the subject matter characterized in the claims.

Das verfahrensgemäß eingesetzte Dihydromocimycin hat die Formel The dihydromocimycin used according to the process has the formula

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Dihydromocimycin kann durch Züchten von Mikroorganismen des Stammes Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69) oder nach üblichen Methoden daraus erhaltenen, das Antibiotikum bildenden Mutanten oder Varianten in einem wäßrigen, verwertbare Kohlenstoff- und Stichstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium, Filtrieren der Kulturbrühe, Ansäuern des FiI-trats auf einen pH-Wert von 5 bis 6, Extraktion des angesäuerten Filtrats mit Methylisobutylketon, Behandeln des Extraktes mit einer Base, Abtrennen des ausgefällten Mocimycins und Aufarbeiten der Lösung auf Dihydromocimycin hergestellt v/erden.Dihydromocimycin can be produced by growing the microorganisms of the Strain Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69) or according to customary Methods obtained therefrom, the antibiotic-forming mutants or variants in an aqueous, usable carbon and nutrient medium containing nitrogen sources and inorganic salts, filtering the culture broth, acidifying the filtrate to a pH of 5 to 6, extraction of the acidified Filtrate with methyl isobutyl ketone, treating the extract with a base, separating the precipitated mocimycin and working up the solution prepared on dihydromocimycin.

Mocimycin ist bekannt. Es wird nach dem in der DT-OS 21 kO 673 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der gleichen Mikroorganismen hergestellt. Die Struktur von Mocimycin wurde von Vos und Verwiel, Tetrahedron Letters, Bd. 52 (1973), S. 5173 bis 5176, angegeben.Mocimycin is known. It is produced according to the process described in DT-OS 21 kO 673 using the same microorganisms. The structure of mocimycin was given by Vos and Verwiel, Tetrahedron Letters, 52: 5173-5176 (1973).

Zur Trennung von Dihydromocimycin von Mocimycin benützt man die Löslichkeitsunterschiede dieser Verbindungen in alkalischem Medium. Beim Einleiten von gasförmigem Ammoniak in eine Lösung, die durch Extraktion einer auf einen pH-Wert von 5 bis 6 angesäuerten Kulturflüssigkeit mit Methylisobutylketon erhalten worden ist, fällt zunächst das Mocimycin praktisch vollständig aus. Das Dihydromocimycin bleibt dabei praktisch vollständig in Lösung. Nach dem Abtrennen, beispielsweise durch Abfiltrieren, des Mocimycinniederschlags aus der Lösung wird weiter Ammoniak eingeleitet, bis das Dihydromocimycin praktisch vollständig ausgefällt ist. Das Dihydromocimycin kann anschlie-To separate dihydromocimycin from mocimycin one uses the Differences in solubility of these compounds in an alkaline medium. When introducing gaseous ammonia into a Solution obtained by extracting a culture liquid acidified to pH 5 to 6 with methyl isobutyl ketone has been, the mocimycin initially precipitates practically completely. The dihydromocimycin remains practically complete in solution. After separating off, for example by filtering off, the mocimycin precipitate from the solution further ammonia is introduced until the dihydromocimycin is practically completely precipitated. The dihydromocimycin can then

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ßend ebenfalls abgetrennt werden, beispielsweise durch Filtrieren. Ammoniak wird dabei beispielsweise etwa 1 bis ^ Minuten mit einer Geschwindigkeit von 150 Liter pro Liter Lösung pro Stunde (d, h. etwa 2,5 bis etwa 10 Liter gasförmiges Ammoniak pro Liter Lösung) bei einer Temperatur von etwa -12 bis etwa +15⁰C, vorzugsweise -5 bis +8⁰C, eingeleitet. Durch weiteres Einleiten von gasförmigem Ammoniak nimmt die Wasserstoffionenkonzentration so weit ab, daß Dihydromocimycin unlöslich wird. Beispielsweise leitet man unter den vorgenannten Bedingungen 10 bis 15 Minuten lang ein (entsprechend etwa 25 bis etwa kO Liter gasförmiges Ammoniak). Neben Ammoniak können allgemein alle alkalisch reagierenden Verbindungen zur Abtrennung von Mocimycin und Dihydromocimycin verwendet werden» Als Beispiele seien Natriummethylat und Triäthylamin genannt.ßend are also separated, for example by filtration. Ammonia is used for about 1 to 4 minutes at a rate of 150 liters per liter of solution per hour (i.e. about 2.5 to about 10 liters of gaseous ammonia per liter of solution) at a temperature of about -12 to about +15 ⁰ C, preferably -5 to +8 ⁰ C, initiated. Further introduction of gaseous ammonia decreases the hydrogen ion concentration to such an extent that dihydromocimycin becomes insoluble. For example, under the aforementioned conditions, a period of 10 to 15 minutes is passed (corresponding to about 25 to about kO liters of gaseous ammonia). In addition to ammonia, all alkaline compounds can generally be used to separate mocimycin and dihydromocimycin. Examples are sodium methylate and triethylamine.

Das auf diese Weise abgetrennte Dihydromocimycin kann von Verunreinigungen an Mocimycin weiter gereinigt werden, indem man den Niederschlag in einer stark verdünnten ammoniakalischen Lösung von pH-Wert 9 löst und diese Lösung mit einem Lösungsmittel, wie Chloroform oder Methylenchlorid, extrahiert. In derartigen Lösungsmitteln ist Mocimycin nur wenig löslich. Gießt man den dabei erhaltenen Extrakt in ein im Überschuß vorhandenes inpolares Lösungsmittel, wie Petroläther, Cyclohexan oder Pentan, so bildet sich ein Dihydromocimycinniederschlag, der weniger als 5 % Mocimycin enthält.The dihydromocimycin separated in this way can be further purified from impurities of mocimycin by dissolving the precipitate in a very dilute ammoniacal solution of pH 9 and extracting this solution with a solvent such as chloroform or methylene chloride. Mocimycin is only sparingly soluble in such solvents. If the extract obtained in this way is poured into an inpolar solvent, such as petroleum ether, cyclohexane or pentane, which is present in excess, a dihydromocimycin precipitate is formed which contains less than 5% mocimycin.

Hochgereinigtes Dihydromocimycin erhält man durch Chromatographie an dreidimensional vernetztem Dextran, wobei man sich derHighly purified dihydromocimycin is obtained by chromatography of three-dimensionally cross-linked dextran, which is called the

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Adsorptionsunterschiede von Mocimycin und Dihydromocimycin bedient. Dabei wird das Dextran in lOOprozentigem Methanol suspendiert und vorsichtig in die Säule geschüttet. Nach Verdrängung des Methanols durch Chloroform wird der Dihydromocimycinniederschlag auf die Säule aufgebracht. Als Elutionsmittel wird Chloroform verwendet. Dabei erhält man zunächst Dihydromocimycin und anschließend Mocimycin. Beide Verbindungen können im Eluat nachgewiesen werden, da sie im UV-Bereich bei 350 nm absorbieren. Die reinen Verbindungen können aus der Chloroformlösung durch Fällung mit einemunpolaren Lösungsmittel, wie Cyclohexan oder Pentan, gewonnen werden.Adsorption differences between mocimycin and dihydromocimycin served. The dextran is suspended in 100 percent methanol and carefully poured into the column. After repression of methanol by chloroform, the dihydromocimycin precipitate is applied to the column. Used as an eluent Used chloroform. This initially gives dihydromocimycin and then mocimycin. Both compounds can be detected in the eluate because they absorb in the UV range at 350 nm. The pure compounds can be extracted from the chloroform solution by precipitation with a non-polar solvent such as cyclohexane or pentane.

Die Identität der Verbindungen läßt sich dünnschichtehromatographisch bestätigen. Dazu werden Kieselgel P 254-Platten der Abmessungen 20 χ 5 cm verwendet . Als lauf mittel dient ein 60:42:10-Gemisch aus Chloroform, Äthanol und 25prozentigem Ammoniak. Die Laufzeit beträgt 2 Stunden. Mocimycin zeigt einen R_f-Wert von. 0,3 (H.aupttautomeres) und Dihydromocimycin von 0,4 (Haupttautomeres).The identity of the compounds can be confirmed by thin-layer chromatography. For this purpose, silica gel P 254 plates measuring 20 × 5 cm are used. A 60:42:10 mixture of chloroform, ethanol and 25 percent ammonia is used as the running agent. The running time is 2 hours. Mocimycin shows an R _f of. 0.3 (H. major tautomeres) and dihydromocimycin of 0.4 (major tautomeres).

Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß sich Dihydromocimycin mit Selendioxid zu Mocimycin dehydrieren läßt» Chinone, wie 2,3-Dicyano-5j6-dichlor-l,4-chinon, p-Chloranil und o-Chloranil eignen sich nicht zur Dehydrierung von Dihydromocimycin, da bei deren Verwendung andere Produkte gebildet werden. Auch Halogenierung mit Kupfer(II)-bromid, Brom, Jod oder H~Bromsuccinimid unter anschließender Dehydrohalogenierung führte nicht zu dem gewünschten Ergebnis, und zwar auch nicht in Gegen-It was found according to the invention that dihydromocimycin Can be dehydrated with selenium dioxide to mocimycin quinones, such as 2,3-dicyano-5j6-dichloro-1,4-quinone, p-chloranil and o-chloranil are not suitable for dehydrating dihydromocimycin, as other products are formed when they are used. Even Halogenation with copper (II) bromide, bromine, iodine or H ~ bromosuccinimide with subsequent dehydrohalogenation did not lead to the desired result, not even in contradiction

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wart von Katalysatoren, wie Benzoylperoxid oder Or,<X-Azobisisobutyronitril. Zur katalytisehen Dehydrierung von Dihydromocimycin sind zu hohe Temperaturen notwendig, so daß die Gefahr einer Zersetzung von Dihydromocimycin besteht.waiting for catalysts such as benzoyl peroxide or Or, <X-azobisisobutyronitrile. For the catalytic dehydrogenation of dihydromocimycin, excessively high temperatures are necessary, so that there is a risk there is decomposition of dihydromocimycin.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auch auf Gemische von Dihydromocimycin und Mocimycin anwenden, die beispielsweise bei der Aufarbeitung von Mocimycin.aus Kulturflüssigkeiten erhalten werden« Dies ist vorteilhaft, da die Gewinnung beider Verbindungen aus Kulturflüssigkeiten wesentlich einfacher ist, als die Trennung des Dihydromocimycins von Mocimycin·The inventive method can also be applied to mixtures of Use dihydromocimycin and mocimycin, which are obtained from culture fluids, for example, in the processing of mocimycin become «This is advantageous because the extraction of both compounds from culture fluids is much easier than the Separation of dihydromocimycin from mocimycin

Die Dehydrierung von Dihydromocimycin mit Selendioxid kann bei normaler Umgebungstemperatur durchgeführt werden. Vorzugsweise wird die Reaktion jedoch bei erhöhten Temperaturen, beispielsweise etwa 65 bis etwa 110 C und vorzugsweise bei 80 bis 95 G durchgeführt. Die Reaktionszeit kann etwa 10 Stunden bis etwa 2Ö Minuten bei einem Temperaturbereich von etwa 65 bis etwa 110 C betragen. Vorzugsweise beträgt die Reaktionszeit etwa 3 Stunden bis etwa 1 Stunde im bevorzugten Temperaturbereich. Bei Hormaltemperaturen beträgt die Reaktionszeit etwa 1 Woche.The dehydrogenation of dihydromocimycin with selenium dioxide can be carried out at normal ambient temperature. Preferably however, the reaction is carried out at elevated temperatures, for example from about 65 to about 110.degree. C. and preferably from 80 to 95.degree carried out. The reaction time can be from about 10 hours to about 20 minutes at a temperature range of from about 65 to about 110.degree be. The reaction time is preferably about 3 hours to about 1 hour in the preferred temperature range. At normal temperatures the response time is about 1 week.

Die Umsetzung wird vorzugsweise in einem Lösungsmittel durchgeführt. Beispiele für entsprechende Lösungsmittel sind Hexamethylphosphortriamid (HMPT), Dimethylsulfoxid' _" (DMSO), tert.-Butanol, tert.-Amylalkohol, see.-Butanol, Hexylehglykol, n-Buta-The reaction is preferably carried out in a solvent. Examples of corresponding solvents are hexamethylphosphoric triamide (HMPT), dimethyl sulfoxide '_ "(DMSO), tert-butanol, tert-amyl alcohol, sea-butanol, hexyl glycol, n-buta-

Isopropanol,
nol, /Athylenglykolmonomethyläther, Dimethylformamid, Wasser; Phenylmethylcarbinol und Propanol sowie Gemische von zwei oderIsopropanol,
nol / ethylene glycol monomethyl ether, dimethylformamide, water; Phenylmethylcarbinol and propanol and mixtures of two or

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mehr dieser Lösungsmittel. Bevorzugt werden HMPT,'DMSO und tert. Butanol. Besonders bevorzugt ist HMPT.more of these solvents. HMPT, 'DMSO and tert are preferred. Butanol. HMPT is particularly preferred.

Vorzugsweise wird das Selendioxid in mindestens stöchiometrischen Mengen, bezogen auf Dihydromocimycin, eingesetzt.The selenium dioxide is preferably used in at least stoichiometric amounts, based on dihydromocimycin.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.The examples illustrate the invention.

example 1

Eine Lösung von 1 g Dihydromocimycin in 15 ml HMPT (technisches Produkt über einem Molekularsieb 3 A getrocknet) wird mit 139mgA solution of 1 g of dihydromocimycin in 15 ml of HMPT (technical Product dried over a molecular sieve 3 A) is with 139mg

(1,25 raMol) ,Selendioxid versetzt. Das Gemisch wird 100 Minuten auf einem Dampfbad erwärmt und nach 60 Minuten mit(1.25 raMol), selenium dioxide added. The mixture is 100 minutes heated on a steam bath and after 60 minutes with

'weiteren 139 mg Selendioxid versetzt. Das nach dem Abkühlen ausgefallene Selen wird durch ein G4-Glasfilter abfiltriert.'Another 139 mg of selenium dioxide are added. The selenium precipitated after cooling is filtered off through a G4 glass filter.

Der Niederschlag wird mit einer geringen Menge Methanol gewaschen. Das Piltrat wird in 350 ml destilliertes Wasser gegossen. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Das Piltrat wird aufbewahrt.The precipitate is washed with a small amount of methanol. The piltrate is poured into 350 ml of distilled water. The precipitate is filtered off and distilled with Water washed. The piltrate is kept.

Der Niederschlag wird in Methanol gelöst und mit MIBK verdünnt. Die Lösung wird bei 4O⁰C unter vermindertem Druck zur Entfernung von Methanol und Wasser eingedampft. Dünn-¹schichtchromatographisch. läßt sich feststellen, daß der Niederschlag kein Mocimycin enthält und nur aus polaren Verunreinigungen, besteht. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit MIBK gewaschen. Das Piltrat wird tropfenweise mit überschüssigem Petroläther vom Siedebereich 40 bis 6O⁰C versetzt. DerThe precipitate is dissolved in methanol and diluted with MIBK. The solution is evaporated at 4O ⁰ C under reduced pressure to remove methanol and water. Thin ¹ schichtchromatographisch. it can be determined that the precipitate does not contain mocimycin and consists only of polar impurities. The precipitate is filtered off and washed with MIBK. The Piltrat is treated dropwise with an excess of petroleum ether of boiling range 40 to 6O ⁰ C. Of the

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entstandene Niederschlag wird abfiltriert, mit Petroläther gewaschen und getrocknet. Ausbeute 500 mg Produkt·The resulting precipitate is filtered off and washed with petroleum ether and dried. Yield 500 mg of product

Das aufbewahrte Filtrat wird mit MIBK extrahiert. Der Extrakt wird tropfenweise zu Petroläther gegeben. Man erhält weitere 100 mg Produkt der gleichen Qualität. Die G-esamtausbeute beträgt 650 mg. Dünnschichtchromatographisch läßt sich feststellen, daß das Endprodukt aus Mocimycin besteht, das nur Spuren an Dihydromocimycin enthält.The stored filtrate is extracted with MIBK. The extract is added dropwise to petroleum ether. A further 100 mg of product of the same quality are obtained. The total yield is 650 mg. Thin-layer chromatography can be used to determine that the end product consists of mocimycin, which contains only traces of dihydromocimycin.

Example 2

Dieser Versuch wird in einem doppelten Ansatz durchgeführt. 2,4 g eines Produktes mit einem Gehalt an 22,8 % Mocimycin und 35,5 Prozent Dihydromocimycin werden in 50 inl HMPT gelöst. Sodann werden 350 mg Selendioxid zugegeben. Das Gemisch wird 45 Minuten bei 105°C gerührt. Durch eine dünnschichtchromatographische Untersuchung läßt sich feststellen, daß nunmehr kein Dihydromocimycin mehr vorhanden ist. Das Gemisch wird auf Raumtemperatur abgekühlt und zur Entfernung des Selens und einer geringen Menge an nicht umgesetztem Selendioxid durch ein G4-Glasfliter filtriert.This experiment is carried out in a double approach. 2.4 g of a product with a content of 22.8 % mocimycin and 35.5 percent dihydromocimycin are dissolved in 50 ml of HMPT. 350 mg of selenium dioxide are then added. The mixture is stirred at 105 ° C. for 45 minutes. A thin-layer chromatographic examination reveals that dihydromocimycin is no longer present. The mixture is cooled to room temperature and filtered through a G4 glass filter to remove the selenium and a small amount of unreacted selenium dioxide.

Der Niederschlag wird mit MIBK gewaschen. Das Filtrat und die MIBK-Waschflüssigkeit werden vereinigt und mit 350 ml Wasser, 10 g Natriumchlorid und 5 ml 4 η Salzsäure versetzt. Das Gemisch wird dreimal mit je 10σ ml MIBK extrahiert. Die vereinigten MIBK-Extrakte werden mit 100 ml Wasser gewaschen. Die Wasserphase wird entfernt und die MIBK-Phase über Magnesiumsulfat ge-The precipitate is washed with MIBK. The filtrate and the MIBK washing liquid are combined and mixed with 350 ml of water, 10 g of sodium chloride and 5 ml of 4 η hydrochloric acid are added. The mixture is extracted three times with 10σ ml MIBK each time. The United MIBK extracts are washed with 100 ml of water. The water phase is removed and the MIBK phase over magnesium sulfate

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trocknet« Das Magnesiumsulfat wird mit einer geringen Menge an MIBK gewaschen. Die MIBK-Phase wird sodann unter vermindertem Druck bei etwa 2O⁰C bis auf ein Volumen von 25 ml eingeengt. Der Rückstand wird tropfenweise unter Rühren mit Petroläther vom Siedebereich ^O bis 6O⁰C versetzt. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, mit Petroläther vom Siedebereich 4-0 bis 60 gewaschen und über Uacht bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck getrocknet.dries «The magnesium sulphate is washed with a small amount of MIBK. The MIBK layer was then concentrated ml under reduced pressure at about 2O ⁰ C to a volume of 25th ^{Petroleum ether with a boiling point of between 0} and 60 ° C. is added dropwise to the residue while stirring. The resulting precipitate is filtered off, washed with petroleum ether with a boiling point of 4-0 to 60 and dried overnight at room temperature under reduced pressure.

Die Ausbeute im ersten Ansatz beträgt 1,64 g Produkt mit einem Gehalt an 41,2 Prozent Mocimycin und an <_ 2 Prozent Dihydromocimycin (bestimmt durch Hochdruck-Jlüssigkeitschromatograpnie) Im zweiten Ansatz beträgt die Ausbeute 1,79. g Produkt mit einem Gehalt an 41,6 Prozent Mocimycin und £ 1 Prozent Dihydromocimycin. The yield in the first batch is 1.64 g of product with a content of 41.2 percent mocimycin and < 2 percent dihydromocimycin (determined by high pressure liquid chromatography). In the second batch, the yield is 1.79. g product containing 41.6 percent mocimycin and £ 1 percent dihydromocimycin.

Example 3

Dieses Beispiel erläutert den Einfluß verschiedener Lösungsmittel auf die Dehydrierung von Dihydromocimycin. Es werden jeweils 50 mg eines technischen Produktes mit einem Gehalt an Dihydromocimycin und Mocimycin mit 20 mg (0,18 mMol) Selendioxid in 3 ml Lösungsmittel bei einer Temperatur von 80°C umgesetzt. Nach zwei., vier und sieben Stunden werden Proben entnommen und dünnschichtchromatographisch an Kieselgel 60-Scheiben un ter Verwendung eines 50 : 45 : 5-Gemlsches aus MIBK, Aceton und Wasser als Laufmittel untersucht. Der Nachweis wird durch Aufsprühen eines Gemisches aus Schwefelsäure und DiäthylätherThis example illustrates the influence of various solvents on the dehydrogenation of dihydromocimycin. In each case 50 mg of a technical product containing dihydromocimycin and mocimycin are reacted with 20 mg (0.18 mmol) of selenium dioxide in 3 ml of solvent at a temperature of 80.degree. . After two, four and seven hours, samples are taken and thin-layer chromatography on silica gel 60 slices un ter using a 50: 5-examined Gemlsches of MIBK, acetone and water as eluent 45. Evidence is provided by spraying on a mixture of sulfuric acid and diethyl ether

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durchgeführt. Dadurch läßt sich der Reaktionsverlauf qualitativ verfolgen.carried out. This allows the course of the reaction to be followed qualitatively.

Bei Verwendung folgender Lösungsmittel ergibt sich eine Zersetzung oder keine Umsetzung: Propargylalkohol, Diacetonalkohol, .Nitromethan,""Propylencarbonat, Acetonitril, Pyridin, SuIf ο lan, Benzylalkohol, Mesityloxid, Äthylencarbonat, H-Methyl-2-pyrrolidon, Ιϋί,Ν-Dimethylacetamid, Dioxan, MIBK, · Butylacetat, Amylacetat, H-Methylacetamid, Anisol, Diäthylenglykolmethylather und 1,2-Dichloräthan. Einen geringen Umsetzungsgrad erhält man bei Verwendung von Tetramethylharnstoff, 0,1 m NaHC0,,/Na₂C!0,-Puffer vorn pH-Wert 9,1, n-Propanol, PhenyImethylcarbinol,'Wasser und Dimethylformamid. Einen etwas besseren Umsetzungsgz'ad erreicht man bei Verwendung von Äthylenglykolmonomethyläther, Isopropanol, n-Butanol, Hexylenglykol, sec.-Butanol und tert.-Amylalkohol. Eine mäßige Umsetzung erreicht man in tert.-Butanol und Dimethylsulfoxid. Die besten Ergebnisse werden bei Verwendung von HMPT erhalten. - ■If the following solvents are used, decomposition or no conversion occurs: propargyl alcohol, diacetone alcohol, .nitromethane, "" propylene carbonate, acetonitrile, pyridine, sulfo lan, benzyl alcohol, mesityl oxide, ethylene carbonate, H-methyl-2-pyrrolidone, Ιϋί, Ν-dimethylacetamide , Dioxane, MIBK, butyl acetate, amyl acetate, H-methylacetamide, anisole, diethylene glycol methyl ether and 1,2-dichloroethane. A low degree of conversion is obtained when using tetramethylurea, 0.1 M NaHCO ₂ / Na 2 C 10, buffer with a pH of 9.1, n-propanol, phenyl methyl carbinol, water and dimethylformamide. A somewhat better conversion rate is achieved when using ethylene glycol monomethyl ether, isopropanol, n-butanol, hexylene glycol, sec-butanol and tert-amyl alcohol. A moderate conversion is achieved in tert-butanol and dimethyl sulfoxide. The best results are obtained using HMPT. - ■

Example 4

Die Eignung von Lösungsmittelgemischen mit HMPT. als einem Bestandteil wird untersucht. Es werden jeweils 2,4 g des Ausgangsmaterials von Beispiel 3 eingesetzt. Hach der dünnschichtchromatographisch festgestellten Umsetzung des gesamten Dihydromocimycins wird das Reaktionsgemisch jeweils folgendermaßen aufgearbeitet: Hach dem Abkühlen wird das entstandene Selen durch ein D4-Glasfilter abfiltriert· " ^{und mit} einerThe suitability of solvent mixtures with HMPT. as a component is examined. In each case 2.4 g of the starting material from Example 3 are used. After the conversion of all of the dihydromocimycin determined by thin-layer chromatography, the reaction mixture is worked up as follows: After cooling, the selenium formed is filtered off through a D4 glass filter ^{and with} a

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kleinen Menge an Methanol gewaschen. Das Filtrat wird in einen Überschuß an Wasser gegossen und auf den pH-Wert 3 angesäuert. Anschließend wird 3 mal mit . j'eweils "einem Viertel-"des Volumens an MIBK "' 'extrahiert. Eine teerartige Zwischenschicht wird mit MIBK extrahiert,- indem man wieder zunächst in Methanol löst und anschließend mit MIBK und Wasser verdünnt. Die vereinigten MIBK-Extrakte werden J mal mit jeweils einem ~ .Drittel des Volumens an Wasser "" ' gewaschen.. Die organische Phase wird bei etwa 4O⁰C unter vermindertem Druck eingeengt. In allen Fällen besteht der Niederschlag im wesentlichen aus Zersetzungsprodukten, wie sich dünnschichtchromatographisch zeigen läßt. Der Niederschlag wird abfil-triert und mit MIBK gewaschen. Die vereinigten MIBK-Konzentrate werden langsam unter Rühren zu einem Überschuß an Petroläther vom Siedebereich 40 bis 6O⁰C gegeben. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, mit Petroläther gewaschen und getrocknet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.washed small amount of methanol. The filtrate is poured into excess water and acidified to pH 3. Then 3 times with. in each case "a quarter" of the volume of MIBK "" is extracted. A tar-like intermediate layer is extracted with MIBK by first dissolving it again in methanol and then diluting with MIBK and water. The combined MIBK extracts are mixed with J times each a ~ .Drittel the volume of water ""'washed .. the organic phase is concentrated at about 4O ⁰ C under reduced pressure. in all cases the precipitate consists essentially of decomposition products, as can be shown by thin layer chromatography the precipitate is abfil. -triert and washed with MIBK. The combined MIBK concentrates are slowly added with stirring to an excess of petroleum ether of boiling range 40 to 6O ⁰ C. The resulting precipitate is filtered, washed with petroleum ether and dried. The results are summarized in Table I.

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Table I.

Menge an
Lösungs
mittelAmount of
Solution
middle ieaktions
bemperatu
(⁰C)action
bemperatu
( ⁰ C) - Gesamte
r Reaktions
zeit·
(sta.)- Entire
r reaction
Time·
(sta.) SeOp-Zusatz
in g;
Zeit nach
Reaktions
beginnSeOp addition
in g;
Time after
Reaction
beginning .usbeute
Gewichts-
Dr ο ζ ent).usage
Weight
Dr ο ζ ent) Mol SeO₂
pro Mol
GemischMoles of SeO ₂
per mole
mixture HMPT 25 ml
H₂O 35 mlHMPT 25 ml
H ₂ O 35 ml 9090 2 ·2 · 0,5 am Anfang
+0,5 nach
55 Minuten0.5 at the beginning
+0.5 after
55 minutes 4242 3:13: 1 HMPT 15 ml
0,1 m
ITaHCO,-
Ka₉CO^
Puffer¹ όΗ
9,1 25 mlHMPT 15 ml
0.1 m
ITaHCO, -
Ka ₉ CO ^
Buffer ¹ όΗ
9.1 25 ml 9090 2 3/42 3/4 0,1 am Anfang
0,1 nach 20
Minuten
0,1 nach 85
Minuten
0,1 nach 130
Minut en0.1 at the beginning
0.1 after 20
Minutes
0.1 after 85
Minutes
0.1 after 130
Minutes 5050 1,2:11.2: 1 t-BÜÖH"" 20
ml
HMPT 10 mlt-BÜÖH "" 20
ml
HMPT 10 ml 8484 33 0,1 am Anfang
0,1 nach 25
Minuten
0,1 nach 45
Minuten
0,1 nach 75
Minuten
0,1 nach 120
Minut en0.1 at the beginning
0.1 after 25
Minutes
0.1 after 45
Minutes
0.1 after 75
Minutes
0.1 after 120
Minutes 4242 . 1,5:1. 1.5: 1 t-AmOH
100 ml
HMPT 50 mlt-AmOH
100 ml
HMPT 50 ml 9696 33 0,35 am Anf.
0,35 nach 70
Minuten
0,35 nach 110
Minuten0.35 at the beginning
0.35 after 70
Minutes
0.35 after 110
Minutes 7171 3,2:13.2: 1 t-AmOH
150 mlt-AmOH
150 ml 9696 33 0·, 35 am Anf.
0,35 nach 75
Minuten
0,35 nach 150
Minuten0.35 at the beginning
0.35 after 75
Minutes
0.35 after 150
Minutes • 55• 55 3,2:13.2: 1 t-BuOH
100 ml '
HMPT 50 mlt-BuOH
100 ml '
HMPT 50 ml 8080 22 1,0 am Anfang
1,0 nach 35
Minuten1.0 at the beginning
1.0 after 35
Minutes 4242 6:16: 1 HMPT 1 50 ·
mlHMPT 1 50
ml 9595 Ende der
Reaktions
zeit nach
1 Std.end of
Reaction
time after
1 H. 0,4 am Anfang0.4 at the beginning 7979 1,2:11.2: 1

HMPT = Hexamethylphosphortriamid t-BuOH = tert.-Butanol
t-AmOH = tert.-Amy!alkoholHMPT = hexamethylphosphoric triamide t-BuOH = tert-butanol
t-AmOH = tert.-Amy! alcohol

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Aus der Tabelle ergibt sich, daß die höchste Ausbeute (79 Prozent) bei Verwendung von reinem HEiPT als Lösungsmittel erhalten wird. Eine hohe Ausbeute erhält man auch bei Verwendung eines Gemisches aus HMPT und tert.-Amylalkohol.The table shows that the highest yield (79 percent) obtained when using pure HEiPT as solvent will. A high yield is obtained even if it is used a mixture of HMPT and tertiary amyl alcohol.

Das Dihydromycin wird folgendermaßen hergestellt.The dihydromycin is made as follows.

Versuch AAttempt a

Mikroorganismen des Stammes Streptomyces ramocissimus (CBS 190·69) werden in 2 000 Liter eines Nährmediums, das pro Liter 20 g Gerstenmalzpaste, 10 g Hefeextrakt und 5 g Maisquellwasser-Peststoffe enthält, bei einem pH-Wert von etwa 7 unter Rühren und Belüftung gezüchtet. Nach der Züchtung wird die Kulturflüssigkeit mit etwa 2 % expandiertem Perlit als Filtrierhilfe versetzt und filtriert. Das Filtrat wird mit 8 η Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 6,0 angesäuert und zweimal mit einem Fünftel seines Volumens an Methylisobutylketon (MIBK) extrahiert. Die entstandenen Emulsionen werden mit Diatomeenerde als Filtrierhilfe gebrochen. Die organischen Phasen werden vereinigt und unter vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer auf ein Volumen von etwa 1 Liter eingeengt. Das Konzentrat wird langsam zu 5 Liter Petroläther (Siedebereich 40 bis 6O⁰C) gegeben. Der dabei entstandene Niederschlag wird mit einer Glasfilterfritte (G 3) abfiltriert. Der Filterrückstand wird mit frischem Petrol-Microorganisms of the strain Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69) are grown in 2,000 liters of a nutrient medium containing 20 g of barley malt paste, 10 g of yeast extract and 5 g of corn steeple pests per liter at a pH of about 7 with stirring and aeration . After cultivation, about 2 % expanded perlite is added to the culture liquid as a filter aid and filtered. The filtrate is acidified to pH 6.0 with 8 η sulfuric acid and extracted twice with a fifth of its volume of methyl isobutyl ketone (MIBK). The resulting emulsions are broken with diatomaceous earth as a filter aid. The organic phases are combined and concentrated under reduced pressure in a rotary evaporator to a volume of about 1 liter. The concentrate is added slowly to 5 liters of petroleum ether (boiling range 40 to 6O ⁰ C). The resulting precipitate is filtered off with a glass filter frit (G 3). The filter residue is washed with fresh petroleum

äther gewaschen und getrocknet. Man erhält ein gelbgefärbtes Pulver, das Mocimycin und Dihydromocimycin enthält.ether washed and dried. A yellow colored powder is obtained, which contains mocimycin and dihydromocimycin.

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Gereinigtes Dihydromocimycin mit einem Mociinycingehalt von höchstens 5 Prozent wird auf folgende Weise erhalten: In das Konzentrat wird X Minute lang bei einer Temperatur von 2⁰C₁SaS-förmiges Ammoniak mit einer Geschwindigkeit von 150 liter/Liter Konzentrat/Stunde eingeleitet. Dabei entsteht ein Niederschlag, der Mocimycin enthält. Das nach dem Abfiltrieren des Niederschlags erhaltene Filfrat wird weitere 10 bis 15 Minuten mit gasförmigem Ammoniak behandelt. Der nunmehr gebildete Niederschlag wird abfiltriert und in verdünnter Ammoniaklösung vom pH-Wert 9,0 gelöst. Me erhaltene Lösung wird mit dem gleichen Volumen Methylenchlorid extrahiert. Der Extrakt wird in die 3- bis 5-fache Volumenmenge Cyclohexan gegossen. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, getrocknet und pulverisiert.Purified dihydromocimycin with a mociinycin content of at most 5 percent is obtained in the following manner: ₁ SaS ammonia is passed into the concentrate for X minutes at a temperature of 2 ^° C. at a rate of 150 liters / liter of concentrate / hour. This creates a precipitate that contains mocimycin. The filtrate obtained after filtering off the precipitate is treated with gaseous ammonia for a further 10 to 15 minutes. The precipitate that has now formed is filtered off and dissolved in dilute ammonia solution with a pH of 9.0. The solution obtained is extracted with an equal volume of methylene chloride. The extract is poured into 3 to 5 times the volume of cyclohexane. The precipitate obtained is filtered off, dried and pulverized.

Versuch BAttempt B

Eine lyophilisierte Kultur von Mikroorganismen des Stammes Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69) oder eine gut sporulierende Agar-Kultur dieser Mikroorganismen wird in einen 500 ml-Erlenmeyerkolben überimpft, der 100 ml eines sterilisierten Nährmediums folgender Zusammensetzung enthält: 20 g Gerstenmalzpaste, 10 g Hefeextrakt und 5 g Maisquellwasser-Peststoffe pro"Liter Leitungswasser (pH-Wert 7,0).A lyophilized culture of microorganisms of the strain Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69) or a well sporulating one Agar culture of these microorganisms is placed in a 500 ml Erlenmeyer flask inoculated, which contains 100 ml of a sterilized nutrient medium of the following composition: 20 g barley malt paste, 10 grams of yeast extract and 5 grams of corn steep liquor pests per "liter Tap water (pH 7.0).

Nach 3tägiger Inkubation bei 30⁰C auf einer Drehschüttelmaschine (300 U/min, Hub 2,5 cm) wird die erhaltene Kultur in kleine Fermenter überimpft, die 2 000 ml des Nährmediums und zusätzlich 20 mg CoCl₂,6H₂O pro Liter enthalten. Zur Verbesserung der Bildung von Dihydromocimycin wird diese Wachstumsphase bei 30⁰CAfter 3 days of incubation at 30 ⁰ C on a Drehschüttelmaschine (300 U / min, stroke 2.5 cm) was inoculated the culture obtained in small fermenters, the 2000 ml of the nutrient medium and an additional 20 mg CoCl _2, 6H ₂ O per liter contain . This growth phase is at 30 ^° C. to improve the formation of dihydromocimycin

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unter sehr guter Belüftung durchgeführt. Dazu werden mindestens 2 Liter sterilisierte Luft pro Minute bei einer Rührgeschwindigkeit von 1 000 U/min eingeleitet. Die Bildung von Dihydromocimyein setzt etwa 12 Stunden nach Züchtungsbeginn ein und er reicht nach etwa 120 Stunden das Maximum. Eine Züchtung in größerem Maßstab ist möglich, indem man eine 'i8 Stunden lang in den kleinen Fermentern gezüchtete Kultur als Inokulum für große Fermenter verwendet.carried out with very good ventilation. To do this, at least Introduced 2 liters of sterilized air per minute at a stirring speed of 1,000 rpm. The formation of dihydromocimyein begins about 12 hours after the start of cultivation and reaches the maximum after about 120 hours. A breed on a larger scale Scale is possible by spending an 18 hours in Culture grown in small fermenters is used as inoculum for large fermenters.

Aus der Kulturflüssigkeit wird Dihydromocimycin auf folgende Weise gewonnen: Nach Zusatz von 2 % Diatomeenerde als Filtrierhilfe wird die Kulturflüssigkeit filtriert. Das Filtrat wird mit 8 η Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 5 his 6 angesäuert und zweimal mit einem Fünftel seines Volumens an MIBK extrahiert. Eine gegebenenfalls entstandene Emulsion wird mit Diatomeenerde als Filtrierhilfe gebrochen. Die organischen Phasen werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf etwa ein Zehntel des ursprünglichen Volumens eingeengt« Sodann wird in das Filtrat 1 Minute lang gasförmiges Ammoniak mit einer Geschwindigkeit von 150 Liter/Liter Konzentrat/Stunde eingeleitet. Der dabei entstandene Niederschlag wird abfiltriert.. Das Filtrat wird weitere 10 bis 15 Minuten mit gasförmigem Ammoniak behandelt. Der dabei erhaltene Niederschlag wird in verdünnter Ammoniaklösung vom pH-Wert 9»0 gelöst, Durch Extraktion der Ammoniaklösung mit einem gleichen Volumen Methylenchlorid wird gereinigtes Dihydromocimycin (mit einem Gehalt an Mocimycin von höchstens 5 %) erhalten. Der Extrakt wird in das 3- bis 5fache Volumen Cyclohexan gegossen. Der entstandene Niederschlag wird ab filtriert, getrocknet und pulverisiert.Dihydromocimycin is obtained from the culture fluid in the following way: After adding 2 % diatomaceous earth as a filter aid, the culture fluid is filtered. The filtrate is acidified with 8 η sulfuric acid to a pH value of 5 to 6 and extracted twice with a fifth of its volume of MIBK. Any emulsion that may have formed is broken with diatomaceous earth as a filter aid. The organic phases are combined and concentrated under reduced pressure to about a tenth of the original volume. Gaseous ammonia is then passed into the filtrate for 1 minute at a rate of 150 liters / liter of concentrate / hour. The resulting precipitate is filtered off. The filtrate is treated with gaseous ammonia for a further 10 to 15 minutes. The resulting precipitate is dissolved in dilute ammonia solution with a pH of 9 »0. By extracting the ammonia solution with an equal volume of methylene chloride, purified dihydromocimycin (with a mocimycin content of at most 5 %) is obtained. The extract is poured into 3 to 5 times the volume of cyclohexane. The resulting precipitate is filtered off, dried and pulverized.

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Claims

F at e η t a η s ρ r ü c h e

1. Process for the preparation of mocimycin, thereby characterized in that one dihydromocimycin with Selenium dioxide is dehydrated.

2. The method according to claim 1, characterized in that a mixture of mocimycin and dihydromocimycin is used as the starting material begins.

3 »Method according to claim 1 or 2, characterized in that that the reaction is carried out at elevated temperatures,

4. Process according to claim 3, characterized in that the reaction is carried out at temperatures from about 65 to about 110 ^° C,

5. The method according to claim 4, characterized in that the reaction is carried out at temperatures from 80 to 95.degree.

6t method according to claims 1 to 5 * characterized by " that the reaction in Hexamethylphosphortriamid, Dimethylsulfoxidj tert-butanol, tert-amyl alcohol, sec-butanol, Hexylene glycol, n-butanol, isopropanol, ethylene glycol monomethyl ether, Carries out dimethylformamide, water, phenylmethylcarbinol, propanol or mixtures of two or more of these solvents,

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7. The method according to claim 6, characterized in that the reaction in hexamethylphosphoric triamide, dimethyl sulfoxide or tert-butanol.

8 »Method according to claim 7, characterized in that the reaction is carried out in hexamethylphosphoric triamide as the solvent.

70981 8/1 QBB